CN115645523A - 聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用以及一种免疫制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫技术领域，提供了聚合物脂质杂化纳米粒（PE‑LNP）作为免疫佐剂的应用以及一种免疫制剂。本发明将聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂应用，聚合物脂质杂化纳米粒性质方便调控、质量可控、制备方法简单，且可以和免疫促进剂配合使用，不仅可以促进体液免疫，还可以提高细胞免疫效果，且产生抗体效价的能力及促进细胞免疫的效果皆优于铝佐剂；此外，聚合物脂质杂化纳米粒由两亲性嵌段共聚物和脂质组装形成，所用材料皆具有可生物降解性，且被FDA批准可用于人体，安全性好，毒副作用小。

Description

聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用以及一种免疫 制剂

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用以及一种免疫制剂。

背景技术

免疫佐剂是指预先或与抗原同时注入体内、可增强机体对抗原的应答或改变应答类型的非特异性免疫增强物质。目前，常用的疫苗佐剂为铝佐剂，现有的疫苗用铝佐剂主要有氢氧化铝、磷酸铝、明矾和硫酸铝钾，其中氢氧化铝佐剂由于高吸附能力及其对某些抗原具有较好的吸附性而优于其他铝佐剂，它也是唯一被美国FDA 认证的人用疫苗佐剂。

但是，目前国内外己有数百篇相关铝佐剂不良反应的研究报道，主要包括以下几方面：1、铝佐剂致巨噬细胞肌筋膜炎（MMF）及慢性疲劳，可常年蓄积在注射部位不被代谢。2、铝佐剂的神经系统毒性。近年来关于铝与神经系统疾病的相关性研究越来越多，其中令人注目的是疫苗中的铝佐剂所引起的神经系统毒性作用。3、铝佐剂可能与许多其他疾病如克罗恩病、海湾战争综合征具有相关性。4.铝佐剂只能起到促进体液免疫的效果，对于细胞免疫的激活效应很弱。

因此，目前亟需提供新型的免疫效果好、安全性好的免疫佐剂。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了聚合物脂质杂化纳米粒（PE-LNP）作为免疫佐剂的应用以及一种免疫制剂。本发明将聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂使用，免疫效果好，不仅可以提高体液免疫，还可促进细胞免疫，对于抗病毒感染类的疾病有优势，且材料本身可降解，毒副作用小，安全性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用，所述聚合物脂质杂化纳米粒由聚合物和脂质组装而成；所述聚合物为两亲性嵌段共聚物；所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段和疏水嵌段；所述亲水嵌段为聚乙二醇，所述疏水嵌段包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸和聚ε-癸内酯中的一种或多种。

优选的，所述两亲性嵌段共聚物包括聚(乙二醇)-聚己内酯共聚物、聚(乙二醇)-聚乳酸共聚物、聚(乙二醇)-聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚(乙二醇)-聚ε-癸内酯共聚物中的一种或多种。

优选的，所述亲水嵌段的重均分子量为2K~10K，所述疏水嵌段的重均分子量为2K~20K。

优选的，所述脂质包括阳离子脂质和pH敏感脂质中的一种或多种。

优选的，所述阳离子脂质包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷、乙基磷脂酰胆碱、十二烷基二甲基溴化铵、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、N4-胆固醇-亚精胺和1,2-二醇基氧基-3-二甲基氨基丙烷中的一种或多种；所述pH敏感脂质包括SM-102和D-Lin-MC3-DMA中的一种或多种；所述两亲性嵌段共聚物和脂质的摩尔比为(0.1~1):1。

本发明还提供了一种免疫制剂，包括抗原和免疫佐剂，所述免疫佐剂为上述方案所述应用中的聚合物脂质杂化纳米粒；所述免疫佐剂和所述抗原的质量比为(5~1600):1。

优选的，所述免疫制剂中还包括免疫促进剂；所述免疫促进剂包括TLR3激动剂聚肌胞苷酸poly I:C、TLR7/8激动剂雷西莫特R848和干扰素刺激因子STING激动剂中的一种或多种。

