CN100438919C - 一种核酸疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸疫苗及其应用，其目的是提供一种既可防病，又能促生长的核酸疫苗及用该核酸疫苗来提高动物抗病能力和/或生长速度的方法。本发明的核酸疫苗，是包括生长激素抑制素基因和病原体基因的真核表达载体。其中，所述病原体基因为猪繁殖与呼吸综合征病毒的囊膜糖蛋白基因或伪狂犬病毒的糖蛋白基因。本发明的核酸疫苗可增加家畜体内对病源和生长激素抑制素的中和抗体，提高家畜抗病能力及生长速度，提高了饲料利用效率，降低了动物生产成本。

Description

一种核酸疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及一种核酸疫苗及其应用，特别涉及一种核酸疫苗及用该核酸疫苗来提高动物抗病能力和/或生长速度的方法。

背景技术

自从Wolff J.A.第一次证实了肌肉注射的质粒DNA载体可被骨骼肌肉细胞吸收，并在体内表达数月(Wolff JA，Malone RW et al.Direct gene transfer into mousemuscle in vivo，Science 1990，247：1465-1468)，基于骨骼肌的基因治疗法的前景一直很乐观。这种可被分泌到循环系统到达极端靶位点，由骨骼肌产生的重组蛋白非常适用于治疗因血清蛋白不足而引起的疾病，或引起中和病毒或病原体的抗体。

用灭活疫苗来刺激抗体中和猪繁殖与呼吸综合征病毒和伪狂犬病毒的产品已有报导。现有的抗猪繁殖与呼吸综合征疫苗如Merial公司的Progressis PRRS和Intervet公司的Porcilis PRRS疫苗均为灭活疫苗，只有约六到七成的防病能力，功能有待改进。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)包含3个主要结构蛋白，24.5-26KDa囊膜糖蛋白(GP5)，18-19KDa的膜(M)蛋白和15KDa核衣壳(N)蛋白，分别由ORFs5、6、7编码(Meulenberg JJ，Petersen-den Besten A，De Kluyver EP，Moormann RJ，Schaaper WM，Wensvoort G.Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to7 of Lelystad virus.Virology.1995，10；206(1)：155-63；Dea，S.，Gagnon，C.A.，Mardassi，H.，Pirzadeh，B.，Rogan，D.Current knowledge on the structuralproteins of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus：comparison of the North American and European isolates.Arch Virol.2000，145(4)，659-688)。其中，GP5在免疫反应中起重要作用，含有与病毒中和作用相关的大多数表位，并且GP5与抗原变异、细胞凋亡及抗体依赖增强作用密切相关。

因此，PRRSV ORF5被认为是亚单位疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗的首要候选基因。Pirzadeh等人报道，用编码GP5的质粒DNA免疫BALB/c鼠和猪，诱导了特异性的中和抗体和细胞免疫反应，强毒攻击后，与未免疫猪相比，免疫猪未出现明显的病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻(Pirzadeh B，Dea S.Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcinereproductive and respiratory syndrome virus.J Gen Virol.1998；79(Pt5)：989-99)。

Bastos RG等人报道，表达截短GP5的重组BCG免疫BALB/c鼠诱导了特异性中和抗体和TH1型细胞免疫应答(Bastos RG，Dellagostin OA，Barletta RG，Doster AR，Nelson E，Osorio FA.Construction and immunogenicity of recombinantMycobacterium bovis BCG expressing GP5 and M protein of porcine reproductiverespiratory syndrome virus.Vaccine.2002 22；21(1-2)：21-9)。

糖蛋白gD(glycoprotein D gp50)是伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)主要结构蛋白之一，位于PRV囊膜表面，参与病毒的吸附和穿透过程(Rauh I，Mettenleiter TC.Pseudorabies virus glycoproteins gII and gp50 are essentialfor virus penetration.J Virol.1991；65(10)：5348-56；Peeters B，Pol J，Gielkens A，Moormann R.Envelope glycoprotein gp50 of pseudorabies virus isessential for virus entry but is not required for viral spread in mice.J Virol.1993；67(1)：170-7)。gD同时也是一种重要的免疫原性蛋白，能诱导机体产生中和抗体(Eloit M，Fargeaud D，L’Haridon R，Toma B.Identification of the pseudorabiesvirus glycoprotein gp50 as a major target of neutralizing antibodies.ArchVirol.1988；99(1-2)：45-56)。

