JP6505593B2 - 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン - Google Patents
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Description
したがって、異なる疾患に対して同時に免疫化するための多価組換型ヘルペスウイルス(すなわち、少なくとも2つの異なる抗原遺伝子を有する)が特に研究されるであろう。しかしながら、これまでのところ、複数の外来遺伝子を発現する組換型HVT(rHVT)は不安定であり、外来遺伝子の全て又は一部は、培養細胞において繰り返し継代している間に削除されるということが分かっている。それゆえ、このような不安定な多価ウイルスベクターを効率的なワクチンとして使用することはできない。
本発明の文脈において、配列に関する「再構成」又は「組換型」という用語は、天然に存在しない、及び/又は組換型DNA技術(遺伝子クローン化又は分子クローン化とも称される)を用いて作成された配列、核酸、又は単位を指す。
本発明において使用されるウイルスは、一般的には、鳥ヘルペスウイルスの属に属するウイルスである。
本発明の目的は、継代を通して向上した安定性を有する、少なくとも2つの疾患に対して鳥類を免疫化するために適した組換型鳥ヘルペスウイルスに関する。特定の挿入部位は、発明者らによって同定され、これらは、組み合せによって、外来抗原遺伝子に向上した安定性をもたらす。
例えば、FC126全ゲノム(GenBank:AF291866.1)を参照すると、UL44とUL45との間に位置する領域はHVTゲノムのヌクレオチド94243−94683に対応し、UL45とUL46との間に位置する領域はHVTゲノムのヌクレオチド95323−95443に対応し、US10とSORF3との間に位置する領域はHVTゲノムのヌクレオチド138688−138825に対応し、SORF3とUS2との間に位置する領域はHVTゲノムのヌクレオチド139867−140064に対応する。
遺伝子クローニング及びプラスミド構造は、当業者に周知であり、標準的な分子生物学技術(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Woodbury, N.Y. 2001)によって実質的に実施されてもよい。
本発明のウイルスゲノムの非翻訳領域の1つに外来遺伝子を挿入するための1つの可能性としては、目標非翻訳領域を含む配列をプラスミドに、又は他の適切なベクターにまずクローン化することである。本発明によると、このような配列は、UL44とUL45との間に位置する領域の配列、UL45とUL46との間に位置する領域の配列、US10とSORF3との間に位置する領域の配列、及びSORF3とUS2との間に位置する領域の配列から選択される。
ウイルスへの挿入のための前記ヌクレオチド及びプロモーター配列は、プラスミドにおけるウイルスゲノムの挿入領域へさらに挿入される。
上記のようにして得られた非翻訳領域に少なくとも1つのヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドは、電気穿孔法、カルシウムリン酸塩、リポフェクチンベースの方法などによって、HVT感染細胞又はHVTゲノムトランスフェクト細胞に導入されてもよい。導入されるプラスミドの量が、0.1μg〜1000μgの範囲である場合、HVT−DNA及びプラスミドの同種領域の間の再結合により、組換型ウイルスの生成の効率が細胞において高まる。
本発明の多価組換型ヘルペスウイルスは、同じ細胞培養において、プラスミド及び組換型ヘルペスウイルスを同時トランスフェクトすることによって取得されてもよい。なお、プラスミドは、上述のとおり、外来ヌクレオチド配列が統合された挿入部位配列を含み、組換型ヘルペスウイルスは、上述のとおり、外来ヌクレオチド配列を有していない同じ挿入部位と、別個の外来ヌクレオチド配列が統合された第2挿入部位とを含む。この同時トランスフェクションにより、プラスミドDNAがウイルスゲノムに再結合することになる。
本発明の目的は、少なくとも2つの外来ヌクレオチド配列を提供する多価組換型ヘルペスウイルスを提案することであり、各外来ヌクレオチド配列は、鳥細胞において対応する抗原ペプチドをコードし且つ発現するための適した方法で特定の挿入部位に挿入されている。
本発明により生じる組換型ウイルスは、前記組換型ウイルスが繁殖し且つ成長することのできる細胞培養物において繁殖されてもよい。ウイルスの必要な成長が行われた後、細胞は、スクレーパーを用いて、又はトリプシンによってウェルから剥離されてもよく、感染細胞は、遠心沈殿法によって上澄液から分離されてもよい。
本発明は、家禽などの鳥類を免疫化するための、有効免疫量の本発明の多価組換型鳥ヘルペスウイルスを含む多価ワクチンにも関する。
実験において、以下のように(HVT/第1挿入部位−第1外来遺伝子/第2挿入部位−第2外来遺伝子)指定される、(一価又は本発明の多価の)複数の組換型ヘルペスウイルスを使用した:
FW122: HVT/45−46 Hcmv VP2 Bac F
FW123: HVT/44−45 Bac VP2、
FW125: HVT/45−46 Bac F/44−45 Hcmv VP2
FW129: HVT/45−46 PecF/44−45 Rsv VP2
FW130: HVT/45−46 PecF/44−45 SV40 VP2
