KR960003898B1 - 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조방법 - Google Patents

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Description

리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조방법

제 1 도는 시간의 경과에 따른 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주 및 카프주의 항체가(antibody titer) 변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 리켓챠 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamushi) 항원의 제조방법 및 그 방법에 의해서 제조되는 항원을 함유하는 백신 및 리켓챠 쯔쯔가무시 진단시약에 관한 것이다.

쯔쯔가무시병(tsutsugamushi disease)은 털진드기속에 속하는 진드기의 유충이 번데기로 탈바꿈하기 위하여 사람이나 동물에 붙어 그 조직액을 빨때 유충의 침샘에 있던 리켓챠 쯔쯔가무시가 체내에 침입하여 발생하는 급성 발열질환이며, 쯔쯔가무시병의 주된 유행지역은 일본을 포함하는 한국, 중국, 말레이시아, 태국 및 베트남 등의 아시아, 태평양 연안지역으로 알려져 있다.

한편, 우리나라에서도 1951년 6.25동란때 주한 UN군에서 발병된 이래, 1980년대 중반까지는 발병에 대한 보고가 없다가 1986년 이강수 등이 진해지방에서 21명의 환자발생을 보고하는 등 그해 약 450여명의 환자가 발생하였고, 아울러 이들 환자로부터 원인균인 리켓챠 쯔쯔가무시를 분리할 수 있었다[참조 : 이강수 등 대한미생물학회지, 21 : 113(1986)]. 1989년에는 장우현 등이 전국 20개 병원 내원환자 2,295명중 965명의 쯔쯔가무시병 환자를 확인하였다[참고 : 장우현 등 대한미생물학회지, 25 : 227(1989)].

쯔쯔가무시병의 병원균은 전신 소혈관 내피세포에 침입 증식하여 미세혈전, 혈관 주위염을 일으키는데, 특히 심장, 폐, 피부, 뇌혈관 등의 감염이 많고, 임상적으로는 급격한 발열, 오한, 두통, 피부발진, 가피 및 임파선종창 등을 주 증상으로 한다. 쯔쯔가무시병은 신증후 출혈열, 랩토스피라증 등과 같은 발열성 질환과 발병초기의 증상이 비슷하기 때문에 임상적으로는 정확한 진단이 곤란할 때가 많고, 적절한 치료가 되지 않았을 때 치사율도 높아 예방백신 및 고품질의 진단시약의 실용화가 급선무의 과제로 대두되었다.

이와 같이, 쯔쯔가무시병이 인체에 치명적이라는 것은 그 병원체인 리켓차 쯔쯔가무시의 병원성이 매우 높고 또한 위험하다는데 기인하고 있다. 그러므로, 리켓챠 쯔쯔가무시의 기초연구에는 생물위험 대책의 관점에서 고도의 격리, 무균시설 및 숙달된 지식, 기술 및 조작을 요하기 때문에, 리켓챠 쯔쯔가무시의 병원균을 다루는 시험연구는 이와 같은 제약을 만족시킬 수 있는 고도의 설비와 인력구조를 가지는 국한된 연구기관에서만 행하여지고 있다. 이러한 관점에서, 쯔쯔가무시병 예방백신이나 쯔쯔가무시병 진단시약 등을 대량 생산하여 쯔쯔가무시병의 방역대책에 기여하기 위해서는, 일차적으로 고순도의 쯔쯔가무시 항원을 안전하고도 대량으로 제조할 수 있는 방법의 확립이 필요하게 되었다.

쯔쯔가무시병의 원인균인 리켓챠 쯔쯔가무시는 세포내 편성 기생체(obligate intracellular parasite)이기 때문에 일반 세균과는 달리 인공배지로는 배양할 수 없고, L-929 세포 등과 같은 실험실적 세포배양 체계(in vitro cell culture system)를 이용하거나, 수정란의 난황낭 배양과 같은 기내 세포배양 체계(in vivo cell culture system)를 이용하여야 한다.

