CN108601825A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于预防和治疗寨卡病毒感染的疫苗组合物、制备和生产此类组合物的方法，所述疫苗组合物包含呈免疫原性组合物的寨卡病毒抗原，以及寨卡抗原与一种或更多种虫媒病毒抗原诸如基孔肯亚病毒抗原(Chikungunya virus)和日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)抗原的组合，此类组合物用于作为疫苗用于在哺乳动物中引发针对以上提及的病原体的免疫应答使用。

Description

疫苗组合物
发明领域
本发明公开了包含寨卡病毒抗原的疫苗组合物，用于预防和治疗哺乳动物中的寨卡病毒感染。本发明还公开了稳定的疫苗组合物，所述稳定的疫苗组合物包含寨卡病毒抗原与一种或更多种虫媒病毒抗原诸如基孔肯亚病毒和/或日本脑炎病毒抗原。本发明还涉及用于在哺乳动物中同时引发以上提及的病原体的每一种的免疫应答并且适于免疫人类受试者的稳定的疫苗组合物的制备(preparation)、配制(formulation)和使用方法。
发明背景
目前世界上尚不存在用于预防或治疗寨卡病毒感染可用的疫苗。因此，不存在与本申请公开的发明相关的现有技术。然而，为了总体理解本发明背后的背景和目的，下文将在以下段落中讨论本发明。
本专利申请的发明人预期了寨卡病毒在具有传播病毒的伊蚊属(Aedes)蚊，特别地埃及伊蚊(Aedes aegypti)的高流行的区域中的流行性潜力。早在2015年12月在寨卡病毒感染与吉兰-巴雷综合征(Guillain Barre Syndrome)和与小头畸型的因果联系成为公共知识之前的几个月，对启动寨卡疫苗项目的兴趣在于世界上任何国家均没有准备，当时也不存在开发疫苗来阻止病毒在诸如巴西的国家的进行中的病毒传播，并且阻止在有寨卡病毒风险的国家中的进一步传播的由任何人启动的措施。往来于具有进行中的病毒传播的区域的增加的国际旅行加强在具有伊蚊属蚊，特别地埃及伊蚊的高流行的国家以及具有迄今未暴露于病毒的大量未被感染群体的那些国家中启动爆发的主要风险。在早期(early stages)的寨卡病毒感染的特征性高热、斑状丘疹和关节痛的临床表现与基孔肯亚病毒和登革热病毒感染的早发(early onset)症状惊人地相似，这使鉴别诊断特别具有挑战性。
寨卡病毒疫苗项目是在有关病毒发病机理、遗传多样性、传播、诊断、血清学相关保护或检测疫苗概念的动物模型的信息很少或根本没有的情况下启动的。从疫苗的角度来看，没有关于病毒是否可以在细胞基质中体外培养，以及如果能够在体外培养，哪种细胞基质是最适合的、细胞适应机制、潜在的病毒滴度以及制造用于人类施用的疫苗产品的可行性的信息，因为当时公布的信息涉及在小鼠脑中将病毒传代，这不适于疫苗生产。BharatBiotech于2014年年末启动开始寨卡疫苗项目的步骤，并且于此后不久开始实验工作，产生该专利申请。
虫媒病毒(节肢动物传播(arthropod-borne))感染是由节肢动物诸如蚊子传播的病毒引起的。它们引起显著的人类疾患，范围从轻度、无症状感染至可能致命的急性脑炎或出血热。引起人类疾患的最显著的虫媒病毒属于三个病毒科，披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)。虫媒病毒感染在发展中国家非常猖獗，并且特别地在老年群体中引起严重的发病率。除其他以外，由登革热病毒、基孔肯亚病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒和西尼罗河病毒(West Nile viruses)引起的虫媒病毒感染的共同特性特征(characteristic feature)是在病毒感染的急性期期间发热、头痛、肌痛、伴随肿胀的关节疼痛和斑状丘疹。特别地，关节痛是基孔肯亚病毒、登革热病毒和寨卡病毒发热的特性特征。共同感染是常见的，因为虫媒病毒在很大程度上共有相同的蚊载体(mosquito vector)，诸如例如由伊蚊属蚊传播的登革热病毒、基孔肯亚病毒和寨卡病毒。日本脑炎病毒和西尼罗河病毒主要通过库蚊属(Culex)蚊传播。在蚊载体防治项目已经无效的且在很大程度上不成功的发展中国家，该问题是严重的。以下事实让这个问题更复杂：不存在可用于确信地诊断引起疾病的病毒的稳健的诊断方法。国际旅行已经有助于广泛传播这些感染原(infectious agent)，并且迄今仅限于热带国家的疾病如登革热和基孔肯亚热(Chikungunya)现在在地理上被传播至新的地区和温带区域。据报道，寨卡病毒在过去两年已传播至超过65个国家。在这些区域的少数国家中报道的本土流行性暴发是由蚊载体的当地群体维持的。
寨卡病毒(ZIKV)是一种新出现的人畜共患的虫媒病毒，属于黄病毒科。如登革热病毒和基孔肯亚病毒一样，寨卡病毒也可以通过伊蚊属蚊传播，更特别地具叉伊蚊(A.furcifer)、泰勒伊蚊(A.taylori)、A.luteocephalus、非洲伊蚊(A.africanus)、白纹伊蚊(A.albopictus)并且主要通过埃及伊蚊(A.aegypti)传播。对最近报道流行的国家诸如波利尼西亚进行旅行旅游(travel tourism)已经有助于在地理上将病毒感染传播至巴西、哥伦比亚、意大利及其他国家。报道了在意大利由地方性伊蚊属蚊引起的本土病毒爆发。在亚洲，寨卡病毒感染已经在柬埔寨、泰国、印度尼西亚、马来西亚和孟加拉零星地发生，尽管在这些区域尚未报道过大规模的流行性暴发。
基孔肯亚病毒(CHIKV)是披膜病毒科的甲病毒属(Alphavirus)。该病毒引起自限性发热感染，以高热、头痛、肌痛、关节痛、关节肿胀、斑状丘疹的急性发作为特征。在更近期的流行中报道了严重的症状，诸如出血(hemorrhagia)、急性肝炎和神经系统症状。基孔肯亚病毒是由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的。日本脑炎病毒(JEV)也是黄病毒科的黄病毒属(flavivirus)，并且主要由库蚊属蚊传播。JEV与登革热病毒、黄热病病毒、寨卡病毒和西尼罗河病毒相关。JEV感染在很大程度上是无症状的，但通常它引起伴随发热、头痛和其他流感样症状的不适。罕见地，临床感染进展为脑炎，伴随癫痫发作、痉挛性瘫痪、昏迷和死亡。儿童是特别地易感的。在流行JEV的国家，大部分成年人在儿童感染之后具有天然免疫。在童年时期期间未暴露于感染的成年人在任何年龄均是易感的。在JEV引起的脑炎的致死率(case-fatality rate)可以高达30％。神经系统并发症或精神病学后遗症在患脑炎的病例中以高比例发生。全球约有30亿人处于JEV感染风险。用于预防JEV感染的几种疫苗已经成功商业化。登革热病毒(DENV)是黄病毒科的成员。虫媒病毒感染可以不再被认为是区域特定的，因为它们现在在地理上广泛传播，并且在世界许多地方都是重大的公共健康问题。由前面提及的虫媒病毒感染引起的发病率通常是高的，并且特别地关节痛不利地影响患者的身体活动性。寨卡病毒在妊娠中的感染期间引起更严重的先天性出生畸形，并且寨卡相关的吉兰-巴雷综合征已经在进行中的流行中被证实。如任何其他病毒感染一样，无可用的特定疗法。预防性疫苗接种可以有效地阻断寨卡病毒的传播，并且疫苗将是寨卡病毒疾病的第一道防线。
出于这种考虑，开发了防止寨卡病毒的进一步传播的一项有效的策略，来保护正在进行中的流行性的国家、以及目前尚未报道过活跃寨卡病毒传播的国家中的未被感染的群体。用于虫媒病毒感染的组合疫苗是保护脆弱人群免受由登革热病毒、基孔肯亚病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒引起的令人虚弱的疾患的良好策略。针对JEV、黄热病病毒的疫苗和针对登革热血清型的疫苗已经商业化，并且针对西尼罗河病毒和CHIKV的疫苗正在临床开发中。目前尚未存在用于寨卡病毒感染的疫苗，并且本发明公开了用于开发第一种候选寨卡疫苗的方法。
然而，包含在此类疫苗试剂盒中的抗原的选择取决于几个因素。由登革热血清型引起的病毒的抗体依赖性增强以及黄病毒属抗体的交叉反应性被充分研究和公布。但不清楚的是，在寨卡病毒感染的同一群体中是否将存在流行的基孔肯亚抗体的此类干扰或交叉反应性。相似地，针对日本脑炎病毒的抗体是否可以在发展针对寨卡病毒的免疫中引起抗原性干扰也是未知的，并且研究该问题是一个有趣的想法。所提出的工作还提供了由针对候选寨卡疫苗的流行的JE和CHIKV抗体引起的任何可能的免疫干扰的见解。
在本发明中，已经开发了候选寨卡病毒疫苗，并且测试多种制剂引发适当水平的免疫应答来保护免受寨卡病毒疾病的效力。由于当日本脑炎病毒疫苗和基孔肯亚病毒疫苗被共同施用或组合作为组合疫苗时，对寨卡诱导的免疫应答不存在显著的抗原性干扰，制剂在引发高水平的能够赋予针对每一种病毒的保护的中和抗体方面是有效的。
发明目的
本发明的一个目的是提供用于预防和治疗寨卡病毒感染的稳定的免疫原性组合物。
本发明的另一个目的是提供使寨卡病毒在Vero细胞中适应和生长的方法。
本发明的另一个目的是提供用于制备灭活寨卡病毒疫苗和纯化寨卡病毒主体(bulk)抗原的方法。
本发明的又一个目的是提供用于通过用福尔马林、β丙内酯和过氧化氢的化学手段(means)进行寨卡病毒灭活的方法。
本发明的又另一个目的是提供用于通过物理手段诸如热、γ辐照和紫外线进行寨卡病毒灭活的方法。
本发明的又另一个目的是提供用于制备和配制包含prME蛋白的重组寨卡病毒抗原的方法以及测试其在动物中的免疫原性的方法。
本发明的另外的目的是提供用不同佐剂配制寨卡病毒抗原的方法以及估计在动物中针对制剂的免疫应答的方法。
本发明的又另一个目的是提供在动物中针对单个剂量、两个剂量和三个剂量的福尔马林和BPL灭活寨卡病毒疫苗的免疫应答动力学。
本发明的又一个目的是提供用于预防寨卡病毒感染和基孔肯亚病毒感染的免疫原性组合物。
本发明的又另一个目的是提供用于预防寨卡病毒感染、基孔肯亚病毒感染和日本脑炎病毒感染的免疫原性组合物。
发明概述
●本发明涉及疫苗制剂(vaccine formulations)的组合物及制造方法，所述疫苗制剂用于预防和治疗寨卡病毒感染以及由其他虫媒病毒诸如基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒引起的感染。
●在一个方面，本发明涉及疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防和治疗寨卡病毒感染，其中所述组合物包含呈免疫原性组合物的寨卡病毒抗原，并且还可以包含一种或更多种虫媒病毒抗原，诸如基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒抗原，以及合适的佐剂和赋形剂。
●在另一个方面，本发明涉及一种通过包括以下的过程获得疫苗制剂的方法：
(a)使用Vero细胞系作为用于寨卡病毒培养的细胞基质
(b)将寨卡病毒培养按比例放大到10L的收获体积
(c)灭活病毒培养物
(d)纯化病毒培养物
(e)在另一方面，重组克隆和表达寨卡病毒pRME蛋白。
●在本发明的一个实施方案中，Vero细胞系被用作用于寨卡病毒培养的细胞基质，并且在具有或不具有血清使用的情况下在培养基中生长。
●在本发明的另一个实施方案中，通过在Vero细胞中重复连续传代来使寨卡病毒适应以获得更高滴度。
●在本发明的另一个实施方案中，寨卡病毒在C6/36白纹伊蚊细胞中传代，随后在Vero细胞中生长以增加滴度。
●在本发明的另一个实施方案中，公开了用于按比例放大病毒培养物和进一步纯化按比例放大的病毒培养物的过程，其中收获体积是约8-10L。使用多种方法使病毒收获物灭活。然后纯化病毒。
●在本发明的另一个实施方案中，在存在或不存在病毒稳定剂和氨基酸的情况下，灭活方法选自福尔马林灭活、β丙内酯(BPL)灭活、热灭活、UV灭活、γ灭活的组。
●在本发明的优选的实施方案中，氨基酸单独或组合选自L-组氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸和L-天冬氨酸和L-谷氨酰胺以及人血清白蛋白的组。
●在本发明的另一个优选的实施方案中，纯化方法通过以下来选择：使用cellufine sulphate，DEAE-Sephadex，具有盐梯度的CM-sephadex，通过在Captocore-700、Sepharose CL-4B、陶瓷羟磷灰石柱上以0.2M至0.8M磷酸盐梯度进行凝胶过滤随后渗滤，和在20％-60％蔗糖梯度上超速离心，最优选地通过Capto core 700柱。
●本发明的另一个实施方案涉及寨卡病毒prME蛋白的重组克隆和表达。重组克隆的方法利用表达盒与克隆插入物的位点特异性转座到在大肠杆菌(E.coli)中繁殖并在昆虫细胞中表达的杆状病毒(baculovirus)穿梭载体。
●在本发明的另一个实施方案中，提供了疫苗制剂。疫苗可以包含选自寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的一种或更多种虫媒病毒抗原。
●在另一个实施方案中，佐剂可以选自以下的组：铝盐，菊粉，algammulin，菊粉和氢氧化铝的组合，单磷酰脂质A(MPL)，雷西莫特(resiquimod)，胞壁酰二肽(MDP)，N-羟乙酰基二肽(GMDP)，聚IC，CpG寡核苷酸，雷西莫特，氢氧化铝与MPL，任何油包水乳液，包含以下成分中的一种或更多种的任何水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇，或其分子的任何类似物和衍生物，或磷酸钙或佐剂的任何组合。
●在本发明的另一个实施方案中，制剂用赋形剂和防腐剂制备。
●在本发明的另一个实施方案中，疫苗制剂中的稳定剂单独使用或与山梨糖醇、L-甘氨酸、甘露糖醇、L-谷氨酸和人血清白蛋白以各种浓度组合使用。
●在本发明的另一个实施方案中，已经在动物模型中测试了疫苗制剂的效力，显示在宽范围剂量免受病毒血症的完全保护。
●在本发明的另一个实施方案中，组合疫苗制剂也在提供针对日本脑炎以及基孔肯亚病毒的足够保护方面是有效的。
●在本发明的另一个实施方案中，抗血清在兔中赋予针对寨卡病毒感染的被动免疫以提供针对病毒血症的完全保护，而在对照动物中检测到在病毒攻击之后持续多达6天的病毒血症。
●在本发明的另一个实施方案中，候选灭活寨卡病毒疫苗可以通过肌内途径作为单个剂量或以两个剂量或更多个剂量施用。
●在本发明的另一个实施方案中，进行用于中和抗体滴度的测定以检查针对本发明的疫苗制剂的抗体水平，所述疫苗制剂显示出引发高水平的中和抗体。
●在本发明的另一个实施方案中，交叉中和研究显示，本发明的灭活疫苗制剂针对任何寨卡病毒毒株将同样是保护性的和有效的。
●在本发明的另一个优选的实施方案中，BPL灭活的寨卡疫苗制剂和福尔马林灭活的寨卡疫苗制剂两者的抗体滴度均高于具有氢氧化铝的与单独的抗原的。
●在本发明的另一个实施方案中，通过抗体亲合力测定针对本发明的疫苗制剂的抗体应答的质量表明高亲和力抗体通过加强剂量随着时间推移而发生。
因此，本发明提供了一种稳定的疫苗组合物，所述稳定的疫苗组合物包含选自寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的一种或更多种虫媒病毒抗原，所述抗原在具有或不具有佐剂的情况下被配制在药学上可接受的缓冲液中，其中所述疫苗组合物在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答。组合物的寨卡病毒抗原对于治疗、诊断和预防针对寨卡病毒的任何基因型/基因型变体/毒株有效，其中组合物针对在基因组的任何区域中的氨基酸水平共有50％至100％之间任何数值的同一性的任何基因型/基因型变体/毒株/合成寨卡病毒有效。本发明的组合物包含任何基因型/基因型变体/毒株/合成寨卡病毒的寨卡病毒抗原，其中针对任何前面提及的寨卡病毒类型的抗体交叉中和同源病毒或在其全基因组的任何区域，特别地包膜E蛋白中共有至少50％-100％氨基酸同一性的任何异源寨卡病毒毒株。
组合物的寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的抗原是灭活全病毒体(病毒)抗原。而寨卡病毒抗原和基孔肯亚病毒抗原是纯化的重组抗原。
本发明的寨卡病毒抗原使用Vero细胞作为细胞基质通过使病毒适应于Vero细胞来制备。
本发明的组合物的寨卡病毒抗原是从选自以下的一种或更多种方法获得的纯化的且浓缩的抗原：
a.超速离心；
b.密度梯度离心；
c.使用膜过滤澄清病毒收获物，随后通过柱层析纯化；和
d.使用具有从100kDa至300kDa的截止值的膜的切向流动过滤(tangential flowfiltration)，其中切向过滤在病毒灭活之前或之后进行。
其中通过柱层析的纯化包括凝胶过滤、混合模式树脂柱层析、离子交换柱层析、亲和基质层析和疏水相互作用层析。柱层析在流通液(flow through)中洗脱大部分病毒抗原，柱层析诸如Capto Core 700，最优选地Capto Core 700，其中病毒样品在Capto Core700柱上纯化，并且在流通液中洗脱。
组合物的寨卡病毒通过化学灭活剂、物理灭活剂和辐照剂中的至少一种或更多种灭活，其中寨卡病毒的灭活在病毒纯化之前或之后进行。在示例性实施方案中，寨卡病毒通过选自福尔马林(甲醛)、β丙内酯(BPL)和过氧化氢的化学灭活剂灭活。
在一个优选的实施方案中，寨卡病毒通过选自以下的以下方法的任何一种灭活：
a.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在8℃至37℃，优选地25℃±3℃，持续至少1天至7天的福尔马林处理；
b.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少10天至30天的福尔马林处理；
c.以范围从1:500至多达1:4000v/v BPL:病毒的任何浓度，在范围从8℃至30℃的温度持续至少24小时至48小时，优选地25℃±3℃持续48小时的β丙内酯(从此以后称为BPL)；
d.以范围从1:500至多达1:4000(BPL:病毒，v/v)的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少3-7天的β丙内酯；
e.在任何前面提及的条件的BPL和福尔马林的组合，优选地在15℃至30℃，优选地25℃±3℃以1:3000(BPL:病毒，v/v)持续24小时的BPL灭活，随后是以1:3000(福尔马林:病毒，v/v)持续24小时至48小时的福尔马林灭活；
f.以从0.1％至3％，优选地0.1％至1％的任何浓度在从20℃-30℃的任何温度持续5分钟至120分钟的过氧化氢。
在一个实施方案中，寨卡病毒通过辐照剂的灭活包括通过暴露于来自60Co源的从20kGy(千戈瑞)至多达35kGy，优选地25kGy至30kGy通过γ辐照的灭活。
在另一个实施方案中，寨卡病毒通过辐照剂的灭活包括通过暴露于254nm持续30-60分钟通过UV辐照的灭活。
在另外的实施方案中，病毒通过在50℃至65℃之间的温度持续30min至多达2小时的热处理来灭活。
本发明中使用的缓冲液可以选自包括以下的列表：磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、含甘氨酸或组氨酸作为缓冲剂之一的缓冲液，其中磷酸盐缓冲液是在6.50至pH9之间的任何pH的5mM至多达200mM浓度的磷酸根离子和任选地包含在50mM至200mM浓度的氯化钠的磷酸钠缓冲液。缓冲液在从病毒培养至制备纯化的灭活病毒主体的整个生物过程中将液体组合物的pH维持高于pH 6.5，优选地高于pH 7.0。
在一个实施方案中，寨卡病毒的灭活在选自以下的稳定剂的存在下进行：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、异麦芽糖、棉子糖、水苏糖、乳二糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖酸、右旋糖酐、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和人血清白蛋白或其组合。然而，在一个优选的实施方案中，稳定剂可以选自：
a.2％山梨糖醇和1％L-甘氨酸；
b.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸；
c.1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸；
d.1％甘露糖醇和0.5％L-谷氨酸；以及
e.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸，1％人血清白蛋白。
在示例性实施方案中，寨卡病毒的灭活包括任何基因型/毒株、活的减毒寨卡病毒、去活化病毒、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中、在载体化疫苗中携带任何寨卡病毒抗原特别是E蛋白的嵌合病毒颗粒、和使用任何寨卡病毒基因组的序列在体外或体内衍生的感染性合成病毒颗粒的灭活。
本发明的纯化的重组寨卡病毒包含寨卡病毒的抗原作为疫苗抗原用于引发免疫应答以用于预防寨卡病毒感染，所述寨卡病毒的抗原包含包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和任选地非结构1(NS1)蛋白，其中所述寨卡病毒具有如在分别对应于SEQ ID.No.1和SEQ ID No.2的SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4中公开的核苷酸序列的结构蛋白序列，用于作为针对由基因型或其变体引起的寨卡病毒感染的疫苗抗原使用。重组DNA构建体包含(i)载体(ii)对应于分别编码SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的蛋白的氨基酸序列的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的至少一种核酸片段，其适用于与前面提及的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4共有至少70％氨基酸同一性的任何寨卡病毒蛋白序列。本发明的组合物包含重组DNA构建体，其中载体是被克隆到真核宿主中的真核质粒载体，诸如用于在昆虫细胞中表达为病毒样颗粒(VLP)的杆状病毒。
寨卡病毒的重组蛋白通过包括以下步骤的过程获得：
a.将重组质粒DNA转染到昆虫细胞中；
b.收获细胞并且从中分离重组蛋白；
c.通过选自以下的方法纯化蛋白：离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水柱层析、混合模式树脂层析、渗滤、超速离心、密度梯度离心和用盐分级分离。
寨卡病毒的结构抗原在任何原核或真核表达系统中表达，包括在昆虫细胞中的杆状病毒介导的表达。
本发明的组合物通过这样的过程获得，其中中和抗体主要针对以下中的包膜蛋白被引发：诸如在最佳灭活病毒、活的减毒病毒、去活化病毒、DNA疫苗、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中诸如在载体化疫苗中展示所述寨卡病毒E蛋白的嵌合病毒颗粒和来源于任何寨卡病毒基因组RNA序列的合成病毒颗粒中。
本发明的疫苗组合物还可以包含佐剂，其中所述佐剂选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的任何水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。在一个优选的实施方案中，组合物包含0.1mg至1.5mg铝/疫苗剂量，优选地0.25mg至0.5mg铝/疫苗剂量的浓度范围内的氢氧化铝。
当在哺乳动物中施用时，本发明的组合物的佐剂赋予粘膜免疫和全身免疫。
具有寨卡病毒抗原的疫苗组合物在具有或不具有佐剂的情况下以从0.125μg/剂至100μg/剂的范围的任何剂量被施用，或作为单个剂量或以两个剂量或更多个剂量被施用，以在哺乳动物中引发免疫应答。
在一个实施方案中，本发明提供了一种在包括人类的哺乳动物中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括通过包括肌内、皮内、皮下、静脉内、口服、鼻内或经皮途径的任何途径施用如权利要求1所述的疫苗组合物。
本发明的组合物可以通过包括针和包括预填充注射器的注射器、微针贴片、无针贴片、吸入和鼻喷雾剂的任何方法施用。
本发明还提供了一种体外或体内使用组合物的寨卡病毒抗体用于制备用于寨卡病毒感染的免疫诊断剂和免疫治疗剂的方法。
在一个实施方案中，疫苗组合物包含呈组合疫苗的寨卡病毒抗原和日本脑炎病毒抗原，所述组合疫苗在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答，其中寨卡病毒抗原和日本脑炎病毒灭活抗原在不具有佐剂或具有佐剂的药学上可接受的制剂中以范围在5μg至50μg每种抗原的浓度存在于组合疫苗中。
佐剂可以选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的任何水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。在一个优选的实施方案中，佐剂是具有0.25mg铝含量/疫苗剂量至1.0mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
在另一个实施方案中，疫苗组合物包含呈组合疫苗的寨卡病毒抗原和基孔肯亚病毒抗原，所述组合疫苗在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答，其中寨卡病毒抗原和基孔肯亚病毒抗原在不具有佐剂或具有佐剂的药学上可接受的制剂中以范围从5μg至50μg每种抗原的浓度存在于组合疫苗中。
佐剂可以选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐(aluminum sulphate phosphate)的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的任何水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。在一个优选的实施方案中，佐剂是在0.25mg铝含量/疫苗剂量至1.5mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
在另一个实施方案中，疫苗组合物包含呈组合疫苗的寨卡病毒抗原、基孔肯亚病毒抗原和日本脑炎病毒抗原，所述组合疫苗在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答，其中寨卡病毒抗原、基孔肯亚病毒抗原、和日本脑炎病毒抗原在不具有佐剂或具有佐剂的药学上可接受的制剂中以范围从5μg至50μg每种抗原的浓度存在于组合疫苗中。
佐剂可以选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的任何水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。优选地，佐剂是在0.25mg铝含量/疫苗剂量至1.0mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
本发明的疫苗组合物任选地包含在2.5mg/mL至5mg/mL的浓度的2-苯氧乙醇防腐剂。
当在哺乳动物中以单个剂量或以两个剂量或更多个剂量施用时，疫苗组合物引发针对包括寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的虫媒病毒抗原的任何一个的Th1和Th2免疫应答两者并且适于施用至人类。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备包含选自寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的一种或更多种虫媒病毒抗原的疫苗组合物的方法，所述方法包括灭活、生产重组蛋白、表达结构抗原、纯化和浓缩所述病毒抗原中的一个或更多个步骤，其中寨卡病毒的所述纯化和浓缩包括选自以下的一个或更多个步骤：
a.超速离心；
b.密度梯度离心；
c.使用膜过滤澄清病毒收获物；
d.通过柱层析纯化；
e.使用具有从100kDa至300kDa的截止值的膜的切向流动过滤，其中切向过滤在病毒灭活之前或之后进行。
柱层析方法包括凝胶过滤、混合模式树脂柱层析、任何离子交换柱层析、亲和基质层析和疏水相互作用层析，其中所述柱层析方法在流通液中洗脱大部分病毒抗原，柱层析方法诸如Capto Core 700，最优选地Capto Core 700，其中病毒样品在Capto Core 700柱上纯化，并且在流通液中洗脱。
寨卡病毒通过选自化学灭活剂、物理灭活剂和辐照剂的一种或更多种灭活剂来灭活。
制备方法包括寨卡病毒的灭活，所述寨卡病毒的灭活可以在病毒纯化之前或之后进行，其中寨卡病毒可以通过选自福尔马林(甲醛)、β丙内酯(BPL)和过氧化氢的化学灭活剂灭活。
在一个实施方案中，制备方法包括寨卡病毒主体的灭活，所述寨卡病毒主体通过选自以下的以下方法的任何一种灭活：
a.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在8℃至37℃，优选地25℃±3℃，持续至少1天至7天的福尔马林处理；
b.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少10天至30天的福尔马林处理；
c.以范围从1:500至多达1:4000v/v BPL:病毒的任何浓度，持续至少24小时至48小时(如果不是更多的话)，在范围从8℃至30℃的温度，优选地25℃±3℃，持续48小时的β丙内酯(从此以后称为BPL)
d.以范围从1:500至多达1:4000v/v(BPL:病毒，v/v)的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少3-7天的β丙内酯；
e.在任何前面提及的条件BPL和福尔马林的组合，优选地在15℃至30℃，优选地25℃±3℃，以1:3000(BPL:病毒，v/v)持续24小时的BPL灭活，随后是以1:3000(福尔马林:病毒，v/v)持续24小时至48小时福尔马林灭活；
f.以从0.1％至3％，优选地0.1％至1％的任何浓度在从20℃至30℃的任何温度持续5分钟至120分钟的过氧化氢。
在制备方法的实施方案中，病毒通过来自60Co源的从20kGy(千戈瑞)至多达35kGy，优选地25kGy至30kGy的暴露通过γ辐照来灭活。
在制备方法的另一个实施方案中，寨卡病毒通过暴露于254nm持续30-60分钟通过UV辐照来灭活。
在制备方法的另一个实施方案中，寨卡病毒通过从50℃至65℃持续30min多达2小时，优选地65℃持续1小时的热处理来灭活。
在制备方法的一个实施方案中，灭活在选自以下的稳定剂的存在下进行：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、异麦芽糖、棉子糖、水苏糖、乳二糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖酸、右旋糖酐、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和人血清白蛋白或其组合。在一个优选的实施方案中，稳定剂选自：
a.2％山梨糖醇和1％L-甘氨酸；
b.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸；
c.1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸；
d.1％甘露糖醇和0.5％L-谷氨酸；以及
e.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸，1％人血清白蛋白。
上文描述的灭活方法适用于寨卡病毒的任何基因型/毒株、活的减毒寨卡病毒、去活化病毒、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中、在载体化疫苗中携带任何寨卡病毒抗原特别地E蛋白的嵌合病毒颗粒、和使用任何寨卡病毒基因组的序列在体外或在体内得到的感染性合成病毒颗粒。
在一个实施方案中，本发明公开了一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将重组质粒DNA转染到昆虫细胞中；
b.收获细胞并且从中分离重组蛋白；