优选的，所述免疫促进剂和所述免疫佐剂的质量比为1:(1~120)。

本发明还提供了上述方案所述免疫制剂的制备方法（不包括免疫促进剂时），包括以下步骤：

将聚合物脂质杂化纳米粒和抗原混合，得到免疫制剂。

本发明还提供了上述方案所述免疫制剂的制备方法（包括免疫促进剂时），包括以下步骤：

将负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒和抗原混合，得到免疫制剂；

当所述免疫促进剂溶于水时，所述负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将免疫促进剂溶于水中，得到免疫促进剂水溶液；将两亲性嵌段共聚物和脂质溶解于有机溶剂中，得到有机相；将所述免疫促进剂水溶液和有机相混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到负载有免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒；

当所述免疫促进剂不溶于水时，所述负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将两亲性嵌段共聚物、脂质和免疫促进剂溶解于有机溶剂中，得到有机相；将有机相和水混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到负载有免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒。

本发明提供了聚合物脂质杂化纳米粒（PE-LNP）作为免疫佐剂的应用，所述聚合物脂质杂化纳米粒由聚合物和脂质组装而成；所述聚合物为两亲性嵌段共聚物；所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段和疏水嵌段；所述亲水嵌段为聚乙二醇，所述疏水嵌段包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸和聚ε-癸内酯中的一种或多种。本发明将聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂应用，聚合物脂质杂化纳米粒性质方便调控、质量可控、制备方法简单，且可以和免疫促进剂配合使用，不仅可以促进体液免疫，还可以提高细胞免疫效果，且产生抗体效价的能力及促进细胞免疫的效果皆优于铝佐剂；此外，聚合物脂质杂化纳米粒由两亲性嵌段共聚物和脂质组装形成，所用材料皆具有可生物降解性，且被FDA批准可用于人体，安全性好，毒副作用小。

附图说明

图1为实施例1中聚合物脂质杂化纳米粒PE-LNP的粒径（A）和Zeta电位（B）测试结果；

图2为聚合物脂质杂化纳米粒PE-LNP的TEM图；

图3为巨噬细胞与BSA或者PE-LNP/BSA(w/w)=600纳米粒共孵育4 h后细胞内FITC呈阳性的细胞百分比；

图4为免疫制剂HBsAg、HBsAg/PE-LNP、HBsAg/PE-LNP/poly I:C的粒径（A）和Zeta电位（B）测试结果；

图5为制剂PE-LNP/BSA (w/w=600)、PE-LNP/poly I:C/BSA (w/w/w=600/25/1)在荧光共聚焦显微镜下巨噬细胞中的细胞内吞情况；

图6为HBsAg/PE-LNP纳米粒以及HBsAg/PE-LNP/poly I:C纳米粒对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性作用测试结果；

图7为不同制剂的溶血作用测试结果；

图8为实施例8中对小鼠进行3次免疫及在不同时间点进行抗体检测的操作流程图；

图9为不同制剂免疫14天时血清中的Anti-HBsAg IgG抗体浓度值；

图10为不同制剂免疫21天时血清中的Anti-HBsAg IgG抗体浓度值；

图11为不同制剂免疫35天时血清中的Anti-HBsAg IgG抗体浓度值；

图12为不同制剂免疫42天时血清中的Anti-HBsAg IgG抗体浓度值；

图13为不同制剂免疫42天时血清中的IgG1浓度；

图14为不同制剂免疫42天时血清中的IgG2a浓度；

图15为不同制剂免疫42天时血清中的IgG2a/IgG1的比值；

图16为不同制剂免疫小鼠三次后，血清中的各种细胞因子含量测试结果；

图17为小鼠免疫三针后，取小鼠脾细胞离体培养，再次经抗原刺激24 h或48 h后的增殖情况；

图18为不同抗原制剂免疫后小鼠的脾细胞离体后再经HBsAg刺激后，产生的可分泌IFN-γ的T细胞的ELISPOT图（A）以及分泌IFN-γ的T细胞数量的定量数据（B）；