현재 리켓챠 쯔쯔가무시의 배양은 주로 L-929 세포에서 배양하는 방법으로 연구가 이루어지고 있으나, 세포배양법으로는 백신생산에 필수적인 리켓챠 쯔쯔가무시의 대량배양이 불가능하므로 이를 이용한 백신의 개발은 실용성이 없는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 대량배양을 위해서는 수정란의 난황낭을 이용하여야 하나, 이 경우 난황난에 순화된 리켓챠 쯔쯔가무시를 얻기 위해 장기간(3 내지 4년)의 계대배양이 필요하고, 난황물질의 복잡한 구성으로 인한 정제상의 난점으로 백신의 유효성분으로서 유용한 항원의 제조는 이루어지지 못하고 있다.

그리하여, 1969년 유일하게 난황낭에서 배양한 리켓챠 쯔쯔가무시의 정제에 관한 보고가 있었으나[참고 : The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 18 : 942-952, (1969)], 실제로 실용화되지는 못하였고 이후 이에 대한 보고는 전무한 실정이다. 전기 방법에서는 유기용매인 에테르 추출로 항원을 정제하였으나, 이 경우 에테르에 의한 단백질의 3차 구조에 의해 유지되는 항원성의 손상으로 인해 특이도가 높은 진단시약으로서나 예방백신 수준의 면역효과는 기대하기 어려우므로 전술하였듯이 현재는 전혀 사용되고 있지 않다.

아울러, 비교적 정제방법이 간단한 세포배양 방법을 이용한 보고도 있었다[참고 : Microbiol. Immunol. 26 : 321-328, (1982)]. 이에 의하면 L-929 세포에서 배양한 리켓챠 쯔쯔가무시를 퍼콜 밀도 구배법(percoll density gradient method)을 이용하여 정제하였다. 그러나, 이 경우 수정란 배양에 비해 균량이 너무 적으므로 최대 항원생산량이 최종 세포배양액 1리터당 2 내지 3mg 정도 밖에는 되지 않아, 대량의 항원확보가 필수적인 백신개발에서는 역시 실용화되기 어렵다는 난점이 있었다.

따라서, 쯔쯔가무시병 예방 백신 및 진단시약의 개발을 위해서는 대량의 리켓챠 쯔쯔가무시를 배양하고 이를 효율적으로 정제하는 새로운 방법이 절실히 요구되었으며, 이를 달성하기 위해서는 대량생산에 적합한 난황난 순화 균주의 수득과 함께 높은 면역원성과 수율을 유지하는 항원의 정제방법의 개발이 아울러 요구되어 왔다.

이에 본 발명자는 전술한 종래 각 기술의 문제점을 극복하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 놀라웁게도 특이 병원이 제거된(specific pathogen free, SPF) 수정란에서 계대시킨 후 난황난에서 대량배양이 가능한 난황낭 순화주를 수득할 수 있었고, 이로부터 고순도의 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 얻음과 동시에 이항원을 높은 생산수율로 제조하는 방법과 이 방법으로 제조된 항원을 이용한 특이도(specificity) 및 감도(sensitivity)가 뛰어난 쯔쯔가무시병 진단용 ELISA 및 PHA 진단시약 및 면역효과가 뛰어난 백신제제를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 리켓챠 쯔쯔가무시를 수정란의 난황낭에서 배양하여 난황물질을 정제한 후 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 제조방법에 의해서 얻어지는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 면역효과를 그대로 유지하는 상태로 제조하는 방법과 그 방법에 의하여 제조되는 면역효과가 우수한 백신을 제공하는 것이며, 아울러 전기 제조방법에 의해서 얻어지는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 이용한 PHA 및 ELISA 진단시약을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 백신 제조과정에 관하여 공정별로 상술한다.