c.通过包括以下的方法的至少一种纯化所述蛋白：离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水柱层析、混合模式树脂层析、渗滤、超速离心、密度梯度离心、用盐分级分离。
在另一个实施方案中，本发明公开了表达寨卡病毒的结构抗原的方法，包括表达系统为任何原核或真核表达系统，包括在昆虫细胞中的杆状病毒介导的表达。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种方法，其中所述方法包括中和抗体，所述中和抗体主要针对以下的包膜蛋白被引发：诸如在最佳灭活病毒、活的减毒病毒、去活化病毒、DNA疫苗、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中诸如在载体化疫苗中展示所述寨卡病毒E蛋白的嵌合病毒颗粒和来源于任何寨卡病毒基因组RNA序列的合成病毒颗粒中。
本发明的疫苗组合物可以以初免加强策略施用，其中所述初免是候选灭活疫苗，并且所述加强是相同疫苗或任何其他疫苗，诸如DNA疫苗、嵌合寨卡病毒疫苗、病毒样颗粒、去活化寨卡疫苗、活的减毒病毒疫苗、重组亚基疫苗、载体化疫苗或来源于合成寨卡病毒的任何疫苗，其中它们中的每一种中的中和抗体均针对寨卡病毒包膜蛋白引发。
附图简述
图1：图.在12.5％SDS-PAGE凝胶中通过银染检测的纯化的寨卡病毒主体。包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白是在纯化的抗原中检测到的主要蛋白。
图2：图2A–通过福尔马林以范围从1:1000v/v福尔马林:病毒至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的浓度在25℃±3℃的寨卡病毒的灭活动力学。图2B–通过β丙内酯以范围从1:1000至多达1:3500v/v的BPL:病毒的浓度在25℃±3℃的寨卡病毒的灭活动力学。在两种灭活程序中，添加1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸(终浓度)作为稳定剂，这对灭活动力学不具有影响。将灭活样品在体外在Vero细胞中连续扩殖(amplified)三次，并且在三次传代结束时通过TCID50测定。
图3：图3A：SEQ ID NO.1的～2.1kb寨卡病毒prME基因通过基因特异性引物扩增(amplified)用于启动在pFastBac载体中的克隆，以用于在昆虫细胞中表达。图3B：使用寨卡兔多克隆抗血清通过标准程序通过蛋白印迹探测Sf9细胞裂解物，用于检测prME蛋白的表达。～55kD的包膜蛋白可以作为主要带被检测到。
图4：由具有不同佐剂的寨卡疫苗制剂引发的中和抗体滴度的估计。佐剂缩写如下：pIC(聚IC)；C-胆钙化醇；MPL(脂质A；单磷酰基)；RP(雷西莫特+聚IC)；RM(雷西莫特+OWEM2)；I(菊粉)；OWEM2(水包油乳剂2)；AI(氢氧化铝+菊粉)；MDP(胞壁酰二肽)；OWEM1(水包油乳剂1)。在各自对照组中未检测到显著的抗体滴度，并且因此在图中没有描绘。在所有情况下，配制10μg的两个剂量的寨卡疫苗抗原，用于在Balb/c小鼠中通过IM途径施用。
图5：图5A：在剂量范围研究中通过PRNT50估计中和抗体滴度，剂量范围研究以从0.125μg/剂至多达40μg/剂的氢氧化铝佐剂化福尔马林灭活的寨卡病毒疫苗在Balb/c小鼠中以两个剂量通过IM途径施用。图5B：在加强剂量之后7天，将接种疫苗的动物用10e5PFU/动物的寨卡病毒毒株静脉内攻击，并且每24小时监测病毒血症，持续7天(图中描绘6天)。所有的动物显示免于病毒血症的完全保护，而施用安慰剂对照的动物显示持续多达6天的病毒血症。通过TCID50估计血液样品中的感染性病毒。
图6：在4-6周龄Balb/c小鼠中，在施用1μg至40μg的BPL灭活、经明矾吸附的寨卡病毒疫苗之后进行的病毒攻击。所有疫苗剂量组和安慰剂组的动物在施用加强剂量之后7天用10e5PFU的寨卡病毒MR766毒株进行攻击。在病毒攻击之后每24小时监测病毒血症，并且通过TCID50估计血液中感染性颗粒的滴度。候选寨卡疫苗在所有剂量组均提供了免受病毒攻击的完全保护。
图7：被动免疫提供了针对病毒血症的完全保护，并且在腹腔内接受寨卡兔多克隆抗血清并在24小时后用10e5PFU寨卡病毒攻击的动物中通过TCID50未能检测到感染性病毒。当每24小时监测持续6天时，在血液中通过TCID50未能检测到传染性病毒颗粒，而接受等同体积PBS的对照动物当用相同剂量的病毒攻击时显示持续的病毒血症多达6天。
图8：来自接种疫苗的小鼠的福尔马林灭活、经明矾吸附的寨卡病毒疫苗抗血清中和同源MR766寨卡病毒毒株(图8B)，并且以等同效率交叉中和异源亚洲基因型FSS 13025毒株(图8A)，其中PRNT50滴度分别为18105和18325。对于安慰剂(仅明矾)的值也平行地(alongside)被描绘于附图中。
图9：如在实施例7中描述的，在4-6周龄Balb/c小鼠中施用的(图9A)单个剂量、(图9B)两个剂量、(图9C)三个剂量的福尔马林灭活的疫苗的剂量范围研究中被表示为log10血清稀释度倒数的抗体滴度。图9D是对于单个剂量、两个剂量和三个剂量的无明矾的10μg疫苗抗原的抗体滴度。所有值均被表示为几何平均滴度，具有95％CI。在9A-9D中，单独动物数据被绘制。寨卡病毒抗原在甚至没有佐剂的情况下也是免疫原性的。来自其他剂量范围的数据被估计，但未包括在图中。
图10：甚至在低至1μg疫苗抗原的低剂量，通过单个剂量的福尔马林灭活的经明矾吸附的寨卡病毒疫苗也可以在Balb/c小鼠中引发高亲和力抗体。抗体亲合力被表示为亲合力指数并且通过实施例12中描述的方法进行估计。
图11：在用具有不同佐剂的寨卡疫苗制剂疫苗接种的小鼠中的Th1细胞因子(图11A)IFNγ和(图11B)IL-2的估计。在所有情况下，它是10μg疫苗抗原/剂。佐剂缩写如下：pIC(聚IC)；C-胆钙化醇；MPL(脂质A；单磷酰基)；RP(雷西莫特+聚IC)；RM(雷西莫特+OWEM2)；I(菊粉)；OWEM2(水包油乳剂2)；AI(氢氧化铝+菊粉)；MDP(胞壁酰二肽)；OWEM1(水包油乳剂1)，如在实施例5中描述的。与其他测试的佐剂相比，油基佐剂和聚IC引发强烈的Th1应答。
图12：在用具有不同佐剂的寨卡疫苗制剂疫苗接种的小鼠中的Th2细胞因子(图12A)IL-4和(图12B)IL-10的估计。在所有情况下，它是10μg疫苗抗原/剂。佐剂缩写如下：pIC(聚IC)；C-胆钙化醇；MPL(脂质A；单磷酰基)；RP(雷西莫特+聚IC)；RM(雷西莫特+OWEM2)；I(菊粉)；OWEM2(水包油乳剂2)；AI(氢氧化铝+菊粉)；MDP(胞壁酰二肽)；OWEM1(水包油乳剂1)，如在实施例5中描述的。除了Th1应答以外，油基佐剂和聚IC还引发强烈的Th2应答。
发明详述
本公开内容涉及免疫原性组合物的配制。本发明特别地公开了寨卡病毒以单价组合物以及以与其他虫媒病毒诸如基孔肯亚病毒和/或日本脑炎病毒组合的疫苗抗原的制备和配制。特别地，本发明公开了用于预防和治疗寨卡病毒感染的组合物。
本发明的一个方面是作为用于引发适用于寨卡病毒的任何基因型、基因型变体或任何毒株的免疫应答的疫苗的寨卡抗原的制备方法、制剂和用途，其中寨卡病毒的一种基因型有效地交叉中和异源毒株。寨卡病毒可以选自亚洲、西非或东非的病毒基因型。因此，在本文的本发明中描述的方法适用于寨卡病毒的任何基因型/毒株、活的减毒寨卡病毒、去活化病毒、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中、在载体化疫苗中携带任何寨卡病毒抗原特别地E蛋白和M蛋白的嵌合病毒颗粒、和使用任何寨卡病毒基因组的序列在体外或体内得到的感染性合成病毒颗粒。嵌合病毒具有异源病毒的核酸和寨卡病毒的核酸。
在本文公开的免疫原性组合物，特别地用于制备免疫原性组合物使用的主体抗原的情况下，寨卡疫苗抗原的制备方法、制剂和用途适用于任何前面提及的寨卡病毒类型，所述任何前面提及的寨卡病毒类型在基因组的任何区域共有至少50％氨基酸同一性及多达100％的氨基酸同一性。在本文公开的免疫原性组合物的情况下，非洲基因型的寨卡病毒MR766毒株的序列(对于基因组核苷酸序列SEQ ID NO.5和对于完全ORF SEQ ID NO.6)与亚洲基因型毒株FSS13025在结构包膜蛋白中共有多于96.5％氨基酸同一性，并且所述亚洲基因型毒株FSS13025的序列的核苷酸和蛋白序列分别被公开于SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中。MR766毒株的疫苗抗血清以与同型MR766毒株100％等同效力交叉中和FSS13025毒株。同样在本文的本文公开内容的情况下，寨卡病毒prME(SEQ ID NO.3)抗血清有效地交叉中和MR766毒株，证实所有寨卡病毒均是血清型相似的(serotypically similar)。在本文的本公开内容的情况下，使用任何一种寨卡病毒毒株开发的疫苗方法适用于作为候选疫苗使用的同源和任何异源的寨卡病毒毒株。
可以在培养中体外繁殖的细胞系可以用作寨卡病毒培养的宿主。为了繁殖寨卡病毒毒株，优选地选择允许病毒良好地生长的允许细胞。例如，可以使用二倍体细胞系诸如MRC-5和WI-38，以及连续传代的细胞系诸如Vero、BHK-21、CHO细胞等。例如，可以使用Vero细胞(ATCC号CCL-81)、BHK-21(ATCC号CCL-10)、C6/C3(ATCC号CRL-1660)等。在优选的实施方案中，本发明中使用的一种此类细胞系是Vero细胞(ATCC号CCL-81)，其已经被验证用于作为用于疫苗生产的宿主细胞使用。验证的Vero细胞系符合世界卫生组织(WHO)推荐的关于用于生产生物制品(biologicals)的细胞的使用的要求的第50号生物物质要求，从而证实这些细胞系适于(as qualified for)生产疫苗(WHO技术报告系列，第878期，第19-52页，1998)。
在本发明的一个方面，使寨卡病毒适应于Vero细胞的方法增加了病毒滴度。在Vero细胞中重复传代的寨卡病毒增加病毒滴度。在本文公开的Vero细胞中的病毒生长的情况下，在小鼠脑或白纹伊蚊C6/36细胞(ATCC号CRL-160)中初始传代并然后适应于Vero细胞的寨卡病毒增加病毒滴度，适于疫苗生产。
为了维持以上提及的细胞系，特别地Vero细胞的细胞培养，可以采用以单层静置培养、灌注系统培养、摇瓶、滚筒管/瓶培养、具有和不具有微运载体(microcarrier)的悬浮液培养、细胞工厂和细胞堆集室(cell stacks)、生物反应器和一次性生物反应器、wave生物反应器等。例如多种类型的微运载体商购可得。商购可得的动物细胞培养装置可以用于便于细胞生长至高细胞密度。
在本发明以及本文公开的一个方面，寨卡病毒被纯化用于作为候选疫苗使用。纯化在病毒灭活之前或之后通过物理和化学方法两者的组合来实现。物理方法包括但不限于以下技术中的任何一种：超速离心、密度梯度离心、超滤、渗滤和使用具有合适分子截止尺寸的半透膜进行浓缩。通过化学手段进行的纯化采用以下方法：诸如通过化学或物理化学反应的吸附/解吸，诸如离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析诸如例如Captocore700TM、羟磷灰石基质、用无机盐进行的盐析，一个此类实例是硫酸铵。
在优选的实施方案中，病毒在Capto core 700(GE Healthcare Life Sciences)柱层析上纯化。在Capto core 700柱上纯化之前或纯化之后实现病毒的灭活。在Captocore 700柱之前，病毒收获物可以使用具有不同孔径的膜滤器，优选地不少于0.45μM的低蛋白结合膜，澄清。在优选的实施方案中，病毒收获物可以用两种不同孔径的双膜进行澄清，例如1.2μM随后是0.45μM，或0.8μM随后是0.45μM。澄清的病毒收获物适于在Capto Core700柱上纯化。用于在Capto core 700上纯化的缓冲液具有最佳的pH和离子强度，以使杂质在柱上的结合最大化并在流通液中洗脱病毒。在病毒灭活之前或之后，病毒样品通过渗滤进一步浓缩。灭活之后的病毒样品的渗滤从主体抗原中去除病毒灭活剂，并且适用于配制。
在本发明的一个实施方案中，灭活(杀死)寨卡病毒用于作为疫苗抗原使用。灭活可以在病毒纯化之前或之后进行。在优选的实施方案中，在病毒纯化之后进行寨卡病毒的灭活。
寨卡病毒可以通过热、γ辐照、紫外线或化学手段灭活。在本文公开的优选的实施方案中，寨卡病毒是化学灭活的。化学灭活剂选自以下列表，其包括但不限于：福尔马林、β-丙内酯、戊二醛、N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺(binary ethyleneimine)、三乙烯亚胺(tertiary ethyleneimine)、抗坏血酸、辛酸、补骨脂素(psoralens)、去垢剂包括非离子型去垢剂等，其中将化学灭活剂添加至病毒悬浮液中以灭活病毒。
在本发明的优选的实施方案中，所选择的化学灭活剂是福尔马林和/或β丙内酯(BPL)。福尔马林以从1:1000至1:4000v/v的福尔马林:病毒的范围的任何浓度使用。β丙内酯以范1:1000至1:4000v/v的BPL:病毒的范围的任何浓度使用。优化灭活的温度和持续时间以对免疫原性的最小不利影响完成病毒灭活。这可以用暴露于最小量的灭活剂持续较短的持续时间来实现。在病毒灭活的情况下，本文的公开内容描述了将寨卡病毒暴露于福尔马林和BPL的浓度、温度和时间。在本发明的优选的实施方案中，灭活温度是25℃±3℃，最优选地是22℃，持续7天。在2℃至8℃的较低温度，福尔马林暴露的持续时间长于7天，以在前面提及的浓度范围实现完全的病毒灭活。病毒暴露于福尔马林的持续时间可以通过将暴露温度升高至高达37℃来降低至低于48小时。因此，在任何前面提及的暴露浓度、时间和温度，寨卡病毒的有效福尔马林灭活可以如下实现：以从1:1000v/v福尔马林:病毒至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何福尔马林浓度范围，通过选择从2℃至37℃的任何温度范围并且将暴露时间从24小时改变至多于10天。
在本公开内容的一个实施方案中，BPL被用作用于寨卡病毒的病毒灭活剂。在本发明的优选的实施方案中，BPL以范围从1:1000v/v BPL:病毒至多达1:4000v/v BPL:病毒的浓度使用。在2℃至8℃的较低温度，BPL暴露的持续时间优选持续3天至7天，以在前面提及的浓度范围实现完全的病毒灭活。病毒暴露于BPL的持续时间可以通过将暴露温度升高至高达25℃±3℃或甚至高达37℃来降低至48小时或低于48小时。因此，在任何前面提及的暴露浓度、时间和温度，寨卡病毒的有效BPL灭活可以如下实现：通过选择从1:1000v/v BPL:病毒至1:4000v/v BPL:病毒的任何BPL浓度范围，通过选择从2℃至37℃的任何温度范围并且将暴露时间从24小时改变至多于10天。
本文公开的本发明的一个实施方案是，在任何前面提及的条件使用BPL和福尔马林的组合，在15℃至30℃，优选地25℃±3℃，优选地以1:3000v/v的BPL:病毒持续24小时的BPL灭活，随后是以1:3000v/v福尔马林:病毒持续24小时至48小时的福尔马林灭活。用于寨卡病毒灭活的BPL和福尔马林组合的使用是因为福尔马林和BPL的灭活机制不同，它们的组合使用降低了其整体浓度和于两种灭活剂的暴露，并且此外使用低浓度的福尔马林通过促进病毒表位的交联来促进病毒主体的稳定性。在本发明的另一个实施方案中，过氧化氢用于如下灭活寨卡病毒：以范围从0.1％至3％，优选地0.1％至1％的浓度在从20℃至30℃的任何温度持续5分钟至120分钟，如果不是更多的话。
本发明的实施方案公开了寨卡病毒的prME抗原作为引发针对寨卡病毒的免疫应答的候选疫苗抗原的用途。本公开内容适用于任何疫苗设计方法，其中prME或E蛋白以中和寨卡抗体针对所述抗原的此类方式表达。在本发明的优选的实施方案中，prME蛋白在昆虫细胞中杆状病毒介导的表达被表达为重组病毒样颗粒(VLP)。本领域技术人员将使用以上公开内容得到另外的实施方案，以设计使用prME蛋白作为靶寨卡抗原的疫苗候选者，诸如DNA疫苗、包含prME蛋白的病毒样颗粒、包含包膜(E)抗原的亚基疫苗、活的载体化疫苗，在异源核酸骨架上使用寨卡prME的嵌合疫苗，其中在以上所有中，抗寨卡抗体直接针对E蛋白。
在本发明中，本文公开了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含纯化的重组寨卡病毒抗原作为疫苗抗原用于引发免疫应答以用于预防寨卡病毒感染，所述纯化的重组寨卡病毒抗原包含包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和任选地非结构1(NS1)蛋白。在优选的实施方案中，使用具有分别编码SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4的结构蛋白的序列SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的prME基因的寨卡病毒，其中所表达和纯化的prME蛋白可以用作疫苗抗原，以用于预防寨卡病毒感染。
在优选的实施方案中，寨卡病毒prME基因用于生成重组基因构建体，所述重组基因构建体可以用于在原核或真核表达系统中，优选地在昆虫细胞中的杆状病毒介导的表达中，将prME蛋白表达为病毒样颗粒(VLP)。本文公开的方法适用于与前面提及的SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4共有至少70％氨基酸同一性的任何寨卡病毒毒株。
本公开内容的实施方案是在整个生物过程中选择药学上可接受的缓冲液，其中缓冲剂选自但不限于由以下中的任何一种或更多种组成的列表：磷酸盐缓冲液；柠檬酸盐缓冲液；磷酸盐柠檬酸盐缓冲液；硼酸盐缓冲液；含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；含甘氨酸或组氨酸作为缓冲剂之一的缓冲液。在最优选的实施方案中，使用磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液是磷酸根离子的浓度为5mM至多达200mM的磷酸钠缓冲溶液，优选地10mM至100mM磷酸盐缓冲液，最优选地10mM至50mM磷酸盐缓冲液，具有高于6.50至pH 9的任何pH，优选地使用pH 6.8至pH 7.8用于上游和下游过程。在优选的实施方案中，使用pH 7.4±0.2的10mM磷酸钠缓冲液以制备寨卡病毒抗原的纯化的灭活疫苗主体，并且任选地包含浓度从50mM至200mM的氯化钠。在另一个优选的实施方案中，山梨糖醇和L-甘氨酸任选地被添加至最终浓度分别为1％和0.5％。
本发明的实施方案还公开了与寨卡病毒抗原一起配制相容的佐剂的选择。
寨卡病毒作为单价疫苗、以及与基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒呈组合疫苗的抗原组合物在药学上可接受的用于免疫的载体中配制。佐剂的使用可以降低制剂中所需的抗原的量。此外，对于佐剂化疫苗制剂，合适的佐剂选自以下列表，其包括但不限于：明矾诸如氢氧化铝、磷酸铝或无定形硫酸铝磷酸盐；磷酸钙；任何多晶形式的菊粉，优选地γ菊粉；包含菊粉与其他有机和无机化合物(诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐和磷酸钙)组合的佐剂；脂质体、壳聚糖和复合糖类诸如右旋糖酐、糊精、淀粉、甘露聚糖和葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、β-葡聚糖、肝素、纤维素、半纤维素、果胶和果胶酸盐(pectinates)、凝集素和任何其他合成的或来源于任何来源的糖类，任何生物可降解的和生物相容性聚合物诸如聚丙交酯(poly lactide)和聚丙交酯乙交酯共聚物(polylactide co-glycolide)(PLG或PLGA)；任何乳液，包括但不限于水包油乳液，一个此类实例是包含角鲨烯或角鲨烯类似物的水包油佐剂、包含植物油的水包油乳液；任何油包水乳液；用胆钙化醇作为成分之一与其他脂溶性化合物一起制备的脂质体；其他组成的脂质体；RIBI佐剂系统，皂苷包括但不限于QS-21、QuilA、番茄苷(tomatine)、ISCOM、ISCOMATRIX等，脂肽类，糖肽类及其类似物，雷西莫特，脂多糖类，脂质A，胞壁酰二肽或其类似物以及任何基于肽的佐剂，寡核苷酸、任何TLR配体及其作为佐剂的类似物，任何细胞因子，维生素和无毒的细菌毒素，甚至所有前面提及的佐剂的任何类似物以及在疫苗制剂中相容并测试了增强的免疫原性的前面提及的佐剂或其类似物中的两种或更多种的组合。除了以上的以外，具有良好免疫强化活性的任何其他有机和无机物质适于单独地或以佐剂组合用作佐剂，以增强虫媒病毒抗原的免疫原性。佐剂在疫苗制剂中的使用可以降低所需抗原的量。
在本发明的优选的实施方案中，氢氧化铝用于福尔马林和BPL两者灭活的寨卡抗原的剂量范围研究，以及寨卡、CHIKV和JEV疫苗的疫苗组合，因为其用于在靶群体中使用的安全性特征。当被用作佐剂时，油基乳液和聚IC对寨卡抗原具有良好的免疫强化作用。在本发明的一个实施方案中，同时提供全身和粘膜免疫的聚IC和其他佐剂对于防止由寨卡病毒感染引起的疾病是特别有利的。通过测量Th1和Th2细胞因子所估计的，在本发明中公开的聚IC和油基乳液和佐剂组合在接种疫苗之后引发Th1和Th2应答两者。
在本发明的一个实施方案中，疫苗防腐剂被用于疫苗制剂中。优选的实施方案是2.5mg/剂至5mg/剂的浓度的2-苯氧乙醇。
在本发明的一个方面，本文公开了在通过任何前面提及的方法灭活寨卡病毒期间赋予稳定性的任何合适的浓度使用的选自但不限于以下的一种或更多种的稳定剂：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、异麦芽糖、棉子糖、水苏糖、乳二糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖酸、右旋糖酐、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和人血清白蛋白或其组合。在优选的实施方案中，稳定剂选自但不限于任何以下组合：2％山梨糖醇和1％L-甘氨酸；1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸；1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸；1％甘露糖醇和0.5％L-谷氨酸；1％山梨糖醇、0.5％L-甘氨酸、1％人血清白蛋白。在优选的实施方案中，1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸的组合以及1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸的组合是优选的组合，最优选地1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸。本领域技术人员将基于以上公开内容认识到另外的实施方案。
冻干制剂是用于制备疫苗产品的方法之一。寨卡病毒疫苗的冻干制剂通常包含纯化的灭活寨卡病毒、糖醇(sugar polyol)，优选地山梨糖醇和甘露糖醇，最优选地山梨糖醇与玻璃形成糖(glass forming sugar)的组合，所述玻璃形成糖优选地是二糖或寡糖。优选的二糖选自但不限于以下列表：蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、棉子糖、异麦芽糖、水苏糖等。本公开内容的优选实施方案是以下的组合：1％山梨糖醇与5％蔗糖、1％甘露糖醇与5％蔗糖、以及3％蔗糖和2％海藻糖、1％甘露糖醇与1％L-甘氨酸和/或2％海藻糖。本领域任何普通技术人员将基于以上公开内容设计另外的实施方案。
冻干制剂可以被重悬于注射用水或药学上可接受的用于施用的水性缓冲液，例如作为人类受试者的可注射液体中。冻干制剂也可以用作可吸入粉末，其将适于诱导粘膜免疫。另外，寨卡病毒的冻干制剂可以包含赋予粘膜免疫的佐剂，优选地来自本发明中对于寨卡病毒测试的那些佐剂的列表例如诸如聚IC。
在本发明中，本文提供的关于寨卡病毒抗原引发稳健的免疫应答的最佳用途的公开内容中，疫苗抗原可以以0.10μg/剂至多达100μg/剂使用，其中优选的实施方案是从0.125μg/剂至多达40μg/剂的任何浓度，使得施用的疫苗剂量引发通过诸如ELISA和PRNT50的测定可测量的抗体滴度。由于灭活疫苗和佐剂化制剂两者引发良好的免疫应答，疫苗可以在具有和不具有佐剂的情况下施用。
在本发明的又另一个公开内容中，通过任何所公开的方法灭活的灭活寨卡疫苗候选者可以作为单个剂量或以两个剂量或更多个剂量施用以引发免疫应答。本发明中公开的方法提供了在每一个疫苗剂量之后的免疫应答动力学，剂量范围从0.125μg/剂至多达40μg/剂，其提供选择适合用于接种疫苗的靶群体的疫苗剂量范围浓度和剂量数的灵活性。
疫苗施用的途径可以是通过选自但不限于以下的任何途径：肌内、皮内、皮下、静脉内、口服、鼻内和经皮途径。在本发明的优选的实施方案中，疫苗施用的优选的途径是肌内(IM)途径。
疫苗制剂可以以玻璃小瓶呈现并且通过针和注射器注射，以呈即用型(ready touse)的预填充注射器呈现，或者通过电穿孔、微针贴片、无针贴片，通过吸入或通过鼻喷雾剂施用。
本发明公开了用于制备包含选自包括寨卡病毒、基孔肯亚病毒(CHIKV)和日本脑炎病毒(JEV)的列表的一种或更多种虫媒病毒抗原的制剂的方法及所述制剂的用途。当以疫苗组合使用时，疫苗可以引发针对组合疫苗中存在的每一种病毒的免疫应答。在本发明的优选的实施方案中，公开了一种疫苗组合物，其中寨卡病毒抗原和日本脑炎病毒抗原以每一种抗原范围从5μg至50μg的浓度存在于不具有佐剂或优选地具有佐剂的药学可接受的制剂的组合疫苗中，所述佐剂选自本发明中公开的佐剂的列表，优选地具有0.25mg至1.5mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。在本发明的又另一个优选的实施方案中，公开了一种在制剂中包含基孔肯亚病毒和寨卡病毒抗原的疫苗组合物，所述制剂在不具有佐剂或优选地具有佐剂的药学上可接受的制剂中每一种抗原范围从5μg至50μg存在，所述佐剂选自本发明中公开的佐剂的列表，优选地具有0.25mg至1.5mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
在本发明的又另一个优选的实施方案中，公开了一种在制剂中包含基孔肯亚病毒抗原、寨卡病毒抗原和JEV病毒抗原的疫苗组合物，所述制剂在不具有佐剂或优选地具有佐剂的药学上可接受的制剂中每一种抗原范围从5μg至50μg存在，所述佐剂选自本发明中公开的佐剂的列表，优选地具有0.25mg至1.5mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。疫苗组合的使用赋予疫苗制造和分布的独特的经济优势，条件是针对制剂中的每一种抗原引发免疫应答，并且未观察到由另外的抗原的存在对抗原中的任一种的抗原性干扰。疫苗抗原可以从单一制剂施用，或者可以同时或以合适的时间间隔单独施用以引起对关联(cognate)抗原的免疫应答。
本发明还公开了寨卡病毒抗体用于通过ELISA或任何免疫诊断方法检测寨卡病毒的用途，其中抗体可应用于寨卡病毒感染的检测或诊断。
在本文本发明还公开了寨卡病毒抗体用于预防和治疗寨卡病毒疾病的用途。
本发明中使用的缩写：IM–肌内；mcg-微克；TCID50-半数组织培养感染剂量(50％Tissue Culture Infectious Dose)；PFU–蚀斑形成单位(Plaque forming unit)
实施例
实施例1：在Vero细胞中的寨卡病毒培养
Vero细胞系(ATCC号CCL-81)用作用于寨卡病毒培养的细胞基质。从BioReliance,USA获得的充分表征的Vero细胞用于中试规模(pilot scale)生产。使Vero细胞在包含5％胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBCS)的DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle培养基；Sigma-Aldrich目录号D5523并且根据制造商的说明使用)或EMEM(Eagles最小必需培养基)中生长并且在35℃至37℃孵育直至达到80％–100％的单层汇合。感染后，使用包含1％血清的相同培养基，或者可选地将病毒培养在适应于无血清培养基的Vero细胞中。寨卡病毒也可以在MRC-5细胞单层中生长，所述MRC-5细胞单层在由具有5％血清的用Hepes缓冲液缓冲至中性pH的EMEM组成的生长培养基中并且在35℃至37℃静置孵育6天至8天制备。将寨卡病毒在Vero细胞中常规培养。通过在Vero细胞中直接接种，使寨卡病毒MR766毒株(ATCC VR-84)适应于Vero细胞。可选地，使病毒通过连续传代两次适应于C6/36白纹伊蚊细胞，并且使用在来自这些细胞的培养物上清液中的寨卡病毒感染Vero细胞。寨卡病毒在25℃至28℃培养的C6/36细胞中的连续传代将病毒滴度增加到高于10e8.0TCID50/mL或10e8.0PFU/mL。这也避免了对随后在Vero细胞中重复传代以获得高滴度的需求。通过这种方法进行病毒适应对于实现高滴度和随后生产中的更高产量是有用的。在C6/36细胞中培养之后，将病毒从Vero细胞中连续蚀斑纯化两次，并且来自单个孔分离的蚀斑的病毒被扩殖，并且使用NGS(下一代测序)平台充分表征为不含外源因子(adventitious agents)(所有已知的RNA和DNA病毒、细菌、真菌、支原体等)。通过NGS平台对病毒基因组RNA进行测序，并且将MR766毒株的完整核苷酸序列提供于SEQ ID NO.5中，且对应推断的氨基酸序列提供于SEQ ID NO.6中。测序显示包膜蛋白中完整的糖基化位点，否则如果细胞在哺乳动物细胞中广泛传代则完整的糖基化位点被丢失。寨卡病毒在Vero细胞中产生致细胞病变效应(CPE)，并且在最佳感染复数(Multiplicity of Infection)(MoI)和收获条件，可以获得高于10e8.5TCID50/mL或10e8.5PFU/mL的病毒滴度。
实施例2：寨卡病毒纯化
对于中试规模的寨卡病毒培养，病毒培养物从T-175瓶被系统地按比例放大至CS1(细胞堆集室1)、CS10(细胞堆集室10)和CS40(细胞堆集室40)。以标准化MoI同时感染病毒的多个CS40被用来按比例放大生产。使用多个CS40允许快速且线性地按比例放大至所期望的生产。来自每一个CS40的收获物体积是约8-10L。在4-6天或每当达到多于90％的CPE时收获病毒。可选地，一次性生物反应器在以下的良好标准化条件下用于增加细胞密度和病毒收获物：温度35℃至37℃，pH不少于7.0，并且最佳地在pH 7.4，溶解氧在45ppm至75ppm，优选地60rpm及240rpm至280rpm的搅拌，并且根据培养物体积从1L至100L的规模优化的最佳控制流入和流出的速率。将病毒收获物通过微量过滤或使用具有1.2μM和0.45μM截止值的双重过滤器澄清。然后使澄清的病毒收获物通过(passed through)在磷酸盐缓冲盐水pH7.4中的Capto Core700柱(GE healthcare Life Sciences)。在流通液中的包含寨卡病毒的级分任选地通过使用100kDa或300kDa截止值的膜的渗滤进行浓缩。浓缩的病毒级分用于病毒灭活。在可选方法中，根据后续部分中描述的方法，将澄清的病毒收获物用BPL或福尔马林灭活，并且然后装载在柱上。在12.5％SDS-PAGE上检查病毒的纯度。在纯化之前和之后，灭活病毒的产量或纯度不存在显著差异。病毒还可以使用以下进行纯化：cellufinesulphate、DEAE-Sephadex、具有盐梯度的CM-sephadex以及通过在Sepharose CL-4B上的凝胶过滤、具有0.2M至0.8M磷酸盐梯度的陶瓷羟磷灰石柱，并且在所有情况下随后是使用100kDa或300kDa截止值的膜的渗滤。病毒制品的纯度通过银染12.5％SDS-PAGE凝胶中的病毒样品进行检查(参见图1)。可以将寨卡病毒通过前面提及的方法纯化至适于用作疫苗主体抗原的高纯度。病毒还可以通过以下进行纯化：在100,000×g离心6小时至8小时后，使用P28S转子在Hitachi HIMAC超速离心机中在20％-60％蔗糖梯度上超速离心。
实施例3：寨卡病毒灭活
