CN114796480B - 一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法 - Google Patents

一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，涉及疫苗佐剂的技术领域，尤其涉及一种纳米复合疫苗佐剂的制备方法。是要解决现有铝盐佐剂缺乏诱导Th1型免疫反应的能力，且不能诱导黏膜免疫反应的问题。方法：一、配置可溶性铝盐溶液。二、制备取代度可控的N‑2‑羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。三、将步骤二制备的N‑2‑HACC溶于乙酸钠缓冲溶液中，搅拌制得N‑2‑HACC溶液；四、将阴离子聚合物溶液加入到N‑2‑HACC溶液中，搅拌均匀得到混合溶液。五、制备N‑2‑HACC‑Al复合纳米粒铝佐剂。本方法可在控制粒径的前提下提高产率，使产量大幅度增加。带正电且稳定的纳米颗粒显示出良好的递送和免疫增强。本发明用于制备疫苗用铝佐剂。

Description

一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗佐剂的技术领域，尤其涉及一种纳米复合疫苗佐剂的制备方法。
背景技术
佐剂是一种先于抗原或与抗原混合同时注入体内，能非特异增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而自身并无免疫原性，不能引起免疫应答反应的物质。佐剂在免疫中的作用主要是提升机体免疫系统对抗原或免疫原的免疫应答反应，包括增强免疫反应强度和反应的持久性。
铝佐剂在机体的固有免疫、获得性免疫、补体系统的反应中均发挥着一定作用。大量研究及应用结果表明，铝佐剂可促进巨噬细胞和炎性单核细胞向DC细胞分化，并增强其摄取抗原的能力。铝佐剂自身或其诱导细胞凋亡释放出的宿主DNA均可诱导炎性反应产生，从而增强对疫苗的免疫反应。研究表明，铝佐剂可经由Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)刺激B细胞，诱导T细胞依赖的抗体反应。氢氧化铝复合物可引起肉芽肿和巨噬细胞损伤，进而活化补体途径，且其活化补体的方式无需经典及旁路途径。铝佐剂的颗粒大小及其均一性均会对疫苗的免疫效果产生影响。传统的氨水配制氢氧化铝佐剂的工艺进行了改良，使佐剂的粒径分布自517-950nm降低至275-435nm，且均一性得到改善，发现其吸附能力得到较大提高。将铝佐剂制备成纳米颗粒后，由于其粒径更小，比表面积急剧增大，具有表面反应活性高、活性中心多、吸附能力强等特性，在相同铝含量的情况下，可吸附更多的抗原。铝佐剂疫苗能够增强机体产生高滴度IgG，引发强烈的Th2型免疫反应，但铝盐佐剂，导致其在增强细胞免疫效果方面不理想，同时铝佐剂不能诱导黏膜免疫反应。
发明内容
本发明是要解决现有铝盐佐剂缺乏诱导Th1型免疫反应的能力，且不能诱导黏膜免疫反应的问题，提供一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法。
本发明复合纳米粒铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：配置可溶性铝盐溶液
将可溶性铝盐溶于去离子水，于20℃-50℃持续搅拌9小时，高温120℃灭菌20min；其中可溶性铝盐的质量与去离子水的体积比为(0.2～1)g∶(50～200)mL；
步骤二：制备取代度可控的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)
将壳聚糖溶于乙酸溶液，调节pH至碱性，抽滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，然后将壳聚糖分散到异丙醇溶液中，逐滴加入2,3环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，滴加完毕后，恒温油浴70-90℃搅拌9-10h，然后冷却至室温，静置1～2h，加入4℃无水乙醇浸泡后抽滤，真空冷冻干燥至恒重，得到取代度可控的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖N-2-HACC；其中制备的N-2-HACC的取代度为30％-90％；
本发明中所述取代度是指壳聚糖的每个(2-胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖)结构单元上的活性胺基被取代的物质的量和活性胺基总物质的量百分比。
步骤三：将步骤二制备的N-2-HACC溶于乙酸钠缓冲溶液中，搅拌均匀，制得N-2-HACC溶液；
步骤四：将阴离子聚合物溶液加入到N-2-HACC溶液中，以800r/min的速度搅拌均匀，得到混合溶液；阴离子聚合物溶液的浓度为(0.001～2)mg/mL；
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将可溶性铝盐溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为10℃～70℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。
进一步的，步骤一所述可溶性铝盐为氯化铝、硫酸铝、醋酸铝、硝酸铝中的一种或任意几种的混合物。
进一步的，步骤二乙酸溶液中乙酸与去离子水的体积比为(8～10)∶(150～300)。
步骤二中壳聚糖的质量与乙酸溶液中乙酸的体积比为(5～9)g∶(8～10)mL。
进一步的，步骤三所述乙酸钠缓冲溶液的制备方法为：将乙酸钠溶于去离子水中，并加入冰乙酸调节pH值为酸性，乙酸钠的质量与去离子水的体积比为(1～5)g∶(0.5～2)L，乙酸钠的质量与冰乙酸的体积比为(1～5)g∶(20～200)μL。