[Ⅰ. 리켓챠 쯔쯔가무시의 난황난 순화주의 작제]

공지의 리켓챠 쯔쯔가무시의 표준균주를 미합중국 종균협회(ATCC)등에서 분양받아 사용하였다(Gilliam strain, ATCC VR-312 : Karp strain, ATCC VR-150). 이 균주를 수정란에서 대량배양하기 위하여는 장기간 수정란에서 계대배양시켜 난황낭에 순화시켜야 하는데, 특히 병원이 제거된(SPF) 수정란을 구입하여 37℃에서 6 내지 7일간 부화시킨 후, 수정상태가 양호한 난을 선별하여 상기의 표준균주를 난황낭에 0.1ml씩 접종한다. 접종된 수정란을 35℃에서 9 내지 11일간 배양시키면서, 수시로 난황막을 채취하여 공지의 김자 발색법(Giemsa staining)과 간접면역 형광항체법으로 리켓챠 쯔쯔가무시의 증식을 확인하면서 균주의 증식이 최고점에 도달하는 시기를 결정한 후, 그 수정란의 난황막을 채취하여 다시 6 내지 7일 동안 부화시킨 SPF 수정란에 접종한다. 이와 같은 과정을 반복함으로써 수정란의 난황막에 순화된 리켓챠 쯔쯔가무시 균주를 얻을 수 있었다.

리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 대량생산에 적합한 리켓챠 쯔쯔가무시의 수정란 난황막 순화주의 작게는 적어도 50대(2년) 이상, 바람직하게는 100대(4년) 이상, 계대배양함으로써 달성될 수 있다. 이 경우 계대수의 증가에 따라 수정란에서의 배양기간이 짧아지고 균의 항원역가도 높아지는 것을 알 수 있었다.

[Ⅱ. 리켓챠 쯔쯔가무시의 대량배양]

전술한 바와 같이 작제한 수정란 난황막 순화주를 리켓챠 쯔쯔가무시 항원 제조용 균주로 사용한다. 우선 제조용 균주의 난황막 균질액을 저속 원심분리하고 중간층을 채취하여 접종원액으로 한다. 그 접종원액을 다시 희석액으로 약 0.1내지 5%(v/v)되게 희석한 다음, 이것을 수정란의 난황막에 약 0.1 내지 0.5ml씩 접종한다. 피접종된 수정란은 부화기내에서 35℃로 배양되며, 매일 검란하면서 접종한 전체 수정란중 10 내지 50% 정도가 죽었을 때 생종한 나머지 수정란의 난황막을 채취하여 후술하는 바와 같이 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조에 사용한다. 또한 채취한 수정란의 난황막은 정제에 사용할 때까지 -70℃에서 보관한다.

[Ⅲ. 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 정제]

리켓챠 쯔쯔가무시 항원은 상술한 리켓챠 쯔쯔가무시가 배양된 수정란의 난황막에서 제조한다. 리켓챠 쯔쯔가무시의 중식이 확인된 난황막으로부터 리켓챠 쯔쯔가무시를 정제하기 위해서는 양이온 교환수지를 사용한 흡착법, 원심분리법 및 밀도구배 원심분리법 등을 조합시켜 사용한다. 즉, 앰버라이트(Amberlite)와 같은 양이온 교환수지를 이용하여 난황물질들을 여기에 흡착시킨 후 원심분리시켜 제거하고, 상등액을 취하여 저속 및 고속 원심분리를 반복하여 수용성 난황물질들을 제거한다. 이렇게 하여 수득한 조원액을 퍼콜, 수크로스 등을 사용하여 밀도구배 원심분리를 행하여 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 정제한다.

상기 과정을 반복횟수에 따라, 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 순도를 높일 수 있었다. 예를 들면, 양이온 교환수지 처리를 반복하면 정제도를 높일 수 있으며, 이 경우 항원의 회수율이 감소할 수도 있으므로 정제도와 회수율의 상호관계를 고려하여 반복횟수를 결정하는 것이 중요하다.

이상과 같은 방법으로, 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 정제 농축액을 얻고, 이것을 후술하는 바와 같이 리켓차 쯔쯔가무시 백신원책 또는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원원액으로 사용하였다.

