CN104004774A - 一种猪伪狂犬病病毒、疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪伪狂犬病病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。该疫苗组合物能有效诱发抗体产生，通过动物试验检测该疫苗免疫效果，证实能够预防猪伪狂犬强毒株的感染对猪产生有效的保护。

Description

一种猪伪狂犬病病毒、疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种疫苗组合物，属于动物病毒学领域。
背景技术
伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。
研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使机体产生中和抗体，这些抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。“伪狂犬病亚单位疫苗研究进展”(杨承槐，娄高明，谌南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期)公开了在伪狂犬病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体的参与下，gB、gC、gD的单克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗gB、gC、gD的单克隆抗体均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白gD是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒gD蛋白可以制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。
猪PRV只有一个血清型，通常认为毒株的交叉保护力很强，但目前仍存在仔猪注射商品化疫苗后发生典型猪伪狂犬病，例如长时间体温升高，精神沉郁，食欲减退，出现呼吸道和/或神经症状。突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间。现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪伪狂犬病病毒株，该猪伪狂犬病病毒株可用于制备疫苗，通过动物实验证明该疫苗对于猪伪狂犬病具有良好的免疫作用。
本发明提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表SEQ ID NO.1所示的蛋白。
本发明提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表SEQ ID NO.2所示的蛋白。
本发明提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表SEQ ID NO.3所示的蛋白。
“编码序列”在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。
为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码的gD糖蛋白。
本发明术语“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为gp50蛋白。
本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.etal，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
优选地，所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列编码的gB糖蛋白。
优选地，所述的猪伪狂犬病病毒，它具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的gB糖蛋白。
优选地，根据本发明的所述猪伪狂犬病病毒，它具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的gC糖蛋白。
优选地，所述猪伪狂犬病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus，strainHN1201)或其培养物，保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉市·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
所述术语“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代以内的培养物。
本发明的另一个目的是提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪伪狂犬病病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。
优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗或基因工程疫苗。
优选地，本发明的疫苗组合物包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。用于疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列或与其共有98％以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白。
优选地，所述疫苗组合物的猪伪狂犬病病毒为HN1201株或其培养物。
用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有与SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
可选择地，抗原可包含具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其片段共有95％以上核苷酸同源性的gB蛋白。
可选择地，抗原可包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列或其片段共有95％以上核苷酸同源性的gC蛋白。
本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。
所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。例如，表达的猪伪狂犬病病毒的gD或gC蛋白可用于制备亚单位疫苗。
术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。
优选地，所述疫苗组合物包括≥106.0TCID50/ml的猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物灭活疫苗。
优选地，本发明的疫苗组合物可包含每头份106.0TCID50量的猪伪狂犬病病毒。当猪伪狂犬病病毒以少于106.0TCID50的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经济的。
优选地，所述疫苗组合物包括猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物的25～100μg/剂量gD蛋白抗原。
此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。
优选地，所述疫苗组合物进一步包括介质、佐剂、赋形剂。
本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括弗氏的不完全佐剂或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾，但不限于此。在实践中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。
本发明的再一目的是提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括增殖培养所述猪伪狂犬病病毒株HN1201株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀。
具体地，所述方法为：(1)将猪伪狂犬病病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；收获细胞培养物；
(2)用甲醛溶液、BPL(β-丙内酯)或BEI(二乙烯亚胺)处理来自步骤(1)的病毒；
所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪伪狂犬病病毒的易感细胞包括但不限于，ST细胞系(ATCC编号：CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号：CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系(ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号：CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系(如：IBRS-2，见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture：susceptibility of the IB-RS-2swine cell line.Arquivos Instituto Biologica31：63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。
可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)克隆所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白重组基因；(2)表达所述猪伪狂犬病病毒gD重组蛋白；(3)将所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。