Riviere及Hammond等人报道，含有gD基因的重组痘苗病毒或腺病毒(RiviereM，Tartaglia J，Perkus ME，Norton EK，Bongermino CM，Lacoste F，Duret C，Desmettre P，Paoletti E.Protection of mice and swine from pseudorabies virusconferred by vaccinia virus-based recombinants.J Virol.1992；66(6)：3424-34；Hammond JM，Jansen ES，Morrissy CJ，van der Heide B，Goff WV，Williamson MM，Hooper PT，Babiuk LA，Tikoo SK，Johnson MA.Vaccination of pigs with arecombinant porcine adenovirus expressing the gD gene from pseudorabiesvirus.Vaccine.2001，14；19(27)：3752-8)及Haagmans等人报道，编码gD基因的质粒DNA都对免疫猪产生了保护作用(Haagmans BL，van Rooij EM，Dubelaar M，KimmanTG，Horzinek MC，Schijns VE，Bianchi AT.Vaccination of pigs againstpseudorabies virus with plasmid DNA encoding glycoprotein D，Vaccine.1999，5；17(9-10)：1264-71)。

利用抗体中和家畜体内的生长激素抑制素(somatostatin或SS)的报导有杜念兴等构建的SS与乙肝表面抗原融合的疫苗病毒活载体疫苗(激生1号)，可促进动物的生长，但其免疫期只有约3个月，而且该疫苗不适于加强免疫(杜念兴，杨宏，吉传义等，生长抑素基因工程活载体疫苗田间试验总结初报。畜牧与兽医，2001，33(2)，23-24)。刘永庆等利用大肠杆菌表达的SS融合蛋白与氟氏不完全佐剂混合免疫动物，有一定的促生长作用，但对仔猪的作用并不明显(刘永庆，陈溥言，赵国平，重组生长抑素(SS)大肠杆菌疫苗促进动物生长的效果。中国生物制品学杂志，2002，15(3)，147-150)。Mears报导对SS的免疫可提高绵羊的生长速度，(Mears G J.，Immunization of lambs against somatostatin improve growth rate.Can.J.Anim，Science 1990，70：1091-1097)。Dawson等亦报导对SS的免疫可影响幼鹿的生长(Dawson JM，Soar JB，Buttery PJ et al.，The effect of immunization againstsomatostatin and β-agonist administration alone and in combination on growthcarcass composition in young steers，Anim.Sci.1997，64：37-51)。

发明内容

本发明的目的是提供一种既可防病，又能促生长的核酸疫苗。

本发明所提供的核酸疫苗，是包括生长激素抑制素(SS)基因和病原体基因的真核表达载体。

其中，所述SS基因和病原体基因是种特异性的。

所述病原体基因可为猪繁殖与呼吸综合征病毒的囊膜糖蛋白(GP5)基因或伪狂犬病毒糖蛋白(gD)基因。

所述SS基因是具有序列表中序列1的核苷酸序列或与序列表中序列1的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与所述生长激素抑制素具有相同活性的蛋白质的核苷酸序列。上述SS基因可以是天然的，也可以是人工合成的。

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因具有序列表中序列2的核苷酸序列或与序列表中序列2的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5具有相同活性的蛋白质的核苷酸序列。上述猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因可以是天然的，也可以是人工合成的。

所述伪狂犬病毒gD基因具有序列表中序列3的核苷酸序列或与序列表中序列3的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与所述伪狂犬病毒gD具有相同活性的蛋白质的核苷酸序列。上述伪狂犬病毒gD基因可以是天然的，也可以是人工合成的。

序列表中序列1由448个碱基组成的SS基因序列，序列2由603个碱基组成的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因序列，序列3由1203个碱基组成的伪狂犬病毒gD基因序列。