[Ⅳ. 리켓챠 쯔쯔가무시 백신원액의 제조]

전술한 바와 같이 얻어지는 리켓챠 쯔쯔가무시 백신원액을 제균여과할 수 있도록 수용액화하기 위해서 균체를 파쇄한다. 이 경우 계면활성제를 이용하거나, 초음파 파쇄방법 또는 이들의 적절한 조합을 사용한다. 계면활성제를 이용하여 균체를 파쇄할 경우, SDS(sodium dodecylsulfate) DCA(deoxycholic acid), 콜레이트(Cholate) 등을 0.1내지 2(w/v)%로 첨가하여 균제가 파쇄되도록 반응시킨 후, 다시 투석시켜 계면활성제 성분을 제거한다. 계면활성제의 농도가 높을 경우 반응시간을 단축시킬 수 있으나, 항원역가의 감소를 초래하므로 적정농도를 결정하는 것이 중요하다. 초음파 파쇄법을 사용할 경우 조원액에 함유된 단백질 농도에 따라 처리시간을 결정하여 실시한다. 파쇄 후 원심분리를 행하여 파쇄되지 않은 부분을 제거하고 상층액을 사용한다. 이렇게 해서 파쇄된 리켓챠 쯔쯔가무시 항원원액은 제균여과하고, 여과액을 희석하여 브래드포드(Bradford)법에 의한 단백함량의 측정치가 1 내지 50mg/ml이 되도록 조제한다[참고 : Bradford, Anal. Biochem., 72 : 248(1976)].

이와 같이 조제된 리켓챠 쯔쯔가무시 항원액은 길리암(Gilliam)주를 이용한 항원액과 카프(Karp) 주를 이용한 항원액을 최대의 항체가(antibody titer)를 나타내는 비율로 혼합한다. 이어서 보조액으로 수산화 알루미늄겔을 최종농도가 약 0.1내지 1mg/ml이 되도록 첨가 혼합하여 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 흡착시킨다. 또한, 항원의 안정화를 도모하기 위해 당류 및 아미노산류 등의 공지의 안정화제를 적절히 첨가 혼합할 수 있다. 이 항원을 직접 리켓챠 쯔즈가무시 백신의 유효성분으로 사용할 수도 있으며, 진단시약의 유효성분으로서도 사용할 수도 있다. 진단시약은 PHA또는 ELISA 키트로 제조되며, 본 항원을 이용한 리켓챠 쯔쯔가무시 진단용 ELISA 키트는 마이크로 플레이트의 표면에 항원을 흡착시킨 상태로 제공되며, 또한 PHA 키트의 경우는 면양적혈구(Sheep red blood cell)에 감작시킨 다음 동결건조시킨 상태로 제공된다.

[Ⅴ. 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 불활화]

리켓챠 쯔쯔가무시의 불활화방법으로서는 공지의 방법 즉, 포름알데히드, 글루타르디알데히드, 에틸렌 옥사이드, β-프로피오락톤, 카르보디이미도, γ선 및 자외선 등에 의한 불활화방법 등의 채용이 가능하다. 그러나 이들중 병원성이 강한 리켓챠 쯔쯔가무시의 감염성을 완전히 실활시키고 항원성과 높은 면역원성을 함께 가지는 제품을 얻기 위해서는, 포름알데히드를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 불활화제의 첨가시기는 정제공정의 중간과정에 처리하여 정제과정중에 제거될 수 있다. 이 경우 따로 불활화제를 제거하기 위한 과정이 추가되지 않으므로 항원성과 면역원성의 손실을 막을 수 있다. 예를 들어, 시판하는 포르말린(37(w/v)% 포름알데히드 수용액)을 사용하는 경우 난황막의 균질액(homogenate)에 0.05 내지 0.5(w/v)%가 되도록 첨가하여 혼합한다. 첨가 혼합후 얻어지는 혼합물은 약 4℃내지 약 37℃에서 약 5일 내지 약 60일간 보존한다. 그리고, 포르말린의 첨가농도, 불활화 보존의 온도 및 일수의 3요소는 각종 설정조건을 상호 조합시켜 채용할 수 있다. 또, 불활화 개시와 동시에 이와 병행해서 불활화의 진행사항을 추적하기 위해 불활화 보존중의 포르말린을 첨가혼합한 난황막 균질액으로부터 그 일부를 1내지 7일마다 샘플링하여 샘플링한 피검체의 각각에 대해서, 공지의 생리적 식염수를 외액으로 하는 투석에 의해 포름알데히드를 제거한 수 리켓챠 쯔쯔가무시 감염가(infectivity, 플라크계수치/ml)를 측정한다.

