CN113274492B

CN113274492B - 一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法

Info

Publication number: CN113274492B
Application number: CN202110558430.5A
Authority: CN
Inventors: 薛长颖; 孙冰冰; 宝航; 梁智慧
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: WO2022242162A1; CN113274492A; US20230241209A1

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合佐剂的制备方法。所述制备方法利用羧基化的羟基氧化纳米颗粒为载体，但不限于载体作用，羧基化方法操作简单方便，与CpG‑ODN新型佐剂复合，从而延长CpG佐剂的半衰期，佐剂的复合显示出协同效应，既增强了其Th2型免疫刺激能力也将赋予其Th1型免疫的可能；另外本发明的佐剂效应验证工艺简单，易于控制，耗时短，为疫苗佐剂的工程化开发及利用提供良好思路。

Description

一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂系统的制备方法，以及其在体内外用于免疫治疗和预防的应用。

背景技术

传染病是人与人、人与动物或动物与动物之间广泛流行的一类疾病，其病症严重、容易在机体间蔓延，并且治疗困难、治疗周期较长，极大地威胁着人类的生命和健康，严重时甚至会引起社会的恐慌，是造成人类死亡的主要原因之一。抗生素疗法作为传染病治疗常用的方法，可以起到有效地治疗作用，但过多使用抗生素也为人体器官及神经带来了极大的损伤，耐药性的产生将使得传染病更加顽固。而疫苗接种是减少传染病死亡率最有效的措施之一，甚至可以在根源上遏制传染病的蔓延，发展至今，为多种传染病的治疗提供了强有力的工具。

本文涉及的疫苗佐剂，又称免疫调节剂或免疫增强剂，作为疫苗的一种添加剂，通过先于抗原或与抗原同时注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答甚至改变免疫反应的类型。到目前为止，已有多种疫苗佐剂被FDA批准用于人用疫苗中。其中，CpG-ODN佐剂是指含有未甲基化胞嘧啶鸟苷序列(CpG)的寡脱氧核苷酸链，该核酸链可被特异性识别并内化到含Toll样受体9的内体囊泡中，促进促炎因子的表达分泌，其作为佐剂，可以诱导抗原递呈细胞激活和成熟，从而促进TH1型免疫应答。然而核酸结构的特殊性，在体内会被快速酶解失活，限制了其免疫佐剂效果，通过对其骨架硫代磷酸酯修饰，可以增加游离态CpG 的半衰期，提高免疫应答，但同时也导致了其特异性结合的降低。近年来的研究发现，若将CpG-ODN与蛋白抗原或微小颗粒复合共递送，将会减少酶解，显示出更强的佐剂效果，但复合颗粒载体的安全性以及复合方式对佐剂效果的影响一直限制其发展。因此，本领域仍然需要在复合颗粒的类型及复合方式等方面深入探究，来制备更加安全高效的复合疫苗佐剂。

铝佐剂作为首个被FDA批准用于人用疫苗的佐剂，主要促进Th2型免疫应答，安全性良好，应用广泛。因此，本发明通过利用Th2型为主的铝盐佐剂作为载体，对其进行羧基改性后与具有氨基修饰的CpG-ODN共递送配制成复合疫苗佐剂，可望增强佐剂效力，从而为工程化疫苗佐剂的开发设计提供理论依据。

发明内容

针对以上基础，本发明提供一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，制备的复合疫苗佐剂颗粒，及其佐剂效果探究验证的方法。

一方面，本发明提供一种基于羟基氧化铝羧基改性的复合疫苗佐剂制备方法，通过对羟基氧化铝纳米表面羧基修饰，并利用具有氨基封端的CpG-ODN与之键合，从而得到复合疫苗佐剂。

