CN102348466A

CN102348466A - 西尼罗病毒疫苗

Info

Publication number: CN102348466A
Application number: CN2009801432029A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂娜.J.亨尼西; 菲利普.W.海斯
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2029-08-31
Also published as: BRPI0918897B1; CO6331444A2; AU2009287449B2; US20170049877A1; JP2012501350A; WO2010025469A1; KR101813017B1; NZ591188A; SG193821A1; BRPI0918897A2; NZ603854A; CA2735164A1; CL2015001803A1; KR20110069024A; AU2009287449A1; JP2015028058A; US9517259B2; US20110159033A1; US8821889B2; EP2334327B1

Abstract

本发明提供了抗西尼罗病毒的致免疫组合物。在备选实施方案中，所述致免疫组合物还包括另外的马病原体。本发明的西尼罗病毒组合物有利地提供抗北美优势西尼罗病毒株或分离物的保护作用。

Description

西尼罗病毒疫苗

背景

西尼罗病毒(West Nile Virus，“WNV”)属于黄病毒科(Flavivirade)。常常以蚊子为载体通过昆虫叮咬而发生感染。西尼罗感染全球范围内的所有类型的动物和鸟类。该病毒最初是1999年在北美地区发现，第一例是在加拿大的马中被诊断出来的。现在，西尼罗病毒在美国流行，感染所有类型的鸟类、人类和动物。2002年，在43个州报道了超过14,700例确诊的西尼罗病毒病例。

WNV的传播受多种因素影响。由于蚊子是该病毒的载体，并且保持WNV，因而有利于蚊子群体生长和发育的环境条件对WNV的传播造成影响。已有数种策略被用于控制蚊子群体，以期阻止WNV传播。这些策略包括，使用杀虫剂，驱虫药(repellant)，能阻止蚊子与病毒接触的物理障碍，消除支持蚊子繁殖的环境，以及进行免疫接种。WNV的典型症状包括影响中枢神经系统的多种不同症状。脑炎症状很常见，包括病毒血症，中枢神经系统的组织病理学损伤，厌食(anorexia)，抑郁抑郁，发热，虚弱，异常步态(abnormal gait)，后肢麻痹(paralysis of hind limbs)，视力下降(impaired vision)，共济失调(ataxia)，无目标地游荡(aimless wandering)，抽搐(convulsions)，不能吞咽(inability to swallow)，昏迷(coma)，以及死亡。

已有数种抗WNV疫苗，但都因各种各样的原因而不理想。例如，一种疫苗由金丝雀痘病毒(canarypox)-携载的西尼罗病毒产生。另一组疫苗由西尼罗病毒的重组嵌合蛋白产生，所述嵌合蛋白疫苗被设计为：将改良型细菌鞭毛蛋白(STF2 Delta)与WNV包膜蛋白的EIII域融合。另一种疫苗包括了灭活的早期北美西尼罗株，它需要可代谢的油作为佐剂。最后，一种嵌合减毒活疫苗从黄热病毒17D的一个感染性克隆制得，其中的前膜(pre-membrane)和包膜蛋白已被相应的WN(4)基因替换。

上述疫苗存在多种问题。含有活病毒的疫苗具有通过接种使动物被该病毒感染、导致疾病或甚至死亡的危险。嵌合蛋白疫苗、重组表达的疫苗、以及一些亚单位疫苗存在着与所述疫苗组合物中所包括的多种蛋白有关的免疫学活性和效果有限的问题。这些类型的疫苗的效力常常有限，被所述病毒感染或回复为野生型病毒的危险较大。而且，在常见疫苗中用到的一些佐剂包含可代谢的油，它们很快被机体清除，限制了被接种动物的免疫系统可能对该致免疫活性组合物反应的持续时间。其它佐剂在被接种动物中能引起过敏反应和不利影响。此外，这些疫苗不包括刺激抗除WNV以外的其它病原体的免疫力的抗原，因而它们不能即方便又安全地保护动物抵抗多种疾病。还有，所有此前的疫苗都是从WNV的早期分离物衍生的，所述分离物已不存在于环境中，因此不再感染动物并引起疾病。

相应地，本领域目前需要的是，对所有年龄的动物、包括怀孕的动物施用都安全的疫苗，它们包括对辅助致免疫效应和疫苗维持时间而言合适的佐剂，它们是从目前仍存在于自然环境中并引起疾病的WNV的当期(contemporary)或显性(dominant)分离物制得，这样的疫苗能提供抗所述分离物的保护作用。本领域还需要减少由西尼罗病毒引起的疾病或感染相关的临床症状的发生率和/或减轻所述临床症状的严重程度，直至消除或阻止所述临床症状的疫苗。相应地，现在还需要不仅包括西尼罗病毒抗原、还包括其它的马病原体的抗原的抗西尼罗病毒的疫苗，从而，通过同时减少西尼罗病毒和其它一或多种病原体引起的疾病的临床症状的发生率或减轻其严重程度，来提供进一步的保护作用。

发明简述

本发明克服了现有技术的上述问题，为现有技术提供了明显的进步。更具体地，本发明提供了疫苗或致免疫组合物，其包含致免疫活性抗原成分，所述成分含有西尼罗病毒的一或多个株或分离物。在多个优选实施方案中，所述组合物还包含佐剂，优选卡波姆(carbomer)，并包含可药用载体。优选地，西尼罗病毒抗原是杀死的或灭活的。该组合物在易受西尼罗病毒传染的动物中诱导免疫应答，并提供对于任何年龄的动物都安全的疫苗。

本发明还提供了疫苗组合物，其具有致免疫活性，而且其克服了此前描述的疫苗的缺陷。本发明提供了灭活疫苗，由此给被接种的动物，包括怀孕的雌性动物提供独特的安全性。相应地，本发明的致免疫组合物克服了被动获得的母体免疫力的干扰，在被接种的动物中刺激了活动型免疫力。有利的是，本发明提供了宽范围内有效的致免疫活性组合物，其含有致病性WNV的多种或全部相关抗原组分或蛋白。本发明的致免疫组合物的独特性在于，它包括WNV的当期分离物或流行病学显性分离物的抗原，通过减少WNV感染的临床症状的发生率和/或严重性，直至抗目前在动物(包括马群)中最流行的分离物的免疫力，来提供保护性致免疫应答。在优选实施方案中，WNV的这些当期分离物包括作为北美西尼罗病毒分离物或北美优势西尼罗病毒分离物的一部分的那些。为了本发明的目的，WN02是可以称为北美优势西尼罗病毒株或分离物的WNV株的代表例。。具体地，北美优势株和分离物是与WN99分离物相比有至少1个核苷酸改变且该改变能导致氨基酸改变的那些。NY99(GenBank登录号AF196835)株作为参考株用于确定某种株或分离物是否北美优势(North American Dominant)。此外，那些株或分离物可具有一或多个沉默氨基酸改变。在优选实施方案中，所述核苷酸改变导致该株或分离物的包膜蛋白中的氨基酸改变，更优选地，所述核苷酸改变导致缬氨酸变为丙氨酸。优选地，该氨基酸改变与在中间宿主即蚊子中复制的能力增强有关。更优选地，北美优势株包括在1442位由U突变为C、或在2466位由C突变为U(与北美株，例如NY 99和SEQ ID NO.23相比)，优选包括两者。还更优选地，北美优势株或分离物还包括在编码E蛋白的核苷酸序列中的突变和在编码NS5蛋白的序列中第9352位由C变为U(也是与北美株，例如NY 99和SEQ ID NO.23相比)。这些优选的突变参见实施例10，以及Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates，2001-2004：Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype，C.Todd Davis，et.al，Virology 342，p.252-265(2005)，该文献的教导和内容都引入本文作参考。

本发明还提供了制备本发明致免疫组合物的方法。所述方法总体上包括，将西尼罗病毒抗原与赋形剂或可药用载体或可兽用载体组合的步骤。优选实施方案还包含添加一或多种额外的马抗原的步骤。在另一实施方案中，所述方法还包含给所述组合物添加合适的佐剂的步骤。

在一优选实施方案中，本发明包括WNV抗原和非可代谢的油(non-metabolizable oil)佐剂，优选矿物油，以延长被接种的动物的免疫系统对该致免疫活性组合物反应的持续时间。所述非可代谢的油应理解为，当与抗原一起施用后，不在机体中代谢的油。优选的非可代谢的油是矿物油。在另外的优选形式中，除了WNV抗原以外，卡波姆佐剂和非可代谢的油(优选矿物油)都存在。所述佐剂可以用在本文所述的任一种组合物中。

在另一实施方案中，本发明的组合物包含WNV抗原，优选来自北美优势株的灭活或杀死的WNV，且基本不含油或基于油的佐剂。在这样的实施方案中，也可以包括其它佐剂，优选卡波姆。

在另一实施方案中，提供了含WNV抗原、以及来自马的病原微生物的其它抗原的疫苗组合物，以便对所述动物赋予广谱保护作用。在这样的实施方案中，WNV抗原可以是上述任一种形式。

在一优选实施方案中，本发明提供了疫苗组合物，其包含上述WNV抗原、一或多种免疫学有效量的抗原成分、以及可药用载体，所述抗原成分选自委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezuelan Equine Encephalomyelitis，VEE)，东方型马脑脊髓炎(Eastern Equine Encephalomyelitis，EEE)，西方马疱疹病毒(EHV)包括1型和4型，马流感病毒(EIV)，和它们的组合。优选这样的实施方案还包括佐剂，优选卡波姆，和可药用载体。此外，还可以有非可代谢的油，优选矿物油，但这种油不是必需的。

优选的实施方案还包括上述WNV抗原，其组合了：东方型马脑脊髓炎；西方型马脑脊髓炎；委内瑞拉马脑脊髓炎；破伤风类毒素；东方型马脑脊髓炎和西方型马脑脊髓炎；东方型马脑脊髓炎和委内瑞拉马脑脊髓炎；东方型马脑脊髓炎和破伤风类毒素；东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，和委内瑞拉马脑脊髓炎；东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，和破伤风类毒素；东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎和破伤风类毒素；西方型马脑脊髓炎和委内瑞拉马脑脊髓炎；西方型马脑脊髓炎和破伤风类毒素；西方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎，和破伤风类毒素；委内瑞拉马脑脊髓炎和破伤风类毒素；和东方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎和破伤风类毒素。这些特定组合中最优选的组合包括，WNV抗原与东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎，和破伤风类毒素的抗原或抗原组分的组合。在每一个这样的特定组合中，可以使用一或多种佐剂，尤其优选卡波姆，更优选卡波普(carbopol)。在WNV与东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎和破伤风类毒素组合的最优选形式中，不存在油(可代谢的油或非可代谢的油)。东方型马脑脊髓炎的NJO株，西方型马脑脊髓炎的Fleming株，以及委内瑞拉马脑脊髓炎的TC-83株都是这些疫苗成分的代表株。

本发明另外的优选实施方案可以用上述任一种特定的疫苗组合并加入马疱疹病毒，优选1型，4型(EHV1和/或EHV4)或其组合的抗原而制得。

上述每一种特定疫苗组合的另外的变化形式，包括那些含有EHV1和/或EHV4的形式，可以通过添加马流感病毒(EIV)的抗原而制得。优选的掺入马流感病毒的实施方案包括：西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，和破伤风类毒素；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，和东方型马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，东方型马脑脊髓炎，和西方型马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎；和委内瑞拉马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，和东方型马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，和西方型马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，和委内瑞拉马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，东方型马脑脊髓炎，和西方型马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，东方型马脑脊髓炎，和委内瑞拉马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，西方型马脑脊髓炎，和委内瑞拉马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，西方型马脑脊髓炎，和破伤风类毒素；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，和破伤风类毒素；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，和破伤风类毒素；and西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，东方型马脑脊髓炎，和破伤风类毒素。在每一个特定实施方案中，可以有马流感的任何一或多个株或分离物。马流感病毒的优选株包括：Influenza A/equine-2/Ohio/03，Influenza A/equine-2/New Market/2/93，InfluenzaA/equine-2/Kentucky/95，和它们的组合。在上述所有组合中，优选使用至少两株马流感，还更优选使用至少3株马流感。优选的掺入马疱疹病毒的实施方案包括：西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，东方型马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，破伤风类毒素，东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎；委内瑞拉马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，和东方型马脑脊髓炎；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，西方型马脑脊髓炎和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，东方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，西方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，西方型马脑脊髓炎，破伤风类毒素，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，破伤风类毒素，和马疱疹病毒；西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，破伤风类毒素，和马疱疹病毒；以及西尼罗病毒，至少一株马流感病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，东方型马脑脊髓炎，破伤风类毒素，和马疱疹病毒。在上述所有组合中，优选使用至少两株马流感，还更优选使用至少3株马流感。相应地，在上述所有组合中，所述的“至少一”株马疱疹病毒优选是选自EHV-1和EHV-4。在一些优选形式中，EHV-1和EHV-4两者都包括在致免疫组合物中。在另外的优选形式中，仅包括EHV-1。所述组合中的WNV成分优选为灭活的或杀死的本文所述北美优势株。

所述疫苗组合物可以用任何致免疫有效剂量来施用。在优选实施方案中，所述疫苗组合物以单剂(single dose)施用。优选地，所述剂量的总体积为约0.5ml-2.5ml，更优选约0.6ml-2.0ml，甚至更优选约0.7ml-1.75ml，还更优选约0.8ml-1.5ml，甚至更优选约0.9ml-1.25ml，最优选单个1.0ml剂量。

在另一实施方案中，所述疫苗先施用一剂再施用第二(加强)剂。优选地，第二剂在第一剂的至少15天后施用。更优选地，第二剂在第一剂的15-28天后施用。甚至更优选地，第二剂在第一剂的至少17天后施用。还更优选地，第二剂在第一剂的17-25天后施用。甚至更优选地，第二剂在第一剂的至少19天后施用。还更优选地，第二剂在第一剂的19-23天后施用。最优选第二剂在第一剂的至少21天后施用。在优选实施方案中，第一剂和第二剂疫苗为相同量。优选地，每一剂都是上述优选量，最优选第一剂和第二剂各为1ml。除了这种“第一剂加第二剂”方案以外，另外的方案还包括后续剂量。例如，可以在这些实施方案中施用第三，第四，或第五剂。优选地，后续第三、四和五剂的方案都以与第一剂相同的量施用，各个剂之间的间隔时间与上述第一剂和第二剂之间的间隔时间一致。

在另一优选实施方案中，在本发明的每剂组合物中，WNV抗原包含至少10^2.0TCID₅₀/剂。更优选地，WNV抗原包含约10^2.0TCID₅₀/剂至10^10.0TCID₅₀/剂。还更优选地，WNV抗原包含至少10^2.5TCID₅₀/剂。甚至更优选地，WNV抗原包含约10^2.5TCID₅₀/剂至约10^9.5TCID₅₀/剂。还更优选地，WNV抗原包含至少10^3.0TCID₅₀/剂。甚至更优选地，WNV抗原包含约10^3.0TCID₅₀/剂至约10^9.0TCID₅₀/剂。还更优选地，WNV抗原包含至少10^3.5TCID₅₀/剂。甚至更优选地，WNV抗原包含约10^3.5TCID₅₀/剂至约10^9.0TCID₅₀/剂。最优选地，WNV抗原包含10^7.0TCID₅₀/剂-10^9.0TCID₅₀/剂。WNV灭活疫苗或任何另外的灭活疫苗的TCID₅₀值一般是指最终疫苗中的抗原含量，但它等同于该疫苗组合物在灭活抗原之前计算出的抗原含量。优选地，本发明的致免疫组合物刺激产生抗WNV的血清中和抗体，所述抗体的滴度为1∶4以上，可用商购的检测法或用本领域技术人员已知的方法，例如本文实施例举例的方法，来测定。在优选实施方案中，本发明实施方案中的每一剂包含另外的马抗原，在任一剂中东方型马脑脊髓炎或委内瑞拉马脑脊髓炎的量优选为至少10^5.5TCID₅₀/剂。甚至更优选地，所述剂量为约10^5.5TCID₅₀/剂-10^9.5TCID₅₀/剂。还更优选地，所述剂量为至少10^6.0TCID₅₀/剂。还更优选地，所述剂量为约10^6.0TCID₅₀/剂-10^9.0TCID₅₀/剂。甚至更优选地，所述剂量为至少10^6.5TCID₅₀/剂。还更优选地，所述剂量为约10^6.5TCID₅₀/剂-10^9.5TCID₅₀/剂。甚至更优选地，所述剂量为至少10^7.0TCID₅₀/剂。最优选地，所述剂量为约10^6.7TCID₅₀-10^9.2TCID₅₀/剂。

优选地，本发明组合物中有西方型马脑脊髓炎抗原时，其量为至少10^6.2PFU/ml。甚至更优选地，所述量为10^6.2PFU/ml and 10^10.2PFU/ml。还更优选地，所述量为至少10^6.7PFU/ml。甚至更优选地，所述量为10^6.5PFU/ml-10^9.7PFU/ml。还更优选地，t所述量为至少10^7.2PFU/ml。甚至更优选地，所述量为约10^7.2PFU/ml-10^9.2PFU/ml。还更优选地，所述量为至少10^7.7PFU/ml，最优选为10^6.5PFU/剂-10^9.0PFU/ml。