进一步的，步骤四中所述N-2-HACC与阴离子聚合物的质量比为(2～5)g∶(0.01～20)mg。(即N-2-HACC溶液和阴离子聚合物溶液中两种溶质的质量比)。
进一步的，步骤四所述阴离子聚合物为羧甲基壳聚糖(CMCS)、透明质酸钠或海藻酸钠。
进一步的，步骤五中可溶性铝盐与混合溶液中N-2-HACC的质量比为(4～9)∶(0.5～3)。
进一步的，步骤五中冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖或N-2-HACC。
进一步的，步骤五中孵育的时间为0.1-3h，孵育温度为15℃-70℃。
本发明的有益效果：
为克服铝佐剂缺乏诱导Th1型免疫反应能力、不能诱导黏膜免疫反应的缺点，获得更好的免疫反应，本发明将N-2-HACC与可溶性铝盐复合，制备了复合佐剂。N-2-HACC能够起到控制粒径、调整Zeta电位，同时赋予纳米佐剂黏膜免疫性能的作用。
本发明以N-2-HACC和可溶性铝盐为原材料，通过正负离子自组装形成种子，离子交联的方法制备了核壳结构的复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。N-2-HACC和阴离子聚合物通过正负离子自组装结合形成大量纳米种子，以纳米种子为核制备N-2-HACC-Al纳米佐剂，可在控制粒径的前提下提高产率，使产量大幅度增加。制备得到粒径在200-400nm之间的带正电且稳定的纳米颗粒，显示出良好的递送和免疫增强。
本发明制备的复合纳米粒铝佐剂(N-2-HACC-Al NPs)在血清和黏膜部位能诱导高特异性IgG水平，具有诱导Th1/Th2型免疫反应的作用，肌注与口服免疫sIgA的量都有明显的增加，证明复合纳米粒铝佐剂能够刺激机体产生强烈的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应。
本发明制备的复合纳米粒铝佐剂具有良好的安全性，可作为佐剂在一些已有的、变异的或新发的病原微生物传染病疫苗中使用，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为N-2-HACC-Al NPs在50000倍下的扫描电镜图；
图2为N-2-HACC-Al NPs增加阴离子聚合物的量后在50000倍下的扫描电镜图；
图3为N-2-HACC-Al NPs对PK15细胞的生物安全性测定；
图4为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠肌注免疫后的豚鼠血清中IgG2a的监测结果；
图5为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠肌注免疫后的豚鼠血清中IgG1水平的测定结果；
图6为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠肌注免疫后的豚鼠粪便中sIgA抗体的监测结果；
图7为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠口服免疫后豚鼠血清中IgG2a的监测结果；
图8为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠口服免疫后豚鼠血清中IgG1水平的测定结果；
图9为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠口服免疫后豚鼠粪便中sIgA抗体的监测结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式复合纳米粒铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：配置可溶性铝盐溶液
将可溶性铝盐溶于去离子水，于20℃-50℃持续搅拌9小时，高温120℃灭菌20min；其中可溶性铝盐的质量与去离子水的体积比为(0.2～1)g∶(50～200)mL；
步骤二：制备取代度可控的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)
将壳聚糖溶于乙酸溶液，调节pH至碱性，抽滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，然后将壳聚糖分散到异丙醇溶液中，逐滴加入2,3环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，滴加完毕后，恒温油浴70-90℃搅拌9-10h，然后冷却至室温，静置1～2h，加入4℃无水乙醇浸泡后抽滤，真空冷冻干燥至恒重，得到取代度可控的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖N-2-HACC；其中制备的N-2-HACC的取代度为30％-90％。
本发明中所述取代度是指壳聚糖的每个(2-胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖)结构单元上的活性胺基被取代的物质的量和活性胺基总物质的量百分比。
N-2-HACC在纳米粒的产生过程中首先是和阴离子聚合物产生核心，同时在核心外面和可溶性铝盐作用使铝纳米佐剂沿核心生长，取代度越高制备的纳米粒粒径越大，但取代度过小会导致纳米粒畸形生长和Zeta电位偏低，因此要根据具体纳米粒大小的要求选择合适的取代度。
步骤三：将步骤二制备的N-2-HACC溶于乙酸钠缓冲溶液中，搅拌均匀，制得N-2-HACC溶液；
步骤四：将阴离子聚合物溶液加入到N-2-HACC溶液中，以800r/min的速度搅拌均匀，得到混合溶液；阴离子聚合物溶液的浓度为(0.001～2)mg/mL；
