JP6096176B2 - ブタウイルス感染の予防のための混合ワクチン - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる次の３つの中国特許出願、第２０１１１０１４０９５１．５号、２０１１年５月２７日出願、表題「ブタ繁殖・呼吸障害症候群およびブタコレラ用混合ワクチンならびにその使用」、第２０１１１０３３１２０６．９号、２０１１年１０月２７日出願、表題「ブタ繁殖・呼吸障害症候群およびブタ仮性狂犬病ウイルス用混合ワクチンならびにその使用」、第２０１１１０３３１１５９．８号、２０１１年１０月２７日出願、表題「ブタ繁殖・呼吸障害症候群、ブタコレラ、およびブタ仮性狂犬病ウイルス用３種混合ならびにその使用」の優先権を主張する。

本発明は、獣医生物学的製品に、具体的にはブタ繁殖・呼吸障害症候群、ブタコレラおよびブタ仮性狂犬病ウイルスを予防するための生混合ワクチンならびにそれらの調製物に関する。

ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、世界中の各地で養豚業界を脅かす主な感染性疾患の１つである。２００６年中国での高病原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群（高病原性青耳病とも称される）の大流行以来、ＰＲＲＳは中国養豚業界に莫大な経済的損失を招いており、中華人民共和国農業部によって強制的ワクチン接種が必要とされる疾患の１つとして記載されている。

ＰＲＲＳに加えて、ブタはブタコレラ（ＣＳＦ）および仮性狂犬病などの他の感染性疾患にもさらに感染する場合がある。しかしＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、宿主に感染後に免疫抑制を誘導し、それにより第２の感染への免疫応答の低下またはワクチン接種の失敗さえ生じやすいことが知られている。研究は、例えば、免疫応答をもたらすために重要である肺胞マクロファージを破壊すること、および／または第２の感染に対する免疫学的防御を付与するサイトカイン発現を抑制することによってＰＲＲＳＶが宿主免疫系を損なうことを示している。例えば、ＰＲＲＳＶ感染はブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ワクチンに対する宿主免疫応答を顕著に阻害し、ＣＳＦＶワクチン接種の失敗さえ生じることが見出されている（Ｓｕｒａｄｈａｔ，Ｓ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４：２６３４〜３６４２（２００６）；Ｌｉ，Ｈ．ら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、９５：２９５〜３０１（２００３））。弱毒化ＰＲＲＳＶと弱毒化ＣＳＦＶとの同時接種は、約６０％の免疫防御率の低下（ワクチン接種の条件に合致しない）を有することが報告されている。２つの病原体に対するワクチン接種をするために個々のワクチン接種は１４日間間隔を離す必要がある（例えばＤｕ，Ｘ．Ｚ．ら、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：５〜６頁（２０１１）を参照されたい）。別の例としてＰＲＲＳＶは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）のワクチン接種効果に悪影響を与え、ＰＲＶに対する宿主免疫応答を顕著に低下させるまたは遅延させることが見出されている（Ｄｅ Ｂｒｕｉｎ、Ｍ．Ｇ．Ｍ．ら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、７６（１〜２）：１２５〜１３５頁（２０００））。

ＰＲＲＳＶの免疫阻害は、ブタ用のワクチン接種計画を複雑化させ、ワクチン接種の有効性および効率を低下させる傾向がある。ブタがＰＲＲＳＶおよび他のウイルスに対してワクチン接種される場合、反復注射および複数回投与することがしばしば必要であり、それがワクチン接種工程を、時間がかかり、多くの人手を必要とする経費のかかるものにしている。さらに複数回ワクチン接種計画では、投与欠落がワクチンの防御効能に直接影響を与える一方で、頻回および反復でのワクチン接種は免疫麻痺をもたらし、免疫学的ストレスを誘導する場合がある。

したがって、実質的な免疫阻害を伴わない、ＰＲＲＳＶおよび他のブタ感染性疾患のための混合ワクチン組成物に対する高い必要性がある。

本開示の一態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンを含み、ＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ワクチンが互いに対する免疫阻害を実質的に有さない、ワクチン組成物に関する。特定の実施形態では、ワクチン組成物は第３ブタウイルスワクチンをさらに含み、ＰＲＲＳＶワクチン、第２ワクチンおよび第３ワクチンは互いに対する免疫阻害を実質的に有さない。

特定の実施形態では、第２ブタウイルスワクチンはブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ワクチンおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ワクチンから選択される。特定の実施形態では、第３ブタウイルスワクチンはブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）ワクチンおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ワクチンから選択される。第２ワクチンは第３ワクチンとは異なる。

特定の実施形態では、ワクチン組成物はＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよびＰＲＶワクチンを含み、ＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよびＰＲＶワクチンは互いに対する免疫阻害を実質的に有さない。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンは弱毒化ＰＲＲＳＶを含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号４と比較した場合に少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を欠くＤＮＡ配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチドを含み、断片は配列番号８の等長部分と少なくとも約８０％相同である。特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、または少なくとも３６０の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は配列番号８の等長部分と少なくとも約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同である。特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は配列番号８を含む。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号１１と比較した場合に少なくとも２０の連続したアミノ酸を含むペプチド断片を欠くＮｓｐ２タンパク質配列をコードしているＮｓｐ２ヌクレオチドを含み、断片は配列番号９の等長部分と少なくとも約８０％相同である。特定の実施形態では、ペプチド断片は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、または少なくとも１２０の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ペプチド断片は配列番号９の等長部分と少なくとも約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同である。特定の実施形態では、ペプチド断片は配列番号９を含む。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは高病原性ＰＲＲＳＶから弱毒化される。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号５と比較した場合に配列番号６内の不連続の９０ヌクレオチドを欠くＤＮＡ配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ｎｓｐ２ヌクレオチドは配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされる。特定の実施形態では、Ｎｓｐ２ヌクレオチドは配列番号２を含む配列によってコードされる。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされるＮｓｐ１ヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号１によってコードされるＮｓｐ１ヌクレオチド配列および配列番号２によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含む。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされるＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは配列番号３によってコードされるＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３１２１を有する。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンは弱毒化ＣＳＦＶを含む。特定の実施形態では、弱毒化ＣＳＦＶは配列番号１０と少なくとも８０％の相同性を有する配列によってコードされる。特定の実施形態では、弱毒化ＣＳＦＶは配列番号１０によってコードされる。特定の実施形態では、弱毒化ＣＳＦＶは微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３８９１を有する。

特定の実施形態では、ＰＲＶワクチンは弱毒化ＰＲＶを含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶはＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿００６１５１を有する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含む。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、ＴＫ、ＰＫ、ＲＲ、ｄＵＴＰａｓｅ、ｇＧ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＤおよびｇＩからなる群から選択される１つまたは複数の不活化遺伝子を有する。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは不活化ｇＥ遺伝子を有する。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５０７６を有する。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は免疫学的有効量のＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよび／またはＰＲＶワクチンを含む。特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀または１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀であり、ＣＳＦＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^0.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀（蛍光抗体−ＴＣＩＤ₅₀）、１０^1.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^1.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^2.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^2.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀もしくは１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀または少なくとも２．５ＲＩＤ（ウサギ感染量）、３ＲＩＤ、５ＲＩＤ、１０ＲＩＤ、３０ＲＩＤ、１００ＲＩＤ、１５０ＲＩＤ、３００ＲＩＤ、７５０ＲＩＤ、１０００ＲＩＤ、３０００ＲＩＤもしくは７５００ＲＩＤであり、かつ／またはＰＲＶワクチンの免疫学的有効量は少なくとも１０^3.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀または１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀である。

特定の実施形態では、混合ワクチン中でのＰＲＲＳＶワクチンとＣＳＦＶワクチンのＴＣＩＤ₅₀比は、１００００：１から１：１の範囲である。特定の実施形態では、混合ワクチン中でのＰＲＲＳＶワクチンとＰＲＶワクチンのＴＣＩＤ₅₀比は１：１から１：３０の範囲である。特定の実施形態では、混合ワクチン中でのＰＲＲＳＶワクチン：ＣＳＦＶワクチン：ＰＲＶワクチンのＴＣＩＤ₅₀比は約１０⁴：１：１０⁵から約５：１：６の範囲である。

特定の実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含む。特定の実施形態では、ワクチン組成物は、凍結保護物質をさらに含む。特定の実施形態では、凍結保護物質は、ショ糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよび／またはラクトアルブミン加水分解物を含む。

別の態様では、本開示は、本明細書で提供されるワクチン組成物を調製するための方法であって、（ａ）それぞれの感受性細胞において培養されるＰＲＲＳＶワクチン株、ＣＳＦＶワクチン株および／またはＰＲＶワクチン株を回収するステップと、（ｂ）適切なＴＣＩＤ₅₀比で２つ以上のウイルス株を混合するステップとを含む方法を提供する。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン株についての感受性細胞はＭａｒｃ−１４５、ＭＡ−１０４、ＶｅｒｏおよびＣＬ−２６２１からなる群から選択される細胞株またはＰＡＭ細胞である初代細胞である。特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチン株についての感受性細胞はＢＴ、Ｖｅｒｏ、ＭＰＫ、ＳＫ６、ＰＫ２ａ、ＣＰＫ、ＲＫＣ、ＭＤＢＫ、ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ、ＳＴおよびＰＴからなる群から選択される細胞株またはＢＴ細胞である初代細胞である。特定の実施形態では、ＰＲＶワクチン株についての感受性細胞はＳＴ、ＰＫ−１５、Ｍａｒｃ−１４５、ＭＤＢＫ、ＢＴ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ブタ腎臓細胞株（ＩＢＲＳ−２）、ウサギ腎臓細胞株（ＲＫ）およびニワトリ胚線維芽細胞株からなる群から選択される細胞株またはブタ腎臓初代細胞である初代細胞である。

特定の実施形態では、培養は、各ワクチン株をその感受性細胞に回転ボトル培養中１×１０⁶／ｍｌ〜５×１０⁶／ｍｌの範囲の細胞密度で、またはバイオリアクターに接着担体を導入した懸濁培養中５×１０⁶／ｍｌ〜１×１０⁷／ｍｌの範囲の細胞密度で接種するステップを含む。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン株は０．０１〜０．５の感染多重度（ＭＯＩ）で接種され、ＣＳＦＶワクチン株は０．１〜０．５のＭＯＩで接種され、かつ／またはＰＲＶワクチン株は０．００５〜０．５のＭＯＩで接種される。

特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルスとＣＳＦＶワクチンウイルスとを１００００：１から１：１のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルスとＰＲＶワクチンウイルスとを１：１から１：３０のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルス、ＣＳＦＶワクチンウイルスおよびＰＲＶワクチンウイルスを１０⁴：１：１０⁵から約５：１：６のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む。

特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は回収されたウイルス溶液の混合物を凍結保護物質と混合するステップをさらに含む。特定の実施形態では、回収されたウイルス溶液の混合物は凍結保護物質と容量比７５〜８０：２５〜２０で混合される。

別の態様では、本開示は、本明細書で提供される方法を用いて調製されたワクチン組成物を提供する。

別の態様では、本開示は、ＰＲＲＳ、ＣＳＦおよび／またはＰＲを予防するまたは治療するための薬剤の製造における本明細書で提供されるワクチン組成物の使用を提供する。

別の態様では、本開示は、本明細書で提供されるワクチン組成物をブタに投与するステップを含む、ブタを免疫化する方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＳＴ、ＰＫ−１５、Ｍａｒｃ−１４５、ＭＤＢＫ、ＢＴ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ブタ腎臓細胞株（ＩＢＲＳ−２）、ウサギ腎臓細胞株（ＲＫ）、およびニワトリ胚性線維芽細胞株からなる群から選択される細胞株またはブタ腎臓初代細胞である初代細胞において培養されたＣＳＦＶワクチン株を提供する。別の態様では、本開示は、ＣＳＦＶワクチン株を培養する際のこれらの細胞株の使用を提供する。

ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のＮｓｐ２コード配列には存在しないが、ＰＲＲＳＶ ＴＪ株のＮｓｐ２ヌクレオチド配列には存在する３６０の連続ヌクレオチドを示す図である。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株によってコードされるＮｓｐ２タンパク質には存在しないが、ＰＲＲＳＶ ＴＪ株のＮｓｐ２タンパク質には存在する１２０アミノ酸の配列を示す図である。 高病原性ＰＲＲＳＶ株のＮｓｐ２コード配列における９０ヌクレオチドの欠失ならびに弱毒化ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株における９０ヌクレオチドの欠失および３６０ヌクレオチドの欠失を示す模式図である。 高病原性ＰＲＲＳＶ ＴＪ株には存在しないが、ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株には存在する不連続の９０ヌクレオチドの配列を示す図である。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭワクチン株（レーン２）、高病原性ＰＲＲＳＶ ＴＪ毒性株（レーン１）および水（レーン３、陰性対照として）それぞれの電気泳動像を示す図である。Ｍは、分子量マーカーを意味する。 ＰＲＶワクチン株（レーン１）、毒性株（レーン２）および水（レーン３、陰性対照として）それぞれの電気泳動像を示す図である。Ｍは、分子量マーカーを意味する。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、および混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された検査ブタでのＣＤ３＋Ｔ細胞の変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、および混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された検査ブタでのＣＤ４＋Ｔ細胞の変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、および混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された検査ブタでのＣＤ８＋Ｔ細胞の変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、ＰＲＲＳＶとＣＳＦＶとの混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された検査ブタでのＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種されたブタでのＰＲＲＳＶ抗体価（ＥＬＩＳＡによって測定）を示すグラフである。 ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種されたブタでのＣＳＦＶ抗体価（ＥＬＩＳＡによって測定）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でのワクチン接種後のブタの直腸温を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のブタの直腸温を示すグラフであり、ブタはＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された。 ＣＳＦＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のブタの直腸温を示すグラフであり、ブタはＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された。 ＰＲＲＳＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のブタの臨床症状スコアを示すグラフであり、ブタはＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された。 ＣＳＦＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のブタの臨床症状スコアを示すグラフであり、ブタはＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された。 ＰＲＲＳＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のブタでのＣＤ３＋Ｔ細胞の変化（％）を示すグラフであり、ブタはＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチン、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された。 ＰＲＲＳＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ４＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ８＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフである。 ＣＳＦＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ３＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフであり、ブタはＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチン、ＰＲＲＳＶとＣＳＦＶとの混合ワクチン、または陰性対照でワクチン接種された。 ＣＳＦＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ４＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフである。 ＣＳＦＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ８＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフである。 ＣＳＦＶ毒性ウイルスをチャレンジした後のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における変化（％）を示すグラフである。 ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶでワクチン接種した後の抗ＰＲＶ中和抗体の力価を示すグラフである。群Ｉは、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチンおよびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１単独ワクチンを連続的に接種され、群ＩＩは２−コンボ生ワクチンを接種され、群ＩＩＩはＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１単独ワクチンを接種され、群ＩＶは滅菌ＰＢＳを接種されただけであった。 ３７℃、１４日間保存後のＣＳＦＶ単独ワクチン中および２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶ）中のＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のウイルス力価を示すグラフである。２００９０４、２００９０５および２００９０６は２−コンボワクチンのバッチ３つを表し、２００９０１、２００９０２および２００９０３は、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ３７℃、１４日間保存後のＰＲＲＳＶ単独ワクチン中および２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶ）中のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス力価を示すグラフである。２００９０４、２００９０５および２００９０６は２−コンボワクチンのバッチ３つを表し、２００９０７、２００９０８および２００９０９は、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のバッチ３つを表す。 ２〜８℃、１８カ月間保存後のＣＳＦＶ単独ワクチン中および２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶ）中のＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のウイルス力価を示すグラフである。２００９０４、２００９０５および２００９０６は２−コンボワクチンのバッチ３つを表し、２００９０１、２００９０２および２００９０３は、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ２〜８℃、１８カ月間保存後のＰＲＲＳＶ単独ワクチン中および２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶ）中のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス力価を示すグラフである。２００９０４、２００９０５および２００９０６は２−コンボワクチンのバッチ３つを表し、２００９０７、２００９０８および２００９０９は、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のバッチ３つを表す。 ２〜８℃、２４カ月間保存後の２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶ）中のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス力価を示すグラフである。ＳＤ００１、ＳＤ００２およびＳＤ００３はそれぞれ２−コンボ生ワクチンの３つの異なるバッチを表す。 ２〜８℃、２４カ月間保存後の２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶ）中のＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のウイルス力価を示すグラフである。ＳＤ００１、ＳＤ００２およびＳＤ００３はそれぞれ２−コンボ生ワクチンの３つの異なるバッチを表す。 ３７℃、１４日間保存後の２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶ）中のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス力価を示すグラフである。ＳＤ００１、ＳＤ００２およびＳＤ００３はそれぞれ２−コンボ生ワクチンの３つの異なるバッチを表す。 ３７℃、１４日間保存後の２−コンボワクチン（ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶ）中のＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のウイルス力価を示すグラフである。ＳＤ００１、ＳＤ００２およびＳＤ００３はそれぞれ２−コンボ生ワクチンの３つの異なるバッチを表す。 ２〜８℃、１８カ月間保存後の３−コンボ生ワクチン（ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ＋ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）＋ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１）中のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス力価を示すグラフである。０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３は３−コンボ生ワクチンのバッチ３つを表し、０３１−０４、０３１−０５および０３１−０６はＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ２〜８℃、１８カ月間保存後の３−コンボ生ワクチン（ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ＋ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）＋ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１）中のＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のウイルス力価を示すグラフである。０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３は３−コンボ生ワクチンのバッチ３つを表し、０３１−０７、０３１−０８および０３１−０９はＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ２〜８℃、１８カ月間保存後の３−コンボ生ワクチン（ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ＋ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）＋ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１）中のＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のウイルス力価を示すグラフである。０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３は３−コンボ生ワクチンのバッチ３つを表し、０３１−１０、０３１−１１および０３１−１２はＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ３７℃、１４日間保存後の３−コンボ生ワクチン（ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ＋ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）＋ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１）中のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス力価を示すグラフである。０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３は３−コンボ生ワクチンのバッチ３つを表し、０３１−０４、０３１−０５および０３１−０６はＰＲＲＳＶ ＴＪＭ単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ３７℃、１４日間保存後の３−コンボ生ワクチン（ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ＋ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）＋ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１）中のＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のウイルス力価を示すグラフである。０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３は３−コンボ生ワクチンのバッチ３つを表し、０３１−０７、０３１−０８および０３１−０９はＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）単独ワクチンのバッチ３つを表す。 ３７℃、１４日間保存後の３−コンボ生ワクチン（ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ＋ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）＋ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１）中のＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のウイルス力価を示すグラフである。０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３は３−コンボ生ワクチンのバッチ３つを表し、０３１−１０、０３１−１１および０３１−１２はＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１単独ワクチンのバッチ３つを表す。

以下の記載は本開示の種々の実施形態を例示することを単に意図する。したがって考察される具体的な改変は限定を意図しない。種々の等価物、変更および改変が本明細書に示す対象の精神または範囲を逸脱することなく作製されうることは当業者に明らかであり、そのような等価の実施形態が本明細書に含まれることが理解される。本明細書に引用するすべての刊行物、特許、特許出願はその全体が参照により組み込まれる。

本開示の一態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンを含み、ＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ワクチンが互いに対する免疫阻害を実質的に有さないワクチン組成物に関する。

ＰＲＲＳＶは、プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、２つの遺伝子型（欧州遺伝子型およびアメリカ遺伝子型）が現在同定されている。ＰＲＲＳＶのゲノムは複数の翻訳領域を含有し、第１翻訳領域（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）はＰＲＲＳＶゲノム中の配列の８０％を含有し、ＰＲＲＳＶ複製のために必要であるＲＮＡ複製酵素をコードしている（Ｓｔｒａｗら、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ，第９版、２４章（２００６））。ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂは、その中に含有されるプロテアーゼドメインによってＮｓｐ１〜Ｎｓｐ１２を含むいくつかの非構造タンパク質に切断されるポリタンパク質に翻訳される（例えば、Ｖｒｉｅｓら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８：３３〜４７（１９９７）；Ａｌｌｅｎｄｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８０：３０７〜３１５（１９９９）を参照されたい）。

ＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンは互いに対する免疫阻害を実質的に有さない。

本明細書で用いられる用語「免疫阻害を実質的に有さない」は、２つ以上の単独ワクチンの組合せが、単独ワクチンの内の１つまたはすべての単独ワクチンに対する宿主での防御免疫応答における実質的な低下を生じないことを意味する。本明細書で用いられる用語「実質的な低下」は、≧２０％低下（例えば≧３０％、≧４０％、≧５０％または≧６０％低下）を意味する。

特定の実施形態では、２つ以上の単独ワクチンの組合せは、単独ワクチンによって誘発されるのに匹敵するレベルで各単独ワクチンに対する防御免疫応答を誘発できる。例えば組み合わされたＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンは、ＰＲＲＳＶ単独ワクチンによって誘発される免疫応答に匹敵するレベルであるＰＲＲＳＶに対する免疫応答を誘発でき、かつ／または第２ブタウイルス単独ワクチンによって誘発される免疫応答に匹敵するレベルである第２ブタウイルスワクチンに対する免疫応答を誘発できる。

防御免疫応答は、典型的には体液性、細胞性および／または粘膜免疫応答を含み、当技術分野において周知の方法を用いて特徴付けられうる。体液性免疫応答は、抗原に対する抗体（例えばＩｇＧ）の血清中での産生によって生じる。抗体価は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）などのアッセイを用いて容易に測定されうる。例えばウイルス抗原は固体支持体にコートされ、次いで抗体を含有すると考えられる試料に接触させられることができ、抗原−抗体複合体の形成の測定が続く。細胞性免疫応答は、通常細胞傷害性Ｔリンパ球の生成から生じ、フローサイトメトリーなどの方法を用いるＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団の測定を通じて特徴付けられうる。簡潔にはＴ細胞は、特定の表面マーカーに対する抗体で染色され、表面マーカーの存在に応じてさまざまな亜集団として選別および定量された。粘膜免疫応答は、典型的には粘膜表面で生成される分泌性ＩｇＡから生じる。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンは、混合ワクチン組成物として投与される場合、ＰＲＲＳＶワクチンおよび／または第２ブタウイルスワクチンへの応答での宿主における抗体産生を実質的に低下させない。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンは、混合ワクチンとして投与される場合、ＰＲＲＳＶワクチンおよび／または第２ブタウイルスワクチンへの応答での宿主におけるＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを実質的に低下させない。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンは弱毒化ＰＲＲＳＶを含む。本開示では本明細書で用いられる「弱毒化ＰＲＲＳＶ」は、宿主に感染できるがブタ繁殖・呼吸障害症候群を生じないまたは少ないおよび／もしくは軽度の症状を有するＰＲＲＳＶを意味する。弱毒化ＰＲＲＳＶは、生弱毒化ＰＲＲＳＶおよびその不活化産生物を含む。本明細書で用いられる「ブタ繁殖・呼吸障害症候群」（ＰＲＲＳ）は、天然に存在するＰＲＲＳＶの感染後の一連の生理学的および病理学的症状を意味する。症状には、限定されないが、特に発熱、傾眠、食欲不振、倦怠感、呼吸困難、咳、メスブタでの繁殖障害および成長遅滞または子ブタでの死が含まれる。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号４と比較した場合に少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を欠くＤＮＡ配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチドを含み、断片は配列番号８の等長部分と少なくとも約８０％相同である。

本明細書で用いられる用語「ＤＮＡ配列によってコードされる」は、対応するＲＮＡ配列に転写されうるＤＮＡ配列を意味する。ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶなどの１本鎖ＲＮＡウイルスは、ワトソンクリック塩基対合に基づくＤＮＡ分子によってコードされうる１本鎖ＲＮＡ分子からなるゲノムを有する。転写される場合にそのようなＤＮＡ分子は、ウイルスゲノム中のＲＮＡ配列と同一であるプラス鎖ＲＮＡ分子を産生できる。

理論に束縛されるものではないが、配列番号８と相同な部分内のＮｓｐ２配列中のそのようなヌクレオチド断片が存在しないことで、例えば非機能性または低機能性Ｎｓｐ２タンパク質を産生すること、および／または他のＰＲＲＳＶタンパク質の発現または機能に悪影響を与えること、および／またはＰＲＲＳＶの生活環に悪影響を与えることによるＰＲＲＳＶの毒性及び免疫阻害能を低下できることが企図される。

ＰＲＲＳＶ毒性を消し、他の同時感染したウイルスまたはワクチンに対する免疫を損なうことなくＰＲＲＳＶに対する防御免疫を誘導するために十分である程度までＰＲＲＳＶの毒性ならびに免疫阻害を低下できる限り、存在しない断片は任意の適切な長さであってよい。例えば存在しないＤＮＡ断片は、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、または少なくとも３６０の連続したヌクレオチドを含みうる。存在しないヌクレオチド断片の長さは、上に記載の任意の２つの値によって定義される範囲内で（これらの範囲が本明細書に明確に列挙されるのと同様に）あってよい。特定の実施形態では、存在しないヌクレオチド断片は、約３００の連続したヌクレオチド、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０または約３６０の連続したヌクレオチドを含む。

当業者は、配列番号８と相同な部分内のＮｓｐ２ヌクレオチド配列中に種々の欠失を有する組換えウイルスを容易に調製でき、当技術分野において周知の方法および本開示で提供される方法を用いてこれらの組換えウイルスをそれらの生存能、毒性および免疫阻害能について検査できる。例えばＮｓｐ２に欠失を含有する組換えＰＲＲＳＶを産生することおよび毒性を検査することに関して、方法はＫｉｍ，Ｄａｌ−Ｙｏｕｎｇら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、３８：１１８〜１２８（２００９）に記載されている。組換えＰＲＲＳＶの免疫阻害を検査することに関して、方法はＳｕｒａｄｈａｔ，Ｓ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４：２６３４〜３６４２（２００６）におよび本開示の実施例にも記載されている。配列番号８と相同な部分内の断片を欠失させること（例えば部分内の１番目のヌクレオチドから５０番目のヌクレオチドまで、２番目から６０番目のヌクレオチドまで、５番目から１００番目のヌクレオチドまでなどを欠失させること）によって、目的のＮｓｐ２ヌクレオチドを含む組換えＰＲＲＳＶを調製でき、弱毒化組換えＰＲＲＳＶ株が選択され、第２ブタウイルスワクチンに関してブタで免疫阻害能についてさらに検査されうるように、生存可能な組換えＰＲＲＳＶ株を細胞変性プラークを形成するそれらの能力についてさらに検査できる。

特定の実施形態では、存在しないＤＮＡ断片は、配列番号８の等長部分と少なくとも約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同である。特定の実施形態では、存在しないＤＮＡ断片は配列番号８を含む。特定の実施形態では、存在しないＤＮＡ断片は配列番号８である（図１を参照されたい）。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号１１と比較した場合に少なくとも２０の連続したアミノ酸を含むペプチド断片を欠くＮｓｐ２タンパク質配列をコードしているＮｓｐ２ヌクレオチドを含み、ペプチド断片は配列番号９の等長部分と少なくとも約８０％相同である。

本明細書で用いられる用語「をコードしている」は、遺伝子コドンにより対応するアミノ酸配列に翻訳されうるＲＮＡ配列を意味する。

理論に束縛されるものではないが、そのようなペプチド断片を欠くＮｓｐ２タンパク質が低機能性または非機能性であり、それによりＰＲＲＳＶの毒性を損ない、第２ブタウイルスワクチンへの免疫阻害も低下させることが企図される。

特定の実施形態では、存在しないペプチド断片は、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、存在しないペプチド断片は、配列番号９の等長部分と少なくとも約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同である。特定の実施形態では、存在しないペプチド断片は配列番号９を含む。特定の実施形態では、存在しないペプチド断片は配列番号９である（図２を参照されたい）。