在另外的优选实施方案中，本发明组合物中若有破伤风类毒素，其量为至少3CPU，更优选约3CPU-20CPU，还更优选至少4CPU，最优选至少5CPU，但不超过20CPU。

在另外的有一或多株马流感病毒存在的实施方案中，组合物中马流感的量为至少10^5.0TCID₅₀/mL。更优选地，马流感的量为10^5.0TCID₅₀/mL-10^9.0TCID₅₀/mL，更优选至少10^6.0TCID₅₀/mL。还更优选地，所述量为约10^6.0TCID₅₀/mL-10^8.0TCID₅₀/mL，更优选地，所述量为至少10^6.5TCID₅₀/mL。还更优选地，所述量为约10^6.5TCID₅₀/mL-10^7.0TCID₅₀/mL，最优选所述量为约10^6.7TCID₅₀/mL-10^7.0。

在包含马疱疹病毒的实施方案中，每一剂中马疱疹病毒的量为至少10^6.0TCID₅₀/mL。更优选地，马疱疹病毒在组合物中的量为10^6.0TCID₅₀/mL-10^9.5TCID₅₀/mL，更优选为约10^7.0TCID₅₀/mL。还更优选地，马疱疹病毒的量为10^7.5TCID₅₀/mL-10^9.0TCID₅₀/mL，更优选为约10^8.0TCID₅₀/mL。还更优选地，马疱疹病毒的量为10^8.0TCID₅₀/mL-10^9.0TCID₅₀/mL，最优选为约10^8.50TCID₅₀/mL。

在另外的优选实施方案中，提供了含有WNV的按年代顺序为当期的流行病学优势株的疫苗组合物。所述组合物将总体上改进组合物的效力。优选地，所述优势株是从马的组织分离得到的。这样的来源是为特别需要充分安全和有效的WNV疫苗的物种(即马)而制备免疫学组合物的疫苗种病毒时的优选WNV来源。此外，本发明披露了一种疫苗组合物，其含有来自马组织的经灭活且较少传代的WNV株，从而克服了此前的疫苗的局限，此前在多次传代的减毒疫苗、亚单位疫苗、或经重组技术产生的不能表达所有蛋白的其它组合物中发现蛋白抗原的种类不恰当地减少。这种从马的组织中分离的经灭活且较少传代的WNV株克服了先前疫苗的固有缺陷，通过从较少传代的高毒力马病毒株进行制备而提供了较多种最相关的免疫原性蛋白，从而包含了此前未能用于马接种的独特的、充分有效而且安全的致免疫组合物。相应地，优选的按年代顺序为当期的流行病学优势WNV株是本文所述的北美优势WNV株。

本发明提供了比传统的致免疫组合物或疫苗组合物更宽谱的保护作用，因为本发明提供了抗具体抗原的更宽范围分离物的保护作用。用于评价本发明组合物效力的攻击模型使用了异源攻击株，表明所述组合物能针对除了接种动物所用的具体株或分离物以外的多种分离物和株提供保护作用。这是本发明的特有特征。

本发明还提供了在动物(优选马)中，与野生型感染相比，减少与西尼罗病毒感染相关的临床症状的发生率和/或严重性的方法。所述方法一般性包括施用疫苗组合物的步骤，所述组合物包含杀死的或灭活的西尼罗病毒分离物，优选北美优势WNV株，还包含可药用载体。在本发明的一些优选实施方案中，给所述组合物添加佐剂，在另一些优选形式中，不提供佐剂。在另外的优选实施方案中，所述方法包括施用疫苗组合物，该组合物包含一或多种杀死的或灭活的西尼罗病毒分离物与免疫学有效量的来自其它马病原体的抗原组分的组合。优选那些分离物选自东方型马脑脊髓炎抗原，西方型马脑脊髓炎抗原，委内瑞拉马脑脊髓炎抗原，破伤风类毒素，和它们的组合，更优选上文所述的那些组合。在另外的优选实施方案中，本发明的疫苗与合适的佐剂，稀释剂，或可药用载体组合。

本发明提供了在兽群中，与野生型感染相比，减少与西尼罗病毒感染相关的临床症状的发生率和/或严重性的方法。优选地，接受本发明致免疫组合物的动物与未接受所述给药的动物相比，当都用野生型WNV感染进行攻击或暴露于该感染时，与西尼罗病毒感染相关的临床症状的严重性和/或发生率降低至少10％。更优选地，所述发生率或严重性减少20％，甚至更优选至少30％，还更优选至少40％，甚至更优选至少50％，还更优选至少60％，甚至更优选至少70％，还更优选至少80％，甚至更优选至少90％，还更优选至少95％，最优选至少100％，其中接受本发明组合物的动物未表现出临床症状。优选地，所述WNV株是WNV的北美优势株。相应地，本发明还提供了抗病原体异源株(相对于组合物中所用株)的保护作用。

本发明还提供了通过施用本文所述本发明组合物来刺激血清中和抗体或血清血凝抗体的方法，所述抗体抗选自WNV、WEE、VEE、EEE、EHV、EIV、和它们的组合的病原体。优选本发明的组合物刺激出滴度在1∶4以上的抗WNV的血清中和抗体，从而防止或减弱WNV病毒血症。

本发明的致免疫组合物使得抗疫苗中所有抗原的免疫力能维持更长的时间。优选地，抗西尼罗的免疫力持续至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，抗EIV的免疫力持续时间为至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，抗EHV的免疫力持续时间为至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，和最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，抗西方型马脑脊髓炎的免疫力持续时间为至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，和最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，抗东方型马脑脊髓炎的免疫力持续时间为至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，和最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，抗委内瑞拉马脑脊髓炎的免疫力持续时间为至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，和最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，抗破伤风类毒素的免疫力持续时间为至少1个月，更优选免疫力持续时间为至少2个月，还更优选免疫力持续时间为至少3个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少4-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少6-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少7-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少8-24个月，甚至更优选免疫力持续时间为至少9-24个月，还更优选免疫力持续时间为至少10-24个月，和最优选免疫力持续时间为至少12-24个月。

优选地，至少12个月的免疫力持续时间还涉及形成本发明致免疫组合物的任意抗原组合。

在另外的如上述含EIV和/或EHV抗原的优选实施方案中，所述致免疫组合物使感染性EIV或EHV被排出的情况好转，以防止该病毒向其它易感动物传播。

在另外的优选实施方案中，本文所述本发明组合物克服了被动获得的母体免疫力的干扰，在进行了抗EIV接种的动物中，刺激了主动免疫力，并减少了EIV临床症状的发生率或严重性。

在另外的本发明优选实施方案中，含VEE、WEE、EEE、破伤风、WNV、马鼻肺炎和马流感(全都如本文所述)的致免疫组合物，在按照本发明施用后，证实了抗VEE、WEE、EEE、破伤风、WNV、马鼻肺炎和马流感的效力。优选地，这样的组合物还包括佐剂，优选矿物油和/或卡波姆，还包括可兽用载体。在优选形式中，所述组合物以单个1ml剂量来施用。

本文所述的每一种含WNV抗原的致免疫组合物可以按照本文所述来给药，使得它们减少与西尼罗病毒有关的临床症状的发生率或减轻其严重性。

本文所述的每一种含EIV抗原的致免疫组合物可以按照本文所述来给药，使得它们减少与马流感有关的临床症状的发生率或减轻其严重性。

本发明还提供了减少与马疱疹病毒有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含马疱疹病毒抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明还提供了减少与西尼罗病毒有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含西尼罗病毒抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明还提供了减少与马流感病毒有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含马流感抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明还提供了减少与马流感病毒有关的临床症状的发生率的方法，包括对动物施用上述任一种的致免疫组合物的步骤，其中所述临床症状比未接受所述致免疫组合物的动物的临床症状减少至少10％。

本发明提供了减少兽群中感染发生率的方法，包括对动物施用上述任一种致免疫组合物的步骤。

本发明提供了减少兽群中感染发生率的方法，包括对动物施用上述任一种致免疫组合物的步骤，其中感染发生率比未接受所述致免疫组合物的兽群减少约10％-50％。

本发明提供了减少兽群中EHV临床症状的发生率和严重性的方法，其中的临床症状选自呼吸道疾病，流产，生殖并发症，神经性疾病，中枢神经系统疾病，和它们的组合。

本发明提供了减少与马疱疹病毒有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含马疱疹病毒抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明提供了减轻兽群中与马流感有关的临床症状的严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含马流感抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明提供了减少兽群中与西尼罗病毒有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含西尼罗病毒抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明提供了减少兽群中与东方型马脑脊髓炎有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含东方型马脑脊髓炎抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明提供了减少兽群中与西方型马脑脊髓炎有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含西方型马脑脊髓炎抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明提供了减少兽群中与委内瑞拉马脑脊髓炎有关的临床症状的发生率或减轻其严重性的方法，包括对动物施用上述任一种含委内瑞拉马脑脊髓炎抗原的致免疫组合物的步骤。

本发明还提供了制备上述和本文所述任一种本发明致免疫组合物的方法，包括将西尼罗病毒抗原与合适的赋形剂或可药用载体组合。在优选形式中，该方法还包含添加一或多种马抗原的步骤。一组优选的马抗原选自西方型马脑脊髓炎、东方型马脑脊髓炎、委内瑞拉马脑脊髓炎、破伤风类毒素、EHV、EIV、和它们的组合。在一些优选形式中，本文所述方法还可包括过滤步骤，其中的终产物是纯化形式。

“佐剂”在本文中可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷(saponin)如Quil A，QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)，GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)，非可代谢的油，矿物油和/或植物油和/或动物油，聚合物，卡波姆，表面活性剂，天然有机化合物，植物提取物，碳水化合物，胆固醇，脂质，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂。乳剂可尤其基于轻液体石蜡油(欧洲药典(European Pharmacopea)类型)；类异戊二烯油(isoprenoid oil)如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)；因烯烃，尤其异丁烯或葵烯寡聚产生的油；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油，油酸乙酯，丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)，甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(例如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、聚丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等，The Theoryand Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.).JohnWileyand Sons，NY，pp51-94(1995)and Todd等，Vaccine 15：564-570(1997)。在优选实施方案中，所述佐剂的浓度按照终产物的体积计为约0.01-50％，优选约2％-30％，更优选约5％-25％，还更优选约7％-22％，最优选10％-20％。用于本发明的多个可能的佐剂中，优选不使用可代谢的油。在优选实施方案中，所述佐剂至少是非可代谢的油，优选矿物油。在另外的优选实施方案中，所述疫苗组合物基本上不含基于油的佐剂。在最优选实施方案中，所述疫苗组合物包含非可代谢的油(优选矿物油)和卡波姆两者作为佐剂。

此外，本发明的致免疫组合物和疫苗组合物可包括一或多种可兽用载体。本文中，“可兽用载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、保存剂、赋形剂、抗细菌和抗真菌剂、抗微生物剂、等渗剂、吸收延迟剂、等等。在一些优选实施方案中，尤其在包括冻干的致免疫组合物的方案中，用于本发明的稳定剂包括用于冻干过程的稳定剂。

“稀释剂”可包括水，盐水，葡萄糖(dextrose)，乙醇，甘油等。等渗剂可包括氯化钠，葡萄糖，甘露醇，山梨醇和乳糖等。稳定剂包括乙二氨四乙酸的铝盐和碱金属盐等。

在优选实施方案中，本发明的致免疫组合物制成后含有保存剂和稳定剂；更优选地，本发明的致免疫组合物制成后含有庆大霉素，EDTA，甘油，和它们的组合。

“致免疫组合物或免疫学组合物”是指包含至少一种抗原的组合物，其在已有抗目标组合物或疫苗的细胞性和/或抗体介导性免疫应答的宿主体内激发免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一或多种以下效应：产生或活化特异性针对所述目标组合物或疫苗中所含一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒T细胞和/或gamma-delta T细胞。优选，宿主表现出治疗性免疫应答或保护性免疫应答，结果增强对新感染的抵抗力和/或减少疾病的临床严重程度。如果通常出现在受感染宿主中的临床症状减少或未出现，或者，受感染宿主的恢复时间加快和/或感染持续时间缩短或者组织或体液或排出液中的细菌滴度降低，都可以确认有这类保护作用。

术语“需要所述给药”或“需要所述给药治疗”在本文中是指，所述给药/治疗与导致接受本发明致免疫组合物的动物增强或改善健康或任何其它积极的医疗效果有关。

术语“西尼罗病毒”抗原是指，但不限于，WNV病毒体中对动物具有免疫原性的多种成分，最尤其那些当存在于动物中时能激发体液或细胞免疫应答的WNV蛋白成分，如包膜蛋白和非结构蛋白。这样的抗原可包括DNA，蛋白亚单位，改良病毒，以及杀死的或灭活的病毒。在本发明的一些优选形式中，一或多种WNV抗原包含灭活的或杀死的WNV株，甚至更优选北美优势WNV株。

术语“北美西尼罗病毒(株)”是指，但不限于，已在北美大陆发现的任何西尼罗病毒株或分离物。优选地，北美西尼罗病毒株与NY99株(GenBank登录号AF196835或NCBI指引号NC 00942.1(SEQ ID No.23)有至少97％，甚至更优选至少98％，还更优选至少98.5％，更优选至少99％，甚至更优选至少99.2％，最优选至少99.4％的序列同一性。

“序列同一性”如本领域已知的那样，是指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列，即参考序列和需要与该参考序列比较的给定序列之间的关系。序列同一性如下确定：根据给定序列与参考序列的链之间的配对情况，以产生最高水平序列相似性为目的，将给定序列与参考序列进行最佳比对，然后比较这两个序列。通过这种比对，使一个位置比对一个位置，得到序列同一性，例如，在某一个位置的核苷酸或氨基酸残基相同时，序列在该位置是“同一的”。再将这种位置同一性的总数除以参考序列的核苷酸或残基总数得到％序列同一性。序列同一性可以很容易地用已知方法计算，所述方法包括但不限于Computational Molecular Biology，Lesk，A.N.，ed.，Oxford University Press，New York(1988)，Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York(1991)；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，其教导引入本文作参考。优选的确定序列同一性的方法被设计成使所测试的序列最为匹配。确定序列同一性的方法可在确定给定序列之间序列同一性的公共计算机程序中编辑。这类程序包括，但不限于，GCG程序包(Devereux，J.，et al.，NucleicAcids Research，12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN and FASTA(Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)。BLASTX程序可从NCBI和其它来源获得(BLAST Manual，Altschul，S.et al.，NCVI NLM NIHBethesda，MD 20894，Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，其教导引入本文做参考)。这些程序用缺省空隙权重实现对序列的最佳比对，以便在给定序列和参考序列之间产生最高水平的序列同一性。例如，一个多核苷酸具有与参考核苷酸序列至少例如85％，优选90％，更优选95％“序列同一性”的核苷酸序列是指，该给定多核苷酸的核苷酸序列除了相对于参考核苷酸序列的每100个核苷酸而言可能包含多达15个，优选多达10个，更优选多达5个点突变以外，与参考序列相同。换而言之，在具有与参考核苷酸序列至少85％，优选90％，更优选95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中多达15％，优选10％，更优选5％的核苷酸被缺失或被另一核苷酸取代，或者，数量上占参考序列总核苷酸的多达15％，优选10％，更优选5％的核苷酸可被插入该参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置，或这些末端位置之间的任何位置，可以是单个地散在参考序列的众多核苷酸之间，也可以是以一个或多个连续序列的形式散在参考序列中。类似地，一个多肽具有与参考氨基酸序列至少例如85％，优选90％，更优选95％序列同一性的给定氨基酸序列是指，该多肽的给定氨基酸序列除了相对于参考氨基酸序列的每100个氨基酸而言可能包含多达15个，优选多达10个，更优选多达5个氨基酸改变以外，与参考序列相同。换而言之，为获得与参考氨基酸序列有至少85％，优选90％，更优选95％同一性的给定多肽序列，参考序列中多达15％，优选多达10％，更优选多达5％的氨基酸残基被删除或被另一氨基酸取代，或者，数量上占参考序列氨基酸总数的多达15％，优选多达10％，更优选多达5％的氨基酸可被插入该参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基端位置或羧基端位置，或这些末端位置之间的任何位置，可以是单个地散在参考序列的众多残基之间，也可以是以一个或多个连续序列的形式散在参考序列中。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而有别。但是，在确定序列同一性时，保守取代不算是匹配。