将寨卡病毒样品通过多种方法灭活(杀死)以用于作为疫苗抗原使用。以范围从1:1000(福尔马林:病毒，v/v)至1:4000(福尔马林:病毒，v/v)的不同浓度，在温度25℃±5℃，更具体地在22℃测试福尔马林灭活，并且每24小时持续多达10天监测病毒灭活的动力学，并且常规地病毒灭活在25℃±3℃，优选地在22℃进行7天。在从1:1000v/v福尔马林:病毒至多达1:3500v/v福尔马林:病毒的所有浓度，在前面提及的温度和时间间隔，病毒灭活均是有效的。福尔马林:病毒的1:4000v/v的比率在高达30℃至37℃的较高温度持续3天至7天的病毒灭活中是有效的。当孵育持续的时间间隔长于10天时，福尔马林灭活在所有前面提及的福尔马林与病毒的比率在范围从2℃-8℃的温度均是有效的。因此，根据用于灭活的条件，福尔马林灭活提供在从2℃至37℃的任何温度在范围从24小时至超过10天的时间间隔的病毒灭活的灵活性。在不同条件下测试用β丙内酯(BPL)的寨卡病毒灭活。以范围从1:1000(BPL:病毒，v/v)至多达1:3500(BPL:病毒，v/v)的BPL浓度，在从25℃±5℃的温度持续24小时至48小时，寨卡病毒被完全灭活。以较高的BPL浓度或在高达37℃的较高温度，在24小时或更少时间内实现完全失活，并且其可以用作用于快速灭活病毒的方法。当在2℃至8℃孵育3天至7天时，寨卡病毒也可以以前面提及的BPL浓度灭活。以1:3500(BPL:病毒，v/v)在22℃-25℃持续48小时的BPL灭活随后是用从1:3000至1:4000v/v的福尔马林:病毒的低福尔马林浓度持续24小时的处理的组合在灭活与稳定病毒两者中是有效的。只要灭活是完全的且对免疫原性不具有有害影响，任何浓度的BPL和福尔马林均可以用于灭活和稳定病毒两者。测试从0.005％至多达3％最终浓度的过氧化氢在20℃至25℃持续2小时的时间段的灭活。以较低的过氧化氢浓度用几分钟内的非常简短的暴露时间对病毒的免疫原性不存在有害影响，但在延长的时间在测试的较高的剂量范围是有害的。通过TCID50/mL以5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟及以2小时、4小时和6小时的间隔从5分钟至多达6小时滴定暴露于不同时间和剂量浓度后的灭活病毒样品的感染性病毒颗粒，如果有的话。在较高的浓度，病毒在几秒钟内被灭活。在每一个时间点，通过添加10U/mL的快速水解过氧化氢的过氧化氢酶终止反应。如通过TCID50/mL滴定感染性颗粒以及随后的免疫原性确定的，灭活的最佳浓度是最终0.01％持续60分钟或更少的持续时间。根据样品中的病毒颗粒的浓度，用过氧化氢的寨卡病毒灭活提供在不同的浓度持续不同的时间点的暴露持续时间的灵活性。
将纯化的寨卡病毒样品在50℃至65℃的温度热灭活长达60分钟。在254nm处持续长达120分钟的UV暴露来进行病毒的UV灭活。
在Hyderabad的Gamma Agro医学处理设施，通过由60Co来源的从20kGy(千戈瑞)至多达35kGy的暴露通过γ辐照灭活寨卡病毒。所有以上灭活方法均在病毒稳定剂的存在和不存在下进行，所述病毒稳定剂诸如不同浓度的糖诸如蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖，除了其他以外。用于赋予稳定作用的糖醇是山梨糖醇和甘露糖醇。测试的氨基酸选自L-组氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸和L-天冬氨酸和L-谷氨酰胺和人血清白蛋白以及一种或更多种前面描述的稳定剂的组合。最有效的稳定剂是0.5％至2％，优选1.0％的山梨糖醇与从0.5％至2％，优选0.5％的L-甘氨酸组合。甘露糖醇和L-甘氨酸组合在灭活期间在稳定病毒样品中比单独的甘露糖醇和L-甘氨酸有效。
通过在Vero细胞中将灭活样品连续传代连续三次并且通过TCID50在灭活时间段结束时测试感染性病毒来测试通过所有前面提及的用于疫苗抗原使用的方法灭活的寨卡病毒样品的灭活完全性。除此以外，在体外三次连续传代之后的灭活病毒样品经颅内注射到2日龄小鼠中，并且观察死亡率或生长异常持续21天，当其在体外和体内测试中未显示不利影响时被认为是完全灭活的。对以前面提及的浓度范围和持续所测试的不同时间段的福尔马林和β丙内酯灭活的病毒体均未观察到感染性。作为以上公开的方法之一的代表性实例，福尔马林和BPL的寨卡病毒灭活动力学提供于图2(图2A和图2B)中。
实施例4：寨卡病毒pRME蛋白的重组克隆和表达
编码寨卡病毒的SEQ ID NO.3的prME蛋白的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列SEQID NO.1的合成基因在GenScript,NJ,USA合成。将该基因用下文列出的引物进行PCR扩增以获得编码SEQ ID NO.3的prME蛋白的SEQ ID NO.1的～2.1kb片段。参见图3A。
FVFP：5'AACTGCTCGAGGAATTCGGATCCAAC 3'
FVRP：5'AATGGGCATGCCTGCAGGCGGCCGCTC 3'
将PCR扩增的片段用EcoR1和Not1限制性酶消化并且通过Bac to Bac杆状病毒表达系统的用户手册(“An efficient site-specific transposition system to generatebaculovirus for high-level expression of recombinant proteins(一种生成用于高水平表达重组蛋白的杆状病毒的有效的位点特异性转座系统),Life Technologies,USA)中描述的方法克隆到pFastBac质粒载体(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中处于多角体启动子的控制下的EcoR1和Not1位点。简言之，该方法利用表达盒的位点特异性转座，诸如将具有如以上描述的克隆插入物(inserts)的重组pFastBac载体转化到在大肠杆菌中繁殖的杆状病毒穿梭载体(杆粒(bacmid))中。将包含克隆在多角体启动子控制下的插入物之一SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的重组pFastBac载体转化到大肠杆菌Max EfficiencyDH10BacTM的感受态细胞中，所述感受态细胞包含便于转座以允许重组杆粒的有效再生的杆状病毒穿梭载体(bMON14272)和辅助质粒(pMON7124)。通过使用bluo-gal或X-gal和IPTG的蓝/白选择在包含氨苄青霉素、庆大霉素和卡那霉素的板上选择重组杆粒。在通过PCR证实基因插入物存在之后，通过在前面提及的用户手册中描述的标准方案分离重组杆粒。将约1μg杆粒DNA用于用Lipofectamine转染在无血清昆虫细胞培养基中生长的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9昆虫细胞(Life Technologies,Carlsbad,USA)中。用于P1病毒储备液的转染、分离和滴定的方法正如以上给出的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的用户手册中描述。将P1储备液连续扩殖两次以获得高滴度P3储备液，用于重组prME蛋白在Sf9细胞中的表达。将用于SEQ ID No.3的prME蛋白的表达的高滴度杆状病毒储备液在Sf9细胞的25mL悬浮培养物中表达，并且进一步系统地按比例放大至多达125mL/500mL烧瓶。在感染后72小时收获来自多个烧瓶的杆状病毒感染的细胞，合并，用1×PBS，pH 7.6洗涤一次，并且在包含10mM磷酸盐、pH 7.6与50mM NaCl、1mM PMSF和5mM EDTA的细胞裂解缓冲液中裂解。将细胞裂解物在20,000rpm离心30分钟以去除细胞碎片，并且将上清液使用具有10kDa截止值的膜的蛋白浓缩器浓缩。将浓缩的样品铺于预平衡的20％至60％蔗糖梯度上，并且以100,000×g离心6-8小时。将包含重组膜和包膜蛋白的级分分离，并且通过蛋白印迹(图3B)使用兔MR766多克隆抗血清来证实。纯化的重组蛋白具有使用编码SEQ ID No.3的蛋白的基因序列SEQ ID NO.1表达的寨卡病毒的当代亚洲基因型的序列。重组ME蛋白在蛋白印迹和ELISA中与MR766抗体交叉反应，并且被配制为疫苗抗原用于在Balb/c小鼠中测试，如下文部分描述的。
实施例5：疫苗制剂
在具有和不具有佐剂的情况下，在实验室动物中测试前述实施例中的任何前面提及的方法的寨卡病毒疫苗抗原的免疫原性。甚至当在40mcg的高抗原剂量测试时，观察到以0.1mg至1.5mg铝(以氢氧化铝提供)/剂的剂量范围使用的氢氧化铝(2％,Brenntag)作为佐剂的高结合(＞95％)。在所有浓度的寨卡病毒抗原以及随后部分中讨论的用于在小鼠中测试的CHIKV和JE抗原的疫苗组合中，结合是完全的。与氢氧化铝的结合在环境温度进行持续3小时。将等分试样的制剂以5000×g离心5min，并且通过抗原ELISA测试上清液的结合完全性。抗原的结合是完全的，因为在上清液中未通过ELISA检测到抗原。用于佐剂化制剂的缓冲液是10mM磷酸盐缓冲液，其包含154mM NaCl、pH 7.40±0.2并且任选地包含1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸。其他用于特定制剂的缓冲液在下文提及。测试下文列出的佐剂的相对免疫原性，并且在所有情况下，按每疫苗剂量提供浓度。灭活寨卡病毒抗原以10μg/剂进行测试：
a)菊粉以0.5mg/剂进行测试(Orafti-HPX,Beneo)；γ菊粉通过(Cooper和Steele,1988)中描述的方法制备
b)氢氧化铝和菊粉的组合。algammulin，一种菊粉和氢氧化铝的组合，以10:1的比率(10mg/mL菊粉:1mg/mL铝以氢氧化铝)制备，以0.5mg/剂进行测试
c)胞壁酰二肽(L18-MDP)(tlrl-Imdp,Invivogen)以10μg/剂进行测试
d)MPL(单磷酰脂质A，来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，L-6895-1MG,Sigma Aldrich)以25μg/剂进行测试
e)0.25mg铝/剂(以氢氧化铝)和25μg MPL/剂的组合
f)水包油乳液1(OWEM1)，其在10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4±0.2中包含9.75mg角鲨烯(S3626-100ML,Sigma Aldrich)、11.86mgα-生育酚(T3251-5G,Sigma Aldrich)、4.58mg吐温-80(61771205001730,Merck)。
g)水包油乳液2(OWEM2)，其在10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 7.0中包含9.75mg角鲨烯、1.175mg吐温-80、1.175mg Span-85(S7135-250ML,Sigma Aldrich)
h)聚IC(聚肌胞苷酸，钾盐，目录号P9582-5MG,Sigma Aldrich)以25μg/剂测试
i)胆钙化醇(Arachitol,Abbot)以0.75mg/剂进行测试
j)雷西莫特(SML0196-10MG,Sigma Aldrich)+聚IC，各自25μg
g)雷西莫特(25μg)+水包油乳液2，所述水包油乳液2在10mM柠檬酸盐缓冲液，pH7.0中包含9.75mg角鲨烯，1.175mg吐温-80，1.175mg Span-85(S7135-250ML,SigmaAldrich)
l)铝0.25mg/剂和0.5mg/剂，以氢氧化铝提供
所有以上制剂均引发高水平的中和抗体，并且结果描绘于图4中。不同浓度的前面提及的佐剂的单独组分及其任何类似物、衍生物、侧链取代和任何以上组分的任何修饰可以用作无毒疫苗佐剂组分，只要它们具有免疫强化作用。如前面提及的部分中描述的福尔马林灭活和重组寨卡疫苗抗原各自以10μg/剂的浓度与任一种以下赋形剂组合冻干：1％甘露糖醇和0.5％甘氨酸、5％蔗糖和1％海藻糖、5％蔗糖和1％麦芽糖以及2％甘露糖醇和0.5％甘氨酸。干燥的冻干制剂可以容易地重构于含水的、生理盐水和10mM磷酸盐缓冲的盐水pH 7.4±0.2的水性溶液中。在37℃持续两周测试制剂的稳定性。未观察到块状物(cake)特性中的变化，表明制剂的稳定性。含水量低于1％。
实施例6：稳定剂的作用
用以下浓度的稳定剂测试用于作为非佐剂化疫苗抗原使用的福尔马林灭活的疫苗主体的稳定性：a)2％山梨糖醇和1％L-甘氨酸；b)1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸；c)1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸；d)1％甘露糖醇和0.5％L-谷氨酸；e)1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸、1％人血清白蛋白。稳定性测试在37℃进行2周，并且抗原浓度在37℃暴露之前和之后通过ELISA进行测试。在Balb/c小鼠中测试含1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸的1μg和10μg非佐剂化制剂的免疫原性，如在随后部分中讨论的。
实施例7：动物模型中疫苗制剂的效力测试
在Balb/c小鼠中对通过前面提及的方法灭活的寨卡疫苗抗原以从0.125μg抗原/剂至多达40μg抗原/剂的剂量范围与0.25mg铝/剂量(以氢氧化铝)以100μL体积(以每部位50μL以两个部位注射)通过肌内途径在第0天、第14天、第28天进行测试。铝(以氢氧化铝提供)的作用的初始测试显示明矾吸附的疫苗比非佐剂化疫苗产生更高的中和抗体滴度。约1μg和10μg不含明矾的灭活疫苗抗原包含1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸作为赋形剂以赋予疫苗抗原稳定性。在第13天、第21天和第35天从眶后窦抽取血液，以用于通过PRNT50估计中和抗体滴度，通过ELISA估计总Ab滴度、Ab亲合力和细胞因子谱。在每一次剂量之后的血液抽取和测试提供了关于疫苗制品的单个剂量、两个剂量和三个剂量的效力和安全性的数据。将每一只动物在第36天通过静脉内途径用10e5PFU的寨卡病毒攻击。对于福尔马林组以24小时间隔持续多达7天并且对于BPL灭活组以在48小时和96小时的两个时间点通过TCID50(半数组织培养感染剂量)监测血液样品对病毒血症的保护，并且如果有的话，病毒滴度被表示为TCID50/mL。动物攻击研究显示在测试的1μg至40μg剂量组中免于病毒血症的完全保护。因此，在Balb/c小鼠中通过IM途径对BPL和福尔马林灭活疫苗制剂以0.5μg/剂和0.25μg/剂、0.125μg/剂进行测试，并且发现甚至在低稀释度也具有免疫原性。对于明矾佐剂化制剂，0.25mg铝(以氢氧化铝)/剂用作安慰剂对照，并且对于非佐剂化制剂，包含154mM NaCl、1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.40用作媒介物对照。所有福尔马林和BPL灭活制剂均引发高水平的中和抗体并且保护免受病毒血症，如图5A、图5B和图6中描绘的。仅含抗原的制剂也引发高水平的中和抗体，并且保护免受病毒攻击。在昆虫细胞中表达的重组prME蛋白被配制，以10μg/剂和20μg/剂的两个剂量与0.25mg铝(以氢氧化铝)/剂且在第0天和第21天肌内注射到Balb/c(8只(nos))中，以引发中和抗体，并且数据提供于表1中。将10μg剂量浓度并且用每剂量0.25mg铝(以氢氧化铝)配制的γ辐照和过氧化氢灭活的寨卡病毒抗原在第0天和第21天通过IM注射到Balb/c小鼠中，并且在第28天抽取血液以用于通过PRNT50估计中和抗体。将10μg福尔马林灭活的病毒抗原与实施例5中公开的佐剂的每一种配制，并且肌内注射到4-6周龄Balb/c小鼠中(每剂量组5只)，并且在疫苗施用后21天抽取血液以用于估计中和抗体和细胞因子。对于佐剂的每一种，包括对照组，并且未能检测到中和抗体(≤10，通过PRNT50)，数据未示出。使用来自每一组的合并的血清，不同的佐剂化制剂的通过PRNT50的中和抗体滴度呈现于图4中。前面提及的佐剂化制剂引发高水平的中和抗体。
虫媒病毒抗原的组合疫苗以以下浓度制备并且在Balb/c小鼠中测试：a)以三价疫苗组合的10μg福尔马林灭活的寨卡病毒抗原、20μg BPL灭活的基孔肯亚病毒抗原和6μg福尔马林灭活的JE抗原，b)10μg福尔马林灭活的寨卡病毒抗原和20μg BPL灭活的CHIKV病毒抗原，c)10μg福尔马林灭活的寨卡病毒抗原和6μg JE病毒抗原。在Balb/c小鼠(每一组8只)中对所有以上疫苗组合与0.25mg铝(以氢氧化铝)/剂以及适当的对照进行测试，适当的对照包括任一种前面提及的单独的抗原，并且对照动物还接受等同量的明矾。动物在第一次免疫之后的第14天和第21天时被加强。在最后一次加强注射之后的第7天收集血液。血清样品用于通过PRNT50估计针对寨卡、CHIKV和JEV的中和抗体。在所有制剂中使用的缓冲液是包含154mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2至7.6。以上公开的所有方法适于基孔肯亚病毒、寨卡病毒和日本脑炎病毒的任何基因型/基因型变体/血清型和毒株。结果参见表1。
表1：由如实施例中公开的多种抗原制剂引发的中和抗体。
表1图例：与0.25mg铝/剂配制的寨卡病毒的纯化的重组prME抗原和过氧化氢灭活及γ辐照寨卡病毒抗原在Balb/c小鼠中引发中和抗体。滴度被表示为Log10PRNT50值。当两种或更多种抗原以单个制剂施用时，疫苗组合引发中和抗体，并且在JE、寨卡和CHIKV病毒之间未观察到显著的抗原性干扰。
实施例8：被动免疫研究
通过单次注射具有已知滴度的兔多克隆寨卡抗血清证明了中和抗体是保护免受寨卡病毒感染的重要免疫相关物的概念的证据。将用PBS以1:1稀释的约200μL抗血清腹膜内注射到Balb/c小鼠中，并且在8-24小时后通过静脉内途径以100μL体积用10e5PFU的寨卡病毒攻击。等同数目的对照小鼠接受PBS，pH 7.4并且与测试动物一样接受病毒注射。在病毒攻击后的24小时、48小时、72小时、96小时和144小时收集血液用于检测两组动物中的病毒血症。被动免疫提供了针对病毒血症的完全保护，并且通过TCID50未能检测到感染性病毒。参见图7。在病毒攻击之后持续多达6天在对照动物中检测到病毒血症。寨卡抗体可用作治疗剂以改善、消除或预防寨卡病毒感染。
实施例9：对于中和抗体滴度的测定
通过标准程序通过50％蚀斑减少中和测试(PRNT50)测定实施例7中描述的在小鼠中测试所有前面提及的疫苗的动物血清的中和抗体，所述前面提及的疫苗包括用不同灭活剂灭活并且与不同佐剂配制的单价寨卡疫苗、来自剂量范围研究的疫苗抗血清以及前述部分中描述的具有CHIKV和JEV的组合疫苗。简言之，在测定之前一天，将6孔板用每孔2.5×103个Vero细胞(ATCC CCL-81)接种，并且将板在37℃在5％CO2培养箱中孵育。向用MEM稀释4倍的血清样品添加包含MEM的等体积的标准化寨卡病毒毒株(105pfu/mL)并且在37℃在5％CO2孵育90min。将细胞用1×PBS pH 7.4(10mM磷酸盐与150mM NaCl)洗涤两次并将0.30ml每一稀释度的血清病毒混合物添加至对应的孔中并且在37℃在5％CO2培养箱中孵育90min。每一个测定一式三份地进行。用2ml在含1％青霉素-链霉素和1％L-谷氨酰胺的MEM中的0.85％甲基纤维素覆盖细胞。将板在37℃在5％CO2培养箱中孵育4天。在孵育结束时，将蚀斑用10％福尔马林固定，用1×PBS，pH 7.4洗涤并用0.1％结晶紫可视化。将引起由对照病毒样品形成的蚀斑数目降低50％的最高血清稀释度估计为PRNT50滴度。还估计了来自疫苗组合的抗CHIKV和抗JE抗体的PRNT50。所有以上提及的疫苗抗原均引发高水平的中和抗体，如图5和图6中描绘的。
实施例10：寨卡病毒交叉中和研究
福尔马林灭活疫苗抗血清以等同效率交叉中和非洲基因型的同源MR766病毒毒株和亚洲基因型的FSS13025寨卡病毒毒株(GenBank登录号JN860885)，针对MR766和FSS13025毒株的PRNT50滴度分别为18105和18325。(研究BS-3018与IBT Bioservices,Gaithersburg,MD,USA签订合同)。简言之，将MR766和FSS13025寨卡病毒毒株在无血清培养基中稀释至～250PFU。将疫苗抗血清和对照血清(安慰剂)两者以两倍稀释度连续稀释。将病毒样品与连续稀释的血清样品1:1混合并在37℃孵育2小时。将接种于24孔板中的Vero细胞用稀释液感染1小时，并且将0.85％甲基纤维素添加至每一个孔中并孵育3天。将细胞固定并且通过蚀斑测定分析。扫描板并且使用蚀斑计数用4PL曲线拟合计算PRNT50滴度。因此，疫苗抗原制备、配制和测试的方法完全适用于寨卡病毒的任何基因型，因为具有一种基因型的疫苗100％交叉中和异源毒株，并且这也证明不存在寨卡病毒的血清型，并且使用任何毒株的灭活寨卡疫苗与使用任何基因型和基因型变体或甚至任何寨卡病毒毒株制备的疫苗将是等同保护的和有效的。当针对昆虫细胞中表达为prME(SEQ ID No.3的蛋白)的重组蛋白产生的抗体以高效率交叉中和MR766病毒时，该事实被进一步证实。SEQ ID No.3的蛋白来源于寨卡病毒非洲基因型毒株H/PF/013的prME，该毒株是亚洲基因型的更加当代的毒株。编码SEQ ID NO.6的完整ORF的核苷酸SEQ ID NO.5的同源MR766毒株和编码SEQ IDNO.8的完整ORF的SEQ ID No.7的异源FSS13025的疫苗抗血清的交叉中和描绘于图8A和图8B中。
实施例11：抗体ELISA
简言之，在2℃至8℃，以标准化浓度将寨卡病毒抗原在96孔板中的包被缓冲液中包被过夜。弃去板内含物并且将孔用封闭缓冲液封闭并且充分洗涤，然后将疫苗抗血清以连续稀释度添加。每一种疫苗抗血清一式三份地测定。将板在37℃孵育90min，然后添加在抗体稀释缓冲液中以1:2500稀释的第二抗体(抗小鼠IgG HRPO缀合物)。将每一个孔用洗涤缓冲液(PBST,pH 7.4)洗涤5次，并且用PBS(pH 7.4)洗涤3次，每一次30秒。添加约100μl/孔的新鲜制备的底物溶液，并且在环境温度孵育10分钟以用于显色。通过添加50μL/孔终止溶液(stop solution)停止显色。在492nm处读取吸光度并且记录结果。对于每一个测定，包括抗原空白、第一抗体空白和第二抗体空白作为对照。血清转化截止值的值＝暴露前平均滴度+(3×标准差)。鉴定了显示与暴露前水平滴度等同的滴度的阳性血清转化样品的终点稀释度。将阳性血清转化样品的倒数第二个终点稀释度的倒数解释为抗体终点滴度。具有氢氧化铝的BPL灭活和福尔马林灭活寨卡疫苗制剂两者的抗体滴度均高于单独的抗原的抗体滴度。所有剂量的福尔马林灭活的疫苗(图9A-9C)和所有剂量的BPL灭活的疫苗(数据未示出)的疫苗制剂在施用每一个剂量的疫苗后引发高水平的抗体，证实疫苗可以作为单个剂量或两个剂量或更多个剂量施用以用于引发针对寨卡病毒的稳健免疫应答。
实施例12：抗体亲合力
针对疫苗的抗体应答质量通过抗体亲合力测定来估计。抗原-抗体结合亲合力是B细胞中亲和力成熟的程度。在几个疫苗研究中，更高的抗体亲合力与中和抗体相关。在确定亲合力指数之前，以从0M至2.0M的0.25M步长用从0M至6M浓度的异硫氰酸钠(sodiumisothiocyanate)(NaSCN)进行滴定。将第一抗血清添加至抗原包被的板并孵育之后，将板用梯度浓度的NaSCN伴随间歇震摇孵育15min，洗涤并且如以常规ELISA显影。绘制在每一个浓度获得的光密度。最高OD(A)被绘制并减半(halved)(A/2)，并且测量在A/2处的OD曲线之间的距离作为NaSCN转变值(shift value)。与初免剂量相比，在第一加强剂量之后NaSCN转变较高，并且另外在第二加强剂量施用之后保持静态或稍微增加，表明高亲和力抗体随着时间推移并且以加强注射发生。采取ELISA滴定中的参考点计算亲合力指数(AI])，亲合力指数(AI])是使用和不使用离液剂NaSCN处理的血清样品的ELISA中的抗体浓度(通过吸光度测量)的比率。甚至在1μg福尔马林灭活的寨卡疫苗的最低单个剂量浓度也检测到以高亲和力与抗原结合的抗体，表明甚至在低疫苗抗原浓度疫苗也是有效的(参见图10)。
实施例13：细胞因子谱
在施用两个剂量的用包括氢氧化铝的不同佐剂配制的福尔马林灭活的寨卡抗原之后在小鼠血清中估计Th1和Th2细胞因子两者，并且以仅抗原的对照用于比较。使用小鼠ELISA试剂盒-Th1/Th2(目录号88-7711-44,eBioscience)通过使用试剂盒中提供的标准品完全依照试剂盒方案的方法估计IL-2、IFNγ、IL-4和IL-10。细胞因子的浓度以pg/mL表示。Th1细胞因子水平的结果描绘于图11A和图11B中，并且Th2细胞因子的结果描绘于图12A和图12B中。
实施例14：病毒滴度的估计
上游和下游生物过程样品中的感染性病毒颗粒的量、对于动物攻击研究的寨卡病毒滴度通过TCID50(半数组织培养感染剂量)测定来测量。该测定测量在50％细胞中产生致细胞病变效应(CPE)的病毒样品的稀释度。将Vero细胞接种于96孔微板中，并且在37℃在5％CO2中孵育过夜。将细胞用10倍连续稀释度的病毒样品感染，随后在33℃在5％CO2中孵育5d。目视检查细胞的CPE，并且根据Reed和Muench的方法(参考文献)计算TCID50滴度。结果被表示为log10滴度(10xTCID50单位/mL)。可选地，使用蚀斑测定，并且滴度被表示为蚀斑形成单位，PFU/mL。
参考文献
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序列表
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<211> 2121
<212> DNA
<213> prME，寨卡亚洲基因型(prME, Zika Asian genotype)
<400> 1
ctcgaggaat tcggatccaa ctcctaaaaa accgccacca tggcagatac cagcgtcggc 60
atcgtcggac tcttgttgat taccacggca atggcagcag aagtgacccg caggggcagc 120
gcctactaca tgtacctcga caggaacgat gcgggagagg ctatcagctt ccctaccact 180
ttgggcatga acaagtgtta catccagatt atggacctgg gtcacatgtg cgatgctacc 240
atgtcttacg aatgtcctat gctggacgag ggcgtggaac ccgacgatgt cgattgctgg 300
tgtaacacaa cgagtacttg ggtggtgtac ggtacatgtc accataagaa aggtgaagct 360
aggcgttcga ggagagctgt gacgctcccc agtcactcga ccaggaagtt gcagactaga 420
agtcaaacat ggctggagtc gcgcgaatac acaaaacatc tgatcagggt cgaaaactgg 480
attttcagaa accctggatt cgctctcgct gccgcagcga tcgcttggct gctcggttcc 540
agcacctccc aaaaggttat ttacctggtc atgatcttgc tgattgctcc cgcctactcc 600
atccgctgca ttggcgttag caaccgtgac ttcgtggagg gaatgagcgg tggcacttgg 660
gtggatgttg tgttggaaca cggaggttgt gtcacggtta tggctcagga caagccaacc 720
gttgatatcg agctggtcac cactacagtt tctaacatgg ctgaggtcag gtcatactgc 780
tacgaagcct ccatcagcga catggcatct gattcaagat gtccgaccca aggtgaagct 840
tacctcgaca agcagtcaga tactcaatac gtctgcaaac gcacattggt tgaccgtggc 900
tggggaaacg gttgtggcct cttcggaaag ggtagtttgg tcacgtgcgc caaattcgca 960
tgtagtaaga aaatgaccgg caagtcgatc cagccagaga acctggaata ccgcattatg 1020
ctctctgtgc acggaagtca acattcgggt atgatcgtca acgacacggg ccacgagacc 1080
gatgaaaacc gcgccaaggt ggagatcacg cctaactctc cccgtgcaga agctaccctc 1140
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1 5 10 15
Ala Met Ala Ala Glu Val Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr
20 25 30
Leu Asp Arg Asn Asp Ala Gly Glu Ala Ile Ser Phe Pro Thr Thr Leu
35 40 45
Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys
50 55 60
Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val
85 90 95
Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg
100 105 110
Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser
115 120 125
Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val
130 135 140
Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu
165 170 175
Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly
180 185 190
Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val
195 200 205
Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp
210 215 220
Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met
225 230 235 240
Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala
245 250 255
Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln
260 265 270
Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp
275 280 285
Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala
290 295 300
Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly Ser Gln His Ser
325 330 335
Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala
340 345 350
Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly
355 360 365
Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp
370 375 380
Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val
385 390 395 400
His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ala Gly Ala
405 410 415
Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe
420 425 430
Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln
435 440 445
Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met
450 455 460
Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu
465 470 475 480
Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr
485 490 495
Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr
500 505 510
Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val
515 520 525
Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg
530 535 540
Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys
545 550 555 560
Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile
565 570 575
Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser
580 585 590
Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg Met
595 600 605
Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala
610 615 620
Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe
625 630 635 640
Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly
645 650 655
Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser
660 665 670
Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala
675 680 685
Val Ser Ala Asp Val Gly
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Met Ala Ala Glu Ile Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu
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Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp
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Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser
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Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala
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Ala Phe Thr Phe Thr Lys Val Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val
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Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly
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690
<210> 5
<211> 10269
<212> DNA
<213> 寨卡MR766毒株(Zika MR766 strain)
<400> 5
atgaaaaacc caaagaagaa atccggagga ttccggattg tcaatatgct aaaacgcgga 60
gtagcccgtg taaacccctt gggaggtttg aagaggttgc cagccggact tctgctgggt 120
catggaccca tcagaatggt tttggcgata ctagcctttt tgagatttac agcaatcaag 180
ccatcactgg gccttatcaa cagatggggt tccgtgggga aaaaagaggc tatggaaata 240
ataaagaagt tcaagaaaga tcttgctgcc atgttgagaa taatcaatgc taggaaagag 300
aggaagagac gtggcgcaga caccagcatc ggaatcattg gcctcctgct gactacagcc 360
atggcagcag agatcactag acgcgggagt gcatactaca tgtacttgga taggagcgat 420
gccgggaagg ccatttcgtt tgctaccaca ttgggagtga acaagtgcca cgtacagatc 480
atggacctcg ggcacatgtg tgacgccacc atgagttatg agtgccctat gctggatgag 540
ggagtggaac cagatgatgt cgattgctgg tgcaacacga catcaacttg ggttgtgtac 600
ggaacctgtc atcacaaaaa aggtgaggca cggcgatcta gaagagccgt gacgctccct 660
tctcactcta caaggaagtt gcaaacgcgg tcgcagacct ggttagaatc aagagaatac 720
acgaagcact tgatcaaggt tgaaaactgg atattcagga accccgggtt tgcgctagtg 780
gccgttgcca ttgcctggct tttgggaagc tcgacgagcc aaaaagtcat atacttggtc 840
atgatactgc tgattgcccc ggcatacagt atcaggtgca ttggagtcag caatagagac 900
ttcgtggagg gcatgtcagg tgggacctgg gttgatgttg tcttggaaca tggaggctgc 960
gttaccgtga tggcacagga caagccaaca gttgacatag agttggtcac gacgacggtt 1020
agtaacatgg ccgaggtaag atcctattgc tacgaggcat cgatatcgga catggcttcg 1080
gacagtcgtt gcccaacaca aggtgaagcc taccttgaca agcaatcaga cactcaatat 1140
gtctgcaaaa gaacattagt ggacagaggt tggggaaacg gttgtggact ttttggcaaa 1200
gggagcttgg tgacatgtgc caagtttacg tgttctaaga agatgaccgg gaagagcatt 1260
caaccggaaa atctggagta tcggataatg ctatcagtgc atggctccca gcatagcggg 1320
atgattgtca atgatacagg atatgaaact gacgaaaata gagcgaaagt cgaggttacg 1380
cctaattcac caagagcgga agcaaccttg ggaggctttg gaagcttagg acttgactgt 1440
gaaccaagga caggccttga cttttcagat ctgtattacc tgaccatgaa caataagcat 1500
tggttggtgc acaaagagtg gtttcatgac atcccattgc cttggcatgc tggggcagac 1560
accggaactc cacactggaa caacaaagag gcattggtag aattcaagga tgcccacgcc 1620
aagaggcaaa ccgtcgtcgt tctggggagc caggaaggag ccgttcacac ggctctcgct 1680
ggagctctag aggctgagat ggatggtgca aagggaaagc tgttctctgg ccatttgaaa 1740
tgccgcctaa aaatggacaa gcttagattg aagggcgtgt catattcctt gtgcactgcg 1800
gcattcacat tcaccaaggt cccagctgaa acactgcatg gaacagtcac agtggaggtg 1860
cagtatgcag ggacagatgg accctgcaag atcccagtcc agatggcggt ggacatgcag 1920
accctgaccc cagttggaag gctgataacc gccaaccccg tgattactga aagcactgag 1980
aactcaaaga tgatgttgga gcttgaccca ccatttgggg attcttacat tgtcatagga 2040
gttggggaca agaaaatcac ccaccactgg cataggagtg gtagcaccat cggaaaggca 2100
tttgaggcca ctgtgagagg cgccaagaga atggcagtcc tgggggatac agcctgggac 2160
ttcggatcag tcgggggtgt gttcaactca ctgggtaagg gcattcacca gatttttgga 2220
gcagccttca aatcactgtt tggaggaatg tcctggttct cacagatcct cataggcacg 2280
ctgctagtgt ggttaggttt gaacacaaag aatggatcta tctccctcac atgcttggcc 2340
ctggggggag tgatgatctt cctctccacg gctgtttctg ctgacgtggg gtgctcagtg 2400
gacttctcaa aaaaggaaac gagatgtggc acgggggtat tcatctataa tgatgttgaa 2460
gcctggaggg accggtacaa gtaccatcct gactcccccc gcagattggc agcagcagtc 2520
aagcaggcct gggaagaggg gatctgtggg atctcatccg tttcaagaat ggaaaacatc 2580
atgtggaaat cagtagaagg ggagctcaat gctatcctag aggagaatgg agttcaactg 2640
acagttgttg tgggatctgt aaaaaacccc atgtggagag gtccacaaag attgccagtg 2700
cctgtgaatg agctgcccca tggctggaaa gcctggggga aatcgtattt tgttagggcg 2760
gcaaagacca acaacagttt tgttgtcgac ggtgacacac tgaaggaatg tccgcttgag 2820
cacagagcat ggaatagttt tcttgtggag gatcacgggt ttggagtctt ccacaccagt 2880
gtctggctta aggtcagaga agattactca ttagaatgtg acccagccgt cataggaaca 2940
gctgttaagg gaagggaggc cgcgcacagt gatctgggct attggattga aagtgaaaag 3000
aatgacacat ggaggctgaa gagggcccac ctgattgaga tgaaaacatg tgaatggcca 3060
aagtctcaca cattgtggac agatggagta gaagaaagtg atcttatcat acccaagtct 3120
ttagctggtc cactcagcca ccacaacacc agagagggtt acagaaccca agtgaaaggg 3180
ccatggcaca gtgaagagct tgaaatccgg tttgaggaat gtccaggcac caaggtttac 3240
gtggaggaga catgcggaac tagaggacca tctctgagat caactactgc aagtggaagg 3300
gtcattgagg aatggtgctg tagggaatgc acaatgcccc cactatcgtt tcgagcaaaa 3360
gacggctgct ggtatggaat ggagataagg cccaggaaag aaccagagag caacttagtg 3420
aggtcaatgg tgacagcggg gtcaaccgat catatggacc acttctctct tggagtgctt 3480
gtgattctac tcatggtgca ggaggggttg aagaagagaa tgaccacaaa gatcatcatg 3540
agcacatcaa tggcagtgct ggtagtcatg atcttgggag gattttcaat gagtgacctg 3600
gccaagcttg tgatcctgat gggtgctact ttcgcagaaa tgaacactgg aggagatgta 3660
gctcacttgg cattggtagc ggcatttaaa gtcagaccag ccttgctggt ctccttcatt 3720
ttcagagcca attggacacc ccgtgagagc atgctgctag ccctggcttc gtgtcttctg 3780
caaactgcga tctctgctct tgaaggtgac ttgatggtcc tcattaatgg atttgctttg 3840
gcctggttgg caattcgagc aatggccgtg ccacgcactg acaacatcgc tctaccaatc 3900
ttggctgctc taacaccact agctcgaggc acactgctcg tggcatggag agcgggcctg 3960
gctacttgtg gagggatcat gctcctctcc ctgaaaggga aaggtagtgt gaagaagaac 4020
ctgccatttg tcatggccct gggattgaca gctgtgaggg tagtagaccc tattaatgtg 4080
gtaggactac tgttactcac aaggagtggg aagcggagct ggccccctag tgaagttctc 4140
acagccgttg gcctgatatg tgcactggcc ggagggtttg ccaaggcaga cattgagatg 4200
gctggaccca tggctgcagt aggcttgcta attgtcagct atgtggtctc gggaaagagt 4260
gtggacatgt acattgaaag agcaggtgac atcacatggg aaaaggacgc ggaagtcact 4320
ggaaacagtc ctcggcttga cgtggcactg gatgagagtg gtgatttctc cttggtagag 4380
gaagatggtc cacccatgag agagatcata ctcaaggtgg tcctgatggc catctgtggc 4440
atgaacccaa tagctatacc ttttgctgca ggagcgtggt atgtgtatgt gaagactggg 4500
aaaaggagtg gcgccctctg ggacgtgcct gctcccaaag aagtgaagaa aggagagacc 4560
acagatggag tgtacagagt gatgactcgc agactgctag gttcaacaca ggttggagtg 4620
ggagtcatgc aagagggagt cttccacacc atgtggcacg ttacaaaagg agccgcactg 4680
aggagcggtg agggaagact tgatccatac tggggggatg tcaagcagga cttggtgtca 4740
tactgtgggc cttggaagtt ggatgcagct tgggatggac tcagcgaggt acagcttttg 4800
gccgtacctc ccggagagag ggccagaaac attcagaccc tgcctggaat attcaagaca 4860
aaggacgggg acatcggagc agttgctctg gactaccctg cagggacctc aggatctccg 4920
atcctagaca aatgtggaag agtgatagga ctctatggca atggggttgt gatcaagaat 4980
ggaagctatg ttagtgctat aacccaggga aagagggagg aggagactcc ggttgaatgt 5040
ttcgaaccct cgatgctgaa gaagaagcag ctaactgtct tggatctgca tccaggagcc 5100
ggaaaaacca ggagagttct tcctgaaata gtccgtgaag ccataaaaaa gagactccgg 5160
acagtgatct tggcaccaac tagggttgtc gctgctgaga tggaggaggc cttgagagga 5220
cttccggtgc gttacatgac aacagcagtc aacgtcaccc attctgggac agaaatcgtt 5280
gatttgatgt gccatgccac tttcacttca cgcttactac aacccatcag agtccctaat 5340
tacaatctct acatcatgga tgaagcccac ttcacagacc cctcaagtat agctgcaaga 5400
ggatacatat caacaagggt tgaaatgggc gaggcggctg ccatttttat gactgccaca 5460
ccaccaggaa cccgtgatgc gtttcctgac tctaactcac caatcatgga cacagaagtg 5520
gaagtcccag agagagcctg gagctcaggc tttgattggg tgacagacca ttctgggaaa 5580
acagtttggt tcgttccaag cgtgagaaac ggaaatgaaa tcgcagcctg tctgacaaag 5640
gctggaaagc gggtcataca gctcagcagg aagacttttg agacagaatt tcagaaaaca 5700
aaaaatcaag agtgggactt tgtcataaca actgacatct cagagatggg cgccaacttc 5760
aaggctgacc gggtcataga ctctaggaga tgcctaaaac cagtcatact tgatggtgag 5820
agagtcatct tggctgggcc catgcctgtc acgcatgcta gtgctgctca gaggagagga 5880
cgtataggca ggaaccctaa caaacctgga gatgagtaca tgtatggagg tgggtgtgca 5940
gagactgatg aaggccatgc acactggctt gaagcaagaa tgcttcttga caacatctac 6000
ctccaggatg gcctcatagc ctcgctctat cggcctgagg ccgataaggt agccgccatt 6060
gagggagagt ttaagctgag gacagagcaa aggaagacct tcgtggaact catgaagaga 6120
ggagaccttc ccgtctggct agcctatcag gttgcatctg ccggaataac ttacacagac 6180
agaagatggt gctttgatgg cacaaccaac aacaccataa tggaagacag cgtaccagca 6240
gaggtgtgga caaagtatgg agagaagaga gtgctcaaac cgagatggat ggatgctagg 6300
gtctgttcag accatgcggc cctgaagtcg ttcaaagaat tcgccgctgg aaaaagagga 6360
gcggctttgg gagtaatgga ggccctggga acactgccag gacacatgac agagaggttt 6420
caggaagcca ttgacaacct cgccgtgctc atgcgagcag agactggaag caggccttat 6480
aaggcagcgg cagcccaact gccggagacc ctagagacca ttatgctctt aggtttgctg 6540
ggaacagttt cactggggat cttcttcgtc ttgatgcgga ataagggcat cgggaagatg 6600
ggctttggaa tggtaaccct tggggccagt gcatggctca tgtggctttc ggaaattgaa 6660
ccagccagaa ttgcatgtgt cctcattgtt gtgtttttat tactggtggt gctcataccc 6720
gagccagaga agcaaagatc tccccaagat aaccagatgg caattatcat catggtggca 6780
gtgggccttc taggtttgat aactgcaaac gaacttggat ggctggaaag aacaaaaaat 6840
gacatagctc atctaatggg aaggagagaa gaaggagcaa ccatgggatt ctcaatggac 6900
attgatctgc ggccagcctc cgcctgggct atctatgccg cattgacaac tctcatcacc 6960
ccagctgtcc aacatgcggt aaccacttca tacaacaact actccttaat ggcgatggcc 7020
acacaagctg gagtgctgtt tggcatgggc aaagggatgc cattttatgc atgggacctt 7080
ggagtcccgc tgctaatgat gggttgctat tcacaattaa cacccctgac tctgatagta 7140
gctatcattc tgcttgtggc gcactacatg tacttgatcc caggcctaca agcggcagca 7200
gcgcgtgctg cccagaaaag gacagcagct ggcatcatga agaatcccgt tgtggatgga 7260
atagtggtaa ctgacattga cacaatgaca atagaccccc aggtggagaa gaagatggga 7320
caagtgttac tcatagcagt agccatctcc agtgctgtgc tgctgcggac cgcctgggga 7380
tggggggagg ctggagctct gatcacagca gcgacctcca ccttgtggga aggctctcca 7440
aacaaatact ggaactcctc tacagccacc tcactgtgca acatcttcag aggaagctat 7500
ctggcaggag cttcccttat ctatacagtg acgagaaacg ctggcctggt taagagacgt 7560
ggaggtggga cgggagagac tctgggagag aagtggaaag ctcgtctgaa tcagatgtcg 7620
gccctggagt tctactctta taaaaagtca ggtatcactg aagtgtgtag agaggaggct 7680
cgccgtgccc tcaaggatgg agtggccaca ggaggacatg ccgtatcccg gggaagtgca 7740
aagctcagat ggttggtgga gagaggatat ctgcagccct atgggaaggt tgttgacctc 7800
ggatgtggca gagggggctg gagctattat gccgccacca tccgcaaagt gcaggaggtg 7860
agaggataca caaagggagg tcccggtcat gaagaaccca tgctggtgca aagctatggg 7920
tggaacatag ttcgtctcaa gagtggagtg gacgtcttcc acatggcggc tgagccgtgt 7980
gacactctgc tgtgtgacat aggtgagtca tcatctagtc ctgaagtgga agagacacga 8040
acactcagag tgctctctat ggtgggggac tggcttgaaa aaagaccagg ggccttctgt 8100
ataaaggtgc tgtgcccata caccagcact atgatggaaa ccatggagcg actgcaacgt 8160
aggcatgggg gaggattagt cagagtgcca ttgtctcgca actccacaca tgagatgtac 8220
tgggtctctg gggcaaagag caacatcata aaaagtgtgt ccaccacaag tcagctcctc 8280
ctgggacgca tggatggccc caggaggcca gtgaaatatg aggaggatgt gaacctcggc 8340
tcgggtacac gagctgtggc aagctgtgct gaggctccta acatgaaaat catcggcagg 8400
cgcattgaga gaatccgcaa tgaacatgca gaaacatggt ttcttgatga aaaccaccca 8460
tacaggacat gggcctacca tgggagctac gaagccccca cgcaaggatc agcgtcttcc 8520
ctcgtgaacg gggttgttag actcctgtca aagccttggg acgtggtgac tggagttaca 8580
ggaatagcca tgactgacac cacaccatac ggccaacaaa gagtcttcaa agaaaaagtg 8640
gacaccaggg tgccagatcc ccaagaaggc actcgccagg taatgaacat agtctcttcc 8700
tggctgtgga aggagctggg gaaacgcaag cggccacgcg tctgcaccaa agaagagttt 8760
atcaacaagg tgcgcagcaa tgcagcactg ggagcaatat ttgaagagga aaaagaatgg 8820
aagacggctg tggaagctgt gaatgatcca aggttttggg ccctagtgga tagggagaga 8880
gaacaccacc tgagaggaga gtgtcacagc tgtgtgtaca acatgatggg aaaaagagaa 8940
aagaagcaag gagagttcgg gaaagcaaaa ggtagccgcg ccatctggta catgtggttg 9000
ggagccagat tcttggagtt tgaagccctt ggattcttga acgaggacca ttggatggga 9060
agagaaaact caggaggtgg agtcgaaggg ttaggattgc aaagacttgg atacattcta 9120
gaagaaatga atcgggcacc aggaggaaag atgtacgcag atgacactgc tggctgggac 9180
acccgcatta gtaagtttga tctggagaat gaagctctga ttaccaacca aatggaggaa 9240
gggcacagaa ctctggcgtt ggccgtgatt aaatacacat accaaaacaa agtggtgaag 9300
gttctcagac cagctgaagg aggaaaaaca gttatggaca tcatttcaag acaagaccag 9360
agagggagtg gacaagttgt cacttatgct ctcaacacat tcaccaactt ggtggtgcag 9420
cttatccgga acatggaagc tgaggaagtg ttagagatgc aagacttatg gttgttgagg 9480
aagccagaga aagtgaccag atggttgcag agcaatggat gggatagact caaacgaatg 9540
gcggtcagtg gagatgactg cgttgtgaag ccaatcgatg ataggtttgc acatgccctc 9600
aggttcttga atgacatggg aaaagttagg aaagacacac aggagtggaa accctcgact 9660
ggatggagca attgggaaga agtcccgttc tgctcccacc acttcaacaa gctgtacctc 9720
aaggatggga gatccattgt ggtcccttgc cgccaccaag atgaactgat tggccgagct 9780
cgcgtctcac caggggcagg atggagcatc cgggagactg cctgtcttgc aaaatcatat 9840
gcgcagatgt ggcagctcct ttatttccac agaagagacc ttcgactgat ggctaatgcc 9900
atttgctcgg ctgtgccagt tgactgggta ccaactggga gaaccacctg gtcaatccat 9960
ggaaagggag aatggatgac cactgaggac atgctcatgg tgtggaatag agtgtggatt 10020
gaggagaacg accatatgga ggacaagact cctgtaacaa aatggacaga cattccctat 10080
ctaggaaaaa gggaggactt atggtgtgga tcccttatag ggcacagacc ccgcaccact 10140