Ｎｓｐ２タンパク質中のペプチド断片が存在しないことは、Ｎｓｐ２ヌクレオチド配列を通じて決定されうる。例えばＮｓｐ２ヌクレオチドを配列決定し、アミノ酸配列に翻訳し、その後配列番号１１とのアラインメントを行って、存在しないペプチド配列を同定することができる。

本明細書で用いられる「相同性」または「相同な」は、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間の類似性を意味する。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の相同性は、当技術分野において周知の任意の適切な方法を用いて算出することができ、例えば、候補アミノ酸（ヌクレオチド）配列を参照アミノ酸（ヌクレオチド）配列とアラインすることができ、アラインする配列間で同一アミノ酸残基（ヌクレオチド）の最大数を達成するために必要に応じてギャップを挿入し、それに基づいて２つのアミノ酸（ヌクレオチド）配列間の同一アミノ酸残基（ヌクレオチド）の百分率が算出されうる。アミノ酸（またはヌクレオチド）配列のアラインメントおよびそれらの相同性の算出は、当技術分野において周知のソフトウエア、例えば限定されないがＢＬＡＳＴプログラム（ウェブサイトＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいて入手可能、または例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウエア（ウェブサイトＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／で入手可能、同様に例えばＨｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：３８３〜４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、２３（２１）：２９４７〜８（２００７）を参照されたい）；およびＴＣｏｆｆｅｅソフトウエアなど（ウェブサイトＳｗｅｄｅｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ： ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉで入手可能、または例えばＰｏｉｒｏｔ Ｏ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３〜６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５〜１７（２０００）を参照されたい）を用いて達成されうる。ソフトウエアを用いて配列をアラインする場合、ソフトウエアによって提供される初期設定パラメータを用いることができ、または実際の状況によって調整することができ、これらは当業者の知識の範囲内である。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは高病原性ＰＲＲＳＶから弱毒化される。

用語「高病原性ＰＲＲＳＶ」は、配列番号５と比較した場合に配列番号６（すなわち配列番号５の１４４０番目から１６８０番目のヌクレオチドの断片）の部分内の不連続の９０ヌクレオチドを欠くＤＮＡ配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチドを含むＰＲＲＳＶを意味する。そのような不連続の９０ヌクレオチドを欠くＰＲＲＳＶ単離物（図３を参照されたい）は、ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株より高い病原性を有することが見出されている（例えばＴｉａｎら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（６）：ｅ５２６、（２００７）ｄｏｉ：１０．１３７１を参照されたい）。特定の実施形態では、不連続の９０ヌクレオチドは、配列番号５の１４４０から１４４２ヌクレオチド由来の「ＴＴＴ」および配列番号７に示す配列を含む（例えば図４を参照されたい）。

特定の実施形態では、高病原性ＰＲＲＳＶは、配列番号４のヌクレオチド配列（すなわちＰＲＲＳＶ ＴＪ株のＮｓｐ２ヌクレオチド配列）を含む配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、高病原性ＰＲＲＳＶは、そのゲノムがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ８６０２４８を有する配列によってコードされるＰＲＲＳＶ ＴＪ株である。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、高病原性ＰＲＲＳＶから弱毒化され、配列番号５と比較した場合に不連続の９０ヌクレオチドを欠くＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含み、前記不連続の９０ヌクレオチドは配列番号６内にある。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶのＮｓｐ２ヌクレオチドは、配列番号２（すなわちＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のＮｓｐ２ヌクレオチドをコードする配列）と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされる。特定の実施形態では、Ｎｓｐ２ヌクレオチドは、配列番号２を含む配列によってコードされる。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号１（すなわちＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のＮｓｐ１ヌクレオチドをコードする配列）と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされるＮｓｐ１ヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号１によってコードされるＮｓｐ１ヌクレオチド配列および配列番号２によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含む。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号３（すなわちＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のゲノムをコードする配列）と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされるＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、配列番号３によってコードされるＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＲＳＶは、微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３１２１を有する（そのような弱毒化ＰＲＲＳＶ株は本明細書でＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株とも称される）。

本明細書で提供されるＰＲＲＳＶワクチンは、第２ブタウイルスワクチンに対する免疫阻害を実質的に有さない。特定の実施形態では、第２ブタウイルスワクチンは、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）ワクチンおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ワクチンから選択される。

ブタコレラ（ＣＳＦ）は、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）によって引き起こされる伝染性が高く、致死的なブタ感染性疾患である。国際獣疫事務局（ＯＩＥ）は、法律により報告が必要である疾患として疾患をＯＩＥ疾患表に含めている。中国ではブタコレラは、主な感染性疾患の１つであり、「Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型動物疾患のカテゴリー」においてＩ型動物疾患として列挙されている。ＣＳＦの大流行および蔓延は、中国および世界中のブタ産業における大きな経済的損失の原因となっている。

ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）は、ウイルスのフラビウイルス科のペスチウイルス属の一員として分類される。ＣＳＦＶは、エンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスは、全長１２．５ｋｂのゲノムを有し、およそ４０００アミノ酸を含有し、分子量約４３８ｋＤを有するポリタンパク質をコードする１つだけの長い翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。ポリタンパク質は、ウイルス性のおよび宿主のプロテアーゼによって１２個の成熟タンパク質にさらにプロセスされる。ＣＳＦＶのすべての構造および非構造タンパク質は、この長い翻訳領域によってコードされる。

ブタコレラを制御するための重要な手段は、不活化ワクチンおよび弱毒化ワクチンを含むワクチンである。不活化ＣＳＦＶワクチンの調製は、１９５０〜１９６０年代にピークに達し、この時期にはホルマリンおよびクリスタルバイオレッドの不活化ＣＳＦＶワクチンが広く用いられた。しかしそれらは、投与量の多さ、免疫期間の短さ、免疫応答発生の遅さおよび高いコストにおけるその不利益のために弱毒化ＣＳＦＶワクチンに徐々に置き換えられた。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンは弱毒化ＣＳＦＶワクチンである。ＣＳＦＶ弱毒化ワクチン株は、ＣＳＦＶ野外株の弱毒化によって産生されうる。他国での報告は、ＣＳＦウイルスをウサギに適応させるためおよび弱毒化変異株を産生するためにさまざまな方法が用いられうることを示した。例えば３つの弱毒化ワクチン株は、残存病原性を有さずに安全かつ有効であるとして広く認められている：１）中国ウサギ馴化（ｌａｐｉｎｉｚｅｄ）ワクチン株（例えばＱｉｕ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ、３８（８）：１６７５〜１６８５（２００５）を参照されたい）；２）日本ＧＰＥ（−）細胞弱毒化ワクチン株（例えばＬｉｕ，Ｃ．ら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０巻、５０〜５１頁（２００４）を参照されたい）；および３）フランス「チベオサル（Ｔｈｉｖｅｏｓａｌ）」冷（ｃｏｌｄ）弱毒化ワクチン株（例えばＺｈｕ，Ｌ．Ｑ．ら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、３９（２）： ３３〜３７（２００５）を参照されたい）。

特定の実施形態では、弱毒化ＣＳＦＶワクチンは、中国ウサギ馴化ワクチン株である（Ｃ株）。ＣＳＦＶ Ｃ株のゲノム配列は、配列番号１０に示される。中国ＣＳＦウサギ馴化ワクチン株（Ｃ株とも称される）は、中国の科学者によって開発され、１９５７年から中国で広く用いられており、他の多数の国々にも導入されてブタコレラは制御下になったかまたは排除された。このワクチンは、世界中で最も有用なＣＳＦＶワクチン株の１つとして認識されている。

ＣＳＦウサギ馴化ワクチン（Ｃ株）は、調製方法の違いによって分類される場合がある。第１の方法は、ウサギでワクチンを調製するステップを含む。ウサギはＣＳＦＶを接種され、脾臓およびリンパ組織由来のＣＳＦＶワクチンまたはウサギ由来のＣＳＦＶワクチンを調製するためにウサギからリンパ節、脾臓または組織が回収される。この方法は、外来性ウイルスの混入を有効に防止し、ウイルスの遺伝的安定性を確実にできる。しかし多数のウサギが必要とされ、品質を管理することが難しく、製造経費が比較的高い。第２の方法は、ウシもしくはヒツジの初代細胞またはブタ細胞株をワクチン（すなわち細胞由来のＣＳＦＶワクチン）を産生するために用いるステップを含む。例えば細胞由来のＣＳＦＶワクチンは、ＣＳＦウサギ馴化ウイルス（脾臓由来）を細胞に感染させ、系列希釈による２回のクローン精製を実施することによって調製されうる。この方法は、多数の動物を使用することを必要としない。特定の実施形態では、ＣＳＦＶ Ｃ株は脾臓およびリンパ節組織由来のＣＳＦＶ Ｃ株である。特定の実施形態では、ＣＳＦＶ Ｃ株は、初代細胞または細胞株由来であってよい細胞由来のＣＳＦＶ Ｃ株である。

特定の実施形態では、弱毒ＣＳＦＶは、配列番号１０（すなわちＣＳＦＶ Ｃ株のゲノムをコードしている配列）と少なくとも８０％の相同性を有する配列によってコードされる。特定の実施形態では、弱毒化ＣＳＦＶは、配列番号１０によってコードされる。

特定の実施形態では、弱毒化ＣＳＦＶは、微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３８９１を有する（そのような弱毒化ＣＳＦＶ株は本明細書においてＣＳＦＶ Ｃ株もしくはＦ１６またはＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）とも称される）。ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）は細胞由来のＣＳＦＶ Ｃ株である。

特定の実施形態では、第２ブタウイルスワクチンは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ワクチンである。

ＰＲＶは、ヘルペスウイルス科およびアルファヘルペスウイルス亜科に属する。現在、ＰＲＶ血清型は１つだけ同定されている。ＰＲＶのゲノムは２本鎖ＤＮＡであり、約１５０ｋｂの長さを有する。ウイルスゲノムは、固有の長い（ＵＬ）領域、固有の短い（ＵＳ）領域ならびにＵＳ領域に隣接している末端反復配列および内部反復配列からなる。今日までに、遺伝子６５個がＰＲＶゲノム内に位置付けられ、それらのほとんどが機能的に特徴付けられている。遺伝子５６個は、ＵＬ領域に位置付けられ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＮなどの糖タンパク質、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アルカリヌクレアーゼ（ＡＮ）、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＯＬ）、ＤＢＰ遺伝子、ＭＣＰ遺伝子、ＩＣＰ１８．５遺伝子および初期タンパク質０（ＥＰ０）などを含む。ＵＳ領域は、完全に配列決定されており、その中に糖タンパク質ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＩならびにプロテインキナーゼ（ＰＫ）遺伝子、１１ｋｄおよび２８ｋｄタンパク質遺伝子を含む７遺伝子が位置付けられている。

特定の実施形態では、ＰＲＶワクチンは弱毒化ＰＲＶを含む。用語「弱毒化ＰＲＶワクチン」は、宿主に感染できるが仮性狂犬病を生じないまたは少ないもしくは重度ではない症状を伴うＰＲＶを意味する。弱毒化ＰＲＶは、生弱毒化ＰＲＶおよびその不活化産生物を含む。「仮性狂犬病」は、野生型ＰＲＶの感染によって生じる生理学的および病理学的な一連の症状を意味する。そのような症状には、限定されないが、流産、死産、弱い胎児、ミイラ変性胎児、発熱、食欲低下、神経学的症状、麻痺、全身不全および死さえも含まれる。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿００６１５１を有する配列と少なくとも８０％の相同性を有する、例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含む。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、病原性に関する１つまたは複数の不活化遺伝子を有する。「不活化」遺伝子は、完全なまたは部分的な配列の欠如もしくは欠失によってまたは遺伝子内での挿入もしくは変異によって、その機能が低下した、または無効にされた遺伝子を意味する。ＰＲＶ病原性に関する遺伝子の例には、限定されないが、ＴＫ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５５９）、ＰＫ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５３０または２９５２５６１）、ＲＲ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５３５または２９５２５３６）、ｄＵＴＰａｓｅ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５３７）、ｇＧ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５２０）、ｇＣ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５０５）、ｇＥ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５１７）、ｇＤ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５２１）およびｇＩ（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９５２５１６）が含まれる。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、ＴＫ、ＰＫ、ＲＲ、ｄＵＴＰａｓｅ、ｇＧ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＤおよびｇＩからなる群から選択される１つまたは複数の不活化遺伝子を有する。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、不活化ｇＥ遺伝子を有する。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶにおいてｇＥ遺伝子だけが不活化される。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは不活化ｇＥ遺伝子を有し、さらに病原性に関する１つまたは複数の不活化遺伝子、例えばＴＫ、ＰＫ、ＲＲ、ｄＵＴＰａｓｅ、ｇＧ、ｇＣ、ｇＤおよび／またはｇＩをさらに有する。

弱毒化ＰＲＶワクチンは、当技術分野において周知の方法を用いて得ることができる。例えばＰＲＶ野生型株の単離物は、ウイルスを非ブタ細胞または卵胚に継代することによってまたは上昇させた温度および／もしくは変異誘発物質の存在下で培養することによって弱毒化されうる。多数の弱毒化ＰＲＶワクチンが当技術分野において周知である、例えばＢａｒｔｈａ Ｋ６１株（例えばＢａｒｔｈａ、Ａ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｖｉｒｕｓ．Ｍａｇｙａｒ ａｌｌａｔｏｒｖｏｓｏｋ ｌａｐｊａ １６、４２〜４５（１９６１）を参照されたい）、ＢＵＫ株、ＮＩＡ４株、Ａｌｆｏｒｔ株およびＶＧＮＫＩ株など。これらの弱毒化ＰＲＶワクチンは、本開示において用いられうる。例えば野生型または弱毒化ＰＲＶ株は、病原性に関する１つまたは複数の標的遺伝子が不活化されるが、ウイルスは複製できるままであるようにさらに改変されうる。遺伝子工学によって得られた多数の弱毒化ＰＲＶワクチンは、当技術分野において周知であり、例えばＰＲＶ−ＢＵＫ−ｄ１３株（例えばＫｉｔ Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、１９８５、４６（６）：１３５９〜１３６７を参照されたい）、ＰＲＶ ｄｌｇＣ／ｄｌＴＫ株（例えばＫｉｔ Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、１９８７、４８（５）：７８０〜７９３を参照されたい）、Ｓ−ＰＲＶ−００２（例えば米国特許第４，５１４，４９７号を参照されたい）、ＰＲＶ７８３株（例えばＶａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ Ｊ Ｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，１９８４、４５（１０）：２０９９〜２１０３を参照されたい）、ＥＬ−００１およびＰＲＶ３７６など。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、ｇＥ遺伝子を欠く。特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５０７６を有する（そのような弱毒化ＰＲＶ株は本明細書でＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株とも称される）。