所述真核表达载体的启动子为β-actin启动子。所述β-actin启动子为β-actin启动子全序列或其功能区域。

用于构建所述真核表达载体的出发载体可为pISGRTK3，含有β-actin启动子和CpG基序。

所述核酸疫苗优选为pISG-SS/GP5和/或pISG-GP5/SS和/或pISG-SS/gD和/或pISG-gD/SS。

所述核酸疫苗可通过肌肉注射的方式免疫动物，为提高肌体的免疫应答，也可通过后腿肌肉注射和腹股沟浅表淋巴结注射联合应用方式免疫动物。

本发明的第二个目的是提供一种提高动物抗病能力和/或生长速度的方法。

本发明所提供的提高动物抗病能力和/或生长速度的方法，是用上述核酸疫苗免疫动物。

实验证明本发明的核酸疫苗可使家畜产生针对病原和生长激素抑制素的中和抗体，提高家畜抗病能力及生长速度，提高了饲料利用效率，降低了动物生产成本。

附图说明

图1为Western blotting检测核酸疫苗免疫小鼠和猪的抗GP5的抗体应答图谱

图2a为用ELISA检测免疫鼠血清中抗GP5抗体的柱状图

图2b为用ELISA检测免疫猪血清中抗GP5抗体曲线

图3a为用ELISA检测免疫鼠血清中抗gD抗体的柱状图

图3b为用ELISA检测免疫猪血清中抗gD抗体的曲线图

图4为GP5核酸疫苗免疫后猪的体重变化曲线

图5为GP5核酸疫苗免疫后不同时间猪的增重柱状图

图6为pISGRTK3的物理图谱

具体实施方式

实施例1、构建生长素抑制素SS和猪繁殖与呼吸综合征病毒的囊膜糖蛋白GP5二联体载体及伪狂犬病毒的SD蛋白与SS的二联载体

从3周龄仔猪前腔静脉采血，用白细胞分离液(中国医学科学院血液病研究所)分离猪外周血单核细胞并提取细胞基因组。以猪外周血单核细胞基因组为模板，在如下两对引物：5’-aag aat tct cca tgg aac tgg cca agt act tct t-3’和5’-tttgcg aat tcg ggg tgc cat gg-3’以及5’-aaa cta gtc agg aac tgg cca ag-3’和5’-caa cac tag tta ata aag cta aca gg-3’的引导下PCR扩增猪生长抑素基因，得到的扩增产物分别命名为SS180(两端含有EcoR I位点)、SS237(两端含有Spe I位点)。SS180和SS237分别与pMD18-T(大连宝生物工程公司)载体连接，命名为pT-SS180、pT-SS237。经测序确定正确后用于下面实验。

以猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA为模板，用引物5’-ttg ccc ggg aat tcatgt tgg gga aat gct tg-3’(5’端加入EcoR I)和5’-cgc ctc gag cac ctt ttgtgg atc cgt gct at-3’(扩增片段内部有Xba I酶切位点)扩增GP5基因，用引物5’-aag aat tca cca tgg tgg gga aat gct tga c-3’和5’-aaa cta gtg tag agacga ccc cat tg-3’(两端加入EcoR I和Spe I酶切位点，并突变了终止密码子)扩增ΔGP5基因片段。GP5基因的核苷酸序列如序列2所示。用EcoR I和Xba I消化GP5基因扩增产物，回收约600bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体(图6，香港LeaderGene公司提供)，质粒命名为pISG-GP5。用EcoR I分别消化pT-SS180和pISG-GP5，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，构建的质粒命名为pISG-SS/GP5。用EcoR I和Spe I消化ΔGP5基因扩增片段与pISGRTK3载体，回收约600bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体(图6)，命名为pISG-ΔGP5。Spe I分别消化pT-SS237和pISG-ΔGP5，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，构建的质粒命名为pISG-GP5/SS。

以PRV基因组DNA为模板，用引物5’-ggg gcc ccg aat tcc cat aca ctc acc-3’和5’-cgc cac tag tat cat cga cgc cgg tac-3’(5’端加入EcoR I和Spe I酶切位点)以及5’-ctg aat tca cca tgg tgc tcg cag cgc tat tg-3’和5’-gac tagtgt acg gac cgg gct gcg ctt t-3’(5’端加入EcoR I和Spe I酶切位点，并突变了终止密码子)分别经PCR扩增gD基因(其序列如序列3所示)和ΔgD基因片段。用EcoR I和Spe I消化gD基因扩增产物，回收约1200bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体(图6)，质粒命名为pISG-gD。用EcoR I分别消化pT-SS180和pISG-gD，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，构建的质粒命名为pISG-SS/gD。用EcoR I和Spe I消化ΔgD基因扩增片段与pISGRTK3载体，回收约1200bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体(图6)，命名为pISG-ΔgD。Spe I分别消化pT-SS237和pISG-ΔgD，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，构建的质粒命名为pISG-gD/SS。