图19为不同制剂组免疫小鼠24 h后，小鼠不同器官及注射部位肌肉的HE染色结果；

图20为免疫期间不同组别小鼠的体重变化图；

图21为实施例13制备的聚合物脂质杂化纳米粒的粒径测试结果；

图22为实施例13制备的聚合物脂质杂化纳米粒的Zeta电位测试结果。

具体实施方式

本发明提供了聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用，所述聚合物脂质杂化纳米粒由聚合物和脂质组装而成；所述聚合物为两亲性嵌段共聚物；所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段和疏水嵌段；所述亲水嵌段为聚乙二醇，所述疏水嵌段包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸和聚ε-癸内酯中的一种或多种。

在本发明中，所述亲水嵌段的重均分子量优选为2K~10K，所述疏水嵌段的重均分子量优选为2K~20K。

在本发明中，所述两亲性嵌段共聚物优选包括聚(乙二醇)-聚己内酯共聚物（PEG-PCL）、聚(乙二醇)-聚乳酸共聚物（PEG-PLA）、聚(乙二醇)-聚乳酸-乙醇酸共聚物（PEG-PLGA）和聚(乙二醇)-聚ε-癸内酯共聚物（PEG-PDL）中的一种或多种。在本发明的具体实施例中，所述两亲性嵌段共聚物优选为PEG_5k-PCL_10k、PEG_5k-PLA_12k、PEG_5k-PLGA_12k和PEG_5k-PDL_13k。

本发明对两亲性嵌段共聚物的来源没有特殊要求，采用市售的上述共聚物或者采用本领域技术人员熟知的方法制备均可。

在本发明中，所述脂质优选包括阳离子脂质和pH敏感脂质中的一种或多种；所述阳离子脂质优选包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵（DOTAP）、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷（DOTMA）、乙基磷脂酰胆碱（乙基PC）、十二烷基二甲基溴化铵（DDAB）、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇（DC-胆固醇）、N4-胆固醇-亚精胺（GL67）和1,2-二醇基氧基-3-二甲基氨基丙烷（DODMA）中的一种或多种；所述pH敏感脂质包括D-Lin-MC3-DMA和SM-102中的一种或多种；所述两亲性嵌段共聚物和脂质的摩尔比优选为(0.1~1):1，更优选为(0.3~0.5):1。

本发明还提供了一种免疫制剂，包括抗原和免疫佐剂，所述免疫佐剂为上述方案所述应用中的聚合物脂质杂化纳米粒；所述免疫佐剂和所述抗原的质量比为(5~1600):1，优选为(10~1500):1，更优选为(50~1000):1，进一步优选为(100~800):1，最优选为600:1。

在本发明中，所述免疫制剂的组分优选还包括免疫促进剂；所述免疫促进剂优选包括TLR3激动剂聚肌胞苷酸poly I:C、TLR7/8激动剂雷西莫特R848和干扰素刺激因子STING激动剂中的一种或多种；所述免疫促进剂和所述免疫佐剂的质量比优选为1:(1~120)，更优选为1:(5~100)，进一步优选为1:(20~70)，最优选为1:24。

在本发明中，所述抗原优选为蛋白类抗原，具体可以为蛋白病毒样颗粒VLP抗原或普通蛋白抗原；本发明对所述蛋白类抗原的具体类型没有特殊要求，只要是蛋白类抗原即可，具体可以为乙肝抗原（HBsAg）、人乳头状瘤病毒（HPV）抗原等，在本发明的具体实施例中，所述抗原优选为HBsAg的VLP抗原。

当免疫制剂中不包括免疫促进剂时，所述免疫制剂的制备方法包括以下步骤：

将聚合物脂质杂化纳米粒和抗原混合，得到免疫制剂。

在本发明中，所述聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将两亲性嵌段共聚物和脂质溶解于有机溶剂中，得到有机相；将所述有机相和水混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到聚合物脂质杂化纳米粒；所得产物具体为聚合物脂质杂化纳米粒的水分散液形式，将该水分散液直接和抗原混合即可，在计算聚合物脂质杂化纳米粒的质量时，水分散液中水的质量不计算在内。在本发明中，所述有机溶剂优选为能够和水混溶的低沸点有机溶剂；所述有机溶剂具体优选为四氢呋喃、乙醇和甲醇中的一种或多种；所述有机溶剂和水的体积比优选为1:(1~20)，更优选为1:(1~5)；所述组装优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速优选为100~300 r/min；在搅拌过程中，两亲性嵌段共聚物发生自组装，并将脂质包裹在内部；所述组装优选在室温下进行，所述组装的时间优选为1~10 min。