特定の実施形態では、弱毒化ＰＲＶは、ウイルス複製または宿主感染に影響しない１つまたは複数の不活化遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、弱毒ＰＲＶは、ＰＲＶゲノムに存在しない１つまたは複数の異種性遺伝子をさらに含む。挿入された異種性遺伝子は、ワクチンの検出および／または診断において有用である。

特定の実施形態では、ワクチン組成物は、第３ブタウイルスワクチンをさらに含み、ＰＲＲＳＶワクチン、第２ブタウイルスワクチンおよび第３ブタウイルスワクチンは互いに対する免疫阻害を実質的に有さない。特定の実施形態では、第３ブタワクチンは、第２ワクチンが第３ワクチンと異なる限りＣＳＦＶワクチンおよびＰＲＶワクチンから選択されうる。

特定の実施形態では、ワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよびＰＲＶワクチンを含み、ＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよびＰＲＶワクチンは互いに対する免疫阻害を実質的に有さない。ワクチン組成物に組み合わされる場合に３つのワクチンは、ＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよび／またはＰＲＶワクチンへの応答において宿主での抗体産生および／またはＴ細胞亜集団レベルを実質的に低下させない。特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンはＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株を含む。ＣＳＦＶワクチンは、これだけに限らないがＣＳＦＶ Ｃ株を含む本明細書で提供される任意の弱毒化ＣＳＦＶを含む。ＰＲＶワクチンは、本明細書で提供される任意の弱毒化ＰＲＶ株、例えばこれだけに限らないがＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株を含む。

特定の実施形態では、本開示は、微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３１２１を有するＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株およびＣＳＦＶ Ｃ株を含むワクチン組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣＳＦＶ Ｃ株は、微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３８９１を有するＣＳＦＶ Ｆ１６である。ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株およびＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）は、互いに対するいかなる免疫阻害または免疫抑制を示さない。両ワクチン株は、良好な安全性、免疫原性および特異性を有し、ブタ群における２つの主な伝染病である高病原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群およびブタコレラの両方に対する有効な防御を提供できる。

特定の実施形態では、本開示は、微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３１２１を有するＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株および微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５０７６を有するＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株を含むワクチン組成物を提供する。ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株は、互いの間にいかなる免疫阻害または免疫抑止も示さない。両ワクチン株は、良好な安全性、免疫原性および特異性を有し、ブタ群における２つの主な伝染病である高病原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群および仮性狂犬病の両方に対する有効な防御を提供できる。

特定の実施形態では、本開示は、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株を含むワクチン組成物を提供する。ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株は、互いにいかなる免疫阻害または免疫抑止も示さない。３つのワクチン株は、良好な安全性、免疫原性および特異性を有し、ブタ群における３つの主な伝染病である高病原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群、ブタコレラおよび仮性狂犬病に対する有効な防御を提供できる。

ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の詳細な寄託情報は次のとおりである：微生物寄託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３１２１；分類名称：ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス；寄託住所：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＯ．１ Ｗｅｓｔ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；寄託部署：Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ；寄託日：２００９年６月１５日。

ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の詳細な寄託情報は次のとおりである：微生物寄託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３８９１；分類名称：ブタコレラウイルス；寄託住所：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＯ．１ Ｗｅｓｔ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；寄託部署：Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ；寄託日：２０１０年５月２７日。

ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株の詳細な寄託情報は次のとおりである：微生物寄託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５０７６；分類名称：仮性狂犬病ウイルス；寄託住所：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＯ．１ Ｗｅｓｔ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；寄託部署： Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ；寄託日：２０１１年７月２１日。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよび／またはＰＲＶワクチンの免疫学的有効量を含む。本明細書で用いられる用語「免疫学的有効量」は、宿主で目的の抗原または病原体に対する防御免疫応答を誘導するために十分であるワクチンの量を意味する。例えば免疫学的有効量は、感染の１つまたは複数の症状の発症を低下させるもしくは遅延させるため、感染した宿主の罹患率および／または死亡率を低下させるため、病原体に対する十分なレベルの抗体を誘導するため、Ｔ細胞亜集団のレベルを増大させるため、ならびにこれらの任意の組合せのために十分でありうる。防御免疫応答の特徴付けおよび／または定量は、当技術分野において周知の方法を用いて、例えば、上に記載のとおり病原体に対する抗体価および／もしくはＴ細胞亜集団の量を測定することによって、またはワクチン接種されたブタの毒性ウイルスチャレンジ後の臨床所見を観察することによって実行されうる。

ウイルスワクチンの免疫学的有効量は、ウイルス力価で、例えば５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ₅₀）で特徴付けられる。特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^3.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀または１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀である。特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、少なくとも１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀または少なくとも１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は、約１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀から約１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀、または約１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀から約１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀のＰＲＲＳＶワクチンを含む。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^0.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀（蛍光抗体−ＴＣＩＤ₅₀）、１０^1.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^1.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^2.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^2.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀または１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀である。特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌである。特定の実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は、約１０^0.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀から約１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀または約１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀から約１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀のＣＳＦＶワクチンを含む。用語「ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀」は、蛍光抗体に基づく方法によって決定されたＴＣＩＤ₅₀値を意味する。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも２．５ＲＩＤ、３ＲＩＤ、５ＲＩＤ、１０ＲＩＤ、３０ＲＩＤ、１００ＲＩＤ、１５０ＲＩＤ、３００ＲＩＤ、７５０ＲＩＤ、１０００ＲＩＤ、３０００ＲＩＤまたは７５００ＲＩＤである。

特定の実施形態では、ＰＲＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^3.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀または１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀である。特定の実施形態では、ＰＲＶワクチンの免疫学的有効量は、少なくとも１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀または少なくとも１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は、約１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀から約１０^6.5ＴＣＩＤ₅₀または約１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀から約１０^6.5ＴＣＩＤ₅₀のＰＲＶワクチンを含む。

ウイルスワクチンのＴＣＩＤ₅₀は、当技術分野において周知の任意の適切な方法を用いて決定されうる。例えばウイルスワクチン（ＰＲＲＳＶワクチンおよび／またはＰＲＶワクチン）をウイルス溶液として調製することができ、ウイルス溶液の１０倍系列希釈物を調製し、感受性細胞を播種した９６ウエル培養プレートに接種することができる。各希釈のウイルス溶液は、１００ｕｌ／ウエルで８ウエルに接種することができる。プレートは、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベーターに置かれてよく、４〜５日間培養されてよい。細胞は細胞変性効果について観察され、ＴＣＩＤ₅₀が組織培養物の５０％が細胞変性効果を示すウイルス濃度として算出される。方法の詳細な記載は、Ｒｅｅｄ ＬＪ，Ｍｕｅｎｃｈ Ｈ，Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｅｎｄ ｐｏｉｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ １９３８；２７：４９３〜９７に見出しうる。

ＣＳＦＶは、明らかな細胞変性効果を生じないウイルスであり、したがってＴＣＩＤ₅₀は免疫蛍光法によってまたはウサギ感染研究で決定される。特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンのＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀は、免疫蛍光法によって決定される。簡潔にはＣＳＦＶワクチン株は、１投与量／ｍｌを含有する溶液として調製され、１０倍系列希釈物が３．５％血清を補充したＤＭＥＭ培養培地で調製される。元のウイルス試料の１０^-1、１０^-2、１０^-3、１０^-4および１０^-5を含有する希釈物は、０．１ｍｌ／ウエルでＢＴ細胞の単層にそれぞれ接種される。３〜４日培養後、細胞は固定され、ＣＳＦＶの蛍光モノクローナル抗体と接触される（直接免疫蛍光法）。４５〜６０分間反応後、細胞はウイルスの存在を示す蛍光の存在について観察される。代替的に固定された細胞は、ＣＳＦＶの未標識モノクローナル抗体と接触させることができ（間接免疫蛍光法）、４５〜６０分間反応後、細胞を蛍光標識二次抗体と４５〜６０分間さらに反応させる。細胞はウイルスの存在を示す蛍光の存在について観察される。ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀は、リード・ミュンヒ（Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ）法に従って算出される（例えばＲｅｅｄ ＬＪ，Ｍｕｅｎｃｈ Ｈ、Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｅｎｄ ｐｏｉｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ １９３８；２７：４９３〜９７を参照されたい）。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチンの量は、ウサギ感染量によって決定される。簡潔にはＣＳＦＶワクチン株は、１投与量を含有する溶液として調製され、次いで検査試料を調製するために７５００倍に希釈される。体重１．５〜３ｋｇのウサギ２匹にそれぞれ検査試料１ｍｌが注射され、体温が最初の４８時間について毎日２回、その後６時間ごとに１回測られる。体温反応は、モニターされ、下の基準に応じて段階付けられる、１）典型的発熱反応（＋＋）：潜伏期約４８〜９６時間、体温は顕著に上がる（少なくとも温度３回少なくとも１℃正常体温を上回り１８〜３６時間持続する）；２）わずかな発熱反応（＋）：潜伏期約４８〜９６時間、体温は顕著に上がる（少なくとも温度２回少なくとも０．５℃正常体温を上回り、１２〜３６時間持続する）；３）発熱反応が疑われる（±）：潜伏期約４８〜９６時間、体温は変動し、上昇した温度が１２未満持続しまたは潜伏期が少なくとも２４時間であり、発熱反応が４８時間以内もしくは９６時間後から１２０時間までに示される；および４）発熱反応なし（−）：体温は正常。２匹の検査ウサギの両方が典型的発熱反応（＋＋）を示す、またはウサギの内の１匹が典型的な発熱反応（＋＋）を示し、他の１匹がわずかな発熱反応（＋）を示す場合に、ワクチンは７５００ＲＩＤを有するとして示される。ウサギが特徴付けが困難な他の反応を示す場合、検査は反復してもよいが３回を超えて反復すべきではない。

単独ウイルスワクチンは、本明細書に記載のワクチン組成物を提供するために適切な割合で混合されうる。例えば単独ウイルスワクチンは、特定のウイルス力価（例えば特定のＴＣＩＤ₅₀）でワクチン株を含有するウイルス溶液として調製することができ、各単独ワクチンを予め決定した量（例えばＴＣＩＤ₅₀）または割合で含有する混合ワクチンをもたらすために２つ以上の単独ウイルスワクチンが適切な割合で混合される。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンおよびＣＳＦＶワクチンを含む混合ワクチン組成物においてＰＲＲＳＶワクチンとＣＳＦＶワクチンのＴＣＩＤ₅₀比は、１００００：１から１：１、１０００：１から１：１、１００：１から１：１、１０：１から１：１または５：１から１：１の範囲である。例えばワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀およびＣＳＦＶワクチン１０^0.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、またはＰＲＲＳＶワクチン１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀およびＣＳＦＶワクチン１０^3.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、またはＰＲＲＳＶワクチン１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀およびＣＳＦＶワクチン１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀を含みうる。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンおよびＰＲＶワクチンを含む混合ワクチン組成物においてＰＲＲＳＶワクチンとＰＲＶワクチンのＴＣＩＤ₅₀比は、１：１から１：３０、１：１から１：２５、１：１から１：２０、１：１から１：１５、１：１から１：１０、１：１から１：９、１：１から１：８、１：１から１：７、１：１から１：６、１：１から１：５、１：２から１：１０、１：３から１：１０、１：４から１：１０または１：５から１：１０の範囲である。例えばワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀、またはＰＲＲＳＶワクチン１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀、またはＰＲＲＳＶワクチン１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^6.5ＴＣＩＤ₅₀を含みうる。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶワクチンおよびＰＲＶワクチンを含む混合ワクチン組成物において、ＰＲＲＳＶワクチン：ＣＳＦＶワクチン：ＰＲＶワクチンのＴＣＩＤ₅₀比は、約１０⁴：１：１０⁵から約５：１：６である。例えばワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、ＣＳＦＶワクチン１０^0.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀を含みうる。別の例としてワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、ＣＳＦＶワクチン１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀を含みうる。別の例としてワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン１０^5.7ＴＣＩＤ₅₀、ＣＳＦＶワクチン１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^5.8ＴＣＩＤ₅₀を含みうる。別の例としてワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶワクチン１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀、ＣＳＦＶワクチン１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀およびＰＲＶワクチン１０^6.5ＴＣＩＤ₅₀を含みうる。

本明細書で提供されるワクチン組成物は、アジュバントをさらに含みうる。アジュバントはｉｎ ｖｉｖｏ分解からワクチンを保護でき、かつ／または免疫系を非特異的に刺激でき、それによりワクチンへの免疫学的応答の強化を補助できる。アジュバントの例には、限定されないが、無機塩（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム）、油中水乳剤（例えばフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントなど）、サポニンアジュバント（例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）など）、細菌または微生物の派生物（例えばＬＰＳ、リピドＡ誘導体など）および微粒子（例えばポリ−α−ヒドロキシ酸など）が含まれる。