术语“北美优势西尼罗病毒”株和分离物是指以下文献中提到的株或分离物：Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates， 2001-2004：Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype，C.ToddDavis，et.al，Virology 342，p.252-265(2005)，其教导和内容引入本文做参考。如该文献中所述，北美优势WNV株或分离物具有至少1个核苷酸改变，导致相对于WN99分离物发生氨基酸改变。NY99株(GenBank登录号AF196835，其一例见SEQ ID NO：23)作为参考株用于确定某种株或分离物是否北美优势。在优选实施方案中，所述核苷酸改变导致所述株或分离物的包膜蛋白中的氨基酸改变，更优选所述核苷酸改变导致在关键包膜蛋白的第159位或“E159”发生从缬氨酸至丙氨酸的氨基酸改变。优选地，该氨基酸改变与在中间宿主即蚊子中复制的能力增强有关。此外，那些株或分离物可具有一或多个沉默氨基酸改变。优选地，北美优势株还包括在1442位由U突变为C、或在2466位由C突变为U(与北美株，例如NY 99和SEQ ID NO.23相比)。还更优选地，北美优势株或分离物还包括在编码E蛋白的核苷酸序列中的突变和在编码NS5蛋白的序列中第9352位由C变为U(也是与北美株，例如NY 99和SEQ ID NO.23相比)。特定区域的这些优选突变详见实施例10和图10-17。代表性北美优势WNV株列在本申请中。相应地，为了本发明的目的，北美优势和WN02互换使用。

为了本发明的目的，马源2005株北美马E159，E159(马源)，NAEE159，美国农业部分离物405330(USDA 2005)马源，和E159株互换使用。为了本发明的目的，驴源2004株，美国农业部分离物292206(USDA 2004)驴源，E159(驴源)，和北美驴E159(NADE159)互换使用。E159表示包膜蛋白中的氨基酸改变发生在第159位，如上述。

西尼罗病毒株或分离物，为了本发明的目的，不限于马，也不限于马西尼罗病毒株，可包括但不限于鸟源、驴源、猪源、人源、哺乳动物源、以及马源的西尼罗病毒株。

为了本发明的目的，术语“株”和“分离物”含义相同且互换使用。

本文中，“可药用”或“可兽用载体”或“可药用载体”包括任何和全部的溶剂、生长介质、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、保存剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、等等。

“致免疫组合物或免疫学组合物”是指包含至少一种抗原的组合物，其在已有抗目标组合物或疫苗的细胞性和/或抗体介导性免疫应答的宿主体内激发免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一或多种以下效应：产生或活化特异性针对所述目标组合物或疫苗中所含一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒T细胞和/或gamma-delta T细胞，和/或病毒中和抗体。优选，宿主表现出治疗性免疫应答或保护性免疫应答，结果增强对新感染的抵抗力和/或减少疾病的临床严重程度。如果通常出现在受感染宿主中的临床症状减少或未出现，受感染宿主的恢复时间加快和/或临床疾病的持续时间缩短或者组织或体液或排出液中的病毒抗体滴度较高，或血液中的病毒血症减少，或因感染所致的肉眼可见损伤或组织病理学损伤减少，都可以确认有这类保护作用。

此外，本发明的致免疫组合物和疫苗组合物可包含一或多种可兽用载体。本文中，“可兽用载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、细胞培养基和细胞培养成分、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、保存剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、等等。“稀释剂”可包括水，盐水，生理盐水，葡萄糖，乙醇，甘油等。等渗剂可包括氯化钠，葡萄糖，甘露醇，山梨醇和乳糖等。稳定剂包括乙二氨四乙酸的铝盐和碱金属盐等。

西尼罗病毒的“临床症状”，为了本发明的目的，包括但不限于，与以下相关的症状或损伤：脑炎，病毒血症，厌食，抑郁，发热，虚弱，异常步态，后肢麻痹，视力下降，共济失调，无目标地游荡，抽搐，不能吞咽，昏迷，后肢虚弱，麻痹，协调性差(poor coordination)，抑郁和相关行为，震颤(tremors)，抽搐，后肢步履蹒跚(paddling of the limbs)，神经学问题，中枢神经系统肿块(swelling)，死亡，和它们的组合。受感染的动物所表现出来的临床症状根据感染的严重程度的不同而有不同。

马疱疹病毒的“临床症状”，为了本发明的目的，包括但不限于，流产，神经性缺陷，呼吸道疾病，生殖系统缺陷和功能缺失(failure)，以及与中枢神经系统有关的症状。此外，EHV 1的临床症状包括，但不限于，被EHV1感染的雏马(foal)的表现，有呼吸道并发症，将病毒传给兽群中的老成员使之表现出生殖缺陷，包括流产，以及神经性缺陷，通常表现在中枢神经系统中。

东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，和委内瑞拉马脑脊髓炎的“临床症状”，为了本发明的目的，是那些通常已知与脑脊髓炎有关的症状，包括但不限于发烧，神经症状如对声音敏感，阶段性的兴奋(periods ofexcitement)，以及躁动(restlessness)，脑损伤，嗜睡(drowsiness)，耳下垂(drooping ears)，做圆圈运动(circling)，异常步态，麻痹(paralysis)，失去胃口，抑郁，头压低(head pressing)，缺乏协调性，长期残疾(long-term disability)，脑损害，死亡，和它们的组合。“安全”在本文中是指，动物被接种后无负面后果，包括但不限于，疫苗病毒恢复毒力的潜在可能性和临床上明显的副作用，如持续的全身性病态或疫苗接种部位的不能接受的炎症。

“减少临床表现的发生率和/或严重性”或“减少临床症状的发生率和/或严重性”在本文中是指，与野生型感染相比，减少群体中受感染动物的个数，减少或消除表现出感染的临床症状的动物的个数，或减少这些动物中任何临床症状的严重性。例如，在本文所述实验中，这样的临床表现包括病毒血症，发热，抗体反应，和组织病理学。优选地，接受了本发明组合物的动物与未接种而有可能被感染的动物相比，上述表现减少至少10％。更优选地，接受本发明组合物的动物中，临床表现减少至少20％，更优选至少30％，还更优选至少40％，甚至更优选至少50％。

“免疫力持续时间”在本文中是指，动物产生致免疫应答的最少天数，因为产生致免疫应答，该动物相对较能抵抗病毒感染，和/或受益于减少临床表现的发生率和/或严重性，如本文所述。

术语“株”和“分离物”在本文中互换使用。

术语“疫苗”和“致免疫组合物”在本文中互换使用。

任何一或多种西尼罗病毒株或分离物可按照本发明来使用。在优选实施方案中，分离物选自以下的一或多种：纽约(北美东北部)分离物(WN-NY 99)，马源，1999，纽约(北美东北部)分离物(WN-NY 99)，鸦源，1999，美国农业部分离物292206(USDA 2004)，驴源，美国农业部分离物405330(USDA2005)，马源，北美分离物(WN-Texas-2002/2003)，德克萨斯东南海岸分离物2002，墨西哥(Tabasco)分离物2003，和它们的组合，在更优选实施方案中，分离物选自以下的一或多种：美国农业部分离物292206(USDA 2004)，驴源，美国农业部分离物405330(USDA 2005)，马源，北美分离物(WN-Texas-2002/2003)，德克萨斯东南海岸分离物2002，墨西哥(Tabasco)分离物2003，和它们的组合。在最优选实施方案中，分离物是单独的美国农业部分离物405330(USDA 2005)，马源，或其与上述一或多种分离物的组合。在另外的优选实施方案中，包括作为北美西尼罗病毒分离物的一部分的那些分离物。在另外的优选实施方案中，包括北美优势西尼罗病毒分离物。除了上述所列，特异性分离物包括，但不限于，WN02，以及具有至少1个、优选至少2个、更优选至少3个核苷酸改变、导致与WN NY99分离物相比有至少一个氨基酸改变的那些分离物，最优选包膜蛋白第159位由缬氨酸变为亮氨酸的那些株。最优选的北美优势株包括，但不限于：NY2002Nassau，NY2002Clinton，NY2002Queens，GA20021，GA20022，TX20021，TX20022，IN2002，NY2003Albany，NY2003Suffolk，NY2003Chatauqua，CO20031，CO20032，TX2003，TX2003Harris4，TX2003Harris6，TX2003Harris7，TX2003Harris10，AZ2004，和TX2004Harris4，和它们的组合。可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的西尼罗病毒株可以是任何株或分离物。在优选实施方案中，所用的北美优势西尼罗病毒株是E-159(马源)或E-159(驴源)。这样的北美优势WNV株的代表株包括，按照布达佩斯条约的规定，于2008年8月4日，在位于10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209的ATCC保藏的马源2005株(ATCC保藏号PTA-9409)。可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的马流感株可以是任何株或分离物。代表株包括Equi-2/Ohio/03，其以ATCC保藏号PTA-9522进行保藏，Equi-2/Kentucky/95，其以ATCC保藏号PTA-9523进行保藏，Equi-2/New Market/2/93，其以ATCC保藏号PTA-9524进行保藏。ATCC保藏号为PTA-9522、PTA-9523、和PTA-9524的代表株都是按照布达佩斯条约的规定，于2008年9月23日，在位于10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA，20110-2209的ATCC予以保藏。

可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的马疱疹病毒(“EHV”)株可以是任何株或分离物。代表株包括EHV亚型1，其以ATCC保藏号PTA-9525进行保藏，和EHV亚型4，其以ATCC保藏号PTA-9526进行保藏。ATCC保藏号为PTA-9525和PTA-9526的代表株都是按照布达佩斯条约的规定，于2008年9月23日，在位于10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209的ATCC予以保藏。

可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的西方型马脑脊髓炎株可以是任何株或分离物。代表株包括Fleming株，其按照布达佩斯条约的规定，于2008年8月14日，在位于10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209的ATCC予以保藏，ATCC保藏号为PTA-9410。

可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的委内瑞拉马脑脊髓炎株可以是任何株或分离物。代表株包括TC-83株，其按照布达佩斯条约的规定，于2008年8月14日，在位于10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209的ATCC予以保藏，ATCC保藏号为PTA-9411。

可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的东方型马脑脊髓炎株可以是任何株或分离物。代表株包括NJO株，其按照布达佩斯条约的规定，于2008年8月14日，在位于10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209的ATCC予以保藏，ATCC保藏号为PTA-9412。

可用于本发明的疫苗或致免疫组合物中的破伤风类毒素株可以是任何株或分离物。代表株是从位于马萨诸塞州波士顿的The MassachusettsDepartment of Public Health Institute of Laboratories的破伤风梭菌(Clostridium tetani)原种(master seed)获取的。

本发明的疫苗对WNV易感物种、尤其马科(equidae)物种在任何年龄和任何生育阶段(包括怀孕的雌性动物)给药是安全的。在优选实施方案中，本发明给12月龄以上的雏马给药是安全的，更优选给10月龄以上的雏马给药是安全的，更优选给8月龄以上的雏马给药是安全的，更优选给6月龄以上的雏马给药是安全的，更优选给4月龄以上的雏马给药是安全的，更优选给2月龄以上的雏马给药是安全的，更优选给1月龄以上的雏马给药是安全的，甚至更优选给1日龄至1月龄期间的雏马给药是安全的，最优选给1日龄以上的雏马给药是安全的。

本发明的组合物可以用任何常规方式进行给药。给药方法的实例包括任何为免疫系统的细胞提供接触该致免疫组合物的通道的途径，包括口服，经皮/或皮内，静脉，皮下，肌肉，眼内(intraocular)，腹腔，直肠，阴道，鼻内，胃内，气管，肺内，或它们的任意组合。在优选实施方案中，所述疫苗经胃肠外途径给药，优选鼻内、皮下、或肌肉途径，在最优选实施方案中，所述疫苗是经肌肉给药。

附图说明

图1显示平均总临床分值；

图2显示排出病毒的比例(Proportion Shedding)；

图3显示流鼻涕分值(Nasal Discharge Score)；

图4显示排出病毒的比例；

图5显示结膜炎分值；

图6显示血清中和滴度；

图7显示EHV-1阳性比；

图8是平均白细胞计数；

图9是阳性比(发热)；

图10是WNV分离物的HE区的核苷酸比对；

图11是WNV分离物的DE区的核苷酸比对；

图12是WNV分离物的D NS5区的核苷酸比对；

图13是WNV分离物的H NS5区的核苷酸比对；

图14是WNV分离物的H WN05 E NS5区的核苷酸比对；

图15是WNV分离物的H WN05区的核苷酸比对；

图16是WNV分离物的NS5区的核苷酸比对；和

图17是WNV分离物的E区的核苷酸比对。

详细说明

实施例

以下实施例旨在举例说明本发明的具体实施方式。这些实施例仅仅为举例目的，不应被理解为限制本发明的范围或原则。

实施例1

此实施例例举了一种本发明优选的疫苗组合物。

材料和方法

为制备工作细胞种(working cell stock)，将由已知能繁殖西尼罗病毒的Vero细胞系组成、并经过了纯度、身份(identity)和细胞核(karyology)测试的细胞原种(Master Cell Stock，MCS)解冻，接种一批T25-T150cm²的容器或1050cm²摇瓶，或生物反应器或其它合适的无菌容器。将解冻的细胞悬浮在生长培养基中，0.0015mL-5.0L/容器(依据容器的体积来定)。然后，细胞在36-38℃保温最多7天。需要时，给直接从冻存物接种得到的培养物在接种(plant)后36小时内再补充培养基(re-fed)，以除去残余的DMSO。需要时，在生长期间给培养物再补充培养基，以除去过量碎片，或刺激尚未汇合的培养物进行生长，或维持已汇合的培养物的活力。

将细胞传代1-20次，方法是，在每个容器中，轻轻倒出已用过的培养基，根据容器的体积添加5-500mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA液。将容器温和摇动，直至细胞从表面下沉。通过加培养基进行漂洗，从容器中取出细胞，并汇总。在接种前，从至少55％汇合的Vero工作细胞中轻轻倒出细胞生长培养基。给每个容器添加所述的病毒生长培养基，0.15-0.4mL/cm²表面积。用感染复数(MOI)0.000001-0.0002进行感染，通过对至少两个代表容器进行细胞计数来确定MOI。已被感染的摇瓶培养物以0.1-0.8rpm在36-38℃保温2-5天。

培养期间，通过显微镜检查培养物的典型CPE，并通过肉眼检查总体污染情况。不合适的培养物在灭菌后除去。培养物可以用标准技术进行减毒或不经减毒直接使用。

然后为生产目的收获微生物。当CPE达到85％以上时收获病毒液。旋转摇瓶以除去松脱的细胞和液体，再汇总至适于澄清的无菌2-20L玻璃瓶、塑料瓶、或PETG瓶，20L无菌聚丙烯容器或2-500L无菌不锈钢大型容器。

接下来，制备产物。将已澄清的液体用甲醛溶液，USP，0.2％体积比，或另一种有效灭活剂进行灭活，转移至第二个容器，维持20-25℃(室温)且振荡48小时。取至少12mL经灭活的液体样品，在浓缩前先进行灭活确证测试(见下文)。灭活完成后，将已灭活的材料分批在2-7℃维持最多60天再进行浓缩。可在该疫苗配制剂中添加合适的佐剂，最优选非可代谢的油，优选矿物油，和/或卡波姆。可以将所述佐剂和/或收获的病毒抗原与其它成分一起进行典型的处理，如混合(mixing)，掺合(blending)，微流化(microfluidization)，和乳化。

再将产物标准化。将足量的已澄清、灭活、浓缩(可选)的批次组合，使得终产物中每个株的滴度经计算为至少10^4.0TCID₅₀/剂。可以将多个批次掺合在一起以达到每剂所需的滴度。

然后将产物装配成最终配制剂。根据所需的最终系列体积，抗原组分、佐剂、稳定剂和稀释剂的量计算如下：

a.西尼罗病毒，马源2005(ATCC PTA-9409)：最小10^4.0TCID₅₀/剂

b.佐剂：佐剂总浓度，优选非可代谢的油，更优选矿物油和/或卡波姆，在一个系列中是至少10％v/v，且在分批/配制时添加。

c.稀释剂：添加合适量的磷酸缓冲盐水(PBS)，使终体积达到所需体积。

d.添加福尔马林：添加适当体积的37％福尔马林，以维持适当水平。

e.硫酸庆大霉素

将所需量的佐剂和PBS在无菌容器中混合。如果需要，将该化合物的pH用10N NaOH或5N HCl调整至4.9-5.1。添加经过澄清、杀灭、且浓缩的西尼罗病毒，以及庆大霉素和福尔马林，将pH调至6.9-7.1。在2-6℃混合至少8小时，不超过48小时。

疫苗通过典型的皮下注射方式来给予，如果需要，再进行加强接种。最优选地，起始剂量和多个加强剂量都是以21天的间隔进行1mL体积的肌肉给药。起始和加强剂的接种方案是以最优选的1mL剂量接种马，其它马科动物，其它WNV易感物种，以减少WNV感染的临床表现的发生率和或严重性，优选防止WNV感染以及防止归因于西尼罗病毒感染的疾病在接种后持续一段时间。

结果和讨论

所述疫苗通过各种适当的胃肠外途径，以各种不同剂量和给药方案，施用于具有不同的WNV免疫学状态(包括从未接触过和已有被动抗体)的动物，提供了长期的免疫力，长达接种后的至少2年以上。所述疫苗给WNV易感物种，尤其是马科物种，在任何年龄，以及在任何生育阶段，包括怀孕的雌性动物施用都是安全的。