另一方面，本发明探究所述复合疫苗佐剂在免疫系统中的安全性及对免疫效应的影响。

本发明提供一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合佐剂制备方法，包括如下步骤为：

1)对羟基氧化铝纳米颗粒进行羧基改性：将羟基氧化铝纳米颗粒分散于去离子水或乙醇中，得到羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液，再加入具有羧基基团或酸酐的硅烷偶联剂，利用具有羧基基团或酸酐的硅烷偶联剂作为前躯体对表面羟基氧化铝纳米颗粒进行表面改性，将该前驱体与羟基氧化铝纳米颗粒共同搅拌，充分反应后洗涤、干燥得到羧基改性的羟基氧化铝纳米颗粒。

2)将上述羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒分散于缓冲液中，得到羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，在搅拌条件下，利用1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (sulfo-NHS)对步骤1)的产物(羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒)活化后，得到羧基活化的羟基氧化铝纳米颗粒，再加入CpG(CpG-ODN)，与具有氨基封端的 CpG-ODN充分反应，洗涤后得到最终复合佐剂产物。

选的情况下，步骤1)中，所述的硅烷偶联剂溶于去离子水或乙醇中，配置前驱体溶液，采用超声处理前驱体溶液一段时间，之后加入羟基氧化铝纳米颗粒悬液搅拌反应。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤1)中，所述的羟基氧化铝纳米颗粒为表面含有羟基基团的铝纳米颗粒或羟基改性的铝纳米颗粒。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤1)中，所述的具有羧基基团或酸酐的硅烷偶联剂为3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤1)中，所述的羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液的浓度为0.1-20mg/mL,优先为1mg/mL；硅烷偶联剂与羟基铝纳米颗粒悬浮液的体积比为0.01-1：100(V/V)，优选为0.01：1000(V/V)。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤1)中，所述的搅拌转速为 300-1000rpm，反应的条件为：先25-35℃搅拌反应30-60min，再100-150℃搅拌反应60-200min。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤2)缓冲液pH值小于或等于7，优选为4-5；且优选sulfo-NHS和EDC同时加入；缓冲液为MES缓冲液。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤2)中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度大于或等于100M, 优选为大于或等于200M，即过量保证充分活化；羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液的浓度为0.1-20mg/mL，优选为5mg/mL；羧基化的铝纳米颗粒与CpG 的质量比为5-100：1，优选为50：1。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤(2)中，羧基活化的羟基氧化铝纳米颗粒与具有氨基封端的CpG序列的5’端或3’端发生偶联反应，得到CpG3’端游离或5’端游离的复合疫苗佐剂。其中羧基活化的羟基氧化铝纳米颗粒与具有 5’氨基封端的CpG发生偶联反应，得到CpG3’端游离的复合疫苗佐剂；羧基活化的羟基氧化铝纳米颗粒与具有3’氨基封端的CpG发生偶联反应，得到CpG5’端游离的复合疫苗佐剂。

对于上述的技术方案，优对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤2)中， CpG-ODN作为细胞免疫Toll样受体9的激动剂，具有强特异性，由于不同序列的CpG-ODN在不同动物体内的作用存在很大的差异，如针对小鼠有强特异性的CpG-ODN(ODN1826)及针对人有强特异性的CpG-ODN(ODN2006)，本方法对包括但不限于上述的CpG-ODN均适合。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤2)中，所述的活化的搅拌转速为500-1000rpm，活化时间为20-40min，活化在室温(一般指25℃)进行。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤2)中，所述的反应温度为25-37℃，反应时间为2.5-5h。

本发明另一方面还提供上述方法制备的复合疫苗佐剂，在体内外用于免疫治疗和预防的应用。

本发明再一方面还提供复合疫苗佐剂在疫苗生产中的应用，所述的疫苗为亚单位疫苗或灭活疫苗，如新型冠状肺炎等疫苗，所述的疫苗制剂以肌肉注射施用；所述的免疫程序为两次免疫，佐剂和抗原先后注射于同一部位