本明細書で提供されるワクチン組成物は、凍結保護物質をさらに含みうる。凍結保護物質は、生物学的製品を良好な安定性で保持でき、凍結乾燥の工程中でのワクチンの生物学的活性への損傷を低下できる。凍結保護物質の例は、ショ糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムまたはラクトアルブミン加水分解物などを含む。

調製方法
別の態様では、本開示は、本明細書で提供されるワクチン組成物を調製するための方法であって、（ａ）それぞれの感受性細胞において培養されるＰＲＲＳＶワクチン株、ＣＳＦＶワクチン株および／またはＰＲＶワクチン株を回収するステップと、（ｂ）適切なＴＣＩＤ₅₀比で２つ以上のウイルス株を混合するステップとを含む方法を提供する。

特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、ＰＲＲＳＶワクチン株、ＣＳＦＶワクチン株および／またはＰＲＶワクチン株をそのそれぞれの感受性細胞に接種するステップ、ワクチン産生のための種ウイルスを調製するために細胞を培養するステップ、種ウイルスをそのそれぞれの感受性細胞に接種するステップ、それぞれのウイルスを含有する抗原溶液を得るために細胞を増殖させるステップを含む。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン株は、高病原性ＰＲＲＳＶの弱毒化ワクチン株である。特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン株はＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株である。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチン株は弱毒化ＣＳＦＶである。特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチン株はＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）である。

特定の実施形態では、ＰＲＶワクチン株は、弱毒化ＰＲＶである。特定の実施形態では、ＰＲＶワクチン株は、Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株である。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン株についての感受性細胞には、限定されないが、Ｍａｒｃ−１４５細胞株、ＭＡ−１０４細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株もしくはＣＬ−２６２１細胞株などの細胞株またはＰＡＭ細胞などの初代細胞が含まれる。

特定の実施形態では、ＣＳＦＶワクチン株についての感受性細胞には、限定されないが、ＢＴ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、ＭＰＫ細胞株、ＳＫ６細胞株、ＰＫ２ａ細胞株、ＣＰＫ細胞株、ＲＫＣ細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＣＲＦＫ細胞株、ＰＴ細胞株およびＳＴ細胞株などの細胞株またはＢＴ細胞などの初代細胞が含まれる。ＰＴ細胞株およびＳＴ細胞株の両方はブタ精巣細胞株である。

特定の実施形態では、ＰＲＶワクチン株についての感受性細胞には、限定されないが、ＳＴ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４６）、ＰＫ−１５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−３３）、Ｍａｒｃ−１４５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１２２１９）、ウシ腎臓ＭＤＢＫ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２）、ウシ鼻甲介ＢＴ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１３９０）、Ｖｅｒｏ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）、ＢＨＫ−２１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０）、ブタ腎臓細胞株（ＩＢＲＳ−２、例えばＤＥＣＡＳＴＲＯ、Ｍ．Ｐ．１９６４． Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢ−ＲＳ−２ ｓｗｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ａｒｑｕｉｖｏｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ３１：６３〜７８を参照されたい）およびウサギ腎臓ＲＫ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０６）などの継代細胞株；またはニワトリ胚線維芽細胞およびブタ腎臓細胞などの初代細胞が含まれる。初代細胞は、当技術分野において周知の方法、例えば動物から組織を単離し細胞を調製することによって調製されうる。

特定の実施形態では、感受性細胞は、好ましくは３３〜３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養された。感受性細胞を培養する方法は、ＥＤＴＡ−トリプシン溶液での消化後に細胞株を継代するステップ、増殖培地で細胞株の培養を継続するステップを含むことができ、細胞が９０〜１００％コンフルエンスに達したときにそれらをさらに継代しまたはそれらに種ウイルスを接種することができる。細胞株を培養するための方法は、好ましくは以下のいずれかである：回転ボトル中で細胞を培養し、細胞密度を１×１０⁶／ｍｌ〜５×１０⁶／ｍｌに到達させる；または懸濁培養のためのバイオリアクターに接着担体を導入し、細胞密度を５×１０⁶／ｍｌ〜１×１０⁷／ｍｌに到達させ、接着担体は好ましくはマイクロ担体または紙である。

特定の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチン株はその感受性細胞に感染多重度（ＭＯＩ）０．０１〜０．５で接種され、ＣＳＦＶワクチン株はその感受性細胞にＭＯＩ ０．１〜０．５で接種され、もしくは接種量は３％〜５％の細胞由来ウイルスであり、かつ／またはＰＲＶワクチン株はその感受性細胞にＭＯＩ ０．００５〜０．５で接種される。

特定の実施形態ではそれぞれのウイルスワクチン株を接種された細胞は、接種後３〜５日間培養され、ワクチン産生のための種ウイルスは採取される。ＰＲＲＳＶ株について種ウイルスは、細胞変性効果が７０％に達したときに採取される。ＣＳＦＶ株については、最初の採取は接種後５日目の培地交換によって実施され、５回以下の採取が実施される条件で、続く採取は４日間隔の培地交換によって実施される。ＰＲＶ株については、ウイルスを含有する細胞培養培地は接種の２〜３日後に採取される。

特定の実施形態ではワクチン産生のための種ウイルスは適切なウイルス力価を有する。例えば、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のための種ウイルスは、１ｍｌあたりウイルス１０^7.0ＴＣＩＤ₅₀以上であってよく、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のための種ウイルスは１ｍｌあたり＞１００，０００ウサギ感染量もしくは（免疫蛍光法に基づくアッセイによって測定されるとおり）１ｍｌあたりウイルス１０^6.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀以上であってよく、かつ／またはＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のための種ウイルスは１ｍｌあたりウイルス１０^8.0ＴＣＩＤ₅₀以上であってよい。

特定の実施形態では種ウイルスは、そのそれぞれの感受性細胞に接種され、それぞれのウイルスを含有する抗原溶液を得るために増殖される。特定の実施形態では得られた抗原溶液は、適切なウイルス含有量（例えばＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株について１ｍｌあたりウイルス１０^7.0ＴＣＩＤ₅₀以上、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）について１ｍｌあたり＞１００，０００ＲＩＤもしくは免疫蛍光法に基づくアッセイによって測定されるとおり１ｍｌあたりウイルス１０^6.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀以上、および／またはＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株について１ｍｌあたりウイルス１０^8.0ＴＣＩＤ₅₀以上）を有する。

特定の実施形態ではステップ（ｂ）は、回収されたＰＲＲＳＶワクチン株とＣＳＦＶワクチン株とを１００００：１から１：１のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む。特定の実施形態ではステップ（ｂ）は、回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルスとＰＲＶワクチンウイルスとを１：１から１：３０のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む。特定の実施形態ではステップ（ｂ）は、回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルス、ＣＳＦＶワクチンウイルスおよびＰＲＶワクチンウイルスを約１０⁴：１：１０⁵から約５：１：６のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む。

特定の実施形態ではステップ（ｂ）は、回収されたウイルス溶液の混合物を凍結保護物質と混合するステップをさらに含む。特定の実施形態では回収されたウイルス溶液の混合物は、凍結保護物質と容量比７５〜８０：２５〜２０で混合される。

別の態様では、本開示は、本明細書で提供される方法を用いて調製されるワクチン組成物を提供する。

別の態様では、本開示は、ＰＲＲＳ、ＣＳＦおよび／またはＰＲを予防または治療するための薬剤の製造における本明細書で提供されるワクチン組成物の使用を提供する。

別の態様では、本開示は、本明細書で提供されるワクチン組成物をブタに投与するステップを含む、ブタを免疫化する方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＳＴ、ＰＫ−１５、Ｍａｒｃ−１４５、ＭＤＢＫ、ＢＴ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ブタ腎臓細胞株（ＩＢＲＳ−２）、ウサギ腎臓細胞株（ＲＫ）およびニワトリ胚線維芽細胞株からなる群から選択される細胞株またはブタ腎臓初代細胞である初代細胞で培養されたＣＳＦＶワクチン株を提供する。別の態様では、本開示は、ＣＳＦＶワクチン株を培養する際のこれらの細胞株の使用を提供する。

本開示は、ＰＲＲＳＶワクチンおよびＣＳＦＶワクチンを含み、上に記載の調製方法を用いて調製されたワクチン組成物も提供する。

本開示は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群およびブタコレラを予防または治療するための生物学的製品を製造する際のワクチン組成物の使用も提供する。

本明細書で提供される混合ワクチンは、高病原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群およびブタコレラの予防において顕著な有効性を示す。本明細書で提供される高病原性ＰＲＲＳＶ株およびＣＳＦＶワクチン株は、いかなる免疫学的抑制も示さず、それらから調製される混合ワクチンは安全性、免疫原性、免疫期間、免疫防御および安定性に関してそのそれぞれの単独ワクチンと差異を示さない。安全性研究の結果は、ワクチンの１回投与、反復投与、過量接種を受けた動物がいかなる臨床的症状も有することなく正常な体温および生気（ｓｐｒｉｔ）を示すことを示す。有効性研究の結果は、本明細書で提供されるワクチンが高病原性ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶの毒性株のチャレンジに対する顕著な防御を動物に提供でき、高病原性ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶの感染を有効に予防できることを示す。免疫期間研究の結果は、免疫期間が６カ月間持続し、免疫期間中ブタへの有効な防御を確実にできることを示す。安定性研究の結果は、ワクチンが２〜８℃で１８カ月間保存されうることを示し、長い有効期間および安定的保存でのその有利性を示す。本明細書で提供されるワクチンは、動物に接種され、１回の注射で２つの疾患を予防し、それによりワクチン接種の負担および免疫化の頻度を低下させ、ブタ群への負荷を最少化し、頻回のワクチン接種によって生じる免疫寛容および失敗を防止するために用いられうる。

本開示は、本明細書で提供されるワクチン組成物をブタに投与するステップを含む、ブタを免疫化するための方法も提供する。ブタは、例えば注射によって免疫化されうる。免疫化は、１回の単独投与または複数投与量の反復投与であってもよい。免疫化のための方法および投与量は実際の条件に応じて経験のある獣医学の専門家によって調整されうる。

以下の実施例は、本発明をさらに例示することを意図する。本発明の利点および特性は、本記載により明白になる。しかし、これらの説明は単なる例示であり、本開示の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。

全般
ワクチンの接種は、ブタの頸筋への注射によって実施した。ウイルスチャレンジは、検査ブタの鼻部へのウイルスの滴下および／または検査ブタの筋肉へのウイルスの注射によって実施した。ＣＳＦＶウイルス量のＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀は、免疫蛍光に基づく方法によって測定した。

Ｔ細胞のＦＡＣＳアッセイ。Ｔ細胞をフローサイトメトリー法によって測定した。簡潔には血液試料を抗凝集剤で処理し、赤血球の溶解が続いた。処理試料をＦＩＴＣ−ＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＰＥ−ＣＤ４ｍＡｂ、ＰＥＣｙ５−ＣＤ３ｍＡｂでそれぞれ染色した（すべての抗体は５１ＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｉｊｉｎｇから購入した）。４５分間インキュベーション後、未反応抗体を除去し、細胞をＰＢＳ中に懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ）で分析した。

ＥＬＩＳＡアッセイ。ＰＲＲＳＶ抗原に対する抗体、ＣＳＦＶ抗原に対する抗体をＢｅｉｊｉｎｇ ＩＤＥＸＸ Ｙｕａｎｈｅｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入したそれぞれの検出キットを用いてＥＬＩＳＡによって測定した。

Ｉ部：ワクチンの調製

［実施例１］
ＰＲＲＳＶ ワクチンの調製
細胞継代および培養
Ｍａｒｃ−１４５細胞（ＰＲＲＳＶワクチン株ＴＪＭを培養するために用いた）をトリプシン処理し、１：３に分割した。細胞を培養培地中、３７℃で培養した。細胞が単層を形成した後、それらを継代し、またはウイルス株を接種した。

種ウイルスの細胞での増殖
高毒性ＰＲＲＳＶについてのワクチン株ＴＪＭをＭａｒｃ−１４５細胞にＭＯＩ ０．０１〜０．５で接種した。接種した細胞を３〜５日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が７０％に達したときにウイルス溶液を回収した。回収したウイルス溶液をＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の種ウイルスとして用いた。

種ウイルスを中華人民共和国の獣医薬局方に従って特徴付けた。種ウイルスは細菌、カビまたはマイコプラズマを含んでいなかった。ＰＲＲＳＶ種ウイルス溶液は、ブタに有害作用を示さなかった。ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の種ウイルス溶液は１ｍｌあたりウイルス１０^7.0ＴＣＩＤ₅₀以上を含有した。

ワクチン産生のためのウイルス溶液の増殖
Ｍａｒｃ−１４５細胞を単層で９０〜１００％コンフルエントまで培養した。細胞培養培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の種ウイルス溶液をＭＯＩ ０．０１〜０．５で接種した。接種した細胞を３〜５日間培養し、ウイルス溶液をＣＰＥが７０％に達したときに回収した。回収したウイルス溶液をワクチン産生のためのウイルス溶液として用いた。そのようなウイルス溶液を特徴付け、細菌、カビまたはマイコプラズマは含んでおらず、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス溶液は、１ｍｌあたりウイルス１０^7.0ＴＣＩＤ₅₀以上を含有した。ウイルス溶液をＰＲＲＳＶ単独ワクチンを調製するために適切に希釈し、または混合ワクチンを調製するために他のワクチンと混合した。

［実施例２］
ＣＳＦＶワクチンの調製
細胞継代および培養
ＢＴ細胞を（ＣＳＦＶワクチン株を培養するために用いた）トリプシン処理し、１：５に分割した。細胞を培養培地中、３７℃で培養した。細胞が単層を形成した後、それらを継代し、またはウイルス株を接種した。

ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）を０．３％ウイルス溶液に調製し、ＢＴ細胞の単層に接種した。接種した細胞を５日間培養し、ウイルス溶液をＣＳＦＶワクチン株の種ウイルスとして回収する。