리켓챠 쯔쯔가무시 감염가는 공지의 방법인 플라크 형성방법으로 측정할 수 있다[참조 : Wike, Infect. Immun., 5 : 715(1972)]. 예를 들면, L-929 세포주를 플레이트내에 미리 배양하여 여기에 투석시켜 포름알데히드를 제거한 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 접종하여 감염시킨 후, 다시 배양하여 일정기간이 경과한 다음 감염으로 인한 플라크의 숫자를 계수하여 계수치를 감염가로 결정한다. 대조군으로 포름알데히드 처리를 하지 않은 동일한 상태의 리켓챠 쯔쯔가무시를 같은 방법으로 접종, 배양하면서 감염가를 측정한다. 또, 불활화는 통상, 감염가가 상실된 보존일수의 3 내지 5배 시기로서 완료한다.

한편, 피검체를 접종한 세포로 상술한 간접면역 형광항체법을 실시하여 항원양성 세포가 없음을 확인하고, 이를 계대배양하여 계대전 세포배양에서도 상기와 같이 항원 양성 세포가 없음을 확인한다. 또한 정제완료 후 항원원액중의 포름알데히드의 잔량은 공지의 방법인 아세틸아세톤을 이용하여 포름알데히드를 정량하고 제거 여부를 확인한다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명한다. 다음의 실시예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로, 이들에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

리켓챠 쯔쯔가무시의 수정란 난황낭 순화주의 작제미합중국 종균협회(ATCC)로부터 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주(Rickettsia tsutsugamushi Gilliam strain. ATCC VR-312)와 카프주(R. tsutsugamashi Karp strain, ATCC VR-150)를 각각 종자 균주로하여 수정란에 배양하였다. 아울러, 특이 병원이 제거된(SPF) 수정란을 천호부화장으로부터 구입하여 37℃에서 6 내지 7일 동안 부화시킨 후 수정여부를 확인하였다. 여기에 위의 균주를 수크로스 및 클루탐산을 함유한 인산완충 염화나트륨(이하, "균주희석액"이라 한다)을 사용하여 균주를 적정비율로 희석한 다음, 이를 0.1ml 수정란의 난황낭에 접종하였다. 접종된 수정란을 35℃에서 9 내지 11일간 배양시키면서 수정란의 30% 정도가 죽었을 때 생존한 나머지 수정란의 난황막을 채취하여, 그 일부로 공지의 방법인 김자 염색법과 간접면역 형광항체법으로 균의 증식을 확인하고, 이를 다시 균주희석액으로 균질액을 만들어 다시 6 내지 7일 동안 부화된 수정란의 난황낭에 접종하였다. 이와 같은 계대배양을 계속하여 60 내지 100대(5년) 이상 계대된 균주를 획득하였다.

이렇게 수정란에 완전히 순화된 균주는 병원성 미생물로 확인되었으므로, 1992년 9월 4일자로 국제기탁기관으로부터 기탁이 거부되었다. 한편, 이들 균주를 대량배양에 사용할 균주로 결정하고 다음과 같이 배양하였다.

[실시예 2]

[리켓챠 쯔쯔가무시의 수정란에서의 대량배양]

실시예 2에서와 같이 수정란에 100대 이상 계대된 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주와 60대 이상 계대된 카프주를 각각 6 내지 7일간 부화된 수정란의 난황낭에 접종하였다. 이 경우 균주는 균주희석액으로 1 내지 10(w/v)% 정도되게 희석하여 접종하였으며, 접종된 수정란은 난 배양기(egg incubator)에서 35℃를 유지시키면서 배양하였다. 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주의 경우 10일 정도, 카프주의 경우 11일 정도 배양한 후 난황막을 채취하였으며, 이때 난황물질을 최대로 제거하여 막성분만 얻을 수 있도록 주의하였다. 이와 같이 수득한 난황막들은 정제에 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