当免疫制剂中包括免疫促进剂时，所述免疫制剂的制备方法包括以下步骤：

将负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒和抗原混合，得到免疫制剂。

在本发明中，当免疫促进剂可溶于水时，所述负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将免疫促进剂溶于水中，得到免疫促进剂水溶液；将两亲性嵌段共聚物和脂质溶解于有机溶剂中，得到有机相；将所述免疫促进剂水溶液和有机相混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到负载有免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒。

当免疫促进剂不溶于水时，所述负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将两亲性嵌段共聚物、脂质和免疫促进剂共同溶解于有机溶剂中，得到有机相；将有机相与水混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到负载有免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒。

在本发明中，所述有机溶剂的种类优选和上述方案一致；所述有机溶剂和水的体积比优选为1:(1~20)，更优选为1:(1~5)；所述组装的条件和上述方案一致，在此不再赘述。本发明对去除有机溶剂的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可，例如在通风柜中搅拌至有机溶剂完全挥发。

本发明对免疫制剂的使用方法没有特殊要求，按照常规方法进行使用即可，如肌肉注射。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将650 µg PEG_5k-PCL_10k和250 µg DOTAP溶解于0.5 mL THF中，得到有机相；

将所述有机相与1 mL水混合，在25℃下以200 r/min的转速搅拌进行自组装包覆2min后，在通风柜中20℃搅拌8 min，得到聚合物脂质杂化纳米粒，记为PE-LNP。

采用DLS测定PE-LNP的粒径和Zeta电位，所得结果如图1所示，图1中A为粒径测试结果，B为Zeta电位测试结果；根据图1中的结果可以看出，PE-LNP的粒径为53.1±0.168nm，PDI=0.298，表示具有均一的粒径分布，其Zeta电位为+27.9±1.72 mV。

采用TEM检测PE-LNP的形态，所得结果如图2所示。根据图2可以看出，PE-LNP的粒径分布大小在50 nm左右，且分布均一。

实施例2

将HBsAg抗原与实施例1制备的PE-LNP以不同的质量比混合，得到不同的免疫制剂，测试所得制剂的粒径分布、Zeta电位和PDI，测试结果见表1。

表1 不同配比的免疫制剂的粒径分布、Zeta电位和PDI

根据表1中的数据可以看出，HBsAg和PE-LNP混合后所得免疫制剂的粒径和HBsAg相比明显变大，并且HBsAg的Zeta电位为负电位，而共孵育后所得免疫制剂变成了正电位。

实施例3

选取RAW264.7细胞以2×10⁵密度铺板于6孔板上，孵育24 h，将FITC修饰过的BSA与实施例1中制备好的免疫佐剂PE-LNP按照不同质量比混合，然后按照BSA 2 μg/孔的浓度加入，孵育4 h后进行流式检测，测定巨噬细胞内的FITC阳性细胞百分比及胞内的平均荧光强度MFI。

所得结果如表2所示；

表2 不同PE-LNP纳米佐剂与BSA质量比的制剂在巨噬细胞中的细胞内吞情况

图3为巨噬细胞与BSA或者PE-LNP/BSA(w/w)=600纳米粒共孵育4 h后细胞内FITC呈阳性的细胞百分比。

根据表2和图3可以看出，随着PE-LNP/BSA的质量比增加，FITC阳性细胞百分比及胞内的平均荧光强度MFI也逐步增加，到PE-LNP/BSA的质量比为600时，荧光百分比及MFI强度增加基本达到阈值。表明PE-LNP纳米粒可显著增强蛋白药物的细胞内吞，且PE-LNP/BSA(w/w)=600可能为最优配比的疫苗制剂。