種ウイルスの特徴付け
種ウイルスを中華人民共和国の獣医薬局方に従って特徴付けた。種ウイルスは細菌、カビまたはマイコプラズマは含んでいなかった。ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）を認定された種ウイルス溶液として検査し、ブタに有害作用を示さなかった。ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の種ウイルス溶液は、＞１００，０００ウサギ感染量（ＲＩＤ）または免疫蛍光に基づく方法によって測定されたとおりウイルス溶液１ｍｌあたりウイルス１０^6.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀以上を含んだ。

ワクチン産生のためのウイルス溶液の増殖
ＢＴ細胞を単層で９０〜１００％コンフルエントまで培養した。細胞培養培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の種ウイルス溶液をＭＯＩ ０．１〜０．５でまたは３％〜５％の量で接種した。接種後５日間で、培地交換によって最初の採取を実施し、続く採取は４日間隔で（５回以下の採取が実施される条件で）実施する。回収したウイルス溶液を−２０℃で保存し、ワクチン産生のためのウイルス溶液として用いた。そのようなウイルス溶液を特徴付け、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の種ウイルス溶液は、＞１００，０００ＲＩＤを、または免疫蛍光に基づく方法によって測定されたとおりウイルス溶液１ｍｌあたりウイルス１０^6.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀以上を含有した。ウイルス溶液をＣＳＦＶ単独ワクチンを調製するために適切に希釈し、または混合ワクチンを調製するために他のワクチンと混合した。

［実施例３］
ＰＲＶワクチンの調製
細胞継代および培養
Ｍａｒｃ−１４５細胞、ＭＤＢＫ細胞およびＢＴ細胞（ＰＲＶワクチン株Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１を培養するために用いた）をトリプシン処理し、細胞増殖培地でそれぞれ継代した。細胞を培養培地中、３７℃で培養した。細胞が単層を形成した後、それらを継代し、またはウイルス株をそれぞれ接種した。

種ウイルスの細胞での増殖
ＰＲＶワクチン株Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１を２〜４％ウシ血清を含有するＭＥＭ培地中のＭａｒｃ−１４５細胞、ＭＤＢＫ細胞またはＢＴ細胞の単層に接種した。接種した細胞をそれぞれ２〜３日間培養し、ウイルス溶液をＰＲＶワクチン株の種ウイルスとして回収した。

種ウイルスの特徴付け
種ウイルスを特徴付けた。ＰＲＶ種ウイルスを認定された種溶液として検査し、ブタに有害作用を示さなかった。ＰＲＶ株の種ウイルス溶液は、１ｍｌあたりウイルス１０^8.0ＴＣＩＤ₅₀以上を含有した。

ＰＲＶワクチン株のウイルス溶液の増殖
ＰＲＶ株をＭａｒｃ−１４５細胞、ＭＤＢＫ細胞またはＢＴ細胞のコンフルエント単層に維持培地の添加と共にＭＯＩ ０．００５〜０．５で接種した。接種した細胞を３６〜３７℃で培養し、ＣＰＥが７０％に達したときにウイルス溶液を回収した。

ウイルス溶液の量を２回の凍結融解サイクル後に測定した。種ウイルス溶液は、１ｍｌあたりウイルス１０^8.0ＴＣＩＤ₅₀以上を含有した。ウイルス溶液を中華人民共和国の獣医薬局方に従って特徴付け、細菌、カビまたはマイコプラズマを含んでいなかった。認定されたウイルス溶液を−１５℃以下で保存し、ワクチン産生のためのウイルス溶液として用いた。ウイルス溶液をＰＲＶ単独ワクチンを調製するために適切に希釈し、または混合ワクチンを調製するために他のワクチンと混合した。

［実施例４］
ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶのための混合ワクチン組成物の調製
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス溶液（実施例１に従って調製）およびＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のウイルス溶液（実施例２に従って調製）を組み合わせることによって抗原溶液を調製した。

耐熱性凍結保護物質をショ糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよびラクトアルブミン加水分解物を適切な割合で混合することによって調製し、続いてオートクレーブをかけた。

抗原溶液の７５〜８０容積画分を凍結保護物質の２５〜２０容積画分と混合し、混合物を予め決定した量でアンプルに充填した。アンプルに栓をし、凍結乾燥ワクチン組成物を得るために低温および乾燥工程に供した。ワクチン組成物を無菌性、安全性および有効性に関して検査した。

調製した混合ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶワクチンの各投与量では、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の量は≧１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀であり、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の量は≧７５００ＲＩＤ（もしくは≧７５０ＲＩＤ、もしくは≧１５０ＲＩＤ）または免疫蛍光に基づく方法によって測定されたウイルス１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀以上であった。

混合ワクチンを中華人民共和国の獣医薬局方の付属書１５、１９および２０頁に従って特徴付けた。混合ワクチンは細菌、カビ、マイコプラズマおよび外来性ウイルスを含んでいなかった。

［実施例５］
ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶのための混合ワクチン組成物の調製
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス溶液（実施例１に従って調製）およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のウイルス溶液（実施例３に従って調製）を組み合わせることによって抗原溶液を調製した。

耐熱性凍結保護物質をショ糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよびラクトアルブミン加水分解物を適切な割合で混合することによって調製し、続いてオートクレーブをかけた。

抗原溶液の６〜８容積画分を凍結保護物質の２〜４容積画分と混合し、混合物を予め決定した量でアンプルに充填した。アンプルに栓をし、凍結乾燥ワクチン組成物を得るために低温および乾燥工程に供した。

調製した混合ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶワクチンの各投与量では、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の量は≧１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀であり、ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株の量は≧１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀であった。

混合ワクチンを中華人民共和国の獣医薬局方の付属書１５、１９および２０頁に従って特徴付けた。混合ワクチンは細菌、カビ、マイコプラズマおよび外来性ウイルスを含んでいなかった。

［実施例６］
ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶのための混合ワクチン組成物の調製
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のウイルス溶液（実施例１に従って調製）、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のウイルス溶液（実施例２に従って調製）およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株のウイルス溶液（実施例３に従って調製）を組み合わせることによって抗原溶液を調製した。

耐熱性凍結保護物質をショ糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよびラクトアルブミン加水分解物を適切な割合で混合することによって調製し、続いてオートクレーブをかけた。

抗原溶液の７５〜８０容積画分を凍結保護物質の２５〜２０容積画分と混合し、混合物を予め決定した量でアンプルに充填した。ワクチン組成物を提供するためにアンプルを凍結乾燥した。ワクチン組成物を無菌性、安全性および有効性に関して検査した。

調製した混合ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶワクチンの各投与量では、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株ウイルスの量は≧１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀であり、ＣＳＦＶ Ｃ株ウイルスの量は≧７５００ＲＩＤ（もしくは≧７５０ＲＩＤ、≧１５０ＲＩＤ）または免疫蛍光に基づく方法によって測定されたウイルス１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀以上であり、ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株ウイルスの量は≧１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀であった。

混合ワクチンを中華人民共和国の獣医薬局方の付属書１５、１９および２０頁に従って特徴付けた。混合ワクチンは細菌、カビ、マイコプラズマおよび外来性ウイルスを含んでいなかった。

［実施例７］
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株の遺伝子特徴付け
実施例１に従って調製したウイルス溶液および実施例４〜６に従って調製した混合ワクチンに含有されるＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株を、ＰＲＲＳＶのｎｓｐ２に特異的なプライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴ−３’；リバースプライマー：５’−ＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＡＣＡＧＡ−３’）を用いてＰＣＲによって特徴付けた。ＰＲＲＳＶ ＴＪ株は陽性対照であり、水は陰性対照であった。

結果は、ＰＲＲＳＶ ＴＪ株を含有する陽性対照における５６７ｂｐバンドと比較して、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株を含有する試料に特異的な２０７ｂｐバンドを示した（図５）。結果から、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株がｎｓｐ２遺伝子中の３６０ヌクレオチドを欠くことが確認され、調製したワクチンにＰＲＲＳＶ ＴＪ株が混入していないことがさらに確認された。

［実施例８］
ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株の遺伝子特徴付け
実施例３に従って調製したウイルス溶液および実施例５〜６に従って調製した混合ワクチン組成物に含有されるＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株を、ＰＲＶのｇＥに特異的なプライマー（フォワードプライマー：５’−ＣＧＴＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＣ−３’；リバースプライマー：５’−ＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧ−３’）を用いてＰＣＲによって特徴付けた。ＰＲＶ毒性株（ＪＬ１株）を陽性対照、水を陰性対照とした。

結果により、ＰＲＶ毒性株における２３２ｂｐバンドと比較して、ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株を含有する試料ではバンドは見出されなかった（図６）。

結果から、ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株がｇＥ遺伝子中に欠失を含有することが確認され、調製したワクチンにＰＲＶ毒性株が混入していないことがさらに確認された。

ＩＩ部：有効性研究

［実施例９］
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株についての最小免疫学的有効量の決定
健康な離乳ブタ２５匹を研究に用いた。ブタは、高病原性ＰＲＲＳＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを５群に無作為に分けた。群ＩからＶＩにはさまざまな投与量のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株を接種し、群Ｖは陰性対照とした（表１）。ブタに毒性ＰＲＲＳＶ ＴＪ株をチャレンジし、研究後に防御率を算出した。表１のとおり、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀以上の量でのＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株は、防御率４／５を有してブタで防御免疫を誘導するために十分であった。

［実施例１０］
ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）についての最小免疫学的有効量の決定
健康な離乳ブタ２８匹を研究に用いた。ブタは、ＣＳＦＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを６群に無作為に分けた。群ＩからＶにはさまざまな投与量のＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）を接種し、群ＶＩは陰性対照とした（表２）。ブタに毒性ＣＳＦＶ Ｓｈｉｍｅｎ株をチャレンジし、研究後に防御率を算出した。表２のとおり、１０^0.5ＴＣＩＤ₅₀以上の量でのＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）は、防御率５／５を有してブタで防御免疫を誘導するために十分であった。

［実施例１１］
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株およびＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の混合ワクチンについての最小免疫学的有効量の決定
健康な子ブタ４０匹を研究に用いた。ブタは、高病原性ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶの両方について抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを４群に無作為に分けた。群ＩからＩＩＩにはさまざまな投与量のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株およびＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の混合ワクチンを接種し、群ＩＶは陰性対照とした。各群の半分のブタにＰＲＲＳＶ ＴＪ株をチャレンジし、他の半分のブタにＣＳＦＶ Ｓｈｉｍｅｎ株をチャレンジした。研究後に防御率を算出した。

表３のとおり、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀のＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株および１０^3.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀のＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）を含有する混合ワクチンは、ブタで防御免疫を誘導するために十分であった（表３および４）。具体的にはＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）は、混合ワクチンで検査したすべての投与量で１００％防御を示し、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）への免疫応答がＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株によって抑制されなかったことを示唆している。さらに、実施例１０で示されたＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）の非常に低い免疫学的有効量を考慮すると、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）のより低い投与量を、防御率を低下させることなく混合ワクチンに用いることができる。

［実施例１２］
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株とＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）との組合せは免疫阻害を有さない
２１〜２８日齢の健康なブタ３０匹を研究に用いた。ブタは、高病原性ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶの両方について抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを７群に無作為に分けた（群ＩからＶにブタを各５匹、群ＶＩにブタ３匹、群ＶＩＩにブタ２匹）（表５）。各ブタには、表５に示す研究設計に従って検査試料１ｍｌを接種し、または全く接種しなかった（すなわち群ＶＩＩ）。

ブタの直腸温をワクチン接種の３日前からワクチン接種の１４日後まで毎日測った。体重を７日ごとに測定した。ブタは綿密な臨床観察下にもおいた。血液試料をワクチン接種の３日前、ワクチン接種後０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目および２８日目に研究用の各ブタからそれぞれ採取した。各血液試料を２つに分けた。１つを抗凝固剤で処理し、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出のために用いた。もう一方は凝固剤で処理し、抗体価アッセイに用いた。

結果は、ワクチン接種ブタでのＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞における変化が、対照群のブタにおいて観察されたものに類似していたことを示した（図７〜１０）。混合ワクチンでのワクチン接種後、群ＩＩＩおよびＩＶのブタは、両方のウイルスに対する抗体を産生し、そのような抗体産生は互いに干渉しなかった（図１１〜１２）。群ＩＩＩおよびＩＶのブタについてのＰＲＲＳＶ抗体産生の動態は、群Ｉのブタについてのものに類似しており、群ＩＩＩおよびＩＶのブタについてのＣＳＦＶ抗体産生の動態は、群ＩＩのブタについてのものに類似していた。結果は、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株のワクチン接種がＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）に対する免疫応答を阻害しないことおよびその逆も示した。

各群のブタの直腸温および体重は、顕著な差異を示さなかった（図１３）。

ワクチン接種２８日後に、表６に示す研究設計によりブタを毒性ウイルスでチャレンジした。ウイルスチャレンジ後、ブタの直腸温を毎日測り、ブタを食欲、呼吸および生気を含む臨床所見について観察した。血液試料をウイルスチャレンジ後０日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に各ブタからそれぞれ取り、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出のために抗凝固剤で処理した。ＰＲＲＳＶウイルスおよびＣＳＦＶウイルスの単離およびウイルス血症の存在の測定のために、血液試料をウイルスチャレンジの日およびチャレンジ後の隔日にも取った。臨床的防御率、罹患率（すなわち、罹患したブタの数／検査したブタの数）および死亡率（すなわち、死んだブタの数／検査したブタの数）を各群の動物についてウイルスチャレンジ研究の１４日後に算出し、結果を表６に示す。

結果は、ウイルスチャレンジ後、体温は群ＶおよびＶＩの非ワクチン接種ブタで上昇したが、群Ｉ〜ＩＶのワクチン接種ブタではしなかったことを示した（図１４〜１５）。群Ｖのブタは、低い生気、呼吸でのストレス、赤い皮膚などの高病原性ＰＲＲＳに関する臨床症状を示した。群ＶＩのブタは、低い生気、便秘に続く下痢、赤い皮膚などを含むブタコレラに関する顕著な症状を示した。ワクチン接種群のブタはそのような臨床症状を示さなかった（図１６〜１７）。