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将可溶性铝盐溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为10℃～70℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述可溶性铝盐为氯化铝、硫酸铝、醋酸铝、硝酸铝中的一种或任意几种的混合物。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二乙酸溶液中乙酸与去离子水的体积比为(8～10)∶(150～300)。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中壳聚糖的质量与乙酸溶液中乙酸的体积比为(5～9)g∶(8～10)mL。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三所述乙酸钠缓冲溶液的制备方法为：将乙酸钠溶于去离子水中，并加入冰乙酸调节pH值为酸性，乙酸钠的质量与去离子水的体积比为(1～5)g∶(0.5～2)L，乙酸钠的质量与冰乙酸的体积比为(1～5)g∶(20～200)μL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中所述N-2-HACC与阴离子聚合物的质量比为(2～5)g∶(0.01～20)mg。(即N-2-HACC溶液和阴离子聚合物溶液中两种溶质的质量比)。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四所述阴离子聚合物为羧甲基壳聚糖(CMCS)、透明质酸钠或海藻酸钠。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤五中可溶性铝盐与混合溶液中N-2-HACC的质量比为(4～9)∶(0.5～3)。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖或N-2-HACC。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤五中孵育的时间为0.1-3h，孵育温度为15℃-70℃。其它与具体实施方式一至九之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例复合纳米粒铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：配置可溶性铝盐溶液
将硫酸铝溶于去离子水，于30℃持续搅拌9小时，高温120℃灭菌20min，配置6g/L的硫酸铝溶液；
步骤二：制备N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)
将6g壳聚糖溶于体积浓度为0.05％的乙酸溶液，调节pH至碱性，抽滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，然后将壳聚糖分散到50mL异丙醇溶液中，逐滴加入50mL的2,3环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液(其中2,3环氧丙基三甲基氯化铵的质量为8g)，滴加完毕后，恒温油浴80℃搅拌10h，然后冷却至室温，静置1h，加入4℃无水乙醇浸泡后抽滤，真空冷冻干燥至恒重，得到取代度为60％的N-2-HACC；
步骤三：将0.2g步骤二制备的N-2-HACC溶于100mL乙酸钠缓冲溶液中，搅拌均匀，制得N-2-HACC溶液。所述乙酸钠缓冲溶液的制备方法为：将乙酸钠溶于去离子水中，并加入冰乙酸调节pH值为酸性，乙酸钠的质量与去离子水的体积比为2g∶1L，乙酸钠的质量与冰乙酸的体积比为2g∶20μL。
步骤四：将10mL浓度为0.01g/L羧甲基壳聚糖溶液加入到步骤三的N-2-HACC溶液中，以800r/min的速度搅拌均匀，得到混合溶液；步骤四中所述N-2-HACC与羧甲基壳聚糖的质量比为2g∶1mg。
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将6g/L的硫酸铝溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为30℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂葡萄糖，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。硫酸铝与混合溶液中N-2-HACC的质量比为6∶2。
本实施例加入阴离子聚合物的量为0.1mg得到的复合纳米粒铝佐剂产量为23mg。
实施例2：
本实施例与实施例1不同的是：
步骤三：将0.1g步骤二制备的N-2-HACC溶于100mL乙酸钠缓冲溶液中，搅拌均匀，制得N-2-HACC溶液。乙酸钠缓冲溶液的制备方法为：将乙酸钠溶于去离子水中，并加入冰乙酸调节pH值为酸性，乙酸钠的质量与去离子水的体积比为3g∶1L，乙酸钠的质量与冰乙酸的体积比为3g∶40μL。
步骤四：将浓度为0.1g/L羧甲基壳聚糖溶液加入到步骤三的N-2-HACC溶液中，以800r/min的速度搅拌均匀，得到混合溶液；步骤四中N-2-HACC与羧甲基壳聚糖的质量比为1g∶10mg。
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将5g/L的硫酸铝溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为30℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂葡萄糖，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。硫酸铝与混合溶液中N-2-HACC的质量比为5∶1。
其他步骤及参数与实施例1相同。
本实施例加入阴离子聚合物的量为1mg得到的复合纳米粒铝佐剂产量为28mg。
实施例3：
本实施例与实施例1不同的是：