另外，本发明还公开了所述复合疫苗佐剂在免疫系统中的免疫效果探究，所述方法包括但不限于复合佐剂毒性、免疫细胞因子水平分析以及体内免疫效果探究等技术，具体方法如下：

1)复合疫苗佐剂毒性及免疫炎性水平探究：由一系列复合佐剂材料，对小鼠或人源的树突细胞、单核巨噬细胞等刺激一段时间后，利用MTS法对现存细胞活力检测，通过测定特定波长下的吸光值反映出材料对细胞的毒性；同时利用酶联免疫吸附(ELISA)检测其免疫炎性水平及免疫细胞因子水平。

2)体内免疫细胞募集和激活：利用小鼠腹腔注射模型，材料刺激一段时间后，利用PBS缓冲液灌洗并收集腹腔灌洗液，通过流式细胞术探究腹腔液免疫细胞募集情况，同时利用酶联免疫吸附(ELISA)检测腹腔内免疫细胞因子的分泌。

3)长效免疫效果探究：利用小鼠肌肉注射模型，以新冠病毒灭活的S蛋白受体结合结构域亚单位(RBD)为抗原，对小鼠免疫后，收集血清，利用酶联免疫吸附(ELISA)检测其血清特异性抗体水平。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤1)中，刺激时间16h或更久， MTS处理优选50min。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤2)中，材料注射后刺激时间为 6-48h，对照组可以为生理盐水、PBS缓冲液或其他生理活性模拟液。

对于上述的技术方案，优选的情况下，步骤3)中，两次免疫，优选第0初免，第21天加强免疫，二次加强有助于提供更显著效果。

本发明的优点和积极效果为：

本发明利用羧基化的羟基氧化纳米颗粒为载体，但不限于载体作用，羧基化方法操作简单方便，与CpG-ODN新型佐剂复合，从而延长CpG佐剂的半衰期，佐剂的复合显示出协同效应，既增强了其Th2型免疫刺激能力也将赋予其Th1 型免疫的可能；并且提供了多种细胞模型及动物模型对所生产复合佐剂进行全面评估。另外本发明的佐剂效应验证工艺简单，易于控制，耗时短，为疫苗佐剂的工程化开发及利用提供良好思路。

附图说明

图1是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后的透射电镜表征结果，图中依次为原始羟基氧化铝纳米棒(记为AlOOH)、羧基化的羟基氧化铝纳米棒(记为 Al-COOH)、羟基氧化铝与不同末端CpG复合佐剂(记为3’-CpG-free、5’-CpG-free)，图中标尺为200nm；

图2是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后的傅里叶红外表征结果图；

图3是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对不同细胞系活力的影响(其中 A为THP-1细胞系、B为BMDC细胞系)；

图4是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对体外细胞促炎因子水平的影响；

图5是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对体内腹腔液免疫细胞因子水平的影响；

图6是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对体内腹腔免疫细胞募集的影响；

图7是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对小鼠长效免疫抗体滴度的影响(其中A为总IgG抗体滴度水平，B为IgG_2a抗体滴度水平)；

图8是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对CD4⁺T细胞的激活效应(其中A为分泌IFN-γ的细胞点统计，B为分泌IL-4的细胞点统计)。

图9是羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后对记忆T细胞激活的影响。

图10是复合佐剂对CD8⁺T细胞的细胞免疫激活效应比较。

图11是复合佐剂对CD8⁺T细胞的CTL激活效应比较(其中A和B分别为 CTL主要杀伤介质CD107α和FasL的表达水平)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但本发明法的实施方式不限于此。