实施例4

将650 µg PEG_5k-PCL_10k和250 µg DOTAP溶解于0.5 mL THF中，得到有机相；

将所述有机相与1 mL已溶解37.5 µg poly I:C的水混合，在25℃下以200 r/min的转速搅拌进行自组装包覆2 min后，在通风柜中20℃搅拌8 min，得到负载poly I:C的纳米粒，记为PE-LNP/poly I:C。

将HBsAg抗原和PE-LNP/poly I:C纳米粒按照HBsAg/PE-LNP/poly I:C=1/600/25的质量比混合，得到免疫制剂，记为HBsAg/PE-LNP/poly I:C；通过DLS测试HBsAg/PE-LNP/poly I:C的粒径、Zeta电位和PDI，所得结果如图4和表3所示，同时对HBsAg、PE-LNP、HBsAg/PE-LNP（w/w=1/600）的粒径、Zeta电位和PDI进行测试，以便于对比；图4中A为粒径测试结果，B为Zeta电位测试结果。

表3 不同制剂的粒径、Zeta电位和PDI测试结果

根据表3和图4中的结果可以看出，负载poly I:C后，所得制剂的粒径增加，PDI和Zeta电位降低。

实施例5

选取RAW264.7细胞以2×10⁵密度铺板于共聚焦培养皿上，孵育24 h，将FITC修饰过的BSA与实施例1制备的免疫佐剂PE-LNP按照PE-LNP/BSA(w/w)=600的比例混合，将制备好的制剂按照BSA 2 μg/孔的浓度加入，后用PBS清洗，加入DAPI染色细胞核，再清洗3次后，于荧光共聚焦显微镜下进一步观察荧光强度。

将FITC修饰过的BSA与实施例4制备的PE-LNP/poly I:C按照PE-LNP/BSA=600 (w/w)混合，制备得到PE-LNP/poly I:C/BSA (w/w/w=600/25/1) 纳米粒，并按照相同的方法进行操作，于荧光共聚焦显微镜下观察荧光强度。

所得结果如图5所示。

根据图5可以看出，与BSA组相比，PE-LNP/BSA及PE-LNP/poly I:C/BSA组的细胞内的荧光强度明显增加。表明PE-LNP纳米粒或PE-LNP/poly I:C纳米粒可显著增强蛋白药物的在巨噬细胞中的内吞。

实施例6

选取RAW264.7细胞以1×10⁴密度铺板于96孔板上，孵育24 h，然后将实施例4中制备好的PE-LNP/poly I:C制剂与HBsAg-VLP以HBsAg/PE-LNP/poly I:C=1/600/25的质量比混合，以不同的HBsAg浓度加入孵育24 h后，采用CCK8检测法测定细胞的存活率。

将实施例1制备的PE-LNP和HBsAg-VLP以1:600的质量比混合，按照相同的方法测试细胞存活率。

结果如图6所示。细胞活性实验结果表明，随着HBsAg的浓度增加，对应的HBsAg/PE-LNP/poly I:C/制剂对细胞的毒性增加，当浓度低于2 µg/mL时，细胞存活率在80%以上。HBsAg/PE-LNP组正电荷较高，故毒性相比稍大，但当浓度低于2 µg/mL时，细胞存活率仍在60%以上。

实施例7

采用溶血法研究PE-LNP的生物相容性。将去纤维的绵羊红细胞（RBC）在4 ℃下1500× g离心10分钟，用PBS洗涤3次。用PBS将细胞微球重新悬浮到5%（v/v）的红细胞悬液中。将0.1 mL PE-LNP（900 µg/mL）的加入0.9 mL的RBC悬浮液中，置于离心管中。用去离子水处理红细胞悬液作为阳性对照。37℃孵育1小时后，离心RBC悬浮液，将100 μL上清转移到96孔板上，使用分光荧光仪（GloMax®Discover Microplate Reader, Promega, USA）测量在540 nm处测量吸光度（A）。采用水、PBS以及市售的铝佐剂（Miragen（Al₂O₃），后续实施例中均采用此种Al佐剂，后续不在赘述）作为对照。