实施例2

此研究是为了评价疫苗保护马匹抵抗西尼罗病毒(WNV)攻击的效力。

材料和方法

总共30匹马随机分组，每组15匹。总共20匹马以21天的间隔接受2剂疫苗，用10匹马作为对照。每组的马匹，第1批(Block 1)和第2批，有10匹接种过的马和5匹对照马。所用疫苗是一种组合，包括WNV抗原，特别是灭活的或杀灭的WNV北美优势株马源2005(ATCC保藏号PTA-9409)，以及委内瑞拉马脑脊髓炎TC-83株(ATCC保藏号PTA-9411)，东方型马脑脊髓炎NJO株(ATCC保藏号PTA-9412)，西方型马脑脊髓炎Fleming株(ATCC保藏号PTA-9410)和破伤风类毒素的抗原组分，配方基本如下：

所有组通过鞘内(intrathecal)接种1ml PBS进行攻击，所述PBS含约105pfu WNV异源株(NY99，4132，鸦分离物)。该攻击在氯胺酮(ketamine)-赛拉嗪(xylazine)麻醉下进行。

对马匹监控最多14天，然后人性化处死。那些在14天前就已发生严重疾病的马匹提早实施安乐死。

收集以下数据以评估疫苗效力：

·基本临床评价

·体温

·病毒血症分析

·组织学：由有资质的(board-certified)兽医病理学家对两个脑干切片进行评估。

评估在相应研究日采集的血清对攻击产生血清学应答的特征。

结果和讨论

攻击后病毒血症和血清中和滴度被视为在本研究中变动的主要结果。本研究中第一批经过接种的马匹在攻击后100％受到保护，未发生病毒血症。相比较而言，5匹对照马中，有4匹在攻击的4-5天后被证实有病毒血症，有1匹在第1个时间点就被证实有病毒血症。此外，接种过的马在接种后每个时间点检测的血清中和滴度都比对照马高，具有统计学显著性。而且，所得数据表明，WNV疫苗的血清中和滴度达1∶4以上就能有效防止WNV病毒血症。第1批在攻击后的血清滴度和病毒血症见下表1：

表1：第1批的血清滴度和病毒血症

		血清滴度	攻击后病毒血症
				马匹编号	处理	攻击日	最高滴度
1	对照	＜2	390
				2	接种	12	＜5
3	接种	12	＜5
				4	对照	＜2	65
5	对照	＜2	1475
				6	接种	6	＜5
7	接种	97	＜5
				8	接种	10	＜5
9	接种	21	＜5
				10	接种	35	＜5

		血清滴度	攻击后病毒血症
				马匹编号	处理	攻击日	最高滴度
11	接种	10	＜5
				12	接种	24	＜5
13	接种	4	＜5
				14	对照	＜2	235
15	对照	＜2	165

攻击后病毒血症和血清中和滴度也是本研究的第2批马中变动的主要结果。在第2批马中，仅1匹接种过的马在整个攻击期间的任何时间点都表现病毒血症。该马匹在3个早晨(并非那些相同的晚上)的3个不同时间点有最小读书5(而＜5表示阴性)。本研究中的所有对照马匹(除了一匹马提前退出了研究但表现出明确的WNV组织病理学，且被排出在评价之外)，在攻击后的1-8时间点，显示出高水平的病毒血症。

由于病毒血症是病毒能穿过血脑品屏障引起WNV脑炎的前提，因此病毒血症被证明是在此类实验研究中评价保护作用的主要参数。

本研究表明，2剂实验性组合疫苗给4-5月龄的雏马施用，可靠且有效地刺激了保护性血清学血清中和滴度。此外，这些信息表明，用此实验性组合疫苗中西尼罗病毒有效分批的抗原量进行接种后，血清中和(SN)滴度低至1∶4，也能在用异源西尼罗病毒株进行严重的鞘内攻击后，保护被接种过的马匹而不出现病毒血症、临床疾病、和组织病理学表现。

两组的组织病理学表现也不同，用毒力西尼罗病毒攻击后，第2批中接种者发生损伤的可能性比对照的可能性低40％，第1批中接种者发生损伤的可能性比对照低100％。

此外，对照组的一匹马在攻击后第9天后腿变得虚弱，而且情况越来越坏，最后无法站立。对该马匹的脑桥(pons)和脑髓(medulla)进行的组织病理学检查，发现与比此研究中其它任何马匹的疾病表现都更为普遍的WNV病理学相一致的严重脑炎和脊髓炎。

本研究的第2批中两匹对照马各有3天出现与西尼罗病毒感染有关的临床表现。另一匹对照马仅在一个时间点出现归因于疾病的虚弱。还有一匹对照马任何时间点都无临床表现，但它有多日发生病毒血症。本研究的第2批中，尽管多匹接种过的马的组织具有鞘内WNV攻击所致的轻度至中度组织病理学改变，仅有一匹接种过的马有1天出现非常轻微的临床疾病(轻微的头部震颤)，而有2匹对照马有多日出现临床疾病，另有一匹对照马有1天出现临床疾病。

这些结果表明，所述疫苗是有效的，在施用该疫苗的动物中确实诱导出了致免疫反应。所述疫苗的有效性在该实施例中还表现在：减少了WNV病毒血症，刺激了高水平的抗WNV的血清中和滴度，以及在脑和脑膜中阻止了与WNV有关的临床表现和组织病理学表现。由于该疫苗包含多个独特的组分，包括长效非可代谢性佐剂，它被配制成1mL这样的小体积来提供高度的安全性，作为高度致免疫性、较少传代的、来自近期来源并具有高流行病学优势的完整灭活病毒WNV分离物，和从被感染的马的组织分离出的WNV，它比现有其它疫苗提供更充分的安全性和有效性。因此，它具有在施用于动物时提供安全疫苗的效应。

实施例3

本实施例举例说明本发明致免疫组合物抗EHV-4感染的效力。

材料和方法

37匹1-5月龄的马用于本研究。用随机编号器将这些马随机分配至接种组或对照组，然后进行接种。24匹为接种马，13匹为伪-接种的对照马。所有马在研究开始前都显示低水平(≤1∶14，平均＝1∶7)的EHV-4血清中和(SN)滴度，表明这些马易于被感染。所用的疫苗是实验性疫苗，具有以下成分：

最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

对接种组的24匹马，每匹肌肉内施用1mL剂量的该实验性疫苗。对照组的13匹马接受1mL剂量的佐剂化DMEM(批号004)，含9-联疫苗(9-wayvaccine)中用到的赋形剂(庆大霉素和甲醛)但不含抗原。接种的15天后，用毒力EHV-4HRA005株病毒进行攻击。

接种组和对照组的每匹马都用EHV-4病毒株(HRA005)进行攻击。经稀释的攻击病毒的滴度足以在未接种的马中激发归因于EHV感染的疾病。

每匹马在攻击之前，按照50μg/kg体重的剂量静脉给予

(罗米非定盐酸盐(romifidine hydrochloride))，这是一种镇痛止痛药。然后每匹马用EHV-4株HRA005病毒进行攻击。攻击病毒以气溶胶的形式鼻内给予，所述气溶胶是用雾化器压入Equine AeroMask(Trudell Medical International，Ontario，Canada)制得的。

对于总共37匹马的每一匹，在攻击当天以及攻击后14天内的每天早晨，用校准的电子体温计(GSA Electronics)探头记录直肠温度。每日直肠温度记录的是华氏温度(°F)。

全血细胞计数

在攻击当天以及攻击后14天内的每一天，对37匹马的每一匹，采集静脉血，直接放入EDTA二钠真空采血管(Vacutainer Disodium EDTA)，进行全血计数。

鼻腔分泌物评价

所有对鼻腔分泌物(nasal exudate)的观察都在采集鼻咽拭子之前进行。在攻击当天以及攻击后14天内，检查37匹接种和对照马每一匹的鼻通道和鼻口，用下列分级和评分标准进行分级。

根据下列每一类所指明的疾病严重性给出0-6级评分：

表2：临床症状的评分

鼻咽部病毒分离法

在每一个观察测试日，用无菌拭子深入每匹马的每个鼻孔深处取样。取样后，将两个拭子的每一个迅速放置在一个管子中，管内含4mL冷的转运培养基(Dulbecco基本必需培养基(DMEM)，补充了2％FBS，2X青霉素/链霉素，2X庆大霉素，和2X两性霉素B)。

为了分离病毒，将这些管子混合，无菌取出拭子，将培养基在1500rpm离心10分钟以除去颗粒。在接种组织培养细胞之前，培养基经过0.2μ注射器滤膜过滤。用1mL澄清的转运培养基接种2cm² 1日龄单层ED细胞，所述细胞是已在24孔组织培养板上生长的细胞，所述生长培养基是从所述细胞无菌获取的。接种后，使接种物吸附在所述单层细胞上，37℃在含5％CO₂的潮湿培养箱中维持1小时。吸附阶段后，每孔添加另外1mL补料培养基(DMEM含2-5％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺和3X庆大霉素和2X两性霉素B)。加了补料培养基后，将培养板在CO₂培养箱中37℃保温。连续7天用显微镜检查每个组织培养测试孔和对照孔是否有EHV-4攻击病毒典型的致细胞病变效应(CPE)。将7天观察期结束时仍为阴性的那些孔再克隆到新鲜细胞上，又观察7天。

血清中和测试法

本研究中采用标准微滴板血清中和试验。所有血清都在无菌平底微滴板上测试，每个稀释度5种孔，且5种测试孔的每一种分配8个孔的稀释系列。5种测试孔每孔含25μl稀释血清和25μl指示者病毒和150μl新鲜接种的ED细胞悬液(含约5X10⁴个细胞)。所用的测试指示者病毒是EHV-4 HRA005批号033106 SN原种病毒。在所有测试中，该指示者病毒的回复滴定滴度为68-149TCID₅₀/25μl。血清中和抗体滴度表示为Reed-Muench ID₅₀滴度。

为进行测试，每种待测血清在无菌平底微滴板中进行两倍稀释，每种待测血清分配5行平行孔，每行8个孔的稀释系列。用体积可调的单通道或多通道移液器配备无菌微滴板移液头进行稀释。第一排5孔中，每孔添加50μl血清。其它孔含25μl DMEM(不含FBS)。随着在板上往下进行系列稀释，从每次的末排取出25μl。每个测试孔加25μl预定稀释度的指示者病毒。然后将这些微滴板混合，在37℃5％CO₂中保温1小时。在保温期结束时，每个测试孔和细胞对照孔加150μl悬液，其中含5x10⁴ED细胞。这些微滴板在37℃的CO₂培养箱中保温5-7天后，用显微镜检查板上的EHV-4典型CPE。然而，任何另外的商购试验或在先技术描述的任何试验都可以用于此目的。

结果和结论

鼻腔分泌物评价

每天相互作用的接种组(vaccination group by day interaction)在鼻排出物评分方面具有统计学显著意义(P＜0.05，表1)。统计学显著的组别效应可见于攻击后6-10天和14天(接种组的鼻评分较少)。

将攻击后阶段的每日评分汇总发现，接种组的马比对照组的马总分更低(P＜0.05，表1)。降低系数(mitigated fraction)估计为0.824(95％ASE CI：0.629，1.000)。

表3：鼻排出物评分

	对照	接种	P-值	降低系数(95％ASE CI)
					鼻排出总分	28.9	13.6	＜0.0001	0.824(0.629，1.000)

结膜炎

每天相互作用的接种组在结膜炎(conjunctivitis)评分方面具有统计学显著意义。统计学显著的组别效应可见于攻击后6，7，9，10，13和14天(接种组在这6天中有5天评分较低，P＜0.05，图2)。

血清学研究

滴度在进行统计学分析前转换成log值。每天相互作用的接种组在SN滴度方面具有统计学显著意义。统计学显著的组别效应可见于第0天(接种前；对照组滴度＞接种组滴度)，第35天(攻击当天)，以及攻击后7和14天(第42和49研究日)。接种组的马在第35，42和49天比对照组的滴度高(P＜0.05，表4)。

表4：滴度

研究日	对照	接种	P-值
				0	8.31	5.74	0.0303
21	8.25	6.51	0.1639
				35(攻击日)	6.12	8.56	0.0495
42	4.57	7.27	0.0069
				49	4.87	13.12	＜0.0001

白细胞计数(WBC)和淋巴细胞计数

每天相互作用的接种组在WBC和淋巴细胞计数方面具有统计学显著意义。统计学显著的组别效应可见于攻击后4-6天(WBC)、以及攻击后第4和5天(淋巴细胞)。接种组的马受到保护免于因EHV4疾病所致的白细胞减少症，它们比对照组的马有更高的WBC和淋巴细胞计数(P＜0.05)。

讨论和结论

在本研究中，攻击后观察到中度和适当(adequate)的EHV-4感染的临床表现。鼻腔分泌物显著较少的临床表现可见于攻击后6-10和14天的接种组马匹。结膜炎评分在攻击后7，9，10，13，和14天的接种组马匹中显著较低。尽管攻击后的临床表现有充分展示，鼻拭子样品中病毒排出的情况在该EHV-4攻击后很少见。通过在细胞培养中分离病毒来检查鼻拭子。

WBC和淋巴细胞的显著组别效应可见于第4-6天(WBC)和第4-5天(淋巴细胞)，其中接种组动物的WBC和淋巴细胞计数比对照组的马高。这些值表明对照组的马确实受到疱疹病毒感染所致的免疫抑制的影响，还表明用EHV-1交叉保护株进行免疫接种使得接种组的马更能抵抗疱疹病毒感染的免疫抑制特性。相应地，接种组的马在第35，42和49天比对照组的马有更高的血清中和滴度。

本研究的数据表明，当用异源EHV-4攻击生物进行攻击时，接种过含EHV-1的多组分疫苗的马表现出交叉保护性免疫力。

实施例4

本实施例举例说明本发明组合疫苗的效力和免疫力持续时间。

材料和方法

本研究所评价的疫苗中用到的流感病毒抗原是在Madin Darby犬肾(MDCK)细胞上制出的。培养后，将病毒液过滤，用福尔马林灭活，并浓缩。对灭活的病毒液测试是否有残余的活病毒。满意的残余活病毒测试完成后，再用灭活的病毒液配制疫苗，其中还包含：灭活的委内瑞拉TC-83株(ATCC保藏号PTA-9411)，东方型NJO株(ATCC保藏号PTA-9412)，和西方型Fleming株(ATCC保藏号PTA-9410)，马脑脊髓炎病毒，灭活的EHV-1(ATCC保藏号PTA-9525)，灭活的甲型流感/equine-2/Kentucky/95(ATCC保藏号PTA-9523)和甲型流感/equine-2/NewMarket/2/93(ATCC保藏号PTA-9524)病毒，灭活的西尼罗病毒，马源2005(ATCC保藏号PTA-9409)，和破伤风类毒素。

配制疫苗，使该产物中所包括的所有抗原都有适当的规格。甲型流感/equi-2/Ohio/03(ATCC保藏号PTA-9522)抗原以10^6.7TCID₅₀/mL的灭活前滴度添加到该疫苗中。

最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

26匹4-5月龄的马用于本研究中。15匹马作为接种者，11匹马作为伪接种的对照马。

对接种组的15匹马，每匹肌肉接种1mL剂量的疫苗。对照组的11匹马，每匹接受1mL剂量的佐剂化DMEM(批号004)，含9-联疫苗中用到的赋形剂(庆大霉素和甲醛)但不含抗原。加强接种的4个月后，用毒力influenzaA/equi-2/Ohio/03株的病毒进行攻击接种。

在开始免疫接种前，第一剂接种后第21天(强化接种日)，攻击当天，以及攻击后的7和14天，从接种马和对照马采集血清样品，进行血清学评价。在攻击当天及攻击后10天内的每一天，总共11天的观察日，每天获取每匹马的体温、全血采样、和鼻拭子。还在该11天的观察期每天获取每匹马的临床数据。

攻击

攻击毒种Influenza A/equi-2/Ohio/03是在卵里制备的。在攻击当天的早晨，将攻击病毒用组织培养基进行1∶20稀释，以获得足以在未接种且被攻击的马匹中引起临床流感的滴度。

每匹马在攻击之前，按照50μg/kg体重的剂量静脉给予

(罗米非定盐酸盐)，一种镇痛止痛药。然后每匹马用influenza A/equi-2/Ohio/03病毒进行攻击。攻击病毒以气溶胶的形式鼻内给予，所述气溶胶是用雾化器压入Equine AeroMask(Trudell Medical International，Ontario，Canada)制得的，制备方法如下：

将4mL攻击病毒置于AeroMask装置的雾化器罩杯中。从气体压缩器引出一根压力软管，接到雾化器的进口。将出口管插入AeroMask，AeroMask佩戴在要被攻击的马的头部，对进口加压。这期间，约2mL攻击病毒液变成气溶胶，直接进入被攻击的马的鼻孔中。