tgggctgaaa acatcaaaga cacagtcaac atggtgcgca ggatcatagg tgatgaagaa 10200
aagtacatgg actatctatc cacccaagtc cgctacttgg gtgaggaagg gtccacaccc 10260
ggagtgttg 10269
<210> 6
<211> 3423
<212> PRT
<213> 完整ORF，寨卡MR766毒株(Complete ORF, Zika MR766 strain)
<400> 6
Met Lys Asn Pro Lys Lys Lys Ser Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Asn Pro Leu Gly Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu
35 40 45
Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly
50 55 60
Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile
65 70 75 80
Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn
85 90 95
Ala Arg Lys Glu Arg Lys Arg Arg Gly Ala Asp Thr Ser Ile Gly Ile
100 105 110
Ile Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Ala Glu Ile Thr Arg Arg
115 120 125
Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Gly Lys Ala
130 135 140
Ile Ser Phe Ala Thr Thr Leu Gly Val Asn Lys Cys His Val Gln Ile
145 150 155 160
Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro
165 170 175
Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn
180 185 190
Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly
195 200 205
Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr
210 215 220
Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr
225 230 235 240
Thr Lys His Leu Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly
245 250 255
Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr
260 265 270
Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala
275 280 285
Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly
290 295 300
Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys
305 310 315 320
Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val
325 330 335
Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu
340 345 350
Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly
355 360 365
Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg
370 375 380
Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
385 390 395 400
Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr
405 410 415
Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser
420 425 430
Val His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly Tyr
435 440 445
Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Val Thr Pro Asn Ser Pro
450 455 460
Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys
465 470 475 480
Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met
485 490 495
Asn Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro
500 505 510
Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn
515 520 525
Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr
530 535 540
Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Lys Leu Phe Ser
565 570 575
Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly
580 585 590
Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Val Pro
595 600 605
Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly
610 615 620
Thr Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Val Gln Met Ala Val Asp Met Gln
625 630 635 640
Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr
645 650 655
Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe
660 665 670
Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Lys Lys Ile Thr His
675 680 685
His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr
690 695 700
Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp
705 710 715 720
Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His
725 730 735
Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp
740 745 750
Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn
755 760 765
Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val
770 775 780
Met Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala Asp Val Gly Cys Ser Val
785 790 795 800
Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Ile Tyr
805 810 815
Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser
820 825 830
Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Glu Gly Ile
835 840 845
Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Lys Ser
850 855 860
Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu
865 870 875 880
Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln
885 890 895
Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp
900 905 910
Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val
915 920 925
Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Glu His Arg Ala Trp
930 935 940
Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser
945 950 955 960
Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala
965 970 975
Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Arg Glu Ala Ala His Ser Asp Leu
980 985 990
Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg
995 1000 1005
Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His
1010 1015 1020
Thr Leu Trp Thr Asp Gly Val Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro
1025 1030 1035
Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg Glu Gly
1040 1045 1050
Tyr Arg Thr Gln Val Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu Glu
1055 1060 1065
Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val Tyr Val Glu Glu
1070 1075 1080
Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
1085 1090 1095
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro
1100 1105 1110
Pro Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu
1115 1120 1125
Ile Arg Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met
1130 1135 1140
Val Thr Ala Gly Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu Gly
1145 1150 1155
Val Leu Val Ile Leu Leu Met Val Gln Glu Gly Leu Lys Lys Arg
1160 1165 1170
Met Thr Thr Lys Ile Ile Met Ser Thr Ser Met Ala Val Leu Val
1175 1180 1185
Val Met Ile Leu Gly Gly Phe Ser Met Ser Asp Leu Ala Lys Leu
1190 1195 1200
Val Ile Leu Met Gly Ala Thr Phe Ala Glu Met Asn Thr Gly Gly
1205 1210 1215
Asp Val Ala His Leu Ala Leu Val Ala Ala Phe Lys Val Arg Pro
1220 1225 1230
Ala Leu Leu Val Ser Phe Ile Phe Arg Ala Asn Trp Thr Pro Arg
1235 1240 1245
Glu Ser Met Leu Leu Ala Leu Ala Ser Cys Leu Leu Gln Thr Ala
1250 1255 1260
Ile Ser Ala Leu Glu Gly Asp Leu Met Val Leu Ile Asn Gly Phe
1265 1270 1275
Ala Leu Ala Trp Leu Ala Ile Arg Ala Met Ala Val Pro Arg Thr
1280 1285 1290
Asp Asn Ile Ala Leu Pro Ile Leu Ala Ala Leu Thr Pro Leu Ala
1295 1300 1305
Arg Gly Thr Leu Leu Val Ala Trp Arg Ala Gly Leu Ala Thr Cys
1310 1315 1320
Gly Gly Ile Met Leu Leu Ser Leu Lys Gly Lys Gly Ser Val Lys
1325 1330 1335
Lys Asn Leu Pro Phe Val Met Ala Leu Gly Leu Thr Ala Val Arg
1340 1345 1350
Val Val Asp Pro Ile Asn Val Val Gly Leu Leu Leu Leu Thr Arg
1355 1360 1365
Ser Gly Lys Arg Ser Trp Pro Pro Ser Glu Val Leu Thr Ala Val
1370 1375 1380
Gly Leu Ile Cys Ala Leu Ala Gly Gly Phe Ala Lys Ala Asp Ile
1385 1390 1395
Glu Met Ala Gly Pro Met Ala Ala Val Gly Leu Leu Ile Val Ser
1400 1405 1410
Tyr Val Val Ser Gly Lys Ser Val Asp Met Tyr Ile Glu Arg Ala
1415 1420 1425
Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Asp Ala Glu Val Thr Gly Asn Ser
1430 1435 1440
Pro Arg Leu Asp Val Ala Leu Asp Glu Ser Gly Asp Phe Ser Leu
1445 1450 1455
Val Glu Glu Asp Gly Pro Pro Met Arg Glu Ile Ile Leu Lys Val
1460 1465 1470
Val Leu Met Ala Ile Cys Gly Met Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe
1475 1480 1485
Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser
1490 1495 1500
Gly Ala Leu Trp Asp Val Pro Ala Pro Lys Glu Val Lys Lys Gly
1505 1510 1515
Glu Thr Thr Asp Gly Val Tyr Arg Val Met Thr Arg Arg Leu Leu
1520 1525 1530
Gly Ser Thr Gln Val Gly Val Gly Val Met Gln Glu Gly Val Phe
1535 1540 1545
His Thr Met Trp His Val Thr Lys Gly Ala Ala Leu Arg Ser Gly
1550 1555 1560
Glu Gly Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Asp Val Lys Gln Asp Leu
1565 1570 1575
Val Ser Tyr Cys Gly Pro Trp Lys Leu Asp Ala Ala Trp Asp Gly
1580 1585 1590
Leu Ser Glu Val Gln Leu Leu Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Ala
1595 1600 1605
Arg Asn Ile Gln Thr Leu Pro Gly Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly
1610 1615 1620
Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Ser Gly
1625 1630 1635
Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly Leu Tyr Gly
1640 1645 1650
Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly Ser Tyr Val Ser Ala Ile Thr
1655 1660 1665
Gln Gly Lys Arg Glu Glu Glu Thr Pro Val Glu Cys Phe Glu Pro
1670 1675 1680
Ser Met Leu Lys Lys Lys Gln Leu Thr Val Leu Asp Leu His Pro
1685 1690 1695
Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu
1700 1705 1710
Ala Ile Lys Lys Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg
1715 1720 1725
Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val
1730 1735 1740
Arg Tyr Met Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu
1745 1750 1755
Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu
1760 1765 1770
Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu
1775 1780 1785
Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile
1790 1795 1800
Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr
1805 1810 1815
Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser
1820 1825 1830
Pro Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro Glu Arg Ala Trp Ser
1835 1840 1845
Ser Gly Phe Asp Trp Val Thr Asp His Ser Gly Lys Thr Val Trp
1850 1855 1860
Phe Val Pro Ser Val Arg Asn Gly Asn Glu Ile Ala Ala Cys Leu
1865 1870 1875
Thr Lys Ala Gly Lys Arg Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys Thr Phe
1880 1885 1890
Glu Thr Glu Phe Gln Lys Thr Lys Asn Gln Glu Trp Asp Phe Val
1895 1900 1905
Ile Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Asp
1910 1915 1920
Arg Val Ile Asp Ser Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val Ile Leu Asp
1925 1930 1935
Gly Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val Thr His Ala
1940 1945 1950
Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Lys
1955 1960 1965
Pro Gly Asp Glu Tyr Met Tyr Gly Gly Gly Cys Ala Glu Thr Asp
1970 1975 1980
Glu Gly His Ala His Trp Leu Glu Ala Arg Met Leu Leu Asp Asn
1985 1990 1995
Ile Tyr Leu Gln Asp Gly Leu Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Pro Glu
2000 2005 2010
Ala Asp Lys Val Ala Ala Ile Glu Gly Glu Phe Lys Leu Arg Thr
2015 2020 2025
Glu Gln Arg Lys Thr Phe Val Glu Leu Met Lys Arg Gly Asp Leu
2030 2035 2040
Pro Val Trp Leu Ala Tyr Gln Val Ala Ser Ala Gly Ile Thr Tyr
2045 2050 2055
Thr Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Thr Thr Asn Asn Thr Ile
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Lys Arg Val Leu Lys Pro Arg Trp Met Asp Ala Arg Val Cys Ser
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Asp His Ala Ala Leu Lys Ser Phe Lys Glu Phe Ala Ala Gly Lys
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2120 2125 2130
Gly His Met Thr Glu Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Leu Ala
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Val Leu Met Arg Ala Glu Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Lys Ala Ala
2150 2155 2160
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Leu Leu Gly Thr Val Ser Leu Gly Ile Phe Phe Val Leu Met Arg
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Asn Lys Gly Ile Gly Lys Met Gly Phe Gly Met Val Thr Leu Gly
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Ala Ser Ala Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile Glu Pro Ala Arg
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Ala Ile Ile Ile Met Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr
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Met Asp Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Ala Ile Tyr Ala
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Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala
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Asp Gly Ile Val Val Thr Asp Ile Asp Thr Met Thr Ile Asp Pro
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Ile Ser Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Ala Trp Gly Trp Gly Glu
2450 2455 2460
Ala Gly Ala Leu Ile Thr Ala Ala Thr Ser Thr Leu Trp Glu Gly
2465 2470 2475
Ser Pro Asn Lys Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Ala Thr Ser Leu Cys
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Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ile Tyr
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2510 2515 2520
Thr Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ala Arg Leu Asn Gln
2525 2530 2535
Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr Lys Lys Ser Gly Ile Thr
2540 2545 2550
Glu Val Cys Arg Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Lys Asp Gly Val
2555 2560 2565
Ala Thr Gly Gly His Ala Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg
2570 2575 2580
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2600 2605 2610
Ile Arg Lys Val Gln Glu Val Arg Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Pro
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2630 2635 2640
Val Arg Leu Lys Ser Gly Val Asp Val Phe His Met Ala Ala Glu
2645 2650 2655
Pro Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser
2660 2665 2670
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Gly Asp Trp Leu Glu Lys Arg Pro Gly Ala Phe Cys Ile Lys Val
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Leu Cys Pro Tyr Thr Ser Thr Met Met Glu Thr Met Glu Arg Leu
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Ile Ile Lys Ser Val Ser Thr Thr Ser Gln Leu Leu Leu Gly Arg
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Leu Gly Ser Gly Thr Arg Ala Val Ala Ser Cys Ala Glu Ala Pro
2780 2785 2790
Asn Met Lys Ile Ile Gly Arg Arg Ile Glu Arg Ile Arg Asn Glu
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Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala
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Ser Ser Leu Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp
2840 2845 2850
Asp Val Val Thr Gly Val Thr Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr
2855 2860 2865
Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg
2870 2875 2880
Val Pro Asp Pro Gln Glu Gly Thr Arg Gln Val Met Asn Ile Val
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Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys Arg Lys Arg Pro Arg