相对溶血率按下式计算：

溶血率（%）=（[Abs]_Sample−[Abs]_PBS）/（[Abs]_{DI water}−[Abs]_PBS）×100。

结果如图7所示。根据图7可以看出，PE-LNP的溶血率与市售铝佐剂类似，都低于5%，表明其有良好的生物安全性。

实施例8

免疫实验采用6~8周的SPF级雌性C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为5组（PBS组、HBsAg组、HBsAg/Al（w/w=1/25）组，HBsAg/PE-LNP（w/w=1/600）组，及HBsAg/PE-LNP/poly I:C (w/w/w=1/600/25)组，n=6），在第0、14和28天分别进行初次免疫、第一次加强免疫和第二次加强免疫共计三针。免疫方法采用肌肉注射免疫方式，向每只小鼠两后腿分别肌肉注射50 μL(抗原HBsAg-VLP浓度为20 μg mL^-1)的不同疫苗制剂。除PBS组作为空白对照，其余所有制剂抗原剂量均为2 μg HBsAg/只。并于第14、21、35、42天进行小鼠眼眶取血，第42天取血后，将小鼠处死（操作步骤参考图8）。

采用ELISA试剂盒方法测定小鼠在第14、21、35、42天的血清中抗HBsAg的IgG抗体浓度，并检测第42天小鼠血清中IFN-γ等细胞因子的浓度。抗体浓度见图9~12。

图9~12中的结果表明，初次免疫后第14天，HBsAg/PE-LNP/poly I:C组相比单纯的HBsAg组及HBsAg/Al组，可显著增加抗体浓度（图9）。第一次加强免疫注射后，第21天血清中的HBsAg/PE-LNP及HBsAg/PE-LNP/poly I:C抗体浓度都明显高于HBsAg/Al及HBsAg组（图10）。第二次加强免疫后，第35天血清抗体浓度，HBsAg/PE-LNP及HBsAg/PE-LNP/poly I:C明显高于HBsAg组（图11）。第42天HBsAg/PE-LNP/poly I:C组的抗原浓度仍显著高于HBsAg组（图12）。

同时本实施例还检测了第42天血清中的IgG1及IgG2a的抗原浓度及IgG2a/IgG1的抗原浓度之比，以评价免疫反应是趋于Th1型细胞免疫还是Th2型的体液免疫。结果如图13~15所示，图13为IgG1的浓度测试结果，图14为IgG2a的浓度测试结果，图15为IgG2a/IgG1的抗原浓度之比。结果表明，HBsAg/PE-LNP/poly I:C组的IgG2a/IgG1明显高于其它三组，表明引入poly I:C后，其具有明显的细胞免疫趋势，在清除病毒感染性疾病上更有优势。

IFN-γ作为免疫活性细胞分泌的细胞因子，在诱导抗病毒免疫中起着重要的免疫调理作用，包括激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞和吞噬细胞等，而在疫苗免疫后机体产生IFN-γ的水平实际上反映细胞毒性T淋巴细胞的活动。因此，检测IFN-γ的水平就是间接地检测细胞毒性T淋巴细胞活性。

图16为不同制剂免疫小鼠三次后，第42天时血清中的各种细胞因子含量。根据图16可以看出，HBsAg/PE-LNP及HBsAg/PE-LNP/poly I:C两组的小鼠血清内细胞因子IFN-γ的浓度要明显高于HBsAg组及HBsAg/Al的组，且具有显著性差异，进一步从侧面证明了其具有更高的细胞免疫趋势（图16中的A）。IL-6的表达HBsAg/PE-LNP明显高于HBsAg/Al组（图16中的B），IL-4的表达HBsAg/PE-LNP及HBsAg/PE-LNP/poly I:C组均明显高于HBsAg组（图16中的C）；Gzms-B的表达，HBsAg/PE-LNP/poly I:C组则明显高于HBsAg组及HBsAg/Al组（图16中的D）。以上结果表明，PE-LNP及其引入poly I:C后作为免疫佐剂可有效促进与细胞免疫相关的细胞因子IFN-γ及Gzms-B的分泌，表明PE-LNP/poly I:C相比铝佐剂等可提高细胞免疫；且PE-LNP相比铝佐剂及单纯抗原组具有更加明显的促IL-4及IL-6的分泌作用，而此两种细胞因子可刺激B细胞成熟及分化，同时表明PE-LNP在促进体液免疫方面也具有优势，此结果与本实施例中的图9~图15的结果相呼应。