将上述质粒分别转化到大肠杆菌菌株DH5α中，然后用含有150μg/ml氨苄青霉素的LB培养基进行培养。当培养至稳定期后，收集细菌，并用经典碱溶解法溶解细胞。离心回收质粒，然后通过质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)，将其它细胞DNA，RNA和蛋白质污染物分离，通过在260和280nm的吸收值来检测纯度。通过琼脂糖凝胶电泳测纯化质粒DNA的完整性。最后，通过限制酶消化和DNA测序确定同一性，得到序列正确的质粒pISG-SS/GP5、pISG-GP5/SS、pISG-SS/gD和pISG-gD/SS。

将质粒DNA pISG-SS/GP5、pISG-GP5/SS、pISG-SS/gD和pISG-gD/SS沉淀再溶于无热原的磷酸盐缓冲液(PBS)中，通过测量在260nm的吸收值来计算浓度，可用于动物注射。

实施例2、动物实验

为了检测SS与GP5或gD融合基因质粒DNA的构建体是否能产生中和病毒的抗体，进行了以小鼠和猪为免疫动物的动物实验。

免疫小鼠的具体步骤为：选取3周龄的雌性BALB/c鼠30只，饲养1周确认健康后，随机分为6组，每组5只。分组后，平均体重组间无差异(P＞0.05)，将6组鼠随机定为1、2、3、4、5、6组，分别免疫pISG-SS/GP5、pISG-GP5/SS、pISG-SS/gD、pISG-gD/SS、pISGRTK3空载体质粒DNA和生理盐水。第1-5组以100μg/只的剂量后腿肌肉注射相应的质粒DNA，第6组注射等体积的0.9％生理盐水。隔两周免疫1次，共免3次。每次免疫前分别从尾尖采血，3次免疫后，每周采血、称重1次直至第8周试验结束。

免疫猪的具体步骤为：选择1月龄左右健康断奶仔猪20头，经血清学检测无抗PRRSV和PRV抗体。随机分成5组，每组4头。分组后，平均体重组间无差异(P＞0.05)，分别免疫pISG-SS/GP5、pISG-GP5/SS、pISG-SS/gD、pISG-gD/SS和pISGRTK3空载体质粒DNA。每头猪于后腿肌肉和腹股沟浅表淋巴结分别注射500μg/2000μl和100μg/400μl的相应质粒DNA。间隔3周免疫1次，共免疫3次。第一次免疫为0周，从0周开始，每周定期在上午采食前采血、称重至第19周试验结束。

抗GP5抗体用间接ELISA和Western blotting(WB)检测。间接ELISA按文献(Albina E，Leforban Y，Baron T，Plana Duran JP，Vannier P.An enzyme linkedimmunosorbent assay(ELISA)for the detection of antibodies to the porcinereproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus.Ann Rech Vet.1992；23(2)：167-76)介绍的方法进行。用纯化的大肠杆菌表达的GP5蛋白经pH值9.6的包被液稀释包被96孔板，检测血清100倍稀释，二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗猪IgG。WB按(Gershoni，J.M.(1988)Protein blotting：a manual.Meth.Biochem.Anal.33，1-58)介绍的方法进行，抗原用大肠杆菌表达的GP5蛋白与GST的融合蛋白即重组GST-GP5蛋白(将此表达的蛋白经过SDS-PAGE电泳，含目的片段胶切下回收，研磨后用PBS溶解，溶解物经12000rpm 4℃离心，收取上清即为纯化后的蛋白)；并以GST蛋白作为对照抗原。

抗gD抗体用间接ELISA检测。按文献(Prud’homme I，Zhou EM，Traykova M，Trotter H，Chan M，Afshar A，Harding MJ.Production of a baculovirus-derivedgp50 protein and utilization in a competitive enzyme-linked immunosorbentassay for the serodiagnosis of pseudorabies virus.Can J Vet Res.1997Oct；61(4)：286-91)介绍的方法进行，检测抗原为超离纯化的伪狂犬病毒。

鼠和猪抗GP5的抗体反应结果表明pISG-SS/GP5组检测到抗GP5的弱阳性ELISA抗体(图2a和图2b)，抗GP5的WB抗体更明显(图1)；pISG-GP5/SS组抗GP5的ELISA抗体、WB抗体都不明显。图1中，泳道1表示免疫鼠的检测结果，泳道2表示免疫猪的检测结果，泳道1，2用的是重组GST-GP5蛋白抗原，泳道3表示对照GST蛋白抗原。图2b中，三个箭头代表三次免疫时间，每两次免疫之间间隔3周，即0周、3周、6周。后面的8、10、12、…代表第1次免疫后周数。