[실시예 3]

[리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 정제]

실시예 1에서 얻은 리켓챠 쯔쯔가무시가 대량배양된 난황막을 평량하여 수크로스가 함유된 인산 완충용액(이하 "PS용액"이라 한다)에 25(w/v)%가 되도록 넣고 믹서기로 분쇄하여 균질액으로 만들었다. 이를 400g에서 15분간 원심분리하여 중간층을 채취하고, 중간층을 다시 고속 원심분리하여 침전물을 회수하고 여기에 PS용액을 첨가하여 희석하였다. 이어서, 불활화제인 포르말린(37(w/v)% 포름알데히드)을 0.2(w/v)%가 되도록 첨가 혼합한 다음, 4℃로 방치 보존하여 불활화를 개시하였다. 불활화 진행상황을 추적하고, 불활화 완료의 시기를 확인하기 위해, 전술한 방법으로 리켓챠 쯔쯔가무시의 감염가를 측정한 결과, 4℃ 불활화 보존개시 후 2일째 완전히 소실하는 것을 확인하였다. 불활화 보존을 계속하여 불활화에 소요된 2일의 약 4내지 5배의 일수, 즉, 불활화 개시일로부터 10일째를 불활화 완료일로 하였다.

한편, 불활화 완료의 균질액 일부로 불활화 확인시험을 실시하였다. 불활화 완료의 균질액을 투석시켜 포르말린을 제거한 다음, 이것을 L-929 세포에 접종하고 배양하였다. 배양 12일째 그 배양세포의 일부를 취하여 다른 L-929 세포에 계대배양하였다. 최초의 접종된 배양세포의 일부와 계대된 배양세포의 일부를 취해 간접면역 형광항체법에 의해 리켓챠 쯔쯔가무시 유래의 항원의 유무를 검색하였다. 그 결과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원은 음성이며 그 불활화 균질액은 불활화 시험에 합격하였다. 동시에 그 불활화 균질액에 대해서는 불활화의 완료가 확인되었다.

불활화 완료가 확인된 난황막 균질액에 전처리된 앰버라이트(Amberlite sigma, # IRP-64, U.S.A.)양이온 교환수지를 4.4(w/v)%로 첨가하여 완만하게 교반한 다음 저속 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 상층액을 다시 고속 원심분리하여 리켓챠 쯔쯔가무시가 포함된 침전물을 얻었다. 이를 수크로스가 함유된 트리스 완충액(이하, "TS완충액"이라 한다)에 재용해시키고 퍼콜 밀도구배 원심분리를 실시하였다. 퍼콜(percoll, Pharmacia LKB, #17-0891-01)을 TS완충액으로 90(w/v)%가 되도록 조절한 용액에 리켓챠 쯔쯔가무시가 포함된 부유액을 섞어 퍼콜의 최종농도가 40(w/v)%가 되도록 만든 다음, 25,000g에서 1시간 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리후 아래쪽에 형성되어 있는 리켓챠 쯔쯔가무시층(밀도 1.06 내지 1.07)을 분리한 다음, TS완충액으로 5회 세척하여 퍼콜을 제거하였다. 정제된 항원량은 브래드포드법의 단백측정치로 한 개의 수정란 난황막당 0.6내지 1mg의 항원을 얻을 수 있었다.

[실시예 4]

[리켓챠 쯔쯔가무시 백신원액의 제조]

실시예 3에서 얻은 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주의 항원원액과 카프주의 항원원액을 각각 초음파 파쇄기로 수용액화 하였다. 항원원액 100ml당 5분 동안 실시하여 균체를 파쇄한 다음 미파쇄된 침전물을 원심분리를 하여 제거하고, 상층액을 채취하여 이를 백신 및 진단시약 제조용 항원원액으로 사용하였다.