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Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Asn Lys Val Arg Ser Asn Ala
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Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu Lys Glu Trp Lys Thr Ala
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Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys His Ser Cys Val Tyr
2960 2965 2970
Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys
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Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg
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Gln Arg Leu Gly Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Ala Pro Gly
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Gly Lys Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile
3050 3055 3060
Ser Lys Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met
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Lys Thr Val Met Asp Ile Ile Ser Arg Gln Asp Gln Arg Gly Ser
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Val Gln Leu Ile Arg Asn Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met
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Leu Gln Ser Asn Gly Trp Asp Arg Leu Lys Arg Met Ala Val Ser
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Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala His
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Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly
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Arg Ala Arg Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr
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Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr
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Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser
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Ala Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser
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Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Met
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Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Asp His Met Glu Asp
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Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ser Thr Pro Gly Val Leu
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<210> 7
<211> 10269
<212> DNA
<213> 寨卡毒株FSS13025 (Zika strain FSS13025)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4429)..(4429)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6882)..(6882)
<223> n是a、c、g、t或u
<400> 7
atgaaaaacc caaagaagaa atccggagga ttccggattg tcaatatgct aaaacgcgga 60
gtagcccgtg tgagcccctt tgggggcttg aagaggctgc cagccggact tctgctgggt 120
catgggccca tcaggatggt cttggcgatt ctagcctttt tgagattcac ggcaatcaag 180
ccatcactgg gtctcatcaa tagatggggt tcagtgggga aaaaagaggc tatggaaata 240
ataaagaagt ttaagaaaga tctggctgcc atgctgagaa taatcaatgc taggaaggag 300
aagaagagac gaggcacaga tactagtgtc ggaattgttg gcctcctgct gaccacagcc 360
atggcagtgg aggtcactag acgtgggaat gcatactata tgtacttgga cagaagcgat 420
gctggggagg ccatatcttt tccaaccaca atggggatga ataagtgtta tatacagatc 480
atggatcttg gacacatgtg tgatgccacc atgagctatg aatgccctat gctggatgag 540
ggggtagaac cagatgacgt cgattgttgg tgcaacacga cgtcaacttg ggttgtgtac 600
ggaacctgcc accacaaaaa aggtgaagca cggagatcta gaagagctgt gacgctcccc 660
tcccattcca ctaggaagct gcaaacgcgg tcgcagacct ggttggaatc aagagaatac 720
acaaagcacc tgattagagt cgaaaattgg atattcagga accctggctt cgcgttagca 780
gcagctgcca tcgcttggct tttgggaagc tcaacgagcc aaaaagtcat atacttggtc 840
atgatactgc tgattgcccc ggcatacagc atcaggtgca taggagtcag caatagggac 900
tttgtggaag gtatgtcagg tgggacttgg gttgatgttg tcttggaaca tggaggttgt 960
gttaccgtaa tggcacagga caaaccgact gtcgacatag agctggttac aacaacagtc 1020
agcaacatgg cggaggtaag atcctactgc tatgaggcat caatatcgga catggcttcg 1080
gacagccgct gcccaacaca aggtgaagcc taccttgaca agcaatcaga cactcaatat 1140
gtctgcaaaa gaacgttagt ggacagaggc tggggaaatg gatgtggact ttttggcaaa 1200
gggagcctgg tgacatgcgc taagtttgct tgctctaaga aaatgaccgg gaagagcatc 1260
cagccagaga atctggagta ccggataatg ctgtcagttc atggctccca gcacagtggg 1320
atgatcgtta atgatacagg acatgaaact gatgagaata gagcgaaggt tgagataacg 1380
cccaattcac caagagccga agccaccctg gggggttttg gaagcctagg acttgattgt 1440
gaaccgagga caggccttga cttttcagat ttgtattact tgactatgaa taacaagcac 1500
tggttggttc acaaggagtg gttccacgac attccattac cttggcatgc tggggcagac 1560
accggaactc cacactggaa caacaaagaa gcactggtag agttcaagga cgcacatgcc 1620
aaaaggcaga ctgtcgtggt tctagggagt caagaaggag cagttcacac ggcccttgct 1680
ggagctctgg aggctgagat ggatggtgca aagggaaggc tgtcctctgg ccacttgaaa 1740
tgtcgcctga aaatggataa acttagattg aagggcgtgt catactcctt gtgtaccgca 1800
gcgttcacat tcactaagat cccggctgaa acactgcacg ggacagtcac agtggaggta 1860
cagtacgcag ggacagatgg accttgcaag gttccagctc agatggcggt ggacatgcaa 1920
actctgaccc cagttgggag gttgataacc gctaaccctg taatcactga aagcactgag 1980
aactccaaga tgatgctgga actggatcca ccatttgggg actcttacat tgtcatagga 2040
gtcggggaaa agaagatcac ccaccactgg cacaggagtg gcagcaccat tggaaaagca 2100
tttgaagcca ctgtgagagg tgccaagaga atggcagtct tgggagacac agcctgggac 2160
tttggatcag ttgggggtgc tctcaactca ctgggcaagg gcatccatca aatttttgga 2220
gcagctttca aatcattgtt tggaggaatg tcctggttct cacaaattct cattggaacg 2280
ttgctggtgt ggttgggtct gaatacaaag aatggatcta tttcccttat gtgcttggcc 2340
ttagggggag tgttgatctt cttatccaca gccgtctctg ctgatgtggg gtgctcggtg 2400
gacttctcaa agaaggaaac gagatgcggt acaggggtgt tcgtctataa cgacgttgaa 2460
gcttggaggg acaggtacaa gtaccatcct gactcccctc gtagattggc agcagcagtc 2520
aagcaagcct gggaagatgg gatctgtggg atctcctctg tttcaagaat ggaaaacatc 2580
atgtggagat cagtagaagg ggagctcaac gcaatcctgg aagagaatgg agttcaactg 2640
acggtcgttg tgggatctgt aaaaaacccc atgtggagag gtccacagag attgcccgtg 2700
cctgtgaacg agctgcccca tggctggaag gcttggggga aatcgtactt cgtcagggca 2760
gcaaagacaa ataacagctt tgtcgtggat ggtgacacac tgaaggaatg cccactcaaa 2820
catagagcat ggaacagctt tcttgtggag gatcatgggt tcggggtatt tcacactagt 2880
gtctggctca aggttagaga agattattca ttagagtgtg atccagccgt cattggaaca 2940
gccgctaagg gaaaggaggc tgtgcacagt gatctaggct actggattga gagtgagaag 3000
aacgacacat ggaggctgaa gagggcccac ctgatcgaga tgaaaacatg tgaatggcca 3060
aagtcccaca cattgtggac agatggaata gaagaaagtg atctgatcat acccaagtct 3120
ttagctgggc cactcagcca tcacaacacc agagagggct acaggaccca aatgaaaggg 3180
ccatggcata gtgaagagct tgaaattcgg tttgaggaat gcccaggcac taaggtccac 3240
gtggaggaaa catgtggaac aagaggacca tctctgagat caaccactgc aagcggaagg 3300
gtgatcgagg aatggtgctg cagggagtgc acaatgcccc cactgtcgtt ccgggctaaa 3360
gatggttgtt ggtatggaat ggagataagg cccaggaaag aaccagaaag taacttagta 3420
aggtcaatgg tgactgcagg atcaactgat cacatggatc acttctccct tggagtgctt 3480
gtgattctgc tcatggtaca ggaagggcta aagaagagaa tgaccacaaa gatcatcata 3540
agcacatcaa tggcagtgct ggtagctatg atcctgggag gattttcaat gagtgacctg 3600
gctaagcttg caattttgat gggtgccacc ttcgcggaaa tgaacactgg aggagatgtt 3660
gctcatctgg cgctgatagc ggcattcaaa gtcagacctg cgttgctggt atctttcatt 3720
ttcagagcta attggacacc ccgtgagagc atgctgctgg ccttggcctc gtgtcttctg 3780
caaactgcga tctccgcctt ggaaggcgac ctgatggttc ccatcaatgg ttttgctttg 3840
gcctggttgg caatacgagc gatggttgtt ccacgcactg acaacatcac cttggcaatc 3900
ctggctgctc tgacaccact ggcccggggc acactgcttg tggcgtggag agcaggcctt 3960
gctacttgcg gggggttcat gctcctttct ctgaagggga aaggcagtgt gaagaagaac 4020
ttaccatttg tcatggccct gggactaacc gctgtgaggc tggtcgaccc catcaacgtg 4080
gtgggactgc tgttgctcac aaggagtggg aagcggagct ggccccctag tgaagtactc 4140
acagctgttg gcctgatatg cgcattggct ggagggttcg ccaaggcgga tatagagatg 4200
gctgggccca tggccgcggt cggtctgcta attgtcagtt acgtggtctc aggaaagagt 4260
gtggacatgt acattgaaag agcaggtgac atcacatggg aaaaagatgc ggaagtcact 4320
ggaaacagtc cccggctcga tgtggcacta gatgagagtg gtgatttctc cctagtggag 4380
gatgatggtc cccccatgag agagatcata ctcaaagtgg tcctgatgnc catctgtggc 4440
atgaacccaa tagccatacc ctttgcagct ggagcgtggt acgtgtatgt gaagactgga 4500
aaaaggagtg gtgctctatg ggatgtgcct gctcccaagg aagtaaaaaa gggggagacc 4560
acagatggag tgtacagagt aatgactcgt agactgctag gttcaacaca agttggagtg 4620
ggagtcatgc aagagggggt cttccacact atgtggcacg tcacaaaagg atccgcgctg 4680
agaagcggtg aagggagact tgatccatac tggggagatg tcaagcagga tctggtgtca 4740
tactgtggtc catggaagct agatgccgcc tgggacgggc acagcgaggt gcagctcttg 4800
gccgtgcccc ccggagagag agcgaggaac atccagactc tgcccggaat atttaagaca 4860
aaggatgggg acattggagc agttgcgctg gactacccag caggaacttc aggatctcca 4920
atcctagata agtgtgggag agtgatagga ctctatggta atggggtcgt gatcaaaaat 4980
gggagttacg ttagtgccat cacccaaggg aggagggagg aagagactcc tgttgagtgc 5040
ttcgagcctt cgatgctgaa gaagaagcag ctaactgtct tagacttgca tcctggagct 5100
gggaaaacca ggagagttct tcctgaaata gtccgtgaag ccataaaaac aagactccgc 5160
actgtgatct tagctccaac cagggttgtc gctgctgaaa tggaggaagc ccttagaggg 5220
cttccagtgc gttatatgac aacagcagtc aatgtcaccc attctgggac agaaatcgtt 5280
gacttaatgt gccatgccac cttcacttca cgtctactac agccaatcag agtccccaac 5340
tataatctgt atattatgga tgaggcccac ttcacagatc cctcaagtat agcagcaaga 5400
ggatacattt caacaagggt tgagatgggc gaggcggctg ccatcttcat gactgccacg 5460
ccaccaggaa cccgtgacgc attcccggac tccaactcac caattatgga caccgaagtg 5520
gaagtcccag agagagcctg gagctcaggc tttgattggg tgacggatca ttctggaaaa 5580
acagtttggt ttgttccaag cgtgaggaat ggcaatgaga tcgcagcttg tctgacaaag 5640
gctggaaaac gggtcataca gctcagcaga aagacttttg agacagagtt ccagaaaaca 5700
aaacatcaag agtgggactt cgtcgtgaca actgacattt cagagatggg cgccaacttt 5760
aaagctgacc gtgtcataga ttccaggaga tgcctaaagc cggtcatact tgatggcgag 5820
agagtcattc tggctggacc catgcctgtc acacatgcca gcgctgccca gaggaggggg 5880
cgcataggca ggaaccccaa caaacctgga gatgagtatc tgtatggagg tgggtgcgca 5940
gagactgatg aagaccatgc acactggctt gaagcaagaa tgcttcttga caacatttac 6000
ctccaagatg gcctcatagc ctcgctctat cgacctgagg ccgacaaagt agcagctatt 6060
gagggagagt tcaagcttag gacggagcaa aggaagacct ttgtggaact catgaaaaga 6120
ggagatcttc ctgtttggct ggcctatcag gttgcatctg ccggaataac ctacacagat 6180
agaagatggt gctttgatgg cacgaccaac aacaccataa tggaagacag tgtgccggca 6240
gaggtgtgga ccagatacgg agagaaaaga gtgctcaaac cgaggtggat ggacgccaga 6300
gtttgttcag atcatgcggc cctgaagtca ttcaaagagt ttgccgctgg gaaaagagga 6360
gcggcctttg gagtgatgga agccctggga acactgccag gacatatgac agagagattc 6420
caggaggcca ttgacaacct cgctgtgctc atgcgggcag agactggaag caggccctac 6480
aaagccgcgg cggcccaatt accggagacc ctagagacta tcatgctttt ggggttgctg 6540
ggaacagtct cgctgggaat ctttttcgtc ttgatgcgga acaagggcat agggaagatg 6600
ggctttggaa tggtgactct tggggccagc gcatggctta tgtggctctc ggaaattgag 6660
ccagccagaa ttgcatgtgt cctcattgtt gtgttcctat tgctggtggt gctcatacct 6720
gagccagaaa agcaaagatc tccccaggac aaccaaatgg caatcatcat catggtagca 6780
gtgggtcttc tgggcttgat taccgccaat gaactcggat ggttggagag aacaaagagt 6840
gacctaagcc atctaatggg aaggagagag gagggggcaa cnataggatt ctcaatggac 6900
attgacctgc ggccagcctc agcttgggct atctatgctg ctctgacaac tttcattacc 6960
ccagccgtcc aacatgcagt gaccacttca tacaacaact actccttaat ggcgatggcc 7020
acgcaagctg gagtgttgtt cggtatgggt aaagggatgc cattctatgc atgggacttt 7080
ggagtcccgc tgctaatgat aggttgctac tcacaattaa cacccctgac cctaatagtg 7140
gccatcattt tgctcgtggc gcactacatg tacttgatcc cagggctgca ggcagcagct 7200
gcgcgtgctg cccagaagag aacggcagct ggcatcatga agaaccctgt tgtggatgga 7260
atagtggtga ctgacattga cacaatgaca attgaccccc aagtggagaa aaagatggga 7320
caggtgctac tcatagcagt agctgtctcc agcgccatac tgtcgcggac cgcctggggg 7380
tggggtgagg ctggggccct gatcacagct gcaacttcca ctttgtggga gggctctccg 7440
aacaagtact ggaactcctc cacagccacc tcactgtgta acatttttag gggaagctac 7500
ttggctggag cttctctaat ctacacagta acaagaaacg ctggcttggt caagagacgt 7560
gggggtggaa cgggagagac cctgggagag aaatggaagg cccgcctgaa ccagatgtcg 7620
gccctggagt tctactccta caaaaagtca ggcatcaccg aggtgtgcag agaagaggcc 7680
cgccgcgccc tcaaggacgg tgtggcaacg ggaggccacg ctgtgtcccg aggaagtgca 7740
aagctgagat ggttggtgga gaggggatac ctgcagccct atggaaaggt cattgatctt 7800
ggatgtggca gagggggctg gagttactat gccgccacca tccgcaaagt tcaagaagtg 7860
aaaggataca caaaaggagg ccctggtcat gaagaaccca tgttggtgca aagctatggg 7920
tggaacatag tccgtcttaa gagtggggtg gacgtctttc atatggcggc tgagccgtgt 7980
gacacgttgc tgtgtgatat aggtgagtca tcatctagtc ctgaagtgga agaagcacgg 8040
acgctcagag tcctctccat ggtgggggat tggcttgaaa aaagaccagg agccttttgt 8100
ataaaagtgt tgtgcccata caccagcact atgatggaaa ccctggagcg actgcagcgt 8160
aggtatgggg gaggactggt cagagtgcca ctctcccgca actctacaca tgagatgtac 8220
tgggtctctg gagcgaaaag caacaccata aaaagtgtgt ccaccacgag ccagctcctt 8280
ttggggcgca tggacgggcc caggaggcca gtgaaatatg aagaggatgt gaatctcggc 8340
tctggcacgc gggctgtggt aagctgcgct gaagctccca acatgaagat cattggtaac 8400
cgcattgaga ggatccgcag tgagcacgcg gaaacgtggt tctttgacga gaaccaccca 8460
tataggacat gggcttacca tggaagctac gaggccccca cacaagggtc agcgtcctct 8520
ctaataaacg gggttgtcag gctcctgtca aaaccctggg atgtggtgac tggagtcaca 8580
ggaatagcca tgaccgacac cacaccgtat ggtcagcaaa gagttttcaa ggaaaaagtg 8640
gacactaggg tgccagaccc ccaagaaggc actcgtcagg ttatgagcat ggtctcttcc 8700
tggttgtgga aagagttagg caaacacaaa cggccacgag tctgtaccaa agaagagttc 8760
atcaacaagg ttcgtagcaa cgcagcatta ggggcaatat ttgaagagga aaaagagtgg 8820
aagactgcag tggaagctgt gaacgatcca aggttctggg ctctagtgga caaggaaaga 8880
gagcaccacc tgagaggaga gtgccagagc tgtgtgtaca acatgatggg aaaaagagaa 8940
aagaaacaag gggaatttgg aaaggccaag ggcagccgcg ccatctggta catgtggcta 9000
ggggctagat ttctagagtt cgaagccctt ggattcttga acgaggatca ctggatgggg 9060
agagagaatt caggaggtgg tgttgaaggg ctaggattac aaagactcgg atatgtctta 9120
gaagagatga gtcgcatacc aggaggaagg atgtatgcag atgatactgc tggctgggac 9180
acccgcatca gcaggtttga tctggagaat gaagctctaa tcaccaacca aatggagaaa 9240
gggcacaggg ccttggcatt ggccataatc aagtacacat accaaaacaa agtggtaaag 9300
gtccttagac cagctgaaaa agggaagaca gttatggaca ttatttcaag acaagaccaa 9360
agggggagcg gacaagttgt cacttacgct cttaatacat ttaccaacct agtggtgcag 9420
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aggtcagaga aagtgaccaa ctggttgcag agcaatggat gggataggct caaacgaatg 9540
gcagtcagtg gagatgattg cgttgtgaaa ccaattgatg ataggtttgc acatgctctc 9600
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aaggacggga ggtccattgt ggttccctgc cgccaccaag atgaactgat tggccgagct 9780
cgcgtctcac cgggggcggg atggagcatc cgggagactg cttgcctagc aaaatcatat 9840
gcgcaaatgt ggcagctcct ttatttccac agaagggacc tccgactgat ggccaatgcc 9900