温度

对于总共26匹接种马和对照马的每一匹，在攻击当天以及攻击后10天内，每天用校准的电子体温计(GSA Electronics)探头记录直肠温度。每日直肠温度记录的是华氏温度(°F)。

白细胞计数

在攻击当天以及攻击后10天内的每一天，对26匹接种马和对照马的每一匹，采集静脉血，直接放入EDTA二钠真空采血管，进行WBC计数。

鼻腔分泌物评价

所有对鼻腔分泌物的观察都在收集鼻咽拭子之前进行。在攻击当天以及攻击后10天内，检查26匹接种和对照马每一匹的鼻通道和鼻口，用下列分级和评分标准进行分级。

根据下列每一类所指明的疾病严重性给出0-6级评分：

表5：评分级别

咳嗽

在整个观察期内，对每匹马计数每个观察日的咳嗽发作，不管是否咳嗽时有调查员检查该马匹都如此。由除了调查员以外的观察者记录每匹马在观察期间的咳嗽发作。对咳嗽发作的评分是每匹马咳嗽发作的实际次数。

结膜炎

每天在评价鼻腔分泌物的当时评价结膜炎。结膜炎评分为0＝正常；1＝轻度至中度结膜炎，2＝严重结膜炎。

鼻咽部病毒分离/血凝(HA)法

在每一个观察测试日，用无菌拭子深入每匹马的每个鼻孔深处取样。取样后，将两个拭子的每一个迅速放置在一个管子中，管内含4mL冷的转运培养基(Dulbecco基本必需培养基(DMEM)，补充了2％FBS，2X青霉素/链霉素，2X两性霉素B)。

为了分离病毒，将这些管子混合，无菌取出拭子，将培养基在1500rpm离心10-15分钟以除去颗粒。在接种组织培养细胞之前，培养基经过0.2μ注射器滤膜过滤。过滤后，每份样品添加4-6％的无菌85％蔗糖溶液，以便在-80℃冷冻，以便同时测试所有样品。

所有样品在无菌平底微滴板上测试，每个稀释度5种孔，5种测试孔的每一种分配4个孔的稀释系列。解冻后，用22μL已澄清的样品培养基接种1日龄MDCK-S细胞，所述生长培养基就是从所述细胞无菌获取并被替换为200μl流感病毒生长培养基(DMEM含5-10个单位/mL 10,000U原液猪胰蛋白酶，2mM L-谷氨酰胺，1X青霉素-链霉素和1X两性霉素B)。将培养板在CO₂培养箱中35℃保温5-7天。之后，从滴定板的所有孔取50μl直接转移到标记的96孔乙烯HA板中。每孔加鸡红细胞，室温静置30-90分钟。读取各个孔的阳性血凝，作为存在马流感病毒的证据。

血凝抑制(HI)试验方案

制备血清样品，方法是，每份样品取0.15ml装入试管，用0.3mL 0.01M高碘酸钠溶液室温提取15分钟。每管加甘油液3％(0.125mL)，混合后，室温保温15分钟。然后将所有样品在56℃热灭活30分钟。

0.5％鸡红细胞液用PBS(SAFC目录号59321C)制得，调整为550nm处的光密度达0.5。

经过提取的血清样品平行双份在U形底聚苯乙烯板上用2倍稀释方案进行测试，所述稀释是在PBS中稀释成1∶4至1∶256，25ul/孔。向血清样品稀释液中加入InfluenzaA/Equi2/Ohio03原种病毒(25μL)。平板通过轻拍进行混合，室温保温30分钟。保温后，每孔加入鸡红细胞，室温静置1-1.5小时。通过观察板上每孔中有无凝集的红细胞，来读取结果。将未出现凝集的最高血清稀释度确定为抗体滴度。

结果和结论

将攻击后所有时间点的样品汇总后发现，接种动物的临床总评分比对照动物低。将攻击后每日评分总和发现，接种组的马比对照组的马总分更低(P＜0.05)。降低系数经评估为0.6485(95％ ASE CI：0.3258，0.9712)。

表6：临床总评分

结果变量	接种组	日	每日相互作用组
				临床总评分¹	＜0.0001	＜0.0001	0.1321

¹GLIMMIX法不能集中(converge)，因此用ANOVA法评估攻击后一段时间内的免疫接种效果。结果通过粗体值解释。

表7：降低系数-总体累计临床评分

	对照	接种	P-值¹	降低系数²(95％ASE CI)
					总的累计临床评分²	18.36³	9.93	0.0055	0.6485(0.3258，0.9712)

¹P-值来自Wilcoxon秩和检验

²将每个动物每天的以及跨所有时间点的鼻排出物分值，结膜炎分值和咳嗽分值总和在一起，然后给出秩(ranked)，以评估降低系数。

³平均秩

鼻排出

主要接种效果是流感病毒攻击引起的鼻排出物出现统计学显著性减少。将攻击后跨所有时间点的分值汇总发现，接种动物的鼻排出物分值比对照动物更低。

表8：鼻排出物分值

结果变量	接种组	日	每日相互作用组
				鼻排出物评分¹	0.0012	＜0.0001	0.4627

¹GLIMMIX法不能集中，因此用ANOVA法评估攻击后一段时间内的免疫接种效果。结果通过粗体值解释。

结膜炎

对于结膜炎，主要接种效果是统计学显著的。将攻击后跨所有时间点的分值汇总发现，接种动物因流感病毒感染引起的结膜炎比对照动物减轻，表现为结膜炎分值更低。

表9：结膜炎分值

结果变量	接种组	Day	每日相互作用组
				结膜炎分值¹	0.0187	0.0001	0.2498

咳嗽

疫苗还提供保护作用以免由马流感感染所致的咳嗽。接种动物在攻击后3，5，7，8，和9天比对照动物分值低(P＜0.05)。

表10：咳嗽分值

结果变量	接种组	日	每日相互作用组
				咳嗽分值¹	0.0004	0.0009	0.0275

病毒排出(鼻拭子)

该免疫接种还减少了排病毒的马的百分比(P＜0.05)。下表显示，排病毒的接种动物百分比在攻击后3，4，和5天低于对照动物(P＜0.05)。

表11：降低系数-排病毒天数

¹P-值来自Wilcoxon秩和检验

²排病毒天数算出后，给出秩，以评估降低系数。用渐近标准误(Asymptotic standarderrors，ASE)评估95％置信区间(confidence intervals，CI)。

³阳性结果天数的中值从病毒分离试验获得。

HI滴度

该疫苗也能有效激发保护性抗马流感病毒抗体滴度。在第36天(相对于接种)，第154天(攻击日)，第159天和第164天，接种马具有统计学显著更高的滴度。上述这些天中，每一天接种组的马都比对照组的马滴度更高(P＜0.05)。

WBC和淋巴细胞计数

该接种还保护了马匹以免受流感病毒攻击后白细胞数减少(P＜0.05)。组合疫苗的接种提供了统计学显著的保护作用，可见于第2和7天的WBC计数，以及攻击后第2，6，7，和8天。接种组的马比对照组的马有更高的WBC和淋巴细胞计数(P＜0.05)。进行持续4个月的免疫力攻击，以证明包括西尼罗病毒疫苗的多组分疫苗(脑脊髓炎-鼻肺炎-流感-西尼罗病毒疫苗，东方型，西方型，和委内瑞拉型，杀灭的病毒，破伤风类毒素)中流感病毒组分的效力，所述多组分疫苗包含3株马流感A/equi-2病毒株，它们的ATCC保藏号为PTA-9522，PTA-9523，和PTA-9524，目前分别在美洲、欧洲和亚洲的马群中流行。26匹马(15匹接种马和11匹对照马)以3周的间隔两次接种1mL剂量的疫苗，或用该疫苗不含病毒抗原的佐剂化培养基成分进行伪接种。强化接种的4个月后，马匹用有毒力的马流感A/equi-2/Ohio03活病毒攻击。该毒力病毒是被OIE推荐包括在疫苗中的当期马流感A/equi-2株，现已被认为是与美国的暴发流行最相关的株。

该4个月DOI攻击研究结果显示，用该测试疫苗即包含流感和其它相关马抗原的组合型西尼罗病毒疫苗进行接种，对攻击产生了显著保护效果。重要的是，接种过的马显示统计学更低的流感病毒总临床表现(鼻排出，结膜炎，和咳嗽，P＝0.0055)，降低系数经评估为0.6485(95％ASE CI：0.3258，0.9712)。相应地，病毒排出在接种过的马中比对照马在统计学意义上更低(P＝.0004)，降低系数经评估为0.7939(95％ASE CI：0.5343，1.0000)。接种马与对照马相比，血凝抑制滴度显著更高，白细胞和淋巴细胞计数在多个研究日也更高。这两组的直肠温度未测出差异。

结论是，本研究的数据表明，以21天的间隔，对4-5月龄的雏马施用2x1mL经肌肉剂量的这种西尼罗病毒组合疫苗，保护了马匹免受马流感A/equi-2/Ohio03病毒的毒力攻击，并且该产品提供了持续至少4个月的免疫力。

实施例5

本实施例举例说明本发明致免疫组合物对(马疱疹病毒1型)EHV-1攻击的效力。

材料和方法

本研究评估的疫苗中所用的EHV-1病毒抗原是在Madin Darby牛肾(MDBK)细胞上制备的。培养后，将病毒液过滤，用BPL灭活，并浓缩。对灭活的病毒液测试是否有残余的活病毒。满意的残余活病毒测试完成后，再用灭活的病毒液配制疫苗，其中还包含：灭活的委内瑞拉马脑脊髓炎TC-83株(ATCC保藏号PTA-9411)，东方型马脑脊髓炎NJO株(ATCC保藏号PTA-9412)，以及西方型马脑脊髓炎Fleming株(ATCC保藏号PTA-9410)病毒，灭活的influenza A/equine-2/Kentucky/95(ATCC保藏号PTA-9523)，influenzaA/equine-2/NewMarket/2/93(ATCC保藏号PTA-9524)和influenzaA/equine-2/Ohio/03(ATCC保藏号PTA-9522)病毒，灭活的西尼罗病毒(ATCC保藏号PTA-9409)和破伤风类毒素。

配制疫苗，使该产物中所包括的所有抗原的规格最小化。EHV-1抗原以10^7.0TCID₅₀/mL的灭活前滴度添加到该疫苗中。

最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

40匹4-5月龄的马用于本研究中。将马匹随机分配至接种组或对照组，打上标记，然后接种。20匹马作为接种者，20匹马作为伪接种的对照马。所有马在研究开始前具有阴性至低水平(＜1∶6)的EHV-1血清中和(SN)滴度，表明这些马对感染是易感的。

对接种组的20匹马，每匹肌肉接种1mL剂量的疫苗。对照组的20匹马，每匹接受1mL剂量的佐剂化DMEM(批号004)，含9-联疫苗中用到的赋形剂(庆大霉素和甲醛)但不含抗原。加强接种的15天后，用毒力EHV-1A183株的病毒进行攻击接种。

在开始免疫接种前，第一剂接种后第21天(强化接种日)，攻击当天，以及攻击后的7和14天，从接种马和对照马采集血清样品，进行血清学评价。在攻击当天及攻击后14天内的每一天，总共15天的观察日，每天获取每匹马的体温、全血采样、和鼻拭子。还在该15天的观察期每天获取每匹马的临床数据。

攻击方法

攻击病毒

本攻击研究中使用的攻击病毒原种是原种病毒在马皮肤(Equine Dermal，ED)细胞上培养出的第一代。该攻击病毒在滴度达10^6.2TCID₅₀/mL时收获并冷冻。

鼻内攻击方法

每匹马在攻击之前，按照50μg/kg体重的剂量静脉给予

(罗米非定盐酸盐)，一种镇痛止痛药。然后每匹马用约10^6.5TCID₅₀EHV-1株进行攻击。攻击病毒以气溶胶的形式鼻内给予，所述气溶胶是用雾化器压入Equine AeroMask(Trudell Medical International，Ontario，Canada)制得的，制备方法如下：

从气体压缩器引出一根压力软管，接到雾化器的进口。将出口管插入AeroMask，AeroMask佩戴在要被攻击的马的头部，对进口施加约10psi的气压，维持4分钟。这期间，约2mL 10^6.2TCID₅₀/mL的攻击病毒液变成气溶胶，直接进入被攻击的马的鼻孔中。

攻击前后的评估参数

温度

对于总共40匹接种马和对照马的每一匹，在攻击当天以及攻击后14天内，每天早晨用校准的电子体温计(GSA Electronics)探头记录直肠温度。每日直肠温度记录的是华氏温度(°F)。

白细胞计数

在攻击当天以及攻击后14天内的每一天，对40匹接种马和对照马的每一匹，采集静脉血，直接放入EDTA二钠真空采血管，进行WBC计数。

鼻腔分泌物评价

所有对鼻腔分泌物的观察都在收集鼻咽拭子之前进行。在攻击当天以及攻击后14天内，检查40匹接种和对照马每一匹的鼻通道和鼻口，用下列分级和评分标准进行分级。

根据下列每一类所指明的疾病严重性给出0-6级评分：

(EN)基本正常，表明此马基本无鼻腔分泌物，分值，0；

(C-1)略微清亮的浆液性排出物，是患病马和健康马中都常见的那种，分值，1；

(C-2)中度清亮的浆液性排出物，指示比正常观察到的体积明确更多，分值，2；

(C-3)大量清亮的浆液性排出物，是通常仅见于患病马的那种，分值，3；

(VSM)非常稀薄的粘液脓性排出物，表明一或两个鼻孔中一定存在少量的粘液，分值，1.5；

(SM)很容易在一或两个鼻孔看到稀薄的粘液脓排出物，分值，2；

(MM)中度脓性粘液，表明两个鼻孔都有大量粘性分泌物，分值，4；

(HM)稠的脓性粘液，表明两个鼻孔充满了大量粘性分泌物，分值，6。

鼻咽部病毒分离法

为了分离病毒，将这些管子混合，无菌取出拭子，将培养基在1500rpm离心10分钟以除去颗粒。在接种组织培养细胞之前，培养基经过0.2μ注射器滤膜过滤。用1mL澄清的转运培养基接种2cm² 1日龄单层ED细胞，所述细胞是已在24孔组织培养板上生长的细胞，所述生长培养基是从所述细胞无菌获取的。接种后，使接种物吸附在所述单层细胞上，37℃在含5％CO₂的潮湿培养箱中维持1小时。吸附阶段后，每孔添加另外1mL补料培养基(DMEM含2-5％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺和3X庆大霉素和2X两性霉素B)。加了补料培养基后，将培养板在CO₂培养箱中37℃保温。连续7天用显微镜检查每个组织培养测试孔和对照孔是否有EHV-1 A183攻击病毒典型的致细胞病变效应(CPE)。将7天观察期结束时仍为阴性的那些孔再克隆到新鲜细胞上，又观察7天。

WBC淡黄层病毒分离

对于40匹接种马和对照马的每一匹，在攻击当天和攻击后14天内的每一天，用真空采血器将静脉血采集到EDTA二钠试管中。待试管内EDTA抗凝血中的红细胞受重力沉降后，移出血浆和白细胞，置于无菌的5mL按盖(snap-cap)管中。血浆和白细胞混合物在1500RPM离心10-15分钟，使白细胞沉淀。将沉淀用含2X青霉素/链霉素、2X庆大霉素和2X两性霉素B的3mL磷酸缓冲盐水(PBS)洗两次。然后将细胞悬浮在4mL DMEM(添加了2％胎牛血清(FBS)和2X青霉素/链霉素，2X庆大霉素，和2X两性霉素B)中。用1mL淡黄层悬液接种2cm² 1日龄ED细胞，所述细胞是已在24孔组织培养板上生长的细胞，所述生长培养基是从所述细胞无菌获取的。接种后，使接种物吸附在所述单层细胞上，37℃在含5％CO₂的潮湿培养箱中维持1小时。吸附阶段后，每孔添加另外1mL补料培养基(DMEM含5-7％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺和1X庆大霉素)。加了补料培养基后，将培养板在CO₂培养箱中37℃保温。由于该单层上有大量白细胞，显微镜下无法对这些孔进行观察。因此，在7天结束时，所有孔都用0.5ml的第一代作为接种物而再克隆到新鲜的ED细胞上。对这些再克隆进行7天的观察，以观察攻击病毒感染典型的CPE。

血清中和测试法

本研究中采用标准微滴板血清中和试验。所有血清都在无菌平底微滴板上测试，每个稀释度5种孔，且5种测试孔的每一种分配8个孔的稀释系列。5种测试孔每孔含25μl稀释血清和25μl指示者病毒和150μl新鲜接种的ED细胞悬液(含约5X10⁴个细胞)。所用的测试指示者病毒是EHV-1亚型1病毒株A183。在所有测试中，该指示者病毒的回复滴定滴度为109-263TCID₅₀/25μl。血清中和抗体滴度表示为Reed-Muench ID₅₀滴度。