이렇게 얻은 항원의 항원가를 측정하기 위해 고상 항-IgM ELISA 방법(solid-phase Anti-IgM ELISA method, 참고 : Voller, Manual of clinical immunology, 2nd ed., 359-371(1980)을 실시한 결과, 항원가는 16,000을 나타내었다. 또한, 불활화제로 쓰인 포름알데히드의 잔존여부를 알아보기 위해 포름알데히드 정량을 실시한 결과 0.0002(w/v)%의 함유량을 나타내었다. 이는 실제 사용시 다시 8배 이상 희석(0.000025%)하여 사용하므로 생물학적 제제기준 0.04%(w/v) 이하이며, 따라서 농도는 전혀 문제되지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이 항원원액을 다시 항원가가 2000이 되도록 인산염 완충액으로 8배 희석하여, 희석된 길리암주의 항원원액과 카프주의 항원원액을 부피비로 2 : 1의 비율로 혼합하였다. 여기에 보조제로서 수환화 알루미늄겔을 최종농도가 0.25mg/ml이 되도록 첨가 혼합하고, 4℃에서 교반한 다음 2일간 방치하여 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 흡착시켰다. 이것을 바이알병에 분할 분주한 다음, 마개를 봉하고 리켓챠 쯔쯔가무시 백신으로 사용하였다.

[실시예 5]

[쯔쯔가무시병 진단용 PHA키트의 제조]

실시예 2에서 얻은 리켓챠 쯔쯔가무시 항원원액을 실시예 3에서와 같은 방법으로 초음파 파쇄한 다음, 이를 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 PHA 진단시약 제조용 항원으로 사용하였다.

상기의 상층액을 길리암주의 항원과 카프주의 항원을 부피비로 1 : 1의 비율로 혼합한 뒤, 미리 적정농도로 조절된 면양 적혈구액과 혼합하여 실온에서 일정시간 반응시켜 감작시켰다. 이 액을 원심 세척하여 감작되지 않은 항원을 제거하고 인산염 완충액으로 적혈구 농도를 2.5(v/v)%로 조정하고 보존제를 가한 다음, 분주하여 동결 진공건조하고 밀봉하여 확인된 쯔쯔가무시병 진단용 PHA 키트로 사용하였다. 이렇게 만들어진 PHA 키트로 간접면역 형광항체법으로 확인된 쯔쯔가무시병 환자혈청을 실험한 결과, 매우 높은 일치율을 나타내어 쯔쯔가무시병 진단에 사용할 수 있음이 확인되었다(표 1. 참조).

표 1. PHA 키트를 이용한 혈청 검사

[실시예 6]

쯔쯔가무시병 진단용 ELISA 키트의 제조 실시예 2에서 얻은 리켓챠 쯔쯔가무시 항원액을 실시예 2에서와 같은 방법으로 초음파 파쇄한 다음, 이를 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 ELISA 진단시약 제조용 항원으로 사용하였다.

상기의 상층액을 길리암주의 항원과 카프주의 항원을 부피비로 1 : 1의 비율로 혼합한 뒤, 밑이 둥근 96공 플레이트(well plate)의 매 공(well)당 0.1ml씩 가하고 4℃에서 16시간 동안 흡착시켰다. 이를 인산염 완충액으로 각 공을 3회 세척한 후, 정상 면양혈청이 20(v/v)% 함유된 인산염 완충액을 각 공에 0.2ml씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 인산염 완충액으로 3회 세척한 후 진공건조하고 밀봉하여, 쯔쯔가무시병 진단용 ELISA 키트로 사용하였다. 이렇게 만들어진 ELISA 키트를 가지고 간접면역 형광항체법으로 확인된 쯔쯔가무시병 환자혈청을 실험한 결과, 매우 높은 일치율을 나타내어 쯔쯔가무시병 진단에 사용할 수 있음이 확인되었다(표 2 참조).

표 2. ELISA 키트를 이용한 혈청검사

[실시예 7]

[리켓챠 쯔쯔가무시 백신의 면역원성 및 감염방어 효과의 확인]

면역원성 시험은 랫트에서의 항체생성을 측정하여 수행하였으며, 감염 방어효과는 생쥐 직접공격법에 의해 후술하는 바와 같이 검정하였다.