FW135: HVT/45−46 sv40 F/44−45 Bac VP2
FW137: HVT/45−46 PecF sv40 VP2
FW141: HVT/45−46 PecF/44−45 Mcmv ie1VP2
FW142: HVT/45−46 Bac VP2/44−45 Mcmv ie1 F
FW144: HVT/45−46 PecF/87−88 Mcmvie1VP2
FW145: HVT/45−46 Bac VP2/87−88 Mcmv ie1 F
FW023: HVT/45−46 Bac VP2
FW029: HVT/45−46 PecF
実験1:相同性ベクターの作成
プラスミド作成を、標準的な分子生物学技術(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)によって実質的に行った。DNA制限断片を、アガロースゲルにおいて電気泳動し、Plasmidplus Midi Kit(QIAGEN社、Cat#12945)を用いて精製した。
MDV血清1型のgC相同体(gCh)遺伝子の情報(Coussens et al., J. Virol. 62:2373-2379, 1988)と、その隣接するBamHI−B断片(特開平06−292583)とに基づいて、2つのORF、すなわち、UL44hとUL45hとの間にSfiI部位を有するDNA断片を、PCRにより調製し、pUC18にクローン化した。まず、Lee他(J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980)の方法に基づいてHVTFC126菌種を感染させたCEF細胞からHVT DNAを調製した。得られたHVT DNAをテンプレートとして使用して、2対のプライマーと共にPCRを行った。
第1対は配列番号:7(5’−CCCCGAATTCATGGAAGAAATTTCC−3’)及び配列番号:8(5’−CGCGGGCCAATAAGGCCAACATCGGGACGTACATC−3’)であった。
第2対は、配列番号:9(5’−GCGCGGCCTTATTGGCCTTAAATACCGCGTTTGGAG−3’)及び配列番号:10(5’−CCCCAAGCTTTCAAGTGATACTGCGTGA−3’)であった。
Lee他(J. Gen. Virol., 51:245-253, 1980)の方法に従ってHVTFC126菌種に感染させたCEF細胞からHVT DNAを調製した。得られたHVT DNAをテンプレートとして使用して、2対のプライマーと共にPCRを行った。各プライマーを、Genbank X68653.1の情報に基づいて設計した。2つのORF、すなわち、US2(HVT088)とSORF3(HVT087)との間にSfiI部位を有するDNA断片を、PCRにより調製し、pUC18にクローン化した。
第1対は、配列番号11(5’−GGGAATTCGAAGAGCCCCCGCGGACGCATG−3’)及び配列番号12(5’−CCGCTAGCGGCCGCAAGTTCCTTCACCATGACCAG−3’)であった。
第2対は、配列番号13(5’−GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGTAGCATAAAGACGCAGG−3’)及び配列番号14(5’−CCAAGCTTCTAGTACATATATATACATGAC−3’)であった。
Lee他(J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980)の方法に基づきHVTFC126菌種に感染したCEF細胞からHVT DNAを調製した。得られたHVT DNAをテンプレートとして使用し、2対のプライマーと共にPCRを行った。各プライマーを、Genbank X68653.1の情報に基づいて設計した。2つのORF、すなわち、US10(HVT086)とSORF3(HVT087)との間にSfiI部位を有するDNA断片を、PCRにより調製し、pUC18にクローン化した。
第1対は、配列番号15(5’−GGGGGAATTCATTATCCCATCTAACAGTTATATACG−3’)及び配列番号16(5’−GCCGCTAGCGGCCGCCTTTATTAACAACCTTAC−3’)であった。
第2対は、配列番号17(5’−GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCC GTTTATTCTATGTAAGAC−3’)及び配列番号18(5’−CCCAAGCTTAAGTTCCTTCACCATG−3’)であった。
化学合成されたMcmv ie1プロモーター
Mcmv ie1プロモーター(配列番号19)を、Koszinowski, U.H.により報告されたGeneBankL06816.1における4191−4731bpの情報に基づいて合成した。合成したMcmv ie1プロモーターを、BglI−PstI部位をその先頭に追加し、XbaI−NotI部位をその末尾に付加して設計した。