为进行测试，每种待测血清在无菌平底微滴板中进行两倍稀释，每种待测血清分配5行平行孔，每行8个孔的稀释系列。用体积可调的单通道或多通道移液器配备无菌微滴板移液头进行稀释。第一排5孔中，每孔添加50μl血清。其它孔含25μl DMEM(不含FBS)。随着在板上往下进行系列稀释，从每次的末排取出25μl。每个测试孔加25μl预定稀释度的指示者病毒。然后将这些微滴板混合，在37℃5％CO₂中保温1小时。在保温期结束时，每个测试孔和细胞对照孔加150μl悬液，其中含5x 10⁴ED细胞。这些微滴板在37℃的CO₂培养箱中保温3天后，用显微镜检查板上的EHV-1典型CPE。备选地，任何常规或商购试验都可以使用，或者本领域技术人员能按照本文的指导进行试验。

结果和结论

鼻排出物评分，EHV-1的鼻排出，以及结膜炎分值都被认为是主要的结果变量。所有其它结果被认为是次要的。

表12：总结统计学分析(P-值)

结果变量	接种组	日	每日相互作用组
				鼻排出物评分¹	0.0001	＜.0001	＜0.0001
病毒排出¹	0.0028	＜0.0001	0.0863
				结膜炎分值¹	0.0020	＜0.0001	0.0017
SN滴度	＜0.0001	＜0.0001	＜0.0001
				WBC	0.3064	＜0.0001	＜0.0001

鼻腔分泌物评价

每天相互作用的接种组在鼻排出物评分方面具有统计学显著意义(P＜0.05)。统计学显著的组别效应可见于第4，5天以及攻击后7-11天(接种组的鼻评分较少，P＜0.05)。将攻击后阶段的每日评分汇总发现，接种组的马比对照组的马总分更低(P＜0.05)。降低系数经评估为0.7250(95％ASE CI：0.4886，0.9614)。

表13：降低系数-鼻排出物和结膜炎分值，鼻病毒排出(平均秩)

¹P-值来自Wilcoxon秩和检验

	对照	接种	P-值¹	降低系数²(95％ASE CI)
					鼻排出物	27.75	13.25	＜0.0001	0.7250(0.4886，0.9614)
排病毒天数²	24.43	15.78	0.0068	0.4925(0.1896，0.7954)
					结膜炎	25.80	15.20	0.0038	0.5300(0.2463，0.8137)

²将跨所有时间点的鼻排出物和结膜炎分值总和在一起，给出秩，以评估降低系数。算出排病毒的天数后，给出秩，以评估降低系数。用近似标准误(ASE)评估95％置信区间(CI)。

表14：平均鼻排出物评分(N＝20匹马/组)

攻击后的天数	对照	接种	P-值¹
				0	0.00	0.00	1.0000
1	0.00	0.00	1.0000
				2	0.15	0.00	0.6029
3	0.33	0.48	0.6029
				4	1.08	0.23	0.0033
5	1.43	0.40	0.0004
				6	1.05	0.55	0.0833
7	1.50	0.68	0.0044
				8	1.68	0.63	0.0003
9	2.13	0.50	＜.0001
				10	1.58	0.80	0.0074
11	0.98	0.23	0.0095
				12	0.90	0.35	0.0568
13	1.23	0.90	0.2599
				14	0.93	0.43	0.0833

¹GLIMMIX法不能集中，因此用ANOVA法评估攻击后一段时间内的免疫接种对鼻排出物评分的影响。

结膜炎

每天相互作用的接种组在结膜炎分值方面具有统计学显著意义(P＜0.05)。统计学显著的组别效应可见于第5和6天以及攻击后9-14天(接种组的分值较少，P＜0.05)。将攻击后阶段的每日评分汇总发现，接种组的马比对照组的马总分更低(P＜0.05)。降低系数经评估为0.5300(95％ASE CI：0.2463，0.8137)。

表15：平均结膜炎分值(N＝20匹马/组)

攻击后天数	对照	接种	P-值¹
				0	0.00	0.00	1.0000
1	0.00	0.00	1.0000
				2	0.00	0.00	1.0000
3	0.05	0.00	0.7321
				4	0.15	0.15	1.0000
5	0.70	0.25	0.0022
				6	0.85	0.25	＜.0001

攻击后天数	对照	接种	P-值¹
				7	0.75	0.65	0.4936
8	0.45	0.35	0.4936
				9	0.50	0.15	0.0168
10	0.45	0.15	0.0403
				11	0.50	0.05	0.0022
12	0.45	0.00	0.0022
				13	0.45	0.05	0.0063
14	0.35	0.05	0.0403

¹GLIMMIX法不能集中，因此用ANOVA法评估攻击后一段时间内的免疫接种效果。

从鼻咽拭子分离病毒

接种组的主要效果具有统计学显著性(接种组较少的动物排出，P＜0.05)。对排出天数的评估发现，接种组的马与对照组的马相比，排病毒的天数更少(P＜0.05)。降低系数经评估为0.4925(95％ASE CI：0.1896，0.7954)。

表16：病毒排出比例(鼻拭子，N＝20匹马/组)

攻击后天数	对照	接种
			0	0.00	0.00
1	0.00	0.00
			2	0.05	0.05
3	0.05	0.10
			4	0.20	0.05
5	0.25	0.15
			6	0.45	0.25
7	0.45	0.35
			8	0.50	0.10
9	0.45	0.15
			10	0.25	0.00
11	0.35	0.10
			12	0.30	0.10
13	0.15	0.00
			14	0.05	0.00

白细胞计数

每天相互作用的接种组在WBC计数方面具有统计学显著意义(P＜0.05)。统计学显著的组别效应可见于攻击后第2和3天。接种组的马比对照组的马有更高的WBC计数，表明所述疫苗阻止了这些马遭受EHV 1感染所致的白细胞减少症(P＜0.05)。

表17：平均WBC计数(N＝20匹马/组)

攻击后天数	对照	接种	P-值¹
				1	14.0413	14.4887	0.6081
2	10.7963	14.1287	0.0001

攻击后天数	对照	接种	P-值¹
				3	11.1263	14.0687	0.0008
4	11.5013	13.1037	0.0667
				5	10.7413	11.1987	0.6001
6	9.1063	9.4187	0.7203
				7	10.1563	9.9037	0.7721
8	10.7813	10.6037	0.8386
				9	11.1813	12.0737	0.3065
10	11.9713	12.4187	0.6081
				11	12.6713	13.2137	0.5341
12	13.2913	13.5637	0.7549
				13	14.7063	14.1737	0.5415
14	15.8463	14.4587	0.1121

¹P-值来自ANOVA

血清学研究

滴度在统计分析前转换成log值。每天相互作用的接种组在SN滴度方面具有统计学显著意义(P＜0.05)。统计学显著的组别效应可见于第35天(攻击当天)以及攻击后第7和14天(第42和49研究日)。接种组的马比对照组的马具有更高的滴度(P＜0.05)。

表18：几何平均-血清中和滴度(N＝20匹马/组)

研究日	对照	接种	P-值¹
				0	3.987	3.384	0.4005
21	3.190	2.624	0.3168
				35(攻击日)	3.480	6.863	0.0006
42	3.519	19.252	＜0.0001
				49	33.153	187.417	＜0.0001

¹P-值来自NOVA。血清中和滴度在统计学分析前转换成log(自然对数)。

结果和讨论

由马疱疹病毒1型引起的呼吸道疾病常常是未致敏的(

)刚断奶的周岁小马群在其生命的第一年发生的流行病，通常在秋冬季发病。真正感染的表现有，高烧超过106°F，病毒血症和白细胞减少症和/或中性粒细胞减少症。流鼻涕通常在该首次暴露于病毒的发热阶段出现。EHV-1的自然感染不导致永久的呼吸道免疫力。事实上，马在其一生中每隔3-6个月就可能再次发生自然感染。首次接触该病毒后，再感染导致产生病毒，但通常不表现疾病的临床症状，结果携毒动物起到病毒天然储库的作用。

本报告所述的马疱疹病毒-1多组分疫苗被显示，在经马疱疹病毒1型毒力异源株攻击的马中，能有效减少呼吸道表现，临床症状和鼻排出物中的病毒排出。从呼吸道排出的病毒减少在流行病学上具有重要意义，因为这是未致敏的动物天然的暴露途径，也是同伴从经历自然感染的动物被再感染的途径。它也是安全的疫苗，在本研究的马中使用疫苗后，未在全身或是疫苗接种部位发现副作用。

在本研究中，每天相互作用的接种组在主要结果变量鼻排出物分值和结膜炎方面显示统计学显著性。统计学显著的组别效应在鼻排出物方面可见于第4，5天以及攻击后7-11天的接种组。结膜炎组别效应在第5和6和9-14天也是统计学显著的，接种组的分值低(P＜0.05)。这在流行病学上有显著意义，因为EHV-1病毒很脆弱，不容易在环境中存活。密切接触对于疾病通过含毒力EHV-1病毒的鼻分泌物传播很重要(Campbell and Studdert，1983)。

重要的是，本研究的另一主要结果变量，鼻腔分泌物的病毒排出，显示出作为接种的主要效果有统计学显著性(P＜0.05)。接种组的马与对照组的马相比，排病毒的天数在统计学上更少(P＜0.05)。

接种马比对照马的血清中和滴度在接种后以及在整个攻击期间都是统计学显著的(P＜0.05)。体液免疫力和粘膜抗体对于确定是否EHV-1感染变成可繁殖病毒的事件或是局限感染的事件可能很重要(Kidd，Smith，Hannant等，1994)。

实施例6

本实施例举例说明了本发明致免疫组合物在西尼罗病毒攻击时的效力和6个月的免疫力持续时间。

材料和方法

本研究评估的疫苗中所用的WNV病毒抗原是在实施例1所述的E vero细胞上制备的。将总共15匹马随机分组，其中一组是由5匹马组成的对照组。接种组的10匹马以21天的间隔接受2剂疫苗。满意的残余活病毒测试完成后，用灭活的病毒液配制疫苗，其中还包含：灭活的委内瑞拉马脑脊髓炎TC-83株(ATCC保藏号PTA-9411)，东方型马脑脊髓炎NJO株(ATCC保藏号PTA-9412)，和西方型马脑脊髓炎Fleming株(ATCC保藏号PTA-9410)病毒，灭活的influenza A/equine-2/Kentucky/95(ATCC保藏号PTA-9523)，influenza A/equine-2/NewMarket/2/93(ATCC保藏号PTA-9524)和influenzaA/equine-2/Ohio/03(ATCC保藏号PTA-9522)病毒，灭活的西尼罗病毒(ATCC保藏号9409)和破伤风类毒素。配制疫苗，使该产物中所包括的所有抗原的规格最小化。

最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

15匹马用于本研究中。将马随机分配至接种组或对照组，然后接种。10匹马作为接种者，5匹马作为伪接种的对照马。

接种组的每匹马经肌肉接种1mL剂量的疫苗。对照组的每匹马接受1mL剂量的佐剂化DMEM，含9-联疫苗中用到的赋形剂(庆大霉素和甲醛)但不含抗原。

所有组在接种后通过鞘内接种1ml含约10⁵pfu WNV异源株(NY99，4132，鸦分离物)的PBS攻击约6个月。所述攻击在氯胺酮-赛拉嗪麻醉下进行。

对马监控最多14天。

结果和讨论

攻击后的病毒血症被认为是本研究中的主要结果变量。接种过的马在本研究的攻击后有90％受到保护而免于病毒血症。相比之下，5匹对照马在攻击的3-5天后都被确认有病毒血症。

此外，接种马的血清中和滴度显著高于对照马在接种后的所述滴度。所有接种马在接种后产生可检测的量的血清中和滴度，而没有一匹对照马展示任何抗WNV滴度。该研究表明，2剂所述的实验性组合疫苗可靠且有效地刺激了保护性血清学血清中和滴度。

这些结果表明，在施用该疫苗的动物中确实诱导出了致免疫反应，且所述疫苗对于在接种后提供至少6个月的保护作用而言是有效的。所述疫苗的有效性在该实施例中还表现在：减少了WNV病毒血症，刺激了高水平的抗WNV的血清中和滴度。由于该疫苗包含多个独特的组分，包括长效非可代谢性佐剂，它被配制成1mL这样的小体积来提供高度的安全性，作为高度致免疫性、较少传代的、来自近期来源并具有高流行病学优势(北美优势WNV株)的完整灭活病毒WNV分离物，和从被感染的马的组织分离出的WNV，它比现有其它疫苗提供更充分的安全性和维持至少6个月的长期有效性。因此，它具有在施用于动物(尤其是马)时提供安全疫苗的效应。

实施例7

本实施例举例说明本发明致免疫组合物的一个实施方案(包括脑脊髓炎抗原和破伤风类毒素抗原)的效力。

材料和方法

对宿主动物和实验室动物免疫接种/血清学进行评价，以确定脑脊髓炎-鼻肺炎-流感-西尼罗病毒疫苗(包括东方型、西方型、和委内瑞拉型脑脊髓炎，杀灭的病毒，和破伤风类毒素)中脑脊髓炎抗原和破伤风类毒素抗原组分的效力。马脑炎病毒疫苗和破伤风类毒素组分的效力和不干扰特性可以通过该组合疫苗的实验室动物潜力测试予以明确证实。马匹接种后的血清学反应被确认也表明疫苗-类毒素效力。因此，在本研究中，实验室动物潜力和宿主动物血清学两者都被用于证实所述实验性疫苗的效力。还评价了所述疫苗在包括马的动物中的安全性。

给未接种的母马生出的4-5月龄马匹接种有效系列的WNV组合疫苗，所述疫苗包含：灭活的委内瑞拉马脑脊髓炎病毒TC-83株(ATCC保藏号PTA-9411)，东方型马脑脊髓炎病毒NJO株(ATCC保藏号PTA-9412)，西方型马脑脊髓炎病毒Fleming株(ATCC保藏号PTA-9410)，西尼罗病毒(WNV)马源2005(ATCC保藏号PTA-9409)，马疱疹病毒1型(ATCC保藏号PTA-9525)(EHV-1)，Influenza A/equine-2/Ohio/03(ATCC保藏号PTA-9522)，InfluenzaA/equine-2/Kentucky/95(ATCC保藏号PTA-9523)，InfluenzaA/equine-2/NewMarket/2/93(ATCC保藏号PTA-9524)和破伤风类毒素。马匹在该研究的第0天和第21天接种。血样在第0、21和35天采集。这里报道了第0和35天的血清学结果。

此外，与用于接种马匹的相同的WNV组合疫苗还在豚鼠中测试了效力。此报告中的数据总体上明确证实了该研究中测试的每一种抗原(EEE、VEE、WEE、破伤风)的效力，并证实了WNV组合疫苗的安全性。

制备批量的(Bulk lots)EEE，WEE，和VEE病毒和破伤风类毒素。培养后，将病毒液过滤，福尔马林灭活，并浓缩。测试灭活的病毒液在灭活后的残余活病毒。

用上述灭活的病毒液和类毒素液配制疫苗，该疫苗还包含：灭活的马疱疹病毒1性，灭活的influenza A/equine-2/Kentucky/95，influenzaA/equine-2/NewMarket/2/93和influenza A/equine-2/Ohio/03病毒。

配制疫苗，使该产物中所包括的所有抗原符合规格。

最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

本研究使用40匹4-5月龄的马。在整个免疫接种期，马匹都与它们的妈妈一起留在牧场上，当采集强化免疫的2周后的血清时，使它们断奶。将马匹随机分配制任一处理组，给它们肌肉接种(IM)1.0ml剂量。初步免疫接种的3周后，进行1.0ml IM加强接种。20匹马接种了疫苗。20匹马接种安慰剂。

豚鼠也接种相同的组合WNV疫苗。

按以下时间表对马匹接种并采集血清样品：

表19：免疫接种和血清采样时间表

测试日	活动
		0	接种前采血，进行初步接种
21	采血，进行加强接种
		35	采血进行最后的血清学分析

豚鼠接种和采血按照9CFR，113.207(b)和113.114(c.)规定的方案进行。

按照一般性指南测试本研究中的马血清。对第0天的血清样品进行1∶2和1∶10稀释，对加强免疫的2周后的血清样品进行1∶10和1∶40稀释，用改良的试验测定滴度。测试血清中的EEE，WEE和VEE抗体和破伤风类毒素抗体。

结果和讨论

EEE，WEE和VEE的马血清学评价

在第0研究日，并非所有雏马都是脑脊髓炎病毒血清阴性。5匹被接种的雏马具有显著的(＞1∶10)抗EEE的病毒残余母体抗体。此外，2匹被接种的雏马具有抗WEE的残余母体抗体(＞1∶10)。不考虑施用第一剂WNV组合疫苗当时的后天获得性母体抗体的存在和潜在干扰，对所有三个组分的滴度在接种后显著增加(在80％的测试了EEE的马中＞4倍，在90％的测试了WEE的马中＞4倍，在1000％的测试了VEE的马中＞4倍)，但在未接种的雏马中仍为阴性或为低水平。各匹雏马的数据显示如下。