atttgttcat ctgtgccagt tgactgggtt ccaactggga gaactacctg gtcaatccat 9960
ggaaagggag aatggatgac cactgaagac atgcttgtgg tgtggaacag agtgtggatt 10020
gaggagaacg accacatgga agacaagacc ccagttacga aatggacaga cattccctat 10080
ttgggaaaaa gggaagactt gtggtgtggg tctctcatag ggcacagacc gcgcaccacc 10140
tgggctgaga acattaaaaa cacagtcaac atgatgcgta ggatcatagg tgatgaagaa 10200
aagtacgtgg actacctatc cacccaagtt cgctacttgg gcgaagaagg gtccacacct 10260
ggagtgcta 10269
<210> 8
<211> 3423
<212> PRT
<213> 完整ORF，寨卡毒株FSS13025 (Complete ORF, Zika strain FSS13025)
<400> 8
Met Lys Asn Pro Lys Lys Lys Ser Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu
35 40 45
Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly
50 55 60
Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile
65 70 75 80
Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn
85 90 95
Ala Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile
100 105 110
Val Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Val Glu Val Thr Arg Arg
115 120 125
Gly Asn Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Gly Glu Ala
130 135 140
Ile Ser Phe Pro Thr Thr Met Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile
145 150 155 160
Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro
165 170 175
Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn
180 185 190
Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly
195 200 205
Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr
210 215 220
Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr
225 230 235 240
Thr Lys His Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly
245 250 255
Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr
260 265 270
Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala
275 280 285
Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly
290 295 300
Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys
305 310 315 320
Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val
325 330 335
Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu
340 345 350
Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly
355 360 365
Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg
370 375 380
Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
385 390 395 400
Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr
405 410 415
Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser
420 425 430
Val His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His
435 440 445
Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro
450 455 460
Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys
465 470 475 480
Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met
485 490 495
Asn Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro
500 505 510
Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn
515 520 525
Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr
530 535 540
Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly
580 585 590
Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro
595 600 605
Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly
610 615 620
Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln
625 630 635 640
Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr
645 650 655
Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe
660 665 670
Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His
675 680 685
His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr
690 695 700
Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp
705 710 715 720
Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His
725 730 735
Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp
740 745 750
Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn
755 760 765
Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val
770 775 780
Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala Asp Val Gly Cys Ser Val
785 790 795 800
Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Val Tyr
805 810 815
Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser
820 825 830
Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Asp Gly Ile
835 840 845
Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg Ser
850 855 860
Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu
865 870 875 880
Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln
885 890 895
Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp
900 905 910
Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val
915 920 925
Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Lys His Arg Ala Trp
930 935 940
Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser
945 950 955 960
Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala
965 970 975
Val Ile Gly Thr Ala Ala Lys Gly Lys Glu Ala Val His Ser Asp Leu
980 985 990
Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg
995 1000 1005
Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His
1010 1015 1020
Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro
1025 1030 1035
Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg Glu Gly
1040 1045 1050
Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu Glu
1055 1060 1065
Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu
1070 1075 1080
Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
1085 1090 1095
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro
1100 1105 1110
Pro Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu
1115 1120 1125
Ile Arg Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met
1130 1135 1140
Val Thr Ala Gly Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu Gly
1145 1150 1155
Val Leu Val Ile Leu Leu Met Val Gln Glu Gly Leu Lys Lys Arg
1160 1165 1170
Met Thr Thr Lys Ile Ile Ile Ser Thr Ser Met Ala Val Leu Val
1175 1180 1185
Ala Met Ile Leu Gly Gly Phe Ser Met Ser Asp Leu Ala Lys Leu
1190 1195 1200
Ala Ile Leu Met Gly Ala Thr Phe Ala Glu Met Asn Thr Gly Gly
1205 1210 1215
Asp Val Ala His Leu Ala Leu Ile Ala Ala Phe Lys Val Arg Pro
1220 1225 1230
Ala Leu Leu Val Ser Phe Ile Phe Arg Ala Asn Trp Thr Pro Arg
1235 1240 1245
Glu Ser Met Leu Leu Ala Leu Ala Ser Cys Leu Leu Gln Thr Ala
1250 1255 1260
Ile Ser Ala Leu Glu Gly Asp Leu Met Val Pro Ile Asn Gly Phe
1265 1270 1275
Ala Leu Ala Trp Leu Ala Ile Arg Ala Met Val Val Pro Arg Thr
1280 1285 1290
Asp Asn Ile Thr Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Thr Pro Leu Ala
1295 1300 1305
Arg Gly Thr Leu Leu Val Ala Trp Arg Ala Gly Leu Ala Thr Cys
1310 1315 1320
Gly Gly Phe Met Leu Leu Ser Leu Lys Gly Lys Gly Ser Val Lys
1325 1330 1335
Lys Asn Leu Pro Phe Val Met Ala Leu Gly Leu Thr Ala Val Arg
1340 1345 1350
Leu Val Asp Pro Ile Asn Val Val Gly Leu Leu Leu Leu Thr Arg
1355 1360 1365
Ser Gly Lys Arg Ser Trp Pro Pro Ser Glu Val Leu Thr Ala Val
1370 1375 1380
Gly Leu Ile Cys Ala Leu Ala Gly Gly Phe Ala Lys Ala Asp Ile
1385 1390 1395
Glu Met Ala Gly Pro Met Ala Ala Val Gly Leu Leu Ile Val Ser
1400 1405 1410
Tyr Val Val Ser Gly Lys Ser Val Asp Met Tyr Ile Glu Arg Ala
1415 1420 1425
Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Asp Ala Glu Val Thr Gly Asn Ser
1430 1435 1440
Pro Arg Leu Asp Val Ala Leu Asp Glu Ser Gly Asp Phe Ser Leu
1445 1450 1455
Val Glu Asp Asp Gly Pro Pro Met Arg Glu Ile Ile Leu Lys Val
1460 1465 1470
Val Leu Met Ala Ile Cys Gly Met Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe
1475 1480 1485
Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser
1490 1495 1500
Gly Ala Leu Trp Asp Val Pro Ala Pro Lys Glu Val Lys Lys Gly
1505 1510 1515
Glu Thr Thr Asp Gly Val Tyr Arg Val Met Thr Arg Arg Leu Leu
1520 1525 1530
Gly Ser Thr Gln Val Gly Val Gly Val Met Gln Glu Gly Val Phe
1535 1540 1545
His Thr Met Trp His Val Thr Lys Gly Ser Ala Leu Arg Ser Gly
1550 1555 1560
Glu Gly Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Asp Val Lys Gln Asp Leu
1565 1570 1575
Val Ser Tyr Cys Gly Pro Trp Lys Leu Asp Ala Ala Trp Asp Gly
1580 1585 1590
His Ser Glu Val Gln Leu Leu Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Ala
1595 1600 1605
Arg Asn Ile Gln Thr Leu Pro Gly Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly
1610 1615 1620
Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Ser Gly
1625 1630 1635
Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly Leu Tyr Gly
1640 1645 1650
Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly Ser Tyr Val Ser Ala Ile Thr
1655 1660 1665
Gln Gly Arg Arg Glu Glu Glu Thr Pro Val Glu Cys Phe Glu Pro
1670 1675 1680
Ser Met Leu Lys Lys Lys Gln Leu Thr Val Leu Asp Leu His Pro
1685 1690 1695
Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu
1700 1705 1710
Ala Ile Lys Thr Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg
1715 1720 1725
Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val
1730 1735 1740
Arg Tyr Met Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu
1745 1750 1755
Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu
1760 1765 1770
Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu
1775 1780 1785
Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile
1790 1795 1800
Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr
1805 1810 1815
Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser
1820 1825 1830
Pro Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro Glu Arg Ala Trp Ser
1835 1840 1845
Ser Gly Phe Asp Trp Val Thr Asp His Ser Gly Lys Thr Val Trp
1850 1855 1860
Phe Val Pro Ser Val Arg Asn Gly Asn Glu Ile Ala Ala Cys Leu
1865 1870 1875
Thr Lys Ala Gly Lys Arg Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys Thr Phe
1880 1885 1890
Glu Thr Glu Phe Gln Lys Thr Lys His Gln Glu Trp Asp Phe Val
1895 1900 1905
Val Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Asp
1910 1915 1920
Arg Val Ile Asp Ser Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val Ile Leu Asp
1925 1930 1935
Gly Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val Thr His Ala
1940 1945 1950
Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Lys
1955 1960 1965
Pro Gly Asp Glu Tyr Leu Tyr Gly Gly Gly Cys Ala Glu Thr Asp
1970 1975 1980
Glu Asp His Ala His Trp Leu Glu Ala Arg Met Leu Leu Asp Asn
1985 1990 1995
Ile Tyr Leu Gln Asp Gly Leu Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Pro Glu
2000 2005 2010
Ala Asp Lys Val Ala Ala Ile Glu Gly Glu Phe Lys Leu Arg Thr
2015 2020 2025
Glu Gln Arg Lys Thr Phe Val Glu Leu Met Lys Arg Gly Asp Leu
2030 2035 2040
Pro Val Trp Leu Ala Tyr Gln Val Ala Ser Ala Gly Ile Thr Tyr
2045 2050 2055
Thr Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Thr Thr Asn Asn Thr Ile
2060 2065 2070
Met Glu Asp Ser Val Pro Ala Glu Val Trp Thr Arg Tyr Gly Glu
2075 2080 2085
Lys Arg Val Leu Lys Pro Arg Trp Met Asp Ala Arg Val Cys Ser
2090 2095 2100
Asp His Ala Ala Leu Lys Ser Phe Lys Glu Phe Ala Ala Gly Lys
2105 2110 2115
Arg Gly Ala Ala Phe Gly Val Met Glu Ala Leu Gly Thr Leu Pro
2120 2125 2130
Gly His Met Thr Glu Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Leu Ala
2135 2140 2145
Val Leu Met Arg Ala Glu Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Lys Ala Ala
2150 2155 2160
Ala Ala Gln Leu Pro Glu Thr Leu Glu Thr Ile Met Leu Leu Gly
2165 2170 2175
Leu Leu Gly Thr Val Ser Leu Gly Ile Phe Phe Val Leu Met Arg
2180 2185 2190
Asn Lys Gly Ile Gly Lys Met Gly Phe Gly Met Val Thr Leu Gly
2195 2200 2205
Ala Ser Ala Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile Glu Pro Ala Arg
2210 2215 2220
Ile Ala Cys Val Leu Ile Val Val Phe Leu Leu Leu Val Val Leu
2225 2230 2235
Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Pro Gln Asp Asn Gln Met
2240 2245 2250
Ala Ile Ile Ile Met Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr
2255 2260 2265
Ala Asn Glu Leu Gly Trp Leu Glu Arg Thr Lys Ser Asp Leu Ser
2270 2275 2280
His Leu Met Gly Arg Arg Glu Glu Gly Ala Thr Ile Gly Phe Ser
2285 2290 2295
Met Asp Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Ala Ile Tyr Ala
2300 2305 2310
Ala Leu Thr Thr Phe Ile Thr Pro Ala Val Gln His Ala Val Thr
2315 2320 2325
Thr Ser Tyr Asn Asn Tyr Ser Leu Met Ala Met Ala Thr Gln Ala
2330 2335 2340
Gly Val Leu Phe Gly Met Gly Lys Gly Met Pro Phe Tyr Ala Trp
2345 2350 2355
Asp Phe Gly Val Pro Leu Leu Met Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Leu
2360 2365 2370
Thr Pro Leu Thr Leu Ile Val Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His
2375 2380 2385
Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala
2390 2395 2400
Ala Gln Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn Pro Val Val
2405 2410 2415
Asp Gly Ile Val Val Thr Asp Ile Asp Thr Met Thr Ile Asp Pro
2420 2425 2430
Gln Val Glu Lys Lys Met Gly Gln Val Leu Leu Ile Ala Val Ala
2435 2440 2445
Val Ser Ser Ala Ile Leu Ser Arg Thr Ala Trp Gly Trp Gly Glu
2450 2455 2460
Ala Gly Ala Leu Ile Thr Ala Ala Thr Ser Thr Leu Trp Glu Gly
2465 2470 2475
Ser Pro Asn Lys Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Ala Thr Ser Leu Cys
2480 2485 2490
Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ile Tyr
2495 2500 2505
Thr Val Thr Arg Asn Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Gly Gly Gly
2510 2515 2520
Thr Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ala Arg Leu Asn Gln
2525 2530 2535
Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr Lys Lys Ser Gly Ile Thr
2540 2545 2550
Glu Val Cys Arg Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Lys Asp Gly Val
2555 2560 2565
Ala Thr Gly Gly His Ala Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg
2570 2575 2580
Trp Leu Val Glu Arg Gly Tyr Leu Gln Pro Tyr Gly Lys Val Ile
2585 2590 2595
Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Ala Ala Thr
2600 2605 2610
Ile Arg Lys Val Gln Glu Val Lys Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Pro
2615 2620 2625
Gly His Glu Glu Pro Met Leu Val Gln Ser Tyr Gly Trp Asn Ile
2630 2635 2640
Val Arg Leu Lys Ser Gly Val Asp Val Phe His Met Ala Ala Glu
2645 2650 2655
Pro Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser
2660 2665 2670
Pro Glu Val Glu Glu Ala Arg Thr Leu Arg Val Leu Ser Met Val
2675 2680 2685
Gly Asp Trp Leu Glu Lys Arg Pro Gly Ala Phe Cys Ile Lys Val
2690 2695 2700
Leu Cys Pro Tyr Thr Ser Thr Met Met Glu Thr Leu Glu Arg Leu
2705 2710 2715
Gln Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Leu Val Arg Val Pro Leu Ser Arg
2720 2725 2730
Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val Ser Gly Ala Lys Ser Asn