配列番号19:GGCCAATAAG GCTGCAGTAC TGAGTCATTA GGGACTTTCC AATGGGTTTT GCCCAGTACA TAAGGTCAAT AGGGGTGAAT CAACAGGAAA GTCCCATTGG AGCCAAGTAC ACTGAGTCAA TAGGGACTTT CCATTGGGTT TTGCCCAGTA CAAAAGGTCA ATAGGGGGTG AGTCAATGGG TTTTTCCCAT TATTGGCACG TACATAAGGT CAATAGGGGT GAGTCATTGG GTTTTTCCAG CCAATTTAAT TAAAACGCCA TGTACTTTCC CACCATTGAC GTCAATGGGC TATTGAAACT AATGCAACGT GACCTTTAAA CGGTACTTTC CCATAGCTGA TTAATGGGAA AGTACCGTTC TCGAGCCAAT ACACGTCAAT GGGAAGTGAA AGGGCAGCCA AAACGTAACA CCGCCCCGGT TTTCCCCTGG AAATTCCATA TTGGCACGCA TTCTATTGGC TGAGCTGCGT TCTACGTGGG TATAAGAGGC GCGACCAGCG TCGGTACCGT CGCAGTCTTC GGTCTGACCA CCGTAGAACG CAGAGCTCCT CGCTGCAGGC GGCCGCTCTA GA
p44/45Mcmv ie1 VP2 SPAの作成
SfiIにて切断されたp44−45d46Sfiを、アルカリホスファターゼシュワネラ由来S1B1組換体(PAP)(Funakoshi社#DE110)を用いて脱リン酸化した。断片を、BglIにて切断されたp45/46BacVP2と結合し、プラスミド、p44/45d46 BacVP2を得た。合成されたMcmv ie1プロモーター(BglI/XbaI)を、EcoRV及びXbaIにて切断されたp44/45d46 BacVP2と、EcoRV及びBglIにて切断されたp44/45d46 Bac VP2とに結合し、p44/45d46 Mcmv ie1 VP2を得た。合成された短いポリAシグナル(SPA:配列番号20CTGCAGGCGGCCGCTCTAGAGTCGACAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCCAATAAGGCC)を、SalI及びSfiIにて切断されたp44/45d46 Mcmv ie1 VP2に統合し、相同性プラスミド、p44/45d46 Mcmv ie1 VP2 SPAを得た。
HVT野生型のウイルスDNA、FC126菌種(wt−HVT)をMorgan他(Avian Diseases, 34:345-351, 1990)の記載に従って調製した。FW029(rHVT/45−46PecF)及びFW023(rHVT/45−46BacVP2)のウイルスDNAを同様の方法で調製した。第1の二重rHVTパターンは、CEF細胞に調製したwt−HVT DNA及びp45/46sv40VP2 PecFをトランスフェクトした(例:FW137)ものであった。第2のパターンは、CEF細胞に調製したFW029 DNA及びp44/45 Mcmv ie1 VP2をトランスフェクトしたものであった(例:FW141)。第3のパターンは、CEF細胞に、調製したFW023 DNA及びp44/45 Mcmv ie1 Fをトランスフェクトしたものであった(例:FW142)。第4のパターンは、CEFに、調製したFW029 DNA及びpHVT87−88Bac VPをトランスフェクトしたものであった(例:FW144)。第5のパターンは、CEFに、調製したFW023及びpHVT87−88Pec Fをトランスフェクトしたものであった(例:FW145)。結果として得られるこれらの組換型ウイルスは、抗NDV−F抗体及び抗IBDV−VP2抗体により染色プラークによって精製されたプラークであった。
2×105のCEFを含む2mlの細胞を、組換型HVTに感染させ、37℃で5%のCO2において3日間インキュベートした。
サザンブロッティング分析
精製したrHVT/ND/IBDを1つの25cm2フラスコのCEF細胞で増殖させて、融合性プラークを得た。細胞を、擦過により皿から回収し、ファルコンチューブへ移動させ、300xgで5分間遠心沈殿法を行った。回収した細胞をPBSで洗浄し、0.6mlのPBS及び0.4mlの溶菌緩衝液(PBS中の1.25%のトリトンX−100、250mMの2−ME、及び50mMのEDTA)において再懸濁し、3分間ボルテックス法を行って溶解した。次に、この溶菌液を、600xgで5分間、室温で遠心分離し、上澄液を、15mlファルコンチューブへ移動した。ウイルスを、20,400xgで20分間の遠心沈殿法により収集した。結果として生じるペレットを、次に、0.33mlのヌクレアーゼ溶液(12.5mMのトリス−Cl(pH7.5)、1μg/mlのDNase I、及び1μg/mlのRNase A)において懸濁し、37℃で30分間インキュベートし、83μlのSDS−プロテアーゼ溶液(50mMのEDTA、5%のSDS、0.5mg/mlのプロテアーゼK、及び28.5mMの2−メルカプトエタノール)で55℃で30分間インキュベートすることによって破壊した。得られた混合物を、フェノール−クロロホルムで2回処理し、NaClを、水相へ添加して、最終的に0.2Mの濃度にした。ウイルスDNAを、2.5体積の氷冷エタノールを添加することにより沈降させ、70%のエタノールで洗浄し、20,400xgで20分間4℃で遠心沈殿法を行った。風乾後、ペレットを、TE緩衝液(10mMのトリス−Cl(pH8.0)、1mMのEDTA)に溶かした。
VP2STC−F(配列番号21)5’−CACCGTCCTCAGCTTACCCACATC−3’