EEE，WEE和VEE马的血清学滴度

表20：空斑减少中和滴度

EEE，WEE，VEE和破伤风类毒素的豚鼠血清学评价

10只接种组合疫苗的豚鼠有9只在(≥1∶40)有满意的抗EEE病毒血清转化，10只豚鼠全部具有抗VEE病毒的满意滴度(≥1∶4)，10只豚鼠全部有满意的抗WEE病毒血清转化(≥1∶40)。另外还测试了10接种豚鼠的汇总血清是否有破伤风抗体，结果满意地发现有4.3抗毒素单位/ml(AU/ml)的值。

完成豚鼠潜力试验，对全部四种抗原包括破伤风类毒素、EEE、VEE、和WEE都有满意的发现。

另外，用所述疫苗对马(20匹接种，20匹对照)进行初次免疫，3周后进行加强免疫。加强免疫的14天后，取马血，收集血清进行所有血清学测试。对脑脊髓炎抗原反应的马用2个稀释度(对第0天的样品进行1∶2和1∶10稀释，对第35天的样品进行1∶10和1∶40稀释)在24孔板中测定抗体滴度。

满意的豚鼠潜力测试结论证明了西尼罗病毒组合疫苗(为含9种抗原的疫苗-类毒素)中4种抗原(VEE，EEE，WEE和破伤风类毒素)的效力。而且，满意的潜力测试结果被马血清学数据证实，所述数据表明，接种马在接种后抗每一种脑炎病毒的滴度都大大升高。因此，在任一接种马或豚鼠中未观察到任何副反应表明，所述WNV组合疫苗在动物中是安全的。

实施例8

本实施例举例说明本发明的疫苗或致免疫组合物具有至少1年的免疫力持续时间。

材料和方法

进行宿主动物接种，并在加强免疫的至少1年后进行攻击，以此证实从北美马E159(NAEE159)株北美优势WNV分离物制得的脑脊髓炎-鼻肺炎-流感-西尼罗病毒疫苗中，西尼罗病毒抗原组分的免疫力持续时间，所述疫苗还包含：东方型、西方型和委内瑞拉型杀灭病毒，破伤风类毒素。

表21：最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

本研究中用了30匹1-5月龄的马(20匹接种，0匹对照)。将马随机分配至两个处理组之一中，肌肉接种(IM)1.0mL剂量的指定疫苗或对照产物。初次免疫的3周后，进行1.0mL IM加强免疫。

对马匹接种以此，在约30天后再接种。将马匹随机分配至疫苗组或对照组。20匹马接受VEWT/WNV/EHV-1/Influenza疫苗。10匹接受佐剂化DMEM，其含所述疫苗中用到的赋形剂(庆大霉素和甲醛)但不含抗原。所有给药中用的非可代谢的油佐剂优选矿物油。

加强免疫的380天后，用毒力异源WNV NY99株病毒进行攻击接种。第二批马在加强免疫的408天后用相似的方式进行攻击。

在开始免疫接种前，第一剂接种后第21天(强化接种日)，接种后每个月，攻击当天，以及攻击后的7和14天，从接种马和对照马采集血清样品，进行血清学评价。在攻击当天、及按照每天两次的水平在攻击后1-6天内、及按照每天一次的水平在攻击后的7-10天和第14天，获取每匹马的体温和血清样品。还在所述总共15天的观察期记录临床数据。

称为WNV NY99的异源攻击病毒最初是从受感染的鸦的脑中分离出(CDC，Ft.Collins，CO)。在攻击当天，将原种病毒在冰上解冻，在磷酸缓冲盐水中稀释至适当浓度之后，迅速对马接种。

对于每一匹接种马和对照马，在攻击前一天，攻击当天，以及按照一天两次的水平在攻击后1-14天，然后按照一天一次的水平在攻击后14-21天，每天用校准的电子体温计(GSA Electronics)探头记录直肠温度。每日直肠温度记录的是华氏温度(°F)。

在攻击当天，按照每天两次的水平在攻击后1-6天，按照每天一次的水平在攻击后7-10和14天，用真空采血器从接种马和对照马采集静脉血，放入SST管中。离心后，将血清分成等份试样，立即冷冻。

Vero在6孔板上长至汇合。为进行空斑试验，血清在96孔板上用BA-1培养基(MEM盐含1％BSA，250mg/L碳酸氢钠，50μl庆大霉素和2.5μg两性霉素B/mL，在50mM Tris，pH 7.6中)进行10倍系列稀释。所述6孔板每孔接种0.1mL血清稀释液，保温45-60分钟，期间每隔15分钟摇一摇。保温期后，每孔添加2mL覆盖层(2X培养基含MEM不含酚红，制成正常浓度的2倍，并补加4％FBS，200IU青霉素G/mL和100μg链霉素/mL-预热至45℃)。培养板在37℃保温。

接种的2天后，每孔添加等量的2X培养基和2X琼脂，制备含2X琼脂的2mL第二覆盖层。在接种后的第3，4和5天，检查每个板，记录每孔的空斑数。将计数孔的空斑数(或接种相同稀释度的多个孔的均值)乘以该孔的稀释倍数乘以10，算出每mL原始材料的病毒滴度。

本研究中采样标准微滴板血清中和试验。所有血清在无菌平底96孔微滴板中进行测试，每个稀释度5孔，该5种测试孔的每一种有8个孔的稀释系列。5种测试孔每孔含25μl稀释血清和25μl指示者病毒和150μl新鲜接种的安慰剂Vero细胞悬液(含约4X10⁴个细胞)。所用的测试指示者病毒是WNV NY99。血清中和抗体滴度表示为Reed-Muench ID₅₀滴度。

为进行测试，每种待测血清在无菌平底微滴板中进行两倍稀释，每种待测血清分配5行平行孔，每行8个孔的稀释系列。用体积可调的单通道或多通道移液器配备无菌微滴板移液头进行稀释。第一排5孔中，每孔添加50μl血清。其它孔含25μl DMEM(不含FBS)。随着在板上往下进行系列稀释，从每次的末排取出25μl。每个测试孔加25μl预定稀释度的指示者病毒。然后将这些微滴板混合，在37℃5％CO₂中保温1小时。在保温期结束时，每个测试孔和细胞对照孔加150μl悬液，其中含4x10⁴Vero细胞。这些微滴板在37℃的CO₂培养箱中保温5-7天后，用显微镜检查板上的WNV典型CPE。

组织病理学由有资质的兽医病理学家进行评估。用于描述脑桥或脑髓中缺陷的评分系统如下：

分值：

0＝切片中无明显损伤

0.5＝少见的、小的、多灶性神经胶质结节，散布整个实质

1＝轻度、非化脓性脑炎，特征在于，轻度多灶性血管外周花边(cuff)，其中有淋巴细胞、浆细胞、偶有中性粒细胞，以及散在的多灶性的由神经胶质细胞组成的神经胶质结节，少量单核炎性细胞。偶尔在该级别，有最小的血管外周花边和更中度散布的神经胶质结节。

2＝中度、非化脓性脑炎，特征在于，多个血管周围有中度的淋巴细胞增生性血管外周花边，且神经胶质细胞结节的多灶性积累散布整个实质

3＝重度、非化脓性脑炎，特征在于，严重且厚重的淋巴细胞增生性血管外周花边，整个实质有多个散在的神经胶质细胞结节

结果和讨论

任一剂量时间点都无针对疫苗给药的副反应。所有接受该实验性疫苗的4-5月龄马在本研究中无全身性或局限于注射部位的副反应。这表明了本发明抗WNV疫苗的优良安全性，所述疫苗含有从分离物NAEE159制得的北美优势WNV抗原。

马用异源西尼罗病毒攻击

病毒血症

10匹对照马每一批(100％)在攻击后有至少1天病毒血症，WNV疫苗组的20匹马有2匹(10％)有病毒血症。

临床表现

10匹对照马有7匹(70％)发生与西尼罗病毒感染一致的脑脊髓炎表现。这些病毒在攻击期间都至少有1天的病毒血症。在WNV疫苗组，20匹马有1匹(5％)发生与西尼罗病毒感染一致的表现。引人注目的是，70％的对照马和仅仅5％的接种马的临床表现进展至死亡或安乐死。所有对照死亡都有病毒血症，说明归因于WNV的致命脑炎，2匹死亡的接种马仅1匹在攻击阶段有病毒血症。

血清中和滴度

所有接种马对WNV疫苗产生有利反应，在接种后生成保护水平的血清中和(SN)抗体。接种的一年后，20匹接种马中有17匹(85％)维持了保护性SN滴度。与此相反，对照马无一在毒力WNV攻击之前生成上升的SN滴度。而且，所有接种马在毒力WNV攻击之后展示出SN滴度的记忆性上升。

组织病理学

对脑髓和脑桥都给出严重性的分值。关于该效力参数，从分离物NAEE159制得的含北美优势WNV抗原的WNV疫苗被证实高度有效。对照马有50％出现严重的WNV脑炎损伤，而接种马仅有10％有类似的感染。

讨论和结论

2005年北美大流行期间，出现一种特殊的显性WNV基因型，从其中一匹马获得病毒分离物(北美马E159)，进而制得WNV疫苗。该基因型的特征在于，该病毒的包膜(E)抗原第159位的氨基酸发生了从缬氨酸到丙氨酸的特定改变(与WNV-NY99分离物ATCC AF196835的公众可得序列相比)，这使得所有这样的分离物更强健和多产，从而取代其它WNV分离物，并使得该基因型在众多引起疾病的北美WNV分离物中成为显性。因为本研究所用的疫苗是从该显性基因制得的，故所述疫苗指示了从所有这类带有如此E蛋白特性并导致多产的北美优势分离物制得的疫苗的独特安全性和可以实现的效力。值得注意的是，所有此前测试的WNV疫苗都是从具有另一基因型和E蛋白氨基酸序列的较低产分离物即WNV NY99制得。根据所述的核酸序列差异，E蛋白氨基酸序列，病毒增生率，以及特有的引起大流行的能力，这种北美优势分离物正在或已经在环境中取代NY99。北美优势WNV分离物的特有基因型和表型(多产)，以及最重要的，环境中以压倒优势存在该分离物而缺乏WNV NY99，为北美优势西尼罗病毒疫苗的优势提供了令人信服的证据。这种优势通过在这一用北美优势分离物北美马E159(NAEE159)(ATCC PTA-9409)进行的攻击试验中证实的该疫苗的安全性和效力被确认。

在本研究中，4-5月龄的马匹以适当的抗原量，分批安全有效地接种了多组分VEWT/WNV/EHV-1/马Influenza疫苗，所述疫苗中的WNV组分是从分离物NAEE159c(ATCC保藏号PTA-9409)制得的北美优势WNV抗原。

被研究的马匹在加强免疫的至少380天后，用10⁵PFU毒力异源西尼罗病毒株，经鞘内途径予以攻击。将马匹处以安乐死，通过尸检获得脑桥和脑髓切片，评价攻击后14天的临床表现(包括温度和死亡率)，病毒血症，血清中和滴度，和组织病理学分值。

攻击后病毒血症和血清中和滴度是本研究中指示疫苗效力的关键结果变量。1年以前接种了VEWT/WNV/EHV-1/Influenza批号916的马匹有90％在本研究的攻击后受到保护而免受病毒血症。相比之下，100％的对照马经确认在攻击后有病毒血症。因此，在接种后14天，接种马的血清中和滴度显著高于对照马，并展示异源毒力WNV攻击后有效疫苗典型的记忆反应。

而且，含有从分离物NAEE159制得的北美优势WNV抗原的疫苗减少了毒力WNV异源攻击后所致脑脊髓炎的临床表现和死亡率。接种后至少1年的疫苗效力也通过减少WNV感染典型的损伤而被证实。

本研究首次表明，对4-5月龄的雏马施用用适当剂量的抗原(包括从分离物NAEE159制得的北美优势WNV抗原)制得的2剂实验性组合疫苗，安全、可靠且有效地刺激了保护性血清学血清中和滴度，使得产生了持续至少1年的免疫力，具有在西尼罗度的毒力异源攻击后提供保护免受病毒血症，临床表现，死亡率和脑炎损伤的作用。

实施例9

在本研究中，用北美优势WNV分离物北美马E159(NAEE159)(ATCCPTA-9409)制得组合疫苗。从接种了这种脑脊髓炎-鼻肺炎-流感-西尼罗病毒疫苗(东方型、西方型和委内瑞拉型，杀灭病毒，破伤风类毒素)的豚鼠采集二次接种后14天的血清样品，进行西尼罗病毒空斑减少中和(PRN)实验。测试接种豚鼠的血清中抗北美优势WNV分离物、以及抗WNV分离物NY99的中和抗体。值得注意的是，所述疫苗刺激抗北美优势WNV的中和抗体的能力优于抗NY99WNV。从这些数据得出结论：从北美优势WNV分离物制得的WNV疫苗比从NY99WNV分离物制得或基于该分离物的疫苗的效力更强。

而且，从另外的北美优势WNV分离物北美驴E159(NADE159)制得的疫苗，如上述被同样证明了，这种疫苗相比于此前基于NY99的疫苗效力更强。因此，从源自北美特定位置、在不同时间点于北美获得的、由不同宿主物种培养得到的多种北美优势分离物提供的数据，表明了北美优势WNV分离物用于制备疫苗时意外但更好的效力。

空斑减少中和实验的数据还表明，从北美优势WNV分离物制得的、在接种豚鼠中刺激出1∶12以上的滴度(该滴度在至少90％的接种豚鼠中致50％病毒空斑减少)的疫苗，与在马中提供抗WNV攻击的疫苗保护作用有关，并提供至少1年的免疫力维持时间。在马中以10^7.6-9.0TCID₅₀/剂以上的抗原含量进行西尼罗病毒接种/攻击的数据与这些豚鼠PRN滴度结果相关，并确认了在马中提供1年以上免疫力持续时间的WNV免疫剂量。相应剂量在豚鼠中也刺激了至少1∶12的抗北美优势WNV的血清中和抗体。

本报告中的数据总体表明了从北美优势WNV分离物制得的疫苗的意外效果，确定了马中疫苗效力与豚鼠中和抗体的血清水平之间的关系，证实了豚鼠中1∶12以上的滴度是能提供至少1年的免疫力持续时间的有效马疫苗，还非常引人注意地证实了从北美优势WNV分离物制得的疫苗相比于用NY99WNV制得的疫苗的优势效力。

材料和方法

为了确认脑脊髓炎-鼻肺炎-流感-西尼罗病毒疫苗(东方型、西方型和委内瑞拉型，杀灭病毒，破伤风类毒素)中，用北美优势WNV分离物北美马E159(NAEE159)(ATCC PTA-9409)制得的西尼罗病毒抗原的效力，并找出在马或豚鼠中可测量的有效剂量，进行宿主动物接种/攻击研究，并组合进行豚鼠接种/血清学研究。在本研究中，从接种了脑脊髓炎-鼻肺炎-流感-西尼罗病毒疫苗(东方型、西方型和委内瑞拉型杀灭病毒，破伤风类毒素)的豚鼠采集并测试二次接种后14天的血清样品。此外，进行空斑减少中和实验，以测量在该宿主动物中与产生抗攻击的保护作用有关的滴度。此滴度在豚鼠中被确认为1∶12以上。

疫苗配方

实验系列(保护性剂量疫苗)

配制实验系列，以证实该疫苗中所有抗原的保护性抗原规格。

表22：最终配成的疫苗每1mL剂量含以下成分：

配制实验性系列916以进行宿主动物免疫接种研究。实验系列916是多组分疫苗，含VEWT-WNV-EHV-1和3株马流感A2型病毒。实验性系列916按照10^7.6-9.2TCID₅₀/mL北美马E159(NAEE159)西尼罗病毒抗原的量进行分批。这在马匹中是1mL剂量疫苗。

此疫苗还在豚鼠中在宿主动物接种时进行测试，以证实该WNV的效力和实验动物潜力。对实验性系列916进行4份平行的豚鼠血清稀释实验，以确认所述疫苗维持1年免疫力(DOI)的豚鼠实验标准。

实验系列507(可比的效力系列(Comparative Efficacy Serial))

该报告中包括实验性系列507的数据，以表明，用WNV抗原的北美优势分离物配制的多个系列显示WNV的相关北美优势分离物比较早的NY99分离物有更好的效力，是通过豚鼠滴度来测量的效力。

豚鼠血清学评价

对血清如下测试WNV抗体：

1)西尼罗病毒指示者毒株：北美马E159(NAEE159)(ATCC PTA-9409)和北美驴E159(NADE159)

2)Vero细胞的生长培养基是DMEM+5％FBS，2mM L-谷氨酰胺和30μg/mL庆大霉素

3)测试血清的稀释剂是DMEM加30μg/mL庆大霉素

4)指示者病毒工作液的稀释剂是DMEM+10％正常豚鼠血清(特异于WNV分析)

5)豚鼠测试血清被1∶12稀释

7)用4mL覆盖层替代3mL(特异于WNV分析)