2735 2740 2745
Thr Ile Lys Ser Val Ser Thr Thr Ser Gln Leu Leu Leu Gly Arg
2750 2755 2760
Met Asp Gly Pro Arg Arg Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asp Val Asn
2765 2770 2775
Leu Gly Ser Gly Thr Arg Ala Val Val Ser Cys Ala Glu Ala Pro
2780 2785 2790
Asn Met Lys Ile Ile Gly Asn Arg Ile Glu Arg Ile Arg Ser Glu
2795 2800 2805
His Ala Glu Thr Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr
2810 2815 2820
Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala
2825 2830 2835
Ser Ser Leu Ile Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp
2840 2845 2850
Asp Val Val Thr Gly Val Thr Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr
2855 2860 2865
Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg
2870 2875 2880
Val Pro Asp Pro Gln Glu Gly Thr Arg Gln Val Met Ser Met Val
2885 2890 2895
Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys His Lys Arg Pro Arg
2900 2905 2910
Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Asn Lys Val Arg Ser Asn Ala
2915 2920 2925
Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu Lys Glu Trp Lys Thr Ala
2930 2935 2940
Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Lys
2945 2950 2955
Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys Gln Ser Cys Val Tyr
2960 2965 2970
Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys
2975 2980 2985
Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg
2990 2995 3000
Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp
3005 3010 3015
Met Gly Arg Glu Asn Ser Gly Gly Gly Val Glu Gly Leu Gly Leu
3020 3025 3030
Gln Arg Leu Gly Tyr Val Leu Glu Glu Met Ser Arg Ile Pro Gly
3035 3040 3045
Gly Arg Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile
3050 3055 3060
Ser Arg Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met
3065 3070 3075
Glu Lys Gly His Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr
3080 3085 3090
Tyr Gln Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys Gly
3095 3100 3105
Lys Thr Val Met Asp Ile Ile Ser Arg Gln Asp Gln Arg Gly Ser
3110 3115 3120
Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Val
3125 3130 3135
Val Gln Leu Ile Arg Asn Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met
3140 3145 3150
Gln Asp Leu Trp Leu Leu Arg Arg Ser Glu Lys Val Thr Asn Trp
3155 3160 3165
Leu Gln Ser Asn Gly Trp Asp Arg Leu Lys Arg Met Ala Val Ser
3170 3175 3180
Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala His
3185 3190 3195
Ala Leu Arg Phe Leu Asn Asp Met Gly Lys Val Arg Lys Asp Thr
3200 3205 3210
Gln Glu Trp Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp Glu Glu Val
3215 3220 3225
Pro Phe Cys Ser His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys Asp Gly
3230 3235 3240
Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly
3245 3250 3255
Arg Ala Arg Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr
3260 3265 3270
Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr
3275 3280 3285
Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser
3290 3295 3300
Ser Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser
3305 3310 3315
Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Val
3320 3325 3330
Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Asp His Met Glu Asp
3335 3340 3345
Lys Thr Pro Val Thr Lys Trp Thr Asp Ile Pro Tyr Leu Gly Lys
3350 3355 3360
Arg Glu Asp Leu Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly His Arg Pro Arg
3365 3370 3375
Thr Thr Trp Ala Glu Asn Ile Lys Asn Thr Val Asn Met Met Arg
3380 3385 3390
Arg Ile Ile Gly Asp Glu Glu Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Ser Thr
3395 3400 3405
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ser Thr Pro Gly Val Leu
3410 3415 3420

Claims (69)

1.一种稳定的疫苗组合物，所述稳定的疫苗组合物包含选自寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的一种或更多种虫媒病毒抗原，所述抗原在具有或不具有佐剂的情况下被配制在药学上可接受的缓冲液中，其中所述疫苗组合物在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒抗原对治疗、诊断和预防寨卡病毒的任何基因型/基因型变体/毒株有效。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述组合物针对在基因组的任何区域中在氨基酸水平共有50％至100％之间的任何同一性的任何基因型/基因型变体/毒株/合成寨卡病毒有效。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含任何基因型/基因型变体/毒株/合成寨卡病毒的寨卡病毒抗原，其中针对任何前面提及的寨卡病毒类型的抗体交叉中和同源病毒或在其全基因组的任何区域特别是包膜E蛋白中共有至少50％-100％氨基酸同一性的任何异源寨卡病毒毒株。
5.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的所述抗原是灭活全病毒体(病毒)抗原。
6.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒抗原和基孔肯亚病毒抗原是纯化的重组抗原。
7.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒抗原使用Vero细胞作为细胞基质通过使病毒适应于Vero细胞来制备。
8.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒抗原是由选自以下的一种或更多种方法获得的纯化且浓缩的抗原：
a.超速离心；
b.密度梯度离心；
c.使用膜过滤澄清病毒收获物，随后通过柱层析纯化；和
d.使用具有从100kDa至300kDa的截止值的膜的切向流动过滤，其中切向过滤在病毒灭活之前或之后进行。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述通过柱层析纯化包括凝胶过滤、混合模式树脂柱层析、离子交换柱层析、亲和基质层析和疏水相互作用层析。
10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其中所述柱层析在流通液中洗脱大部分所述病毒抗原，所述柱层析诸如Capto Core 700，最优选地Capto Core 700，其中所述病毒样品在Capto Core 700柱上纯化，并且在流通液中洗脱。
11.如权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒通过化学灭活剂、物理灭活剂和辐照剂中的至少一种或更多种来灭活。
12.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒的灭活在所述病毒纯化之前或之后进行。
13.如权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒通过选自福尔马林(甲醛)、β丙内酯(BPL)和过氧化氢的化学灭活剂灭活。
14.如权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒通过选自以下的以下方法的任何一种灭活：
a.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在8℃至37℃，优选地25℃±3℃，持续至少1天至7天的福尔马林处理；
b.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少10至30天的福尔马林处理；
c.以范围从1:500至多达1:4000v/v BPL:病毒的任何浓度，在范围从8℃至30℃的温度持续至少24小时至48小时，优选地25±3℃持续48小时的β丙内酯(从此以后称为BPL)；
d.以范围从1:500至多达1:4000v/v(BPL:病毒，v/v)的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少3-7天的β丙内酯；
e.在任何前面提及的条件的BPL和福尔马林的组合，优选地在15℃至30℃，优选地25℃±3℃，以1:3000(BPL:病毒，v/v)持续24小时的BPL灭活，随后是以1:3000(福尔马林:病毒，v/v)持续24小时至48小时的福尔马林灭活；
f.以从0.1％至3％，优选地0.1％至1％的任何浓度在从20℃-30℃的任何温度持续5分钟至120分钟的过氧化氢。
15.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒通过辐照剂的灭活包括通过来自60Co源的从20kGy(千戈瑞)至多达35kGy，优选地25kGy至30kGy的暴露通过γ辐照的灭活。
16.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒通过辐照剂的灭活包括通过暴露于254nm持续30-60分钟通过UV辐照的灭活。
17.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述病毒通过在50℃至65℃之间的温度持续30min至多达2小时的热处理来灭活。
18.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述缓冲液选自包括以下的列表：磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、含甘氨酸或组氨酸作为缓冲剂之一的缓冲液。
19.如权利要求18所述的疫苗组合物，其中磷酸盐缓冲液是在6.50至pH 9之间的任何pH的5mM至多达200mM浓度的磷酸根离子和任选地包含在50mM至200mM浓度的氯化钠的磷酸钠缓冲液。
20.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述缓冲液在从病毒培养直至制备纯化的灭活病毒主体的整个生物过程中将液体组合物的pH维持高于pH 6.5，优选地高于pH 7.0。
21.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒的灭活在选自以下的稳定剂的存在下进行：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、异麦芽糖、棉子糖、水苏糖、乳二糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖酸、右旋糖酐、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和人血清白蛋白或其组合。
22.如权利要求21所述的疫苗组合物，其中所述稳定剂选自：
a.2％山梨糖醇和1％L-甘氨酸；
b.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸；
c.1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸；
d.1％甘露糖醇和0.5％L-谷氨酸；以及
e.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸、1％人血清白蛋白。
23.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒的灭活包括任何基因型/毒株、活的减毒寨卡病毒、去活化病毒、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中、在载体化疫苗中携带任何寨卡病毒抗原特别是E蛋白的嵌合病毒颗粒、和使用任何寨卡病毒基因组的序列在体外或在体内得到的感染性合成病毒颗粒的灭活。
24.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中纯化的重组寨卡病毒包含寨卡病毒的抗原作为疫苗抗原用于引发免疫应答以用于预防寨卡病毒感染，所述寨卡病毒的抗原包含包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和任选地非结构1(NS1)蛋白。
25.如权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒具有如在分别对应于核苷酸序列SEQ ID.No.1和SEQ ID No.2的SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4中公开的结构蛋白序列，用于作为针对由基因型或其变体引起的寨卡病毒感染的疫苗抗原使用。
26.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述重组DNA构建体包含(i)载体，(ii)对应于分别编码SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的蛋白的氨基酸序列的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的至少一种核酸片段，其适用于与前面提及的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4共有至少70％氨基酸同一性的任何寨卡病毒蛋白序列。
27.如权利要求26所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含重组DNA构建体，其中所述载体是被克隆到真核宿主中的真核质粒载体，诸如用于在昆虫细胞中表达为病毒样颗粒(VLP)的杆状病毒。
28.如权利要求24所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒的所述重组蛋白通过包括以下步骤的过程获得：
a.将所述重组质粒DNA转染到昆虫细胞中；
b.收获所述细胞并且从中分离所述重组蛋白；
c.通过选自以下的方法纯化所述蛋白：离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水柱层析、混合模式树脂层析、渗滤、超速离心、密度梯度离心和用盐分级分离。
29.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中寨卡病毒的所述结构抗原在任何原核表达系统或真核表达系统中表达，包括在昆虫细胞中的杆状病毒介导的表达。
30.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述组合物通过这样的过程获得，其中中和抗体主要针对以下中的包膜蛋白被引发：诸如在最佳灭活病毒、活的减毒病毒、去活化病毒、DNA疫苗、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中诸如在载体化疫苗中展示所述寨卡病毒E蛋白的嵌合病毒颗粒和来源于任何寨卡病毒基因组RNA序列的合成病毒颗粒中。
31.如权利要求1所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包含佐剂。
32.如权利要求31所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种的组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。
33.如权利要求32所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含0.1mg至1.5mg铝/疫苗剂量，优选地0.25mg至0.5mg铝/疫苗剂量的浓度范围内的氢氧化铝。
34.如权利要求32所述的疫苗组合物，其中当在哺乳动物中施用时所述佐剂赋予粘膜免疫和全身免疫。
35.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中具有寨卡病毒抗原的组合物在具有或不具有佐剂的情况下以从0.125μg/剂至100μg/剂的范围的任何剂量作为单个剂量或以两个剂量或更多个剂量被施用，以在哺乳动物中引发免疫应答。
36.一种在哺乳动物包括人类中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括通过包括肌内、皮内、皮下、静脉内、口服、鼻内或经皮途径的任何途径施用如权利要求1所述的疫苗组合物。
37.一种施用如权利要求1所述的疫苗组合物的方法，所述方法通过包括针和包括预填充注射器的注射器、微针贴片、无针贴片、吸入和鼻腔喷雾剂的任何方法进行。
38.一种在体外或在体内使用如权利要求1所述的组合物的寨卡病毒抗体用于制备用于寨卡病毒感染的免疫诊断剂和免疫治疗剂的方法。
39.如权利要求1所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含呈组合疫苗的寨卡病毒抗原和日本脑炎病毒抗原，所述组合疫苗在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答。
40.如权利要求39所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒抗原和日本脑炎病毒灭活抗原在不具有佐剂或具有佐剂的药学上可接受的制剂中以范围在5μg至50μg每种抗原的浓度存在于组合疫苗中。
41.如权利要求40所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种的组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。
42.如权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是具有0.25mg至1.0mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
43.如权利要求1所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含呈组合疫苗的寨卡病毒抗原和基孔肯亚病毒抗原，所述组合疫苗在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答。
44.如权利要求43所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒抗原和基孔肯亚病毒抗原在不具有佐剂或具有佐剂的药学上可接受的制剂中以范围在5μg至50μg每种抗原的浓度存在于组合疫苗中。
45.如权利要求44所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种的组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。
46.如权利要求45所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是在0.25mg至1.5mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
47.如权利要求1所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含呈组合疫苗的寨卡病毒抗原、基孔肯亚病毒抗原和日本脑炎病毒抗原，所述组合疫苗在哺乳动物中引发针对所述病毒的每一种的保护性免疫应答。
48.如权利要求47所述的疫苗组合物，其中所述寨卡病毒抗原、基孔肯亚病毒抗原和日本脑炎病毒抗原在不具有佐剂或具有佐剂的药学上可接受的制剂中以范围在5μg至50μg每种抗原的浓度存在于组合疫苗中。
49.如权利要求48所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：a)包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝磷酸盐的铝盐；b)菊粉；c)algammulin，其是菊粉和氢氧化铝的组合；d)单磷酰脂质A(MPL)；e)雷西莫特；f)胞壁酰二肽(MDP)；g)N-羟乙酰基二肽(GMDP)；h)聚IC；i)CpG寡核苷酸；j)氢氧化铝与MPL；k)任何油包水乳液；l)包含以下成分中的一种或更多种的水包油乳液：角鲨烯或其类似物或任何药学上可接受的油、吐温-80、脱水山梨糖醇三油酸酯、α-生育酚、胆钙化醇和水性缓冲液，或其分子的任何类似物和衍生物，i)任何前面提及的佐剂的两种或更多种的组合，当与寨卡病毒抗原一起配制时引发针对所述病毒的免疫应答。
50.如权利要求49所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是在0.25mg至1.5mg铝含量/疫苗剂量的氢氧化铝。
51.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述组合物任选地包含在2.5mg/mL至5mg/mL的浓度的2-苯氧乙醇防腐剂。
52.如权利要求1所述的疫苗组合物，当在哺乳动物中以单个剂量或以两个剂量或更多个剂量施用时，引发针对包括寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的虫媒病毒抗原的任何一个的Th1和Th2免疫应答两者并且适于施用至人类。
53.一种用于制备包含选自寨卡病毒、基孔肯亚病毒和日本脑炎病毒的一种或更多种虫媒病毒抗原的疫苗组合物的方法，所述方法包括灭活、生产重组蛋白、表达结构抗原、纯化和浓缩所述病毒抗原中的一个或更多个步骤，其中寨卡病毒的所述纯化和浓缩包括选自以下的一个或更多个步骤：
a.超速离心；
b.密度梯度离心；
c.使用膜过滤澄清病毒收获物；
d.通过柱层析纯化；
e.使用具有从100kDa至300kDa的截止值的膜的切向流动过滤，其中切向过滤在病毒灭活之前或之后进行。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述柱层析方法包括凝胶过滤、混合模式树脂柱层析、任何离子交换柱层析、亲和基质层析和疏水相互作用层析。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述纯化包括通过柱层析方法的纯化，所述柱层析方法在流通液中洗脱大部分病毒抗原，所述柱层析方法诸如Capto Core 700，最优选地Capto Core 700，其中病毒样品在Capto Core 700柱上纯化，并且在流通液中洗脱。
56.如权利要求53所述的方法，其中寨卡病毒通过选自化学灭活剂、物理灭活剂和辐照剂的一种或更多种灭活剂来灭活。
57.如权利要求53所述的方法，其中寨卡病毒的灭活在所述病毒纯化之前或之后进行。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述寨卡病毒通过选自福尔马林(甲醛)、β丙内酯(BPL)和过氧化氢的化学灭活剂灭活。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述寨卡病毒主体通过选自以下的以下方法的任何一种灭活：
a.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在8℃至37℃，优选地25℃±3℃，持续至少1天至7天的福尔马林处理；
b.以范围从1:500至多达1:4000v/v福尔马林:病毒的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少10天至30天的福尔马林处理；
c.以范围从1:500至多达1:4000v/v BPL:病毒的任何浓度，持续至少24小时至48小时(如果不是更多的话)，在范围从8℃至30℃的温度，优选地25℃±3℃，持续48小时的β丙内酯(从此以后称为BPL)；
d.以范围从1:500至多达1:4000v/v(BPL:病毒，v/v)的任何浓度，在2℃至8℃，持续至少3-7天的β丙内酯；
e.在任何前面提及的条件BPL和福尔马林的组合，优选地以下组合：在15℃至30℃，优选地25℃±3℃，以1:3000(BPL:病毒，v/v)持续24小时的BPL灭活，随后是以1:3000(福尔马林:病毒，v/v)持续24小时至48小时福尔马林灭活；
f.以从0.1％至3％，优选地0.1％至1％的任何浓度在20℃-30℃的任何温度，持续5分钟至120分钟的过氧化氢。
60.如权利要求56所述的方法，其中所述病毒通过来自60Co源的从20kGy(千戈瑞)至多达35kGy，优选地25kGy至30kGy的暴露通过γ辐照来灭活。
61.如权利要求56所述的方法，其中所述寨卡病毒通过暴露于254nm持续30-60分钟通过UV辐照来灭活。
62.如权利要求56所述的方法，其中所述寨卡病毒通过从50℃至65℃持续30min至多达2小时，优选地65℃持续1小时的热处理来灭活。
63.如权利要求56所述的方法，其中灭活在选自以下的稳定剂的存在下进行：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、异麦芽糖、棉子糖、水苏糖、乳二糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖酸、右旋糖酐、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和人血清白蛋白或其组合。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述稳定剂选自：
a.2％山梨糖醇和1％L-甘氨酸；
b.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸；
c.1％甘露糖醇和0.5％L-甘氨酸；
d.1％甘露糖醇和0.5％L-谷氨酸；以及
e.1％山梨糖醇和0.5％L-甘氨酸，1％人血清白蛋白。
65.如权利要求56所述的方法，其中所述灭活方法适于寨卡病毒的任何基因型/毒株、活的减毒寨卡病毒、去活化病毒、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中、在载体化疫苗中携带任何寨卡病毒抗原特别地E蛋白的嵌合病毒颗粒、和使用任何寨卡病毒基因组的序列在体外或在体内得到的感染性合成病毒颗粒。
66.如权利要求53所述的方法，其中制备所述重组蛋白的方法包括以下的步骤：
a.将重组质粒DNA转染到昆虫细胞中；
b.收获所述细胞并且从中分离所述重组蛋白；
c.通过包括以下的方法的至少一种纯化所述蛋白：离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水柱层析、混合模式树脂层析、渗滤、超速离心、密度梯度离心、用盐分级分离。
67.如权利要求53所述的方法，其中表达寨卡病毒的所述结构抗原的方法包括表达系统为任何原核或真核表达系统，包括昆虫细胞中的杆状病毒介导的表达。
68.如权利要求53所述的方法，其中所述方法包括中和抗体，所述中和抗体主要地针对以下的包膜蛋白被引发：诸如在最佳灭活病毒、活的减毒病毒、去活化病毒、DNA疫苗、病毒样颗粒、在任何异源病毒骨架中诸如在载体化疫苗中展示所述寨卡病毒E蛋白的嵌合病毒颗粒和来源于任何寨卡病毒基因组RNA序列的合成病毒颗粒中。
69.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述组合物以初免加强策略施用，其中所述初免是候选灭活疫苗，并且所述加强是相同疫苗或任何其他疫苗，诸如DNA疫苗、嵌合寨卡病毒疫苗、病毒样颗粒、去活化寨卡疫苗、活的减毒病毒疫苗、重组亚基疫苗、载体化疫苗或来源于合成寨卡病毒的任何疫苗，其中它们中的每一种中的中和抗体均针对寨卡病毒包膜蛋白引发。
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