ウイルスチャレンジ後、群ＶおよびＶＩの非ワクチン接種ブタは、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞における顕著な低下を示し、ウイルスチャレンジ後７日目から死に始めた。一方、混合ワクチンまたは単独ワクチンをワクチン接種されたブタは、Ｔ細胞におけるそのような顕著な低下は示さず、Ｔ細胞プロファイルは空白対照群の健康なブタに相当するものであった。これは、ワクチンが細胞性免疫応答の誘発において有効であったことを示唆した。追加的に混合ワクチンでワクチン接種されたブタおよび単独ワクチンでされたブタは、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞において類似する変化を示し、混合ワクチンが互いに対する免疫阻害を有さなかったことを示唆した（図１８〜２５）。

高毒性ＰＲＲＳＶでのチャレンジ後、群Ｖの非ワクチン接種ブタは２日目からウイルス血症を発症し始め、１１日間まで持続した。しかし混合ワクチンまたはＰＲＲＳＶ単独ワクチンでワクチン接種したブタは、４日目までウイルス血症を発症せず、５日間まで持続した。これは、混合ワクチンおよび単独ワクチンの両方が高病原性ＰＲＲＳＶの感染に対する有効な防御を提供したことおよび混合ワクチンが互いに対する免疫阻害を有さなかったことを示した。

毒性ＣＳＦＶでのチャレンジ後、群ＶＩのすべてのブタはウイルス血症を発症したが、ワクチン接種ブタはウイルス血症を発症しなかった。これは、混合ワクチンおよび単独ワクチンの両方が毒性ＣＳＦＶの感染に対する有効な防御を提供したことならびに混合ワクチンが互いに対する免疫阻害を有さなかったことを示した。

［実施例１３］
ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶに対する２−コンボワクチンの有効性研究
実施例４に従って調製したＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶに対する研究所作製２−コンボワクチンの３バッチ（バッチ番号：２００９０４、２００９０５および２００９０６）を用いて有効性研究を実行した。

健康なブタ２８匹（高毒性ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶの両方について抗原および抗体の両方に関して陰性）を２−コンボワクチン試料の各バッチについての研究に用いた。ブタを６群（群ＩからＩＶおよび群ＶＩにブタを各５匹、群Ｖにブタ３匹）に無作為に分けた。各群のブタにそれぞれの検査試料を接種し、ワクチン接種２８日後に表７に示す研究設計に従ってブタを毒性ウイルスでチャレンジした。

ＣＳＦＶウイルスチャレンジ研究はチャレンジの１６日後に終了し、ＰＲＲＳＶウイルスチャレンジ研究はチャレンジの２１日後に終了した。防御率を算出し、結果を表７に示す。ＰＲＲＳＶとＣＳＦＶとの２−コンボワクチンの３つすべてのバッチは、高毒性ＰＲＲＳＶまたはＣＳＦＶでのチャレンジに対して良好な防御を示した。２−コンボワクチンでの防御は、単独ワクチン対照と顕著な差異を示さなかった。非ワクチン接種ブタはすべて感染の明らかな臨床症状を示した。

［実施例１４］
ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶに対する２−コンボワクチンの免疫期間研究
ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶに対する２−コンボワクチン（実施例４に従って調製）を用いて免疫期間研究を実行した。ＰＲＲＳＶ単独ワクチン（実施例１に従って調製）およびＣＳＦＶ単独ワクチン（実施例２に従って調製）を対照として用いた。

健康なブタ５６匹を免疫期間研究に用いた。すべてのブタはＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを６群に無作為に分けた、表８に示すそれぞれの検査試料を接種した。抗体価の測定のために血液試料をワクチン接種の１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月後に回収した。

ワクチン接種のそれぞれ３カ月および６カ月後に、各研究群から半分の動物を取った。これらの動物を表８に示すとおりそれぞれの毒性ウイルスでチャレンジした。

結果（表８を参照されたい）は、２−コンボワクチンがワクチン接種の６カ月後にウイルスチャレンジに対する有効な防御をブタに提供し、したがって６カ月間の免疫持続期間を裏付けたことを示した。２−コンボワクチンの免疫持続期間は単独ワクチンのそれに匹敵することが見出された。

［実施例１５］
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭとＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１との組合せは免疫阻害を有さない
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株に対する２−コンボワクチン（実施例５に従って調製）を本研究で用いた。ブタ、４〜５週齢を、各群４匹、４群に無作為に分けた。すべてのブタは、ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性であった。

表９に示す研究設計に従ってブタにそれぞれの検査試料を接種した。２回目ワクチン接種を初回ワクチン接種の１週間後に実施した。

ワクチン接種後、ブタの血液試料を毎週、ワクチン接種の２８日後まで回収した。血液試料を処理し、ＰＲＶに対する抗体価について検出した。

結果は、ＰＲＶ抗体価は群ＩからＩＩＩにおいては顕著な差異がなかったことを示した（図２６）。これは、ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株がＰＲＶワクチンに対する免疫阻害を有さなかったことを示唆した。ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株は、別々にまたはＰＲＶとの混合ワクチンとして投与された場合にＰＲＶ抗体価に影響を与えなかった。ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶに対する２−コンボワクチンは、ＰＲＶ単独ワクチンのそれに匹敵する有効性を有した。

［実施例１６］
混合ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶワクチンの有効性研究
実施例５に従って調製したＰＲＲＳＶおよびＰＲＶに対する２−コンボワクチンの３バッチを用いて有効性研究を実行した。

ブタ、４〜５週齢を、各群１０匹、４群に無作為に分けた。群ＩからＩＩＩに２−コンボワクチンのそれぞれのバッチの１投与量を注射した。ワクチンの各投与量はＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌおよびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌを含有した。群ＩＶは対照群であり、１ｍｌ ＭＥＭ培地を注射した。

ワクチン接種後、ブタを臨床所見および有害作用について観察した。ブタの血液を毎週回収し、血清を抗体価の特徴付けのために分離した。ブタの体重を毎週測定した。

ワクチン接種の４週間後、各群ブタ５匹をＰＲＲＳＶ ＴＪ株２×１０^4.0〜２×１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀でチャレンジし、他の５匹をＰＲＶ毒性株（ＪＬ１株）１０^3.0〜１０^3.5ＴＣＩＤ₅₀でチャレンジした。ウイルスチャレンジ後、ブタを食欲および生気を含む臨床所見について観察した。ブタの直腸温を毎日測った。血液試料および鼻拭き取り検体をウイルス特徴付けのために回収した。

結果は、群ＩからＩＩＩのワクチン接種ブタはワクチン接種後に正常体温を示し、良好な生気および良好な食欲であった。ウイルスチャレンジ後、ワクチン接種ブタは防御率４／５で防御された一方で対照群のすべての非ワクチン接種ブタは感染症を発症し、毒性ＰＲＲＳＶチャレンジからの死亡率２／５および毒性ＰＲＶチャレンジからの３／５を有した。結果は、ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶに対する２−コンボワクチンが両方のウイルスのチャレンジに対する良好な有効性を有し、ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶの感染を予防するために有効であったことを示唆した。

［実施例１７］
ＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株、ＣＳＦＶ Ｃ株およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株の組合せは免疫阻害を有さない
２１〜２８日齢の健康なブタ４６匹を研究に用いた。ブタは、高毒性ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを１０群に無作為に分けた（群ＩからＶＩＩおよび群ＩＸにブタを各５匹、群ＶＩＩＩおよびＸにブタ各３匹）。ブタには、表１０に示す研究設計に従って指定の検査試料１ｍｌを接種し、または全く接種しなかった（すなわち群Ｘ）。

ブタの直腸温をワクチン接種の３日前からワクチン接種の７日後まで毎日測った。ブタを綿密な臨床観察下にもおいた。血液試料をワクチン接種の３日前、ワクチン接種後０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、３５日目、３８日目および４２日目に研究用の各ブタからそれぞれ採取した。各血液試料を２つに分けた。１つを抗凝固剤で処理し、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出のために用いた。もう一方は凝固剤で処理し、抗体価アッセイに用いた。

ワクチン接種２８日後に、表１１に示す研究設計に従ってブタを毒性ウイルスでチャレンジした。ウイルスチャレンジ後、ブタの直腸温を毎日測り、ブタを食欲、呼吸および生気を含む臨床所見について観察した。ＰＲＲＳＶチャレンジ研究はウイルスチャレンジ後２１日目に終了し、ＣＳＦＶチャレンジ研究はウイルスチャレンジ後１６日目に終了した。臨床的防御率、罹患率（すなわち、罹患したブタの数／検査したブタの数）および死亡率（すなわち、死んだブタの数／検査したブタの数）を各群についてウイルスチャレンジ研究後に算出し、結果を表１１に示す。

結果は、ＣＳＦＶ Ｃ株およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株と組み合わされた場合にＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株が３つすべての毒性ウイルスのチャレンジに対する有効な防御を提供したことを示した。混合ワクチンは、各単独ワクチンに匹敵する有効性を示し、混合ワクチンが互いに対する免疫阻害を有さないことを示唆した。

［実施例１８］
組み合わせたＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株、ＣＳＦＶ Ｃ株およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株についての有効性研究
有効性研究を実施例６に従って調製した研究所作製３−コンボワクチンの３バッチ（バッチ番号：０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３）を用いて実行した。

健康なブタ４３匹（高毒性ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性）を研究に用いた。ブタを９群（群ＩからＶＩ、群ＶＩＩＩおよび群ＩＸにブタを各５匹および群ＶＩＩにブタ３匹）に無作為に分けた。各群のブタにそれぞれの検査試料を接種し、ワクチン接種２８日後に表１２に示す研究設計に従ってブタをそれぞれの毒性ウイルスでチャレンジした。ＰＲＲＳＶチャレンジ研究はウイルスチャレンジ後２１日目に終了し、ＣＳＦＶチャレンジ研究はウイルスチャレンジ後１６日目に終了し、ＰＲＶチャレンジ研究はウイルスチャレンジ後１４日目に終了した。臨床的防御率、罹患率および死亡率を各群の動物についてウイルスチャレンジ研究後に算出し、結果を表１２に示した。

ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶの３−コンボワクチンの３つのバッチは、すべて高毒性ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶまたはＰＲＶでのチャレンジに対して良好な防御を示した一方で、陰性対照はすべて感染の明らかな臨床症状を示した。３−コンボワクチンでの防御は、単独ワクチン対照と顕著な差異を示さなかった。

［実施例１９］
組み合わせたＰＲＲＳＶ ＴＪＭ株、ＣＳＦＶ Ｃ株およびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１株についての免疫期間研究
免疫期間研究を実施例６に従って調製した研究所作製３−コンボワクチンの３バッチ（バッチ番号：０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３）を用いて実行した。

健康なブタ８６匹を免疫期間研究に用いた。ブタは、高毒性ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶについて抗原および抗体の両方に関して陰性であった。ブタを９群（群ＶＩＩにブタを６匹および残りの各群にブタ１０匹）に無作為に分けた。ブタは、表１３に示す研究設計に従ってワクチン接種を受けた、または何も受けなかった。抗体価の測定のために血液試料をワクチン接種の１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月後に回収した。

ワクチン接種のそれぞれ３カ月および６カ月後に、各研究群から半分の動物を取り、表１３に示すとおりそれぞれの毒性ウイルスでチャレンジした。

結果（表１３を参照されたい）は、３−コンボワクチンがウイルスチャレンジに対する有効な防御をブタにワクチン接種の６カ月後に提供したことを示し、したがって６カ月間の免疫持続期間を裏付けた。３−コンボワクチンの免疫期間は、各単独ワクチンに匹敵することが見出された。

ＩＩＩ部：安全性研究
［実施例２０］

混合ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶワクチンの安全性研究
安全性研究を実施例４に従って調製したＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶに対する研究所作製２−コンボワクチンの３バッチ（バッチ番号：２００９０４、２００９０５および２００９０６）を用いて実行した。

研究は、単回投与安全性研究、反復投与安全性研究、標的年齢ブタでの過量投与安全性研究、子（ｕｎｄｅｒ−ａｇｅ）ブタでの過量投与安全性研究およびさまざまな品種のブタでの過量投与安全性研究を含んだ。

結果は、ワクチン接種後、各研究群のブタは正常な体温を示し、良好な生気および良好な食欲であった。全身性または局所的な有害作用は観察されなかった。混合ワクチンの過量投与は、子ブタにおよびさまざまな品種にも安全であることが示された。

［実施例２１］
混合ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶワクチンの安全性研究
実施例５に従って調製したＰＲＲＳＶおよびＰＲＶについての２−コンボワクチンの３バッチを用いて安全性研究を実行した。

４〜５週齢の、ＰＲＲＳおよびＰＲの両方について抗原および抗体の両方に関して陰性のブタを、各群１５匹で３群に無作為に分けた。各群に２−コンボワクチンを１回投与（１０^5.0−１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀ウイルス／ｍｌ）、反復投与または１０倍過量投与で接種した。ブタ５匹を対照群として用い、何も接種しなかった。

ブタの直腸温をワクチン接種の２１日後まで毎日測った。ブタを綿密な臨床観察下にもおいた。

結果は、各群のブタがワクチン接種後に正常体温を示し、病理学的変化を示さなかったことを示した。２−コンボワクチンはブタに安全であった。

［実施例２２］
混合ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶワクチンの安全性研究
安全性研究を実施例６に従って調製したＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶに対する研究所作製３−コンボワクチンの３バッチ（バッチ番号：０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３）を用いて実行した。研究は、単回投与安全性研究、反復投与安全性研究、標的年齢ブタでの過量投与安全性研究、子ブタでの過量投与安全性研究およびさまざまな品種のブタでの過量投与安全性研究を含んだ。

結果は、ワクチン接種後に各研究群のブタが正常体温を示し、良好な生気および良好な食欲であったことを示した。全身性または局所的な有害作用は観察されなかった。混合ワクチンの過量投与は、子ブタにおよびさまざまな品種のブタにも安全であることが示された。