8)用50％空斑减少来计算滴度

9)10只接种豚鼠必需有9只具有≥1∶12的抗体滴度以证明效力，阴性豚鼠必需＜1∶4(与SAM中VEE分析的标准相同)。

结果和讨论

对西尼罗病毒的血清学评价

实验系列916复制品I西尼罗豚鼠

空斑减少中和用北美马E159(NAEE159)作为指示者病毒的结果本研究开始的25天后对豚鼠取血。

表23：空斑数/血清稀释度

916(I)	2	3	4	6	8	12	16	32	64
										GP1	0	2	2	4	5.5	2.5	17	14	11
GP2	6.5	9.5	11	14	9	11.5	13	20	22.5
										GP3	7	5	6	9.5	10	9.5	11	10	16.5
GP4	7	5	4	4	1	6	15.5	9.5	12.5
										GP5	6	4.5	9	7	17.5	13.5	12	16	17
GP6	1	1	2.5	7.5	3	8	19.5	19.5	20.5
										GP7	9.5	8	8	15.5	17.5	21.5	36	17.5	20.5
GP8	5	3.5	7.5	7.5	14.5	11	26.5	26.5	27.5
										GP9	0	2	7	6	7	12	9	10.5	11.5
GP10	4.5	4.5	5.5	11	22	8.5	23	29	30.5
										#通过的	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10

阴性对照1	68.5	64.5	72.5	93.5	68	82	89.5	78.5	71
										阴性对照2	72	61	87	69.5	70.5	85.5	77.5	69.5	88

病毒对照值：99.70，68，88，77，64

病毒对照平均空斑：79

病毒对照50％减少：39.5

表24：实验性系列916复制品II西尼罗豚鼠

空斑减少中和用北美马E159(NAEE159)作为指示者病毒的结果本研究开始的35天后对豚鼠取血空斑数/血清稀释度

916(II)	2	3	4	6	8	12	16	32	64
										GP1	1	3	6	6	14.5	6.5	13.5	18	17.5
GP2	1.5	3.5	6.5	6.5	8.5	9.5	10.5	12.5	19
										GP3	12	5.5	22	21	41.5	34	41	41	43.5
GP4	4	8.5	17.5	16.5	21	36.5	28	41.5	42.5

GP5	3.5	4.5	9.5	15	26.5	25.5	13.5	23	40
										GP6	1	3	7	13.5	17.5	14	24.5	26	23
GP7	8	5.5	14.5	11.5	21.5	15.5	34	26.5	28
										GP8	1	1.5	2.5	3.5	4	11	9	20	17.5
GP9	13.5	18	25.5	29.5	29.5	35.5	28	37.5	43
										GP10	9	8	10.5	21.5	21	20.5	27	31.5	27.5
#通过的	10/10	10/10	10/10	10/10	9/10	10/10	9/10	8/10	6/10

阴性对照1	69.5	67	71.5	69.5	72.5	73	83	68	78
										阴性对照2	68	70.5	69	72.5	82.5	66	75	76	74

病毒对照值：99.70，68，88，77，64

病毒对照平均空斑：79

病毒对照50％减少：39.5

表25：实验性系列916复制品III西尼罗豚鼠空斑减少中和用北美马E159(NAEE159)作为指示者病毒的结果开始后35天对豚鼠取血空斑数/血清稀释度

916(III)	2	3	4	6	8	12	16	32	64
										GP1	0.5	1.5	0	0	0	1	4	6	3.5
GP2	0	0	1	0.5	0	0	0	0	0
										GP3	7.5	9	9	16	17	13.5	12	18.5	23
GP4	2.5	0	0	3	2	2	3.5	1	2.5
										GP5	13.5	15.5	18	18	19.5	24	16.5	21.5	33.5
GP6	6.5	15.5	31.5	10	29.5	26.5	28.5	31.5	32
										GP7	14.5	12	17.5	20.5	19.5	29.5	21.5	16	22.5
GP8	21	24.5	36	28	34.5	30.5	27.5	29	26
										GP9	0.5	0.5	3	4	6.5	5	10	9.5	18
GP10	2.5	7.5	11	8	12.5	9	20	10.5	17
										#通过的	10/10	10/10	8/10	10/10	9/10	10/10	10/10	9/10	8/10

阴性对照1	73	61.5	79.5	53.5	58.5	78	57	70	63
										阴性对照2	55	54.5	64	52.5	58	68.5	66	67.5	79

病毒对照值：51，58，61，66，78

病毒对照平均空斑：62

病毒对照50％减少：31

表26：实验性系列916复制品IV西尼罗豚鼠空斑减少中和用北美马E159(NAEE159)作为指示者病毒的结果本研究开始的30天后对豚鼠取血空斑数/血清稀释度

916(IV)	2	3	4	6	8	12	16	32	64
										GP1	11.5	7	5.5	20.5	12	17.5	22.5	20	25
GP2	31	21.5	20.5	36.5	32	30	27	15	28.5
										GP3	16	20.5	18	23.5	21.5	16	35.5	16.5	15
GP4	1	2	6.5	7	11	15	19	14	18.5
										GP5	4	1	9.5	12	20	17	24.5	19.5	23.5
GP6	0	0	0	1.5	2.5	2.5	0.5	3	3
										GP7	5.5	6.5	5.5	10	7	13	5.5	9.5	13
GP8	1	4.5	0.5	3	7.5	4.5	13.5	17.5	11.5
										#通过的	8/8	8/8	8/8	7/8	8/8	8/8	7/8	8/8	8/8

阴性对照1	48	39	46.5	39	48	54	39.5	54	67.5
										阴性对照2	40.5	53	44	44.5	54	48.5	59.5	61.5	45.5

病毒对照值：93，53，56，92，67，44

病毒对照平均空斑：67.5

病毒对照50％减少：33.8

实验系列507(表明北美马E159(NAEE159的优势效力)疫苗，和其它北美优势疫苗，诸如北美驴E159(NADE159的效力优于NY99疫苗)对西尼罗病毒的豚鼠血清学评价

表27：实验性系列507西尼罗豚鼠空斑减少中和用WNVNY1999分离物作为指示者病毒的结果空斑数/血清稀释度

豚鼠数	4	8	16	32	64
						GP1	≥10	≥15	≥15	≥14.5	≥10.5
GP2	4.5	5	7.5	9.5	13
						GP3	1	3.5	3.5	6	6.5
GP4	8	11.5	≥13.5	≥14.5	≥14.5
						GP5	6	7.5	7.5	8.5	9
GP6	8.5	9.5	9.5	12	14
						GP7	7	8.5	9	≥10.5	≥14.5
GP8	5	10.5	10.5	14	14
						GP9	5.5	7	7.5	10	10
GP10	5.5	6.5	8.5	≥12.5	14
						#通过的	9/10	6/10	5/10	2/10	1/10

						阴性对照1	≥13.5	≥13.5	≥13	≥13	≥14.5
阴性对照2	≥15.5	≥14.5	≥16	≥17	≥16.5

病毒对照值：≥24，≥15，≥14，≥16，≥18，≥20

病毒对照平均空斑：≥17.8

病毒对照50％减少：≥8.9

表28：实验性系列507西尼罗豚鼠空斑减少中和用北美马E159(NAEE159)作为指示者病毒的结果空斑数/血清稀释度

豚鼠数	2	4	8	16	32	64
							GP1	17	14	18.5	14.5	19.5	26
GP2	2.5	3.5	2	6	17	15
							GP3	5.5	10	4.5	9	5	11.5
GP4	11.5	10	15	15.5	19	19.5
							GP5	13	23	23.5	19.5	32.5	13
GP6	5.5	8.5	12	11	13	14
							GP7	8.5	12	14	15	16	12
GP8	14.5	14	18	19.5	25.5	27.5
							GP9	1.5	3	3	8.5	15.5	7
GP10	12.5	12	7	18.5	14	13
							#通过的	9/10	9/10	7/10	7/10	5/10	7/10

阴性对照1	24.5	21	22	23.5	22	25
							阴性对照2	24	33	29	29	24.5	34.5

病毒对照值：40，38，34，35，28，23

病毒对照平均：33

病毒对照50％减少：16.5

讨论和结论

对豚鼠进行免疫接种，测试其血清中的西尼罗病毒抗体。该试验确认，接种过的豚鼠中的1∶12滴度，与马接种/攻击研究中用WNV的北美优势分离物如北美马E159(NAEE159)制得的WNV疫苗提供至少持续1年的免疫力的保护作用相关。

对豚鼠进行免疫接种的同时，用WNV的北美优势分离物北美马E159(NAEE159)制得的WNV疫苗也对马施用(20匹接种，10匹对照)，先是初步免疫，3周后加强免疫。在加强免疫的多于1年以后，对马匹进行毒力西尼罗病毒攻击，与未接种的对照相比，马受到保护。接种过的马被保护而免于西尼罗病毒毒力异源攻击后的病毒血症、临床表现、死亡、和脑炎损伤。

此外，所得数据证实了，用WNV的北美优势分离物制得的WNV疫苗比此前从WNV NY99开发的疫苗效力更好。对接种豚鼠的血清测试了抗WNV北美优势分离物以及抗WNV分离物NY99的抗体。在接种豚鼠中，抗北美常见分离物即北美优势(NAEE159)的滴度始终高于抗目前已不再报告在北美地区的存在或引起疾病的WNV NY99的滴度。因此，所述疫苗刺激抗北美优势WNV的中和抗体的活性比抗NY99 WNV的好。这些数据支持了以下结论：用WNV的北美优势分离物制得的WNV疫苗，比早先从NY99 WNV分离物制得或基于NY99 WNV分离物制得的低效疫苗，具有更好效力。

实施例10

本实施例举例说明了本发明所用的多个北美WNV株和多个北美优势WNV株的遗传差异。

材料和方法

对WNV NY99和北美优势WNV分离物的基因组中适于制备新的优势疫苗的相关区域进行测序和比较，以确认关键的遗传差异。疫苗制备中用到的北美优势分离物实例包括，北美马E159(NAEE159)(ATCC PTA-9409)和北美驴E159(NADE159)。

结果和结论

用标准实验室技术，对这些WNV分离物的关键包膜(E)蛋白和非结构5(NS5)蛋白测序，以确认与WNV NY99的核苷酸序列差异。值得注意的是，北美优势分离物，具体例子是北美马E159(NAEE159)和北美驴E159(NADE159)，显示出一些属于北美优势WNV分离物特征性的并因此区别于NY99WNV的改变，即编码E蛋白的核苷酸序列第1442位由U突变为C，第2466位由C突变为U，编码NS5蛋白的序列中第9352位由C突变为U。图10-17显示了这些分离物多个区域的序列比对。E区的比对是相对于公众可获得的NY 99分离物的参考序列(GenBank AY590210)和北美优势分离物(WN 02分离物)的参考序列(GenBank AY590223)。NS5区的比对也是相对于公众可获得的NY 99分离物的参考序列(GenBank AY369442)和北美优势分离物(WN 02分离物)的参考序列(GenBank AY369440)。这些比对显示，北美优势WNV分离物具有同样的相对于NY 99分离物的序列改变，这些改变也是定义北美优势WNV分离物时指定的那些。所述的序列在本文中是SEQ IDNOS.1-22，WN99分离物的全长基因组是SEQ ID NO.23，全长基因组SEQID NO.23编码的蛋白是SEQ ID NO.24。

Claims

1.致免疫组合物，包含一或多种杀死的或灭活的西尼罗病毒株或其任何抗原。

2.权利要求1的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物还包含一或多个另外的株的至少一种抗原，所述另外的株选自：东方型马脑脊髓炎病毒，西方型马脑脊髓炎病毒和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，破伤风类毒素，以及它们的组合。

3.权利要求1或2的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含至少一种另外的株，所述株选自东方型马脑脊髓炎病毒，西方型马脑脊髓炎病毒和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，破伤风类毒素，和它们的组合。

4.权利要求1-3任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含东方型马脑脊髓炎，西方型马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒和破伤风类毒素的一或多个株。

5.权利要求1-4任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含马疱疹病毒的至少一种抗原或一个另外的株。

6.权利要求1-5任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含马疱疹病毒的至少一个另外的株。

7.权利要求1-6任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含马流感病毒的至少一种抗原或一个另外的株。

8.权利要求1-7任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含马流感病毒的至少一个另外的株。

9.权利要求1-8任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物包含东方型马脑脊髓炎病毒，西方型马脑脊髓炎病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，马流感病毒，马疱疹病毒和破伤风类毒素的一或多个株。

10.权利要求1-9任一项的致免疫组合物，其中所述西尼罗病毒是北美分离物。

11.权利要求1-10任一项的致免疫组合物，其中所述西尼罗病毒是北美优势分离物。

12.权利要求1-11任一项的致免疫组合物，其中所述西尼罗病毒选自下组的一个株：马源2005，在ATCC保藏号为PTA-9409；NAEE159，在美国农业分离物部保藏号为405330；NY2002Nassau；NY2002Clinton；NY2002Queens；GA20021；GA20022；TX20021；TX20022；IN2002；NY2003Albany；NY2003Suffolk；NY2003Chatauqua；CO20031；CO20032；TX2003；TX2003Harris4；TX2003Harris6；TX2003Harris7；TX2003Harris10；AZ2004；TX2004Harris4，和它们的组合。

13.权利要求1-12任一项的致免疫组合物，其中所述西方型马脑脊髓炎病毒是ATCC保藏号为PTA-9410的株。

14.权利要求1-13任一项的致免疫组合物，其中所述委内瑞拉马脑脊髓炎病毒是ATCC保藏号为PTA-9411的株。

15.权利要求1-14任一项的致免疫组合物，其中所述东方型马脑脊髓炎病毒是ATCC保藏号为PTA-9412的株。

16.权利要求6-15任一项的致免疫组合物，其中所述马疱疹病毒选自ATCC保藏号为PTA-9525或PTA-9526的株，和它们的组合.

17.权利要求7-16任一项的致免疫组合物，其中所述马流感病毒选自Influenza/Equine-2/Ohio/03，Influenza/Equine-2/KY/95，Influenza/Equine-2/New Market/2/93，和它们的组合。

18.权利要求7-17任一项的致免疫组合物，其中所述马流感病毒是Influenza/Equine-2/Ohio/03，Influenza/Equine-2/KY/95，和Influenza/Equine-2/New Market/2/93。

19.权利要求7-18任一项的致免疫组合物，其中所述马流感病毒选自ATCC保藏号为PTA-9522，PTA-9523或PTA-9524的株，以及它们的组合。

20.权利要求1-19任一项的致免疫组合物，其中任一种所述株的量为约10^2.0TCID₅₀/mL-10^10.0TCID₅₀/mL/剂。

21.权利要求1-20任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物还包含合适的赋形剂或可药用载体。

22.权利要求21的致免疫组合物，其中所述合适的赋形剂或可药用载体选自稀释剂，佐剂，抗微生物剂，灭活剂，和它们的组合。

23.权利要求21或22的致免疫组合物，其中所述佐剂选自，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，未经代谢的油，和它们的组合。

24.权利要求1-23任一项的致免疫组合物，其中所述组合物对马施用。

25.权利要求1-24任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物施用一或多剂。

26.权利要求1-25任一项的致免疫组合物，其中一剂所述致免疫组合物被配制成0.5ml至2.5ml。

27.权利要求1-26任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物在施用一剂之后，提供至少维持12个月的免疫力。

28.权利要求1-27任一项的致免疫组合物，其中所述致免疫组合物在4月龄以上的雏马或马中使用是安全的。

29.在一个或一群动物中，减少与西尼罗病毒相关、或由西尼罗病毒引起的临床症状的发生率、或减轻所述临床症状的严重程度的方法，包括对有需要的动物施用权利要求1-28任一项的致免疫组合物。

30.在一个或一群动物中，减少与一或多种选自西尼罗病毒，东方型马脑脊髓炎病毒，西方型马脑脊髓炎病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒和破伤风梭菌的病原体相关、或由所述病原体引起的临床症状的发生率、或减轻所述临床症状的严重程度的方法，包括对有需要的动物施用权利要求2-28任一项的致免疫组合物。

31.在一个或一群动物中，减少与一或多种选自东方型马脑脊髓炎病毒，西方型马脑脊髓炎病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，马疱疹病毒和破伤风梭菌的病原体相关、或由所述病原体引起的临床症状的发生率、或减轻所述临床症状的严重程度的方法，包括对有需要的动物施用权利要求5-28任一项的致免疫组合物。

32.在一个或一群动物中，减少与一或多种选自西尼罗病毒，东方型马脑脊髓炎病毒，西方型马脑脊髓炎病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，马疱疹病毒，马流感病毒和破伤风梭菌的病原体相关、或由所述病原体引起的临床症状的发生率、或减轻所述临床症状的严重程度的方法，包括对有需要的动物施用权利要求7-28任一项的致免疫组合物。

33.权利要求29-32任一项的方法，其中，在一群动物中，与未接受所述致免疫组合物的动物群相比，由一或多种所述病原体引起的临床症状的发生率减少了约10％-50％。

34.权利要求29-33任一项的方法，其中，施用至少一剂所述致免疫组合物提供了维持至少12个月的抗一或多种所述病原体的免疫力。

35.权利要求29-34任一项的方法，其中所述动物是马。