本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。
本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬病毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。
本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”可以进一步用于指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成感染后成年猪(体重在50kg以上猪)可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
附图说明
图1为HN1201株gC氨基酸序列与SA215株gC氨基酸序列同源分析结果；
图2为HN1201株gD氨基酸序列与SA215株gD氨基酸序列同源分析结果。
序列表中：
序列1为猪伪狂犬病病毒HN1201株gD氨基酸序列；
序列2为猪伪狂犬病病毒HN1201株gB氨基酸序列；
序列3为猪伪狂犬病病毒HN1201株gC氨基酸序列；
序列4为猪伪狂犬病病毒HN1201株gD核苷酸序列；
序列5为猪伪狂犬病病毒HN1201株gB核苷酸序列；
序列6为猪伪狂犬病病毒HN1201株gC核苷酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
本发明中所述的“TCID50”(50％tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。
MEM液体培养基(液)用购自美国Life Technologies公司的MEM干粉培养基按照其说明书配制。
本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
实施例1、病毒的采集分离
从来自河南的疑似猪伪狂犬感染的样本中分离样本无菌采集猪脑组织，以1∶10(体积比)加入MEM培养液，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min，收集上清液，再经0.2μm滤膜滤器过滤，在PK-15细胞上传代37℃培养1h，换加含2％犊牛血清的MEM培养液，37℃培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2％犊牛血清的MEM培养液。采用猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测猪伪狂犬病病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外源病毒的检测(猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品)，PCR检测结果均为阴性，表明毒种纯净。
将分离到的伪狂犬病毒提交保藏，所述猪伪狂犬病病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
实施例2、分离病毒的遗传特性
通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PK15细胞上分离的猪伪狂犬病病毒基因组DNA做模板，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用Primer Premier5.0来设计用于扩增gB、gC、gD基因的引物序列。
以提取的基因组DNA为模板，制备PCR扩增体系如下：模板DNA100μg，PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，2×PrimerSTARGC Buffer25μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dNTP Mix(2.5mM each)4μl，并用蒸馏水将体积补足50μl。进行两步PCR反应：在98℃变性10sec，然后在68℃退火和延伸(按照1kb/min计算所需时间)，共30个循环。在4℃终止PCR反应。通过在含有溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。PCR产物进行序列测定。用Lasergene软件分析所得到的序列数据。
表1  PCR引物序列
实施例3、病毒的致病性试验
3.1不同日龄仔猪的致病性
将34～35日龄猪伪狂犬病抗体阴性仔猪6头随机分成2组，4头/组(试验组)和2头/组(对照组)，滴鼻接种猪伪狂犬病病毒HN1201株(攻毒剂量为2×108.0TCID50/头)，对照组接种DMEM培养基；同时将4头49日龄仔猪接种保藏后培养3代的强毒HN1201株(攻毒剂量为2×108.0TCID50/头)，仍以35日龄仔猪作为对照。病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表2。
表2  猪伪狂犬强毒HN1201株对不同日龄仔猪的致病性
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201株接种不同日龄的仔猪均可导致仔猪发病，且可导致3/4以上的仔猪死亡。
3.2不同剂量对仔猪的致病性
将49日龄猪伪狂犬抗体阴性仔猪8头随机分成2组，每组4头，另取2头仔猪作为对照。实验组分别滴鼻接种2×107.0TCID50/头和2×108.0TCID50/头猪伪狂犬病病毒HN1201株，对照组接种DMEM培养基。病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表3。
表3  不同剂量猪伪狂犬病病毒HN1201株对仔猪的致病性
结果显示，猪伪狂犬病病毒临床分离HN1201以不同剂量接种49日龄的仔猪，均可导致仔猪发病，且4/4的仔猪死亡。
实施例4、猪伪狂犬病病毒病灭活苗的制备
将按照表4将所分离的毒株的不同代次的培养物接种于PK-15细胞培养物先形成种子批，然后按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PK细胞培养物中，置37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。分别向不同代次病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活后病毒液用PH7.4的PBS液稀释至表4所示的病毒含量然后与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。
表4  各组别猪伪狂犬疫苗的制备
实施例5、灭活疫苗免疫原性实验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪16头随机分成4组，4头/组，按照表4注射疫苗灭活苗组注射实施例4制备的疫苗免疫猪伪狂犬灭活疫苗2ml/头，对照疫苗采用CN101186902方法制备的猪伪狂犬活疫苗SA215株，按照其专利说明书免疫原性测定方法的使用，对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为HN1201株猪伪狂犬病病毒2×108.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况(结果见表5)
表5  免疫原性试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
灭活苗A 实施例4制备的疫苗组别A 2ml/头
灭活苗B 实施例4制备的疫苗组别B 2ml/头
活疫苗SA215 猪伪狂犬病病毒活疫苗 106.0TCID50/头
对照组 DMEM培养基 2ml/头
疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，结果见表6。
表6  猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况
表6的结果显示，猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后，能产生较高的中和抗体，且随免疫时间逐渐升高。
免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株猪伪狂犬病病毒2×108.0TCID50/头，观察临床症状和死亡情况见表7，攻毒后每日测定仔猪体温见表8。
表7  猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况
表8  猪伪狂犬疫苗免疫的仔猪攻毒后仔猪体温变化
天数 灭活苗A组 灭活苗B组 活疫苗组
攻毒后1天 39.5 39.6 39.4
攻毒后2天 41.2 41.6 41.8
攻毒后3天 40.5 40.3 41.2
攻毒后4天 40.2 39.7 41.6
攻毒后5天 39.7 39.5 41.4
攻毒后6天 39.6 39.4 41.3
攻毒后7天 39.7 39.5 41.4
攻毒后8天 39.5 39.7 41.2
攻毒后9天 39.6 39.4 41.5
攻毒后10天 39.2 39.5 40.6
攻毒后11天 39.5 39.7 39.7
攻毒后12天 39.4 39.5 39.8
攻毒后13天 39.3 39.4 39.7
攻毒后14天 39.2 39.1 39.4
表7和表8的结果显示，猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染(出现临床症状)，但能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，因此，猪伪狂犬灭活疫苗具有很好的保护力。另外相对于对照组活疫苗，灭活疫苗免疫组的仔猪体温升高时间更短，食欲基本正常，并且基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。
实施例6、猪伪狂犬gD蛋白的制备
1.PRV gD基因的扩增
在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒或其不同代次的培养物(猪伪狂犬病病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus，strainHN1201)，保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日)，该不同代次的培养物为5-35代以内的培养物，收获病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA作为模板，利用gD特异性引物：