VP2STC−R(配列番号22)5’−ACGACGGATCCTGTTGCCACTCT−3’
NDV−F−F(配列番号23)5’−CTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGAT−3’
NDV−F−R(配列番号24)5’−GTTAAGGCAGGGGAAGTGATTTGT−3’
45/46−F(配列番号25)5’−GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC−3’
45/46−R(配列番号26)5’−GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG−3’
44/45−F(配列番号27)5’−GTACTATAGAATGTGTTCC−3’
44/45−R(配列番号28)5’−GTATCCAACGCCTCAAGATC−3’
サザンブロッティングの結果は、2077−bp断片がFW129からのDNAにおいてVP2プローブとハイブリダイズしたということを示した(図5A〜図5D)。対照的に、p45/46 PecFにおいてバンドは検出されなかった。
ウエスタンブロッティング分析
二重組換型HVTを、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)において連続して(最大15回)継代した。次に、細胞溶菌液を、ウエスタンブロット分析に適用した。第1パネルにおいて(図6A)、ブロットを抗Fウサギ血清(#35)と反応させた。第2パネルにおいて(図6B)、ブロットを抗VP2 Mab(R63)と反応させた。模擬:未感染CEF
M:プレシジョンPlusプロテインスタンダード、Bio Rad社、#161−0374
15回継代した後、二重組換型HVTに感染したCEFにおいて、F及びVP2が安定して発現された。しかしながら、FW137は、15継代後、F及びVP2抗原の信号を発現せず、単一部位に2つの遺伝子を有する組換型HVTは不安定であることを示した。
M:分子マーカーラムダHindIII消化
TP−24:トランスファープラスミドp44−45d46SV40VP2
TP−25:トランスファープラスミドp44−45d46RsvVP2
各rHVT/ND/IBDをCEF細胞において15回継代し、実験4に記載のようにサザンブロット分析を行った。結果は、実験4において得られたのと同様であり、15回継代した後でも組換型ウイルスが安定していることを示した。
44/45プローブ及び45/46プローブによるサザンブロットは、FW129及びFW130における各挿入部位44/45又は45/46において安定して維持されたVP2遺伝子又はF遺伝子を示した。
1羽当たり3,000PFU/200μlの各rHVT/ND/IBDを生後1日のニワトリ(LineM、Japan Biological Laboratories社)10羽の背中に20ゲージシリンジを用いて皮下接種した。ワクチン接種後3週間以降に、ワクチン接種した鳥から血清を収集した。抗NDV抗体力価を、市販のELISAキット(IDEXX、ニューカッスル病を診断するためのELISAキット)を用いて測定した。抗IBDV抗体を、市販のELISAキット、Flock Check Infectious BursalDisease Antibody Testキット(IDEXX Laboratory, Inc.社)を用いて滴定した。陰性の対照群(非免疫)のニワトリにはワクチンを投与しなかった。
NDワクチンとしてのrHVT/ND/IBD(FW130、FW135、FW137、FW129)の有効性を、ニューカッスル病ワクチンとしての有効性試験を用いて評価した。
IBDワクチンとしてのFW129及びFW141(HVT/45−46 PecF/44−45 Mcmv ie1 VP2)の有効性をIBDV STCを抗原投与することにより評価した。
グループ:
G1:NINC(ワクチン接種されておらず、抗原投与されていない)
G2:NICC(ワクチン接種されておらず、抗原投与された)
G3:FW141
G4:FW144
G5:FW023(陽性の対照)
雛鳥
MDA+鳥(産卵鶏)、各グループにつき16〜17羽
3,000pfuのワクチンを、生後1日の17羽のMDA+ニワトリの背中の皮下に接種した。生後8週間で、1羽につき103TCID50のIBDV STCを経口で抗原投与した。1週間後、全てのニワトリを体重測定し、剖検してファブリキウス嚢を回収し、伝染性ファブリキウス嚢病により引き起こされる何等かの病巣について観察した。
グループ
G1:抗原投与対照
G2:FW141
G3:FW144
G4:FW145
G5:FW029(陽性の対照)
雛鳥
MDA+鳥(産卵鶏)、各グループにつき17羽
3,000PFUのワクチンを、生後1日の17羽のMDA+ニワトリの背中の皮下に接種した。生後8週間で、ワクチン接種されたニワトリに、103EID50のNDV−TexasGB(合衆国における標準的な抗原投与菌種)を大腿部の筋肉内に抗原投与した。抗原投与されたニワトリを、死亡率をチェックするため、及びニューカッスル病の何等かの症状を検出するために毎日観察した。結果を以下に示す。
Claims (15)
- 組換型鳥ヘルペスウイルスであって、それぞれ別個の抗原ペプチドをコードする少なくとも第1及び第2組換型ヌクレオチド配列を含み、