步骤二：制备N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)
将6g壳聚糖溶于0.05％的乙酸溶液，调节pH至碱性，抽滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，然后将壳聚糖分散到50mL异丙醇溶液中，逐滴加入50mL的2,3环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液(其中2,3环氧丙基三甲基氯化铵的质量为11g)，滴加完毕后，恒温油浴80℃搅拌10h，然后冷却至室温，静置1h，加入4℃无水乙醇浸泡后抽滤，真空冷冻干燥至恒重，得到取代度为80％的N-2-HACC；
其他步骤及参数与实施例1相同。
实施例4：
本实施例与实施例1不同的是：阴离子聚合物为透明质酸钠。其他步骤及参数与实施例1相同。
实施例5：
本实施例与实施例1不同的是：可溶性铝盐为氯化铝。
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将5g/L的氯化铝溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为35℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂葡萄糖，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。
其他步骤及参数与实施例1相同。
实施例6：
本实施例与实施例2不同的是：
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将5g/L的硫酸铝溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为35℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂葡萄糖，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。
其他步骤及参数与实施例1相同。
实施例7：
本实施例与实施例2不同的是：阴离子聚合物为海藻酸钠。其他步骤及参数与实施例1相同。
实施例8：
本实施例与实施例2不同的是：可溶性铝盐为醋酸铝。
步骤五：复合纳米粒铝佐剂的制备
将5g/L的硫酸铝溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为40℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂葡萄糖，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。
其他步骤及参数与实施例1相同。
将实施例1制备的复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs进行以下实验：
(一)复合纳米粒铝佐剂的形态观察
将实施例1制备的复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs在扫描电镜下放大50000倍观察形貌，如图1所示，粒径大小为150±20nm，粒径分布较为均一。
以不加入阴离子聚合物的方法作为对照实验，冷冻干燥后的纳米粒产量大概为6mg左右。当提高阴离子聚合物的加入量，冷冻干燥后的纳米粒产量可增加3-6倍。
而且阴离子聚合物的加入量控制在一定范围内，加入量越多，纳米粒的粒径越小，如图2所示(为阴离子聚合物为1mg时的电镜照片)。
阴离子聚合物的加入，可以在控制粒径的前提下提高产率，使产量大幅度增加。
(二)生物安全性实验
通过MTT试剂盒检测制备的N-2-HACC-Al NPs对PK15细胞活力的影响。吸取5μL不同浓度(400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL)的N-2-HACC-Al NPs悬液加入到96孔板中，孵育24h；之后，向每个孔中加入10μL MTT溶液，培养箱中孵育4h，向每个孔中加入100μL Formazan溶解液；培养箱中孵育3-4h，在550nm波长下测定吸光度，计算PK15细胞活力。
N-2-HACC-Al NPs对PK15细胞的生物安全性测定结果如图3所示，横坐标表示N-2-HACC-Al NPs悬液的浓度，纵坐标表示细胞存活率。当N-2-HACC-Al NPs浓度高达400μg/mL时，PK15细胞活力才降低到80％以下，表明N-2-HACC-Al NPs在一定浓度范围内表现出良好的生物安全性。
(三)免疫实验
将0.3mg/mL复合纳米粒铝佐剂悬浮液与PEDV灭活病毒液以体积比1∶1混合，5min后离心，制备复合纳米粒铝佐剂负载PEDV灭活疫苗。
将PEDV血清抗体阴性的豚鼠36只随机分成6组，每组6只(其中3只口服免疫，3只肌注免疫)，免疫剂量为0.2mL。在首次免疫后2周以相同的免疫方式和免疫剂量进行二次免疫。在首次免疫前一天和首次免疫后每周心脏采血，分离血清，测定血清中豚鼠PEDV特异性抗体IgG1、IgG2a的含量；同时，在首次免疫前一天和首次免疫后每周采集粪便，测定豚鼠粪便中sIgA含量。
图4为制备的N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠肌注免疫后的豚鼠血清中IgG2a的监测结果，其中
Figure BDA0003686221160000091
表示N-2-HACC-Al/PEDV，
Figure BDA0003686221160000092
表示IgG2a；图5为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠肌注免疫后的豚鼠血清中IgG1水平的测定结果，其中
Figure BDA0003686221160000093
表示N-2-HACC-Al/PEDV，