鼠和猪抗gD的抗体反应结果表明pISG-SS/gD组检测到抗gD的ELISA抗体；在猪的试验中，在最后一次免疫后3-4周抗体滴度达到峰值，并持续到免疫后第14周至试验结束(图3a和图3b)；pISG-gD/SS组抗gD的ELISA抗体不明显。

实施例3、检测本发明的核酸疫苗提高猪的增重能力

本实施例使用猪购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验牧场，选择1月龄左右健康断奶仔猪20头，经血清学检测无抗PRRSV和PRV抗体。选择同日龄体重接近的5头猪为一个重复，共设4个重复。每个重复随机选择1头分为1组，每组4头，共5组。分组后，平均体重组间无差异(P＞0.05)，则将5组猪随机定为1、2、3、4、5组，分别免疫pISG-SS/GP5、pISG-GP5/SS、pISG-SS/gD、pISG-gD/SS、pISGRTK3空载体质粒DNA。1-5组每只猪于后腿肌肉和腹股沟浅表淋巴结分别注射500μg/2000μl和100μg/400μl的相应质粒DNA。间隔3周免疫1次，共免疫3次。第一次免疫为0周，从0周开始，每周定期在上午采食前采血、称重至第19周试验结束。

pISG-SS/GP5组的体重结果如图4和图5所示，表明pISG-SS/GP5组在首免后第15周比对照组增重4.3％，至第19周比对照组增重11％(图5)；在3免后第6周，猪的增重明显高于对照组(图4)。图4中，三个箭头代表三次免疫时间，每两次免疫之间间隔3周，即0周、3周和6周。

pISG-GP5/SS组在首免后第10周比对照组增重6.6％，至第19周比对照组增重3.2％。

pISG-SS/gD组在试验前期，pISG-SS/gD组猪的生长甚至低于对照组，这可能是由于pISG-SS/gD组猪初始重低于对照组所致。但从猪的生长趋势来看，从首免后第15周始免疫猪的增长明显快于对照组。

pISG-gD/SS组在试验前期(0-14周)，与对照组比，免疫猪增重并不明显。但从首免后第14周始免疫猪的增重显着高于对照组。至第19周试验结束比对照组增重7.5％。

序列表

<160>3

<210>1

<211>448

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>1

ttataacaac agncctgttt ttatatcctt aacctatttt aagcatttca caaagtgcac     60

atagaaaatt gggggttgga tgtgattaaa tctgtttttt aaaccaagct tttccatttc    120

tttttcacta tcctcattct catccccctc cccctcccat tccacacagg aactggccaa    180

gtacttcttg gcggagctgc tgtctgaacc caaccagaca gagaacgatg ccctggagcc    240

tgaagatttg tcccaggctg ctgagcagga tgaaatgagg ctggagctgc agagatcagc    300

taactcaaac ccggccatgg caccccgaga acgcaaagct ggctgcaaga atttcttctg    360

gaagactttc acatcctgtt agctttatta attattgttg tccatataag acctccaatt    420

cctctcctcc acaccccatc tctcttcc                                       448

<210>2

<211>603

<212>DNA

<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus)

<400>2

atgttgggga aatgcttgac cacgggctgt tgctcgcgat tgctttcttt gtggtgtatc     60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgtcaac gccaacagca acagcagctc tcattttcag    120

ttgatttata acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctggc taacaaattt    180

gactgggcag tggagacttt tgtcatcttt cccgtgttga ctcacattgt ttcctatggg    240

gcactcacca ccagccattt ccttgacaca gttggtctgg tcactgtgtc caccgccggg    300

ttttatcacg ggcggtatgt cttgagtagc atctacgcgg tctgtgctct ggctgcgttg    360

atttgcttcg tcattaggct tgcgaagaac tgcatgtcct ggcgctactc ttgtaccaga    420

tataccaact tccttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcccgttatt    480

gtagagaaag ggggtaaggt tgaggtcgag ggtcacctga tcgacctcaa aagagttgtg    540

cttgatggtt ccgtggcaac ccctttaacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtctc    600

tag                                                                  603

<210>3

<211>1203

<212>DNA

<213>伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400>3

atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg     60

gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcgtacc cgtacaccga gtcgtggcag    120

ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc    180

ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg    240

ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc    300

atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg    360

cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac    420

tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggctccggg gcggttcaac    480

gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg    540

gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac    600

aagttcggcg cgtgctggaa cgacgagagc ttcaggcggg gcgtggacgt gatgcgattc    660

ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag    720

aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg    780

cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg ccccggcccc ggccccggcc gaagcccgag    840

cccgccccgg tgacgcccgc gccccccggc cgcctgcccg agccggcgac gcgggaccac    900

gccgccgggg gccaccccac gccgcgaccc ccgaggcccg agacgccgca ccgccccttc    960

gccccgccgg ccgtcgtgcc cagcgggtgg ccgcagcccg cggagccgtt ccagccgcgg   1020

acccccgccg cgccgggcgt ctcgcgccac cgctcggtga tcgtcggcac gggcaccgcg   1080

atgggcgcgc tcctggtggg cgtgtgcgtc tacatcttct tccgcctgag gggggcgaag   1140

gggtatcgcc tcctgggcgg tcccgcggac accgacgagc taaaagcgca gcccggtccg   1200

tag                                                                 1203

Claims (5)

1、一种核酸疫苗，是包括生长激素抑制素基因和病原体基因的真核表达载体；所述病原体基因为猪繁殖与呼吸综合征病毒的囊膜糖蛋白基因或伪狂犬病毒的糖蛋白基因。

2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述生长激素抑制素基因的核苷酸序列是序列表中的序列1；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的囊膜糖蛋白基因的核苷酸序列是序列表中的序列2；所述伪狂犬病毒的糖蛋白基因的核苷酸序列是序列表中的序列3。

3、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述真核表达载体的启动子为β-肌动蛋白启动子。

4、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：用于构建所述真核表达载体的出发载体为pISGRTK3。

5、根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述核酸疫苗为pISG-SS/GP5和/或pISG-GP5/SS和/或pISG-SS/gD和/或pISG-gD/SS；

所述pISG-SS/GP5和/或pISG-GP5/SS和/或pISG-SS/gD和/或pISG-gD/SS按照包括下述步骤的方法制备：

1)以猪外周血单核细胞基因组为模板，在如下两对引物：5’-aag aattct cca tgg aac tgg cca agt act tct t-3’和5’-ttt gcg aat tcg gggtgc cat gg-3’以及5’-aaa cta gtc agg aac tgg cca ag-3’和5’-caacac tag tta ata aag cta aca gg-3’的引导下PCR扩增猪生长抑素基因，得到的扩增产物分别命名为SS180、SS237；SS180和SS237分别与pMD18-T载体连接，得到pT-SS180、pT-SS237；

2)以猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA为模板，用引物5’-ttgccc ggg aat tca tgt tgg gga aat gct tg-3’和5’-cgc ctc gag cac cttttg tgg atc cgt gct at-3’扩增GP5基因，用引物5’-aag aat tca ccatgg tgg gga aat gct tga c-3’和5’-aaa cta gtg tag aga cga ccc cattg-3’扩增ΔGP5基因片段；用EcoR I和Xba I消化GP5基因扩增产物，回收约600bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体得到pISG-GP5；用EcoR I分别消化pT-SS180和pISG-GP5，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，得到pISG-SS/GP5；用EcoR I和Spe I消化ΔGP5基因扩增片段与pISGRTK3载体，回收约600bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体得到pISG-ΔGP5；Spe I分别消化pT-SS237和pISG-ΔGP5，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，得到pISG-GP5/SS；

3)以伪狂犬病毒基因组DNA为模板，用引物5’-ggg gcc ccg aat tcccat aca ctc acc-3’和5’-cgc cac tag tat cat cga cgc cgg tac-3’以及5’-ctg aat tca cca tgg tgc tcg cag cgc tat tg-3’和5’-gactag tgt acg gac cgg gct gcg ctt t-3’分别经PCR扩增gD基因和ΔgD基因片段；用EcoR I和Spe I消化gD基因扩增产物，回收约1200bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体，得到pISG-gD；用EcoR I分别消化pT-SS180和pISG-gD，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，得到pISG-SS/gD；用EcoR I和Spe I消化ΔgD基因扩增片段与pISGRTK3载体，回收约1200bp的片段，连接于相同酶处理的pISGRTK3载体得到pISG-ΔgD；Spe I分别消化pT-SS237和pISG-ΔgD，回收约180bp的SS片段和约5580bp的载体片段进行连接，得到pISG-gD/SS。

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