实施例9

将实施例8中各组免疫42天的小鼠脱颈处死后，浸泡在75%乙醇中1 min，在无菌条件下，将小鼠右侧卧置于培养皿中，采用灭菌的剪刀和镊子取出小鼠脾脏，将取出的脾脏置于提前加入少许RPMI 1640培养基的200目细胞筛上，采用无菌注射器针芯将脾脏研磨成单细胞悬液，加入15 mL培养基，小心将培养皿中的细胞悬液倒入提前标号的无菌离心管（50mL）中，再用5 mL培养基冲洗细胞筛和培养皿，离心（500 g，5 min）。倾倒上清，保留细胞沉淀（此时为红色），向各个离心管中加入1 mL无菌红细胞裂解液，用移液器吹打重悬细胞，再补足至3 mL，静置4 min充分裂解红细胞。加入10 mL培养基混匀终止裂解，离心（500 g，5min）。倾倒上清，保留细胞沉淀（此时为白色），加入1 mL培养基用移液器吹打重悬细胞，再补足至15 mL混匀，离心（500 g，5 min）洗去可能残留的红细胞裂解液。倾倒上清，加入1 mLRPMI1640完全培养基（含10% FBS和1%双抗），用移液器吹打重悬细胞。按2×10⁵的浓度将脾细胞悬液接种到96孔板中，加入HBsAg、HBsAg/Al（w/w=1/25）、HBsAg/PE-LNP（w/w=1/600）、HBsAg/PE-LNP/poly I:C (w/w/w=1/600/25)，HBsAg 加入量均控制为5 µg mL^-1，分别刺激24 h及48 h，采用CCK8检测细胞增殖情况。

结果如图17所示。根据图17可以看出，不论24 h或48 h，经HBsAg/PE-LNP、HBsAg/PE-LNP/poly I:C组刺激的小鼠脾细胞增殖明显高于HBsAg组。HBsAg/PE-LNP/poly I:C刺激48 h也明显高于HBsAg/Al刺激增殖情况。结果进一步表明，PE-LNP作为免疫佐剂更能促进小鼠的免疫细胞增殖。

实施例10

按照实施例9的方法取小鼠脾细胞，按2×10⁵的浓度将脾细胞悬液接种到96孔板中，按照ELISpot Kit检测可分泌IFN-γ的T细胞。结果见图18，图18中A为用不同抗原制剂的刺激下诱导产生的IFN-γ的T细胞的ELISpot图，B为分泌IFN-γ的T细胞定量数据。

图18中的结果表明，HBsAg/PE-LNP、HBsAg/PE-LNP/poly I:C组可显著的增加能分泌IFN-γ的T细胞数量。

实施例11

免疫实验采用6~8周的SPF级雌性C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为5组（PBS组、HBsAg组、HBsAg/Al（w/w=1/25）组，HBsAg/PE-LNP（w/w=1/600）组，及HBsAg/PE-LNP/poly I:C (w/w/w=1/600/25)组，n=6），在第0、14和28天进行免疫。免疫方法采用肌肉注射免疫方式，向每只小鼠两后腿分别肌肉注射50 μL （抗原HBsAg-VLP浓度为20 μg mL^-1）的不同疫苗制剂。除PBS组作为空白对照，其余所有制剂抗原剂量均为2 μg HBsAg/只，注射24 h后处死小鼠，取重要脏器及注射部位的肌肉做HE染色切片，观察各制剂是否具有急性细胞毒性。结果如图19所示，图19中的结果表明，各免疫制剂未表现出明显的细胞急性毒性。