下述实施例中羟基氧化铝纳米颗粒(AlOOH)的制备方法参见申请号为201811297419.2的中国专利申请。

实施例1

本实施例提供一种羟基氧化铝表面羧基改性的方法，具体步骤如下：

称取20mg羟基氧化铝纳米颗粒(水力学半径约为300nm，zeta电势约40mV)，分散在10mL去离子水中，超声至其分散均匀；量取20uL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐，溶于10mL去离子水并超声5min，充分分散后配置至上述纳米颗粒悬液中，搅拌反应：转速为600rpm,25℃，30min；120℃，90min，将所得的混合溶液用去离子水离心充分洗涤，并在60℃条件下烘干得到最终羧基化后的产物(Al-COOH)，通过透射电镜表征羧基化前后羟基氧化铝纳米颗粒的形貌，结果见图1，羧基化没有改变纳米颗粒形貌特征；通过傅里叶红外光谱表征羧基化前后羟基氧化铝纳米颗粒的主要官能团，结果见图2，羧基化后有碳氧双键吸收峰的出现；通过纳米粒度仪表征水力学半径及zeta电势，结果见表1，表面电荷由于羧基的引入明显变负。

实施例2

本实施例提供一种羧基化羟基氧化铝与CpG-ODN的复合佐剂的制备方法，具体步骤如下：

将实施例1中所得Al-COOH产物5mg悬浮到1mL、pH＝5.0的MES缓冲液中，配制成5mg/mL的纳米颗粒悬液；称取19.2mgEDC及21.7mgsulfo-NHS分别溶于500uL、pH＝5.0的MES缓冲液中，并依次转移至上述纳米颗粒悬液，室温下在600rpm转速下混合活化30min后，10000rpm离心洗涤，重悬于1mL、 pH＝5.0的MES缓冲液中。加入30uLCpG-ODN溶液(CpG-ODN购于Sangon Biotech，质量浓度为0.67mg/mL，溶剂为超纯水)，并在室温下混合反应3h，将所得混合溶液在10000rpm离心洗涤，并重悬于5mL去离子水中，得到复合疫苗佐剂；其中与具有5’氨基封端的CpG复合得到的复合佐剂记为3’-CpG-free，与具有3’氨基封端的CpG复合得到的复合佐剂记为5’-CpG-free，并利用透射电镜表征复合后纳米颗粒的形貌，结果见图1，可以得到化学层面的复合没有改变材料形貌特征；利用傅里叶红外光谱表征复合后铝纳米颗粒的主要官能团，结果见图2，复合后有酰胺键的存在；通过纳米粒度仪表征水力学半径及zeta电势，结果见表1，复合后表面电荷明显变负，粒径没有明显变化。

表1羟基氧化铝纳米棒羧基化及复合前后的水力学半径及Zeta电势表征结果

实施例3

本实施例提供一种对疫苗佐剂毒性评估的方法，具体步骤如下：

预先在96孔板接种THP-1细胞，每孔3万细胞，悬浮于100uLRPMI 1640 (Corning)完全培养基中，接种时使用排枪操作保证每孔细胞数量均匀，37℃、 CO₂恒温培养箱中孵育16h后；利用RPMI 1640完全培养基分别将羟基氧化铝纳米颗粒(AlOOH)、实施例1得到羧基化后的纳米颗粒(Al-COOH)、实施例2 得到的复合后纳米颗粒(3’-CpG-free和5’-CpG-free)四组材料稀释至250、125、 62.5、31.25μg/mL，对上述孔板换液，利用所配置材料继续培养处理，同时设置空白对照组(Ctrl，不含上述四种材料，只有等量的培养基)；24h后，吸出上清，利用100uL含有20％MTS溶液(购于Promega)的RPMI 1640完全培养基继续对底部细胞孵育，40min后收集孵育后的上清液测量其OD₄₉₀，以空白组做对照，得到细胞活力比值，结果见图3A，细胞活力值均保持在100％上下，表明材料安全无毒。