gDSF:5′ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC3′和
gDSR:5′CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3′
进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶HS DNAPolymerase with GC Buffer，扩增条件为：94℃3min；94℃30s，68℃90s，30cycles；72℃5min。PCR产物命名为gD。其核苷酸序列见SEQNO.4，推导其氨基酸序列为SEQNO.1。
2.重组Bacmid的获取及鉴定
将高保真酶扩增获得的PCR产物gD克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体(购自Invitrogen公司，货号A11339)，克隆体系如下：PCR产物gD4μl，Salt solution(盐溶液)1μl，TOPO vector1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5min，转化One ShotR Mach1TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆鉴定gD基因的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gD序列的正确性。测序正确的质粒命名为pFastBac/HBM-TOPO-gD。
pFastBac/HBM-TOPO-gD质粒转化DH10Bac感受态细胞(来源)，pFastBac/HBM-TOPO-gD和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得的重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鉴定gD的插入，阳性Bacmid命名为Bacmid-gD。
3.转染获得重组杆状病毒
按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted ExpressionSystem的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×105个sf9细胞，待细胞贴壁后按照CellfectinⅡ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μlCellfectinⅡ和1μg Bacmid-gD DNA到100ul SF-900Ⅱ培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的CellfectinⅡ(总体积～210μl),混合均匀室温孵育15～30min，一滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gD。P0代重组病毒vBac-gD感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gD用于重组蛋白表达。
4.重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白
将P3代重组杆状病毒vBac-gD接种High-five细胞(购自Invitrogen，货号B85502)。在500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×105cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。利用Millipore的切向流过滤系统将体积浓缩为原来体积的1/10。用1％(体积比)的Triton X-100(购自sigma)灭活杆状病毒，SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为200μg/ml。
实施例7、猪伪狂犬给gD亚单位疫苗的制备
将实施例6制备的亚单位抗原，用PBS液(pH7.4)稀释至表9的体积与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。
表9  各组别猪伪狂亚单位疫苗的制备
组别 蛋白含量 疫苗配比(灭活病毒液：206佐剂)
A 25μg/ml 54:46
B 100μg/ml 54:46
实施例8、疫苗对猪的免疫原性实验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪12头随机分成3组，4头/组，按照表2注射实施例2制备的疫苗，免疫猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗2ml/头。对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×108.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况(结果见表10)。
表10  免疫原性试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
亚单位疫苗A 实施例2制备的疫苗组别A 2ml/头
亚单位疫苗B 实施例2制备的疫苗组别B 2ml/头
对照组 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×108.0TCID50/头，观察临床症状和死亡情况见表11，攻毒后每日测定仔猪体温见表12。
表11  猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒情况
表12  猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫的仔猪攻毒后仔猪体温变化
天数 灭活苗A组 灭活苗B组
攻毒后1天 39.5 39.5
攻毒后2天 41.2 41.6
攻毒后3天 40.3 40.2
攻毒后4天 40.1 39.7
攻毒后5天 39.6 39.5
攻毒后6天 39.6 39.3
攻毒后7天 39.6 39.5
攻毒后8天 39.5 39.4
攻毒后9天 39.5 39.6
攻毒后10天 39.2 39.3
攻毒后11天 39.3 39.4
攻毒后12天 39.4 39.4
攻毒后13天 39.2 39.4
攻毒后14天 39.2 39.1
表11和表12的结果显示，猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染(出现临床症状)，但能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，显示出很好的免疫保护。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表SEQ IDNO.1所示的蛋白。
2.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表SEQ IDNO.2所示的蛋白。
3.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表SEQ IDNO.3所示的蛋白。
4.一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码的gD糖蛋白。
5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列编码的gB糖蛋白。
6.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株为HN1201株或其培养物，保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
7.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求4～6任一项所述的猪伪狂犬病病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗；优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。
8.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求5所述的猪伪狂犬病病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗；优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括≥106.0TCID50/ml的猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物灭活疫苗。
10.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物的25～100μg/剂量gD蛋白抗原。
11.根据权利要求7～10任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括介质、佐剂、赋形剂。
12.一种制备权利要求8所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括增殖培养所述猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培养物，灭活，加入佐剂，搅拌均匀。
13.一种制备权利要求8所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：
(1)克隆所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白重组基因；
(2)表达所述猪伪狂犬病病毒gD重组蛋白；
(3)将所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。
14.根据权利要求7～10任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。
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