ＩＶ部：安定性研究

［実施例２３］
ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶに対する２−コンボワクチンの安定性研究
研究所作製混合ＰＲＲＳＶおよびＣＳＦＶワクチン（バッチ番号：２００９０４、２００９０５および２００９０６）を安定性について検査し、ＰＲＲＳＶ単独ワクチンおよびＣＳＦＶ単独ワクチンの３バッチ（バッチ番号：２００９０１、２００９０２、２００９０３、２００９０７、２００９０８および２００９０９）と平行して比較した。

ワクチン組成物それぞれの３バッチを２〜８℃に保存した。試料を研究の３、６、９、１２および１８カ月でそれぞれ回収した。試料を生理化学的特性、真空度、残存水含有量、強度および３７℃での劣化について検査した。

２〜８℃での１８カ月保存後、２−コンボワクチン組成物の３バッチは、希釈用緩衝液の添加で迅速に溶解するゆるい白色塊であった。真空度の検査では、ワクチンは白色または紫色のグロー（ｇｌｏｗ）を示した。検査したワクチンの平均残存水含有量は、中国獣医薬局方によって定められた要件に合致していた。

ワクチン組成物のウイルス力価を測定し、結果を表２７〜３０に示した。２〜８℃での１８カ月間の保存後、２−コンボワクチンのウイルス力価は各単独ワクチンのそれと顕著に異ならなかった。３７℃、１４日間保存後、２−コンボワクチンは、平行研究における各単独ワクチンと顕著に異ならなかった高いレベルのウイルス力価をまだ含有していた。ワクチン組成物のウイルス力価は、認定ワクチンについての要件に合致していた。これは、耐熱性凍結保護物質がＰＲＲＳＶワクチン株およびＣＳＦＶワクチン株に凍結乾燥手順における良好な保護を提供したことを示した。

当技術分野において周知であるとおり、従来ワクチンは通常０℃以下（−２０℃）で保存され、ワクチンの保存を複雑にする。本実施例の結果は、新規凍結保護物質で、ワクチン組成物を高い温度で発送および保存でき、これによりワクチンの高い安定性を提供しうることを示した。

［実施例２４］
ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶに対する２−コンボワクチンの安定性研究
ＰＲＲＳＶおよびＰＲＶに対する研究所作製２−コンボワクチンの３バッチを２〜８℃に保存した。試料を研究の３、６、９、１２、１８、２１および２４カ月でそれぞれ回収した。試料を生理化学的特性、真空度、残存水含有量、強度および３７℃での劣化について検査した。

２〜８℃での２４カ月保存後、ワクチン組成物の３バッチは、希釈用緩衝液の添加で迅速に溶解するゆるい白色塊であった。真空度の検査では、ワクチンは白色または紫色のグローを示した。ワクチン組成物のウイルス力価を測定し、結果を図３１〜３４に示した。混合ワクチンは、２〜８℃、２４カ月の保存後に安定であり、ウイルス力価は保存前のものと顕著に異ならなかった。

［実施例２５］
ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶに対する３−コンボワクチンの安定性研究
ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶおよびＰＲＶに対する研究所作製３−コンボワクチン（バッチ番号：０３１−０１、０３１−０２および０３１−０３）を安定性について検査し、ＰＲＲＳＶ単独ワクチン（バッチ番号：０３１−０４、０３１−０５および０３１−０６）、ＣＳＦＶ単独ワクチン（バッチ番号：０３１−０７、０３１−０８および０３１−０９）およびＰＲＶ単独ワクチン（バッチ番号：０３１−１０、０３１−１１および０３１−１２）の３バッチと平行して比較した。

ワクチン組成物を２〜８℃に保存した。試料を研究の３、６、９、１２および１８カ月でそれぞれ回収した。試料を生理化学的特性、真空度、残存水含有量、強度および３７℃での劣化について検査した。

２〜８℃での１８カ月保存後、ワクチン組成物の３バッチは、希釈用緩衝液の添加で迅速に溶解するゆるい白色塊であった。真空度の検査では、ワクチンは白色または紫色のグローを示した。検査したワクチンの平均残存水含有量は、中国獣医薬局方によって定められた要件に合致していた。

ワクチン組成物のウイルス力価を測定し、結果を図３５〜４０に示した。２〜８℃での１８カ月間の保存後、混合ワクチンのウイルス力価は単独ワクチンのものと顕著に異ならなかった。３７℃、１４日間保存後、混合ワクチンは、平行研究における単独ワクチンのそれと顕著に異ならなかった高いレベルのウイルス力価をまだ示した。これにより、耐熱性凍結保護物質は、ＰＲＲＳＶワクチン株、ＣＳＦＶワクチン株およびＰＲＶワクチン株に凍結乾燥手順の際に良好な保護を提供することが示された。

Claims (44)

1. ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ワクチンおよび第２ブタウイルスワクチンを含み、前記第２ブタウイルスワクチンがブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンから選択され、前記ＰＲＲＳＶワクチンが、配列番号４と比較した場合に、配列番号８内の少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を欠くＤＮＡ配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含む弱毒化ＰＲＲＳＶを含み、ＰＲＲＳＶワクチンおよび第２ワクチンが互いに対する免疫阻害を実質的に有さない、ワクチン組成物。
2. 第３ブタウイルスワクチンをさらに含み、前記第３ブタウイルスワクチンがブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンから選択され、第３ワクチンが第２ワクチンとは異なり、ＰＲＲＳＶワクチン、第２ワクチンおよび第３ワクチンが互いに対する免疫阻害を実質的に有さない、請求項１に記載のワクチン組成物。
3. ＤＮＡ断片が少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、または少なくとも３６０の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
4. ＤＮＡ断片が配列番号８を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
5. 弱毒化ＰＲＲＳＶが、Ｎｓｐ２タンパク質配列をコードしているＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含み、前記Ｎｓｐ２タンパク質配列は、配列番号１１と比較した場合に、配列番号９内の少なくとも２０の連続したアミノ酸を含むペプチド断片を欠く、請求項１に記載のワクチン組成物。
6. ペプチド断片が少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、または少なくとも１２０の連続したアミノ酸を含む、請求項５に記載のワクチン組成物。
7. ペプチド断片が配列番号９を含む、請求項５に記載のワクチン組成物。
8. 弱毒化ＰＲＲＳＶが高病原性ＰＲＲＳＶから弱毒化される、請求項１から７のいずれかに記載のワクチン組成物。
9. 弱毒化ＰＲＲＳＶが、配列番号５と比較した場合に配列番号６内の不連続の９０ヌクレオチドを欠くＤＮＡ配列によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
10. Ｎｓｐ２ヌクレオチドが配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされる、請求項９に記載のワクチン組成物。
11. Ｎｓｐ２ヌクレオチドが配列番号２を含む配列によってコードされる、請求項１０に記載のワクチン組成物。
12. 弱毒化ＰＲＲＳＶが、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされるＮｓｐ１ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から１１のいずれかに記載のワクチン組成物。
13. 弱毒化ＰＲＲＳＶが、配列番号１によってコードされるＮｓｐ１ヌクレオチド配列および配列番号２によってコードされるＮｓｐ２ヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
14. 弱毒化ＰＲＲＳＶが配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する配列によってコードされるＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む、請求項１から１３のいずれかに記載のワクチン組成物。
15. 弱毒化ＰＲＲＳＶが配列番号３によってコードされるＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
16. 弱毒化ＰＲＲＳＶが微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３１２１を有する、請求項１４に記載のワクチン組成物。
17. ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンが弱毒化ＣＳＦＶを含む、請求項１から１６のいずれかに記載のワクチン組成物。
18. 弱毒化ＣＳＦＶが配列番号１０によってコードされる、請求項１７に記載のワクチン組成物。
19. 弱毒化ＣＳＦＶが微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３８９１を有する、請求項１７に記載のワクチン組成物。
20. ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンが弱毒化ＰＲＶを含む、請求項１から１９のいずれかに記載のワクチン組成物。
21. 弱毒化ＰＲＶが、ＴＫ、ＰＫ、ＲＲ、ｄＵＴＰａｓｅ、ｇＧ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＤおよびｇＩからなる群から選択される１つまたは複数の不活化遺伝子を有する、請求項２０に記載のワクチン組成物。
22. 弱毒化ＰＲＶが不活化ｇＥ遺伝子を有する、請求項２１に記載のワクチン組成物。
23. 弱毒化ＰＲＶが微生物寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５０７６を有する、請求項２０から２２のいずれかに記載のワクチン組成物。
24. 本明細書で提供されるワクチン組成物が免疫学的有効量のＰＲＲＳＶワクチン、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンおよび／またはＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンを含む、請求項１から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
25. ＰＲＲＳＶワクチンの免疫学的有効量が少なくとも１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀または１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀であり、
    ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンの免疫学的有効量が少なくとも１０^0.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀（蛍光抗体−ＴＣＩＤ₅₀）、１０^1.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^1.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^2.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^2.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀もしくは１０^5.0ＦＡ−ＴＣＩＤ₅₀または少なくとも２．５ＲＩＤ、３ＲＩＤ、５ＲＩＤ、１０ＲＩＤ、３０ＲＩＤ、１００ＲＩＤ、１５０ＲＩＤ、３００ＲＩＤ、７５０ＲＩＤ、１０００ＲＩＤ、３０００ＲＩＤもしくは７５００ＲＩＤであり、かつ／または
    ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンの免疫学的有効量が少なくとも１０^3.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^3.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.0ＴＣＩＤ₅₀、１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀または１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀である、
    請求項２４に記載のワクチン組成物。
26. ＰＲＲＳＶワクチンとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンのＴＣＩＤ₅₀比が１００００：１から１：１の範囲である、請求項２４または２５に記載のワクチン組成物。
27. ＰＲＲＳＶワクチンとＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンのＴＣＩＤ₅₀比が１：１から１：３０の範囲である、請求項２４または２５に記載のワクチン組成物。
28. ＰＲＲＳＶワクチン：ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチン：ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンのＴＣＩＤ₅₀比が約１０⁴：１：１０⁵から約５：１：６の範囲である、請求項２４または２５に記載のワクチン組成物。
29. アジュバントをさらに含む、請求項１から２８のいずれかに記載のワクチン組成物。
30. 凍結保護物質をさらに含む、請求項１から２９のいずれかに記載のワクチン組成物。
31. 凍結保護物質がショ糖、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよび／またはラクトアルブミン加水分解物を含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
32. 請求項１から３１のいずれかに記載のワクチン組成物を調製するための方法であって、
    （ａ）それぞれの感受性細胞において培養されるＰＲＲＳＶワクチン株、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチン株および／またはＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチン株を回収するステップと、
    （ｂ）適切なＴＣＩＤ₅₀比で２つ以上のウイルス株を混合するステップと
    を含む方法。
33. ＰＲＲＳＶワクチン株についての感受性細胞がＭａｒｃ−１４５、ＭＡ−１０４、ＶｅｒｏおよびＣＬ−２６２１からなる群から選択される細胞株またはＰＡＭ細胞である初代細胞である、請求項３２に記載の方法。
34. ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチン株についての感受性細胞がＢＴ、Ｖｅｒｏ、ＭＰＫ、ＳＫ６、ＰＫ２ａ、ＣＰＫ、ＲＫＣ、ＭＤＢＫ、ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ、ＳＴおよびＰＴからなる群から選択される細胞株またはＢＴ細胞である初代細胞である、請求項３２に記載の方法。
35. ＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチン株についての感受性細胞がＳＴ、ＰＫ−１５、Ｍａｒｃ−１４５、ＭＤＢＫ、ＢＴ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ブタ腎臓細胞株（ＩＢＲＳ−２）、ウサギ腎臓細胞株（ＲＫ）およびニワトリ胚線維芽細胞株からなる群から選択される細胞株またはブタ腎臓初代細胞である初代細胞である、請求項３２に記載の方法。
36. 培養が、各ワクチン株をその感受性細胞に回転ボトル培養中１×１０⁶／ｍｌ〜５×１０⁶／ｍｌの範囲の細胞密度で、またはバイオリアクターに接着担体を導入した懸濁培養中５×１０⁶／ｍｌ〜１×１０⁷／ｍｌの範囲の細胞密度で接種するステップを含む、請求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
37. ＰＲＲＳＶワクチン株が０．０１〜０．５の感染多重度（ＭＯＩ）で接種され、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチン株が０．１〜０．５のＭＯＩで接種され、かつ／またはＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチン株が０．００５〜０．５のＭＯＩで接種される、請求項３６に記載の方法。
38. ステップ（ｂ）が回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルスとＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンウイルスとを１００００：１から１：１のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む、請求項３２から３７のいずれかに記載の方法。
39. ステップ（ｂ）が回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルスとＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンウイルスとを１：１から１：３０のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む、請求項３２から３７のいずれかに記載の方法。
40. ステップ（ｂ）が回収されたＰＲＲＳＶワクチンウイルス、ＣＳＦＶ Ｃ株（Ｆ１６）ワクチンウイルスおよびＰＲＶ Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１ワクチンウイルスを１０⁴：１：１０⁵から約５：１：６のＴＣＩＤ₅₀比で混合するステップを含む、請求項３２から３７のいずれかに記載の方法。
41. ステップ（ｂ）が回収されたウイルス溶液の混合物を凍結保護物質と混合するステップをさらに含む、請求項３２から４０のいずれかに記載の方法。
42. 回収されたウイルス溶液の混合物が凍結保護物質と容量比７５〜８０：２５〜２０で混合される、請求項４１に記載の方法。
43. ブタ繁殖・呼吸障害症候群、ブタコレラおよび／または仮性狂犬病を予防するまたは治療するための薬剤の製造における請求項１から３１のいずれかに記載のワクチン組成物の使用。
44. 請求項１から３１のいずれかに記載のワクチン組成物をブタに投与するステップを含む、ブタを免疫化する方法。