实施例4

本实施例提供一种对疫苗佐剂毒性及免疫炎性水平系统评估的方法，具体步骤如下：

预先在96孔板接种BMDC细胞，每孔3万细胞，悬浮于100uLRPMI 1640 (Corning)完全培养基中，接种时使用排枪操作保证各孔细胞数量均匀，37℃、 CO₂恒温培养箱中孵育16h后；利用RPMI 1640完全培养基分别将羟基氧化铝纳米颗粒(AlOOH)、实施例1得到羧基化后的纳米颗粒(Al-COOH)、实施例2 得到的复合后纳米颗粒(3’-CpG-free和5’-CpG-free)四组佐剂稀释至250、125、62.5、31.25μg/mL，对上述孔板换液，利用所配置材料继续培养处理，同时设置对照组(Ctrl，不含上述四种材料只有等量培养基)；24h后，收集上述96孔板上清液，后续用ELISA的方法测得细胞因子分泌水平探究其免疫激活效应，结果见图4，分别为IFN-γ,IL-12,TNF-α三种细胞因子分泌水平，结果中IFN-γ的分泌表明复合佐剂组有明显Th1极化性，且5’-CpG-free组具有更优效果，表明复合佐剂既增强了Th2型免疫刺激能力(IL-12,TNF-α)，也将赋予其Th1型(IFN-γ) 免疫的可能。

同时用100uL含有20％MTS溶液(购于Promega)的RPMI 1640完全培养基继续对底部细胞孵育，40min后收集孵育后的上清液测其OD₄₉₀，以空白组做对照，得到细胞活力比值，结果见图3B，细胞活力值均大于等于80％上下，表明材料几乎无毒。

实施例5

本实施例提供一种对疫苗佐剂体内免疫效果评估的小鼠腹腔注射模型及实施方式，具体步骤如下：

分别配制1mg/mL(PBS)的上述AlOOH、实施例2得到的3’-CpG-free和 5’-CpG-free佐剂组，以每只500μL的量注入小鼠腹腔，并设置对照组(Ctrl，只注射等量生理盐水)，6h后利用PBS灌洗腹腔液并收集，将收集液4℃、1000rpm， 6min离心，收集上清液利用ELISA法探究免疫细胞因子水平，结果见图5，分别为TNF-α,IL-6,IL-12三种细胞因子，复合佐剂组细胞因子分泌水平显著升高，且5’-CpG-free具有更优效果。

将上述离心后剩余细胞进行红细胞裂解液处理，除去干扰的红细胞，4℃、1000rpm，6min离心并充分洗涤，对细胞分别进行下述抗体标记处理：单核细胞(SSC^low/ ^medCD11b⁺Ly6c⁺)、中性粒细胞(SSChighCD11b⁺Ly6c⁺)、巨噬细胞 (F4/80⁺)、树突细胞(CD11c⁺MHCII⁺)、T细胞(CD45⁺CD3⁺)、B细胞 (CD45RB220⁺))，避光处理30min后PBS充分洗涤，用于流式细胞检测，结果见图6，复合佐剂组，尤其是5’-CpG-free组，有利于更多免疫细胞的募集。

实施例6

本实施例提供一种对疫苗佐剂体内长效免疫效果评估的小鼠肌肉注射模型及实施方式，具体步骤如下：

分别配制5mg/mL(PBS)的上述AlOOH、实施例2得到的3’-CpG-free和 5’-CpG-free佐剂组、60ug/mL新型冠状病毒RBD抗原，以每只50μL的量肌肉注入小鼠，按照Day0、Day21免疫程序分别初免和加强。在加强免疫的21天后收集小鼠血清及脾脏，通过酶联免疫吸附法测定血清特异性抗体IgG、IgG_2a水平，如图7，其中Ctrl组为只注射等量生理盐水，RBD组为只注射等量抗原、不注射材料，S-CpG组作为对照、只注射单一的游离态CpG佐剂，结果表明复合佐剂组能激活更高水平的IgG及IgG_2a抗体滴度，且5’-CpG-free具有更优的免疫效应，表明两种佐剂的复合产生了更有效的协同效应；