Figure BDA0003686221160000094
表示IgG1；图6为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠肌注免疫后的豚鼠粪便中sIgA抗体的监测结果，其中
Figure BDA0003686221160000095
表示N-2-HACC-Al/PEDV，
Figure BDA0003686221160000096
表示sIgA。
图7为制备的N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠口服免疫后豚鼠血清中IgG2a的监测结果，其中
Figure BDA0003686221160000097
表示N-2-HACC-Al/PEDV，
Figure BDA0003686221160000098
表示IgG2a；图8为N-2-HACC-AlNPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠口服免疫后豚鼠血清中IgG1水平的测定结果，其中
Figure BDA0003686221160000099
表示N-2-HACC-Al/PEDV，
Figure BDA00036862211600000910
表示IgG1；图9为N-2-HACC-Al NPs负载PEDV灭活疫苗给豚鼠口服免疫后豚鼠粪便中sIgA抗体的监测结果，其中
Figure BDA0003686221160000101
表示N-2-HACC-Al/PEDV，
Figure BDA0003686221160000102
表示sIgA。
肌注或口服接种N-2-HACC-Al/PEDV灭活苗均刺激豚鼠，使得IgG2a水平的升高，说明增强了Th1型免疫反应，IgG1水平的升高，说明增强了Th2型免疫反应，sIgA体液免疫水平的升高，说明增强了黏膜免疫反应。本发明制备的N-2-HACC-Al NPs能引发强烈的Th1/Th2型免疫反应，刺激机体产生强烈的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应，N-2-HACC-Al NPs可作为佐剂使用，具有良好的应用前景。

Claims (8)

1.一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：将可溶性铝盐溶于去离子水，于20℃-50℃持续搅拌9小时，高温120℃灭菌20min；其中可溶性铝盐的质量与去离子水的体积比为(0.2～1)g∶(50～200)mL；
步骤二：将壳聚糖溶于乙酸溶液，调节pH至碱性，抽滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，然后将壳聚糖分散到异丙醇溶液中，逐滴加入2,3环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，滴加完毕后，恒温油浴70-90℃搅拌9-10h，然后冷却至室温，静置1～2h，加入4℃无水乙醇浸泡后抽滤，真空冷冻干燥至恒重，得到取代度可控的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖N-2-HACC；其中制备的N-2-HACC的取代度为30％-90％；
步骤三：将步骤二制备的N-2-HACC溶于乙酸钠缓冲溶液中，搅拌均匀，制得N-2-HACC溶液；
步骤四：将阴离子聚合物溶液加入到N-2-HACC溶液中，以800r/min的速度搅拌均匀，得到混合溶液；阴离子聚合物溶液的浓度为(0.001～2)mg/mL；所述N-2-HACC与阴离子聚合物的质量比为(2～5)g∶(0.01～20)mg；所述阴离子聚合物为羧甲基壳聚糖、透明质酸钠或海藻酸钠；
步骤五：将可溶性铝盐溶液加入到步骤四的混合溶液中，在温度为10℃～70℃条件下，以800r/min的速度搅拌均匀，然后静置孵育，离心弃上清液，去离子水洗涤，加入冻干保护剂，冷冻干燥得到复合纳米粒铝佐剂N-2-HACC-Al NPs。
2.根据权利要求1所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤一所述可溶性铝盐为氯化铝、硫酸铝、醋酸铝、硝酸铝中的一种或任意几种的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤二乙酸溶液中乙酸与去离子水的体积比为(8～10)∶(150～300)。
4.根据权利要求3所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤二中壳聚糖的质量与乙酸溶液中乙酸的体积比为(5～9)g∶(8～10)mL。
5.根据权利要求4所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤三所述乙酸钠缓冲溶液的制备方法为：将乙酸钠溶于去离子水中，并加入冰乙酸调节pH值为酸性，乙酸钠的质量与去离子水的体积比为(1～5)g∶(0.5～2)L，乙酸钠的质量与冰乙酸的体积比为(1～5)g∶(20～200)μL。
6.根据权利要求5所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤五中可溶性铝盐与混合溶液中N-2-HACC的质量比为(4～9)∶(0.5～3)。
7.根据权利要求6所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤五中冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖或N-2-HACC。
8.根据权利要求7所述的一种复合纳米粒铝佐剂的制备方法，其特征在于：步骤五中孵育的时间为0.1-3h，孵育温度为15℃-70℃。
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