(1) 렛트에서의 항체 생성시험

실시예 4에서 제조한 백신을 4주령의 S.D.(Spraque-Dawley)랫트 10마리에 접종한 다음 1주일 간격으로 채혈하였다. 그 혈청을 간접면역 형광항체법으로 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주에 대한 항체가와 리켓챠 쯔쯔가무시 카프주에 대한 항체가를 각각 측정하였다. 매번의 항체가를 플롯화하여 항체 생성곡선을 작성하여 항체생성의 추이를 관찰하였다. 그 결과, 제 1 도에서 보는 바와 같이, 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암중 대한 항체가는 접종후 84일이 경과한 1992년 8월 4일 현재까지 2,048 내지 4,096를 유지하고 있음을 알 수 있었으며, 2,048 내지 4,096를 유지하고 있음을 알 수 있었으며, 카프주에 대한 항체가도 84일이 경과한 1992년 8월 4일 현재까지 1,024 내지 2,048을 유지하고 있음을 알 수 있었다.

(2) 생쥐 직접공격법

실시예 4에서 제조한 백신을 50마리의 7주령의 ICR 마우스에 5일 간격으로 접종 3회 면역하였다. 최초 면역후 25일째에 상기 각 마우스를 25마리씩 A,B군으로 나누고, A군에 리켓챠 쯔쯔가무시 생균을 원액부터 10-4까지 희석하여 각 희석단계별로 5마리씩 접종하여 공격시켰으며, B군도 카프 생균을 마찬가지 방법으로 접종하였다. 또한, 대조군으로 면역시키지 않은 생쥐 50마리를 상기와 같은 방법으로 시험하여 그 결과를 비교하였다(표 3. 참조).

표 3. 감염방어효과 시험

상기 시험결과에서 입증되는 바와 같이, 면역시킨 군에서는 높은 방어효과를 나타내는 것으로 확인되었다 :

상기에서 상세히 설명되고 입증되었듯이, 본 발명에서는 세포배양에서는 대량으로 얻기 어려운 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 수정란 난황낭에 순화시켜 대량 배양이 가능한 리켓챠 쯔쯔가무시 균주를 획득하므로써 균의 대량확보가 가능하였으며, 양이온 교환수지흡착법, 원심분리법 및 퍼콜 밀도구배 원심분리법을 병행하는 정제방법으로 높은 항원성과 면역원성을 유지하며 수율도 매우 높아 상업적으로도 가치 있는 항원을 제공할 수 있었다. 아울러, 초음파 파쇄, 길리암 및 카프의 2가지 균주의 항원의 혼합비율, 수산화알루미늄 흡착 및 불활화 등의 최적조건을 결정하여 높은 감염방어 효과와 폭넓은 항원 스펙트럼을 함께 가지고 있어, 매우 유용한 백신 및 진단시약으로서 널리 사용될 수 있었다.

Claims (6)

1. (ⅰ) 리켓챠 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamushi)를 특이 병원이 제거된 수정란 난황막에 접종하여 50대 이상 계대배양하여 증식시키는 공정 ; (ⅱ) 상기 수정란 난황막을 균질화하여 불활화시키는 공정 ; (ⅲ) 상기 불활화된 균질액으로부터 양이온 교환수지를 이용하여 난황물질을 제거하는 공정 ; (ⅳ) 상기에서 얻어진 액을 원심분리하여 수용성 난황물질을 제거하고 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 정제하는 공정을 포함하는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 양이온 교환수지는 앰버라이트를 이용하는 것을 특징으로 하는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 불활화는 포르말린으로 실행하는 것을 특징으로 하는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 리켓챠 쯔쯔가무시 항원은 퍼콜 밀도구배 원심분리에 의해 정제하는 것을 특징으로 하는 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 제조방법.
5. 제 1 항의 방법에 의해 제조된 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암(Rickettsia tsutsug amushi Gilliam) 항원.
6. 제 1 항의 방법에 의해 제조된 리켓챠 쯔쯔가무시카프(Rickettsia tsutsugamushi Karp) 항원.