前記第1組換型ヌクレオチド配列は、UL45とUL46との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域に挿入され、且つ、Pecプロモーターの支配下にあり、
前記第2組換型ヌクレオチド配列は、UL44とUL45との間に位置する領域、US10とSORF3との間に位置する領域、及びSORF3とUS2との間に位置する領域から選択される、ウイルスゲノムの非コード領域に挿入されている、組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)細胞が前記ウイルスに感染すると、前記少なくとも2つの組換型ヌクレオチド配列は、少なくとも10回継代した後、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)細胞に共発現する組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1又は2に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記組換型ヌクレオチド配列は、鳥病原体からの抗原ペプチドをコードする組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記組換型ヌクレオチド配列は、鳥パラミクソウイルス1型の抗原ペプチド、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のFタンパク質、又はその免疫原性断片、ガンボロ病ウイルスの抗原ペプチド、伝染性ファブリキウス病ウイルス(IBDV)のVP2タンパク質、又はその免疫原性断片、感染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)の抗原ペプチド、gBタンパク質又はその免疫原性断片、マイコプラズマ・ガリセプチカムの抗原ペプチド、40Kタンパク質又はその免疫原性断片、及び鳥インフルエンザウイルスの抗原ペプチド、表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)又はその免疫原性断片から選択される抗原ペプチドをコードする組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
Pecプロモーターの支配下にあるUL45とUL46との間に位置する非コード領域に挿入された第1抗原ペプチドをコードする前記第1組換型ヌクレオチド配列と、US10とSORF3との間、又はSORF3とUS2との間に位置する非コード領域に挿入された第2抗原ペプチドをコードする前記第2組換型ヌクレオチド配列とを含む、組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
UL45とUL46との間に位置する領域に挿入された前記第1組換型ヌクレオチド配列は、UL45の転写方向とは反対のUL46と同じ転写方向にある組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記第2組換型ヌクレオチド配列は、ニワトリベータアクチン(Bac)プロモーター、Pecプロモーター、ネズミサイトメガロウイルス(Mcmv)中間〜初期(ie)1プロモーター、ヒトメガロウイルスプロモーター(Hcmv)、サルウイルス(SV)40プロモーター、及びラウスサルコーマウイルス(RSV)プロモーターから選択されるプロモーターの支配下にある組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
各組換型ヌクレオチド配列は、別個のプロモーターの支配下にある組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
UL45とUL46との間に挿入された、前記Pecプロモーターの支配下で第1抗原ペプチドをコードする組換型ヌクレオチド配列と、UL44とUL45との間に挿入された、第2抗原ペプチドをコードする組換型ヌクレオチド配列とを含む組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
UL45とUL46との間に挿入された、前記Pecプロモーターの支配下で第1抗原ペプチドをコードする組換型ヌクレオチド配列と、SORF3とUS2との間に挿入された、第2抗原ペプチドをコードする組換型ヌクレオチド配列とを含む組換型鳥ヘルペスウイルス。 - 七面鳥の組換型ヘルペスウイルス(rHVT)である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルス。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の有効免疫量の組換型鳥ヘルペスウイルスを含む多価ワクチン。
- 病原体に対して鳥を免疫化するために使用する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換型鳥ヘルペスウイルス。
- 少なくとも2つの病原体に対して同時に鳥にワクチン接種するための方法であって、
請求項12に記載の多価ワクチンを前記鳥に投与することを含む方法。 - 鳥を免疫化するためのワクチン接種キットであって、
請求項12に記載の有効量のワクチンと、
前記鳥に前記成分を投与するための手段とを含むキット。
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