实施例12

免疫实验采用6~8周的SPF级雌性C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为5组（PBS组、HBsAg组、HBsAg/Al（w/w=1/25）组，HBsAg/PE-LNP（w/w=1/600）组，及HBsAg/PE-LNP/poly I:C (w/w/w=1/600/25)组，n=6），在第0、14和28天进行免疫。免疫方法采用肌肉注射免疫方式。除PBS组作为空白对照，其余所有制剂抗原剂量均为2 μg HBsAg/只，整个小鼠免疫期间，每3天测量一下小鼠体重。结果如图20所示。图20中的结果表明，不同制剂的小鼠体重与PBS组相差不大，表明各制剂均具有良好的生物安全性。

以上实施例结果表明，本发明采用聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂，相比现有的铝佐剂，制备更加简单，性质方便调控，还可添加免疫促进剂如poly I:C，在保持良好的生物安全性的同时，具有更高的刺激体液免疫的效果，可诱导产生更高的抗体滴度浓度，同时也能促进细胞免疫，相比铝佐剂更具优势。

实施例13

将650 µg PEG_5k-PLGA_10k和250 µg DOTAP溶解于0.5 mL THF中，得到有机相；

将所述有机相与1 mL水混合，在25℃下以200 r/min的转速搅拌进行自组装包覆2min后，在通风柜中20℃搅拌8 min，得到聚合物脂质杂化纳米粒。

采用DLS测定其粒径和Zeta电位，所得结果如图21~图22所示，图21为粒径测试结果，粒径为95.25±0.138 nm，PDI=0.276；图22为Zeta电位测试结果，其Zeta电位为+26.5±1.22 mV。

此结果表明，不同的聚合物同样可以构成粒径均一且带正电的聚合物脂质杂化纳米粒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用，其特征在于，所述聚合物脂质杂化纳米粒由聚合物和脂质组装而成；所述聚合物为两亲性嵌段共聚物；所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段和疏水嵌段；所述亲水嵌段为聚乙二醇，所述疏水嵌段包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸和聚ε-癸内酯中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物包括聚(乙二醇)-聚己内酯共聚物、聚(乙二醇)-聚乳酸共聚物、聚(乙二醇)-聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚(乙二醇)-聚ε-癸内酯共聚物中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述亲水嵌段的重均分子量为2K~10K，所述疏水嵌段的重均分子量为2K~20K。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂质包括阳离子脂质和pH敏感脂质中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阳离子脂质包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷、乙基磷脂酰胆碱、十二烷基二甲基溴化铵、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、N4-胆固醇-亚精胺和1,2-二醇基氧基-3-二甲基氨基丙烷中的一种或多种；所述pH敏感脂质包括SM-102和D-Lin-MC3-DMA中的一种或多种；所述两亲性嵌段共聚物和脂质的摩尔比为(0.1~1):1。

6.一种免疫制剂，其特征在于，包括抗原和免疫佐剂，所述免疫佐剂为权利要求1~5任意一项所述应用中的聚合物脂质杂化纳米粒；所述免疫佐剂和所述抗原的质量比为(5~1600):1。

7.根据权利要求6所述的免疫制剂，其特征在于，还包括免疫促进剂；所述免疫促进剂包括TLR3激动剂聚肌胞苷酸poly I:C、TLR7/8激动剂雷西莫特R848和干扰素刺激因子STING激动剂中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的免疫制剂，其特征在于，所述免疫促进剂和所述免疫佐剂的质量比为1:(1~120)。

9.权利要求6所述免疫制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将聚合物脂质杂化纳米粒和抗原混合，得到免疫制剂。

10.权利要求7或8所述免疫制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒和抗原混合，得到免疫制剂；

当所述免疫促进剂溶于水时，所述负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将免疫促进剂溶于水中，得到免疫促进剂水溶液；将两亲性嵌段共聚物和脂质溶解于有机溶剂中，得到有机相；将所述免疫促进剂水溶液和有机相混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到负载有免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒；

当所述免疫促进剂不溶于水时，所述负载免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒的制备方法包括以下步骤：将两亲性嵌段共聚物、脂质和免疫促进剂溶解于有机溶剂中，得到有机相；将有机相和水混合进行组装，然后去除有机溶剂，得到负载有免疫促进剂的聚合物脂质杂化纳米粒。

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