将所得脾脏研磨，研磨后取三分之一细胞通过CD4负选试剂盒(Stemcell) 筛选得到CD4⁺T细胞，利用ELISpot法，将分选所得的CD4⁺T细胞用5ug/mL RBD 抗原再刺激36h后，得到分泌IL-4和IFN-γ的细胞点，结果见图8，其中A为分泌IFN-γ的细胞点统计，B为分泌IL-4的细胞点统计，从图中可以看到复合佐剂可以提高细胞免疫效应，且其中5’-CpG-free具有更优的刺激效果；另取三分之一研磨后的细胞用5ug/mL RBD抗原再刺激，72h后通过流式细胞术检测其记忆细胞水平，组别设置与上述相同，结果见图9，结果进一步验证了复合佐剂 5’-CpG-free更优的免疫效应。

实施例7

本实施例提供一种对疫苗佐剂体内长效免疫评估CD8⁺T细胞和CTL激活的实施方式，具体步骤如下：

配制5mg/mL实施例2得到的3’-CpG-free和5’-CpG-free佐剂，分别与40μ g/mL新型冠状病毒RBD抗原吸附后，以每只50μL的量肌肉注入小鼠，按照 Day0、Day21免疫程序分别初免和加强。在加强免疫的7天后收集小鼠脾脏，将所得脾脏研磨，研磨后取三分之一细胞通过CD8负选试剂盒(Stemcell)筛选得到CD8⁺T细胞，利用ELISpot法，取一半分选所得的CD8⁺T细胞用5μg/mL RBD 抗原再刺激36h后，得到分泌IL-4的细胞点，统计细胞点得到结果见图10，其中RBD组为未吸附佐剂，只注射等量抗原作为对照，结果表明5’-CpG-free复合佐剂显著增强分泌IL-4的CD8⁺T细胞增殖。另取剩余一半分选所得的CD8⁺T细胞用5μg/mL RBD抗原再刺激，72h后通过流式细胞术检测其CTL杀伤介质表达，组别设置与上述相同，结果见图11，发现5’-CpG-free可以刺激更高水平的 CD8⁺T细胞表面CTL杀伤介质CD178和CD107α的表达，进一步验证了 5’-CpG-free刺激更优的免疫效应。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将羟基氧化铝纳米颗粒分散于去离子水或乙醇中，得到羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液，再加入具有羧基基团或酸酐的硅烷偶联剂，搅拌反应，得到羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒；

2）将上述羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒分散于缓冲液中，得到羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在搅拌条件下混合活化，得到羧基活化的羟基氧化铝纳米颗粒，之后加入具有氨基封端的CpG，反应得到复合疫苗佐剂。

2.根据权利要求1所述的一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的羟基氧化铝纳米颗粒为表面含有羟基基团的铝纳米颗粒或羟基改性的铝纳米颗粒；所述的具有羧基基团或酸酐的硅烷偶联剂为3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐。

3.根据权利要求1所述的一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液的浓度为0.1-20 mg/mL, 硅烷偶联剂与羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液的体积比为0.01-1：100。

4.根据权利要求1所述的一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的搅拌反应的条件为：先25-35℃搅拌反应30-60min，再100-150℃搅拌反应60-200min。

5.根据权利要求1所述的一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度大于或等于100 M,羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒悬浮液的浓度为0.1-20 mg/mL，羧基化的羟基氧化铝纳米颗粒与CpG的质量比为5-100：1；步骤2）中，所述的缓冲液的pH小于或等于7.0；步骤2）中，羧基活化的羟基氧化铝纳米颗粒与具有氨基封端的CpG序列的5’端或3’端反应，得到CpG3’端游离或5’端游离的复合疫苗佐剂。

6.根据权利要求1所述的一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述的活化的搅拌转速为500-1000 rpm，活化时间为20-40min，活化在室温进行。

7.根据权利要求1所述的一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述的反应温度为25-37℃，反应时间为2.5-5h。

8.权利要求1-7中任意一项所述的方法制备的复合疫苗佐剂。

9.权利要求8所述的复合疫苗佐剂在疫苗生产中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的疫苗为亚单位疫苗或灭活疫苗；所述的疫苗制剂以肌肉注射施用。