CN103421817A

CN103421817A - 人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用

Info

Publication number: CN103421817A
Application number: CN2012103897452A
Authority: CN
Inventors: 方六荣; 肖少波; 王荡; 罗锐; 吴群峰; 李振; 曾松林
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-10-15
Also published as: CN103421817B

Abstract

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学及基因工程学技术领域。具体涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗原多表位基因的合成与应用。其特征是将高致病性PRRSVWUH3株GP3、GP4、GP5、M和N蛋白的T细胞表位和修饰的GP5B细胞表位通过linker相连，并根据哺乳动物对密码子的偏爱性进行改造后人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。合成的该多表位基因包含在真核表达质粒pcDNA3.1-mMEP中，含有该质粒的大肠杆菌Escherichia coli DH5α/pcDNA3.1-mMEP保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M 2012171。本发明还公开了该基因在制备猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗中应用。

Description

人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学及基因工程学技术领域。具体地说涉及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因的修饰与合成，还涉及该修饰后的多表位基因在制备猪繁殖与呼吸综合征病DNA疫苗中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS，下文简称PRRS）是近年发现的一种新的病毒性传染病，以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。该病最早于1987年报道于美国南部，不久即传播到了中西部，并在全美迅速蔓延。随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病（Bilodeau R et al，Porcinereproductive and respiratory syndrome in Quebec.Vet Rec,1991,129:102-103;Dea S,BilodeauR，Athanassious R et al.Swine reproductive and respiratory syndrome virus in Quebec:isolationof an enveloped virus serologically-related to lelystad virus.Can Vet J.1992,33:801-808）；亚洲地区报道此病的时间相对较晚，1991年在中国台湾地区出现此病（张志成等，台湾地区猪繁殖与呼吸道征候群I病毒鉴定，中华兽医杂志，1993，19（4）：268-276）；日本1994年暴发PRRS（Hiroyoshi Kuwaahara.An outbreak of PRRS in Japan.J Vet Med Sci,1994,56(50)：901-909）；1996年，中国大陆报道此病开始流行，并分离到病毒（郭宝清等，从疑似PRRS流产胎儿分离猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究，中国畜禽传染病，1996，87（2）：1-5）。目前该病已遍及世界各养猪国家，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。

而在中国，自2006年5月以来又暴发了由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引发的所谓“猪高热综合症”，该病以高热、皮肤潮红、呼吸急促、神经症状等临床症状以及高发病率、高死亡率为主要特征，给我国养猪业造成了极大的危害和重大的经济损失，严重影响了农民增收和猪肉消费市场的稳定及养猪业的生产安全。

同其它病毒性传染病一样，PRRS的防制也主要是通过疫苗免疫接种。目前用于预防PRRS的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗。尽管弱毒疫苗能提供较好的免疫保护，但存在毒力返强的危险，并且返强的机率相当高，这一点在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实（Snijder EJ,Meulenberg JJM.The molecular biology of arteriviruses.J Gen Virol，1998，79：961-979；

A，Strandbygaard B，

K，Have P，Madsen K，Madsen ES，et al.Appearance of acute PRRS-likesymptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaceine.Veterinary Record.1997；141(19)：497-499；Christopher-Hennings J，Nelson E，Nelson J，Benfield D.Effects of amodified live virus vaccine against poreine reproductive and respiratory syndrome in boars.AmJ Vet Res.1997；58(1)：40)。与弱毒苗相比，灭活疫苗虽然安全，但往往需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。可以说，目前对该病的防制一直不尽人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。

Oleksiewicz等通过噬菌体展示技术鉴定了美洲型111/92株GP3蛋白的两个抗原区(60～85aa和243～250aa)(Oleksiewicz MB， A，Toft P，Normann P，Storgaard T.Epitope mapping porcinereproductive and respiratory syndrome virus by phage display：the nsp2fragment of the replicasepolyprotein contains a cluster of B-cell epitopes.J Viro1.2001；75(7)：3277-3290；OleksiewiczMB，

A，Normann P.Porcine B-eells recognize epitopes that are conserved between thestructural proteins of American-and European-type poreine reproductive and respiratory syndromevirus.J Gen Virol.2002；83(Pt6)：1407-1418)。之后，Zhou等通过完整GP3蛋白的单克隆抗体鉴定了美洲型毒株A(y⁶⁷EPGRSLW⁷⁴)和B(W⁷⁴CRIGHDRCGED⁸⁵)两个抗原区域(Zhou YJ，An TQ，He YX，Liu JX，Qiu HJ，Wang YF，et al.Antigenic structure analysis of glycosylated protein 3 of poreinereproductive and respiratory syndrome virus.Virus Res.2006；118(1)：98-104)。突变分析表明，两个表位中的H79和G83为必须氨基酸，它们的突变会改变蛋白的抗原性，而影响它与阳性血清的反应，推测这两个氨基酸位点可能与PRRSV选择性变异有关。用杆状病毒表达系统表达的西班牙Olot/91株GP3蛋白作为抗原免疫怀孕母猪，保护率达68.4％，但其产生的抗体滴度并不高，推测GP3主要与诱导细胞免疫反应相关(Plana DJ，Climent I，Sarraseca J，Urniza A，Cortés E，Vela C，et al.Baculovirusexpression of proteins of poreine reproductive and respiratory syndrome virus strain Olot/91.Involvement of ORF3 and ORF5proteins in protection.Virus Genes.1997；14(1)：19)。

Kapil Vashisht等通过肽库技术，检测到了GP5蛋白两个非常保守的T细胞表位(TEP)，它们分别为T1表位(L¹¹⁷AALICFVIRLAKNC¹³¹)和T2表位(K¹⁴⁹GRLYRWRSPVII/VEK¹⁶³)。这两个免疫T细胞表位也被Ivan Díaz等人证实(Vashisht K，Goldberg TL，Husmann RJ，Schnitzlein W，Zuckermann FA.Identification ofimmunodominant T-cell epitopes present in glycoprotein 5 of the North American genotype of porcinereproductive and respiratory syndrome virus.Vaccine.2008；26(36)：4747-4753；Díaz I，Pujols J，Ganges L，Gimeno M，Darwich L，Domingo M，et al.In silico prediction and ex vivo evaluation of potential T-cell epitopes in glycoproteins 4and 5and nucleocapsid protein of genotype-I(European)of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Vaccine.2009;27(41):5603-5611）。

M蛋白是PRRSV中最保守的结构蛋白，在美洲型与欧洲型毒株间同源性高达78～81%。它也是诱导机体产生T细胞免疫反应最强的蛋白。YANG等报道了M蛋白的三个不连续表位（EpORF6A、EpORF6B、EpORF6C），但只有EpORF6A和EpORF6B的单抗表现出中和病毒活性。YANG推测EpORF6A、EpORF6B大约在10～18个氨基酸之间，这些表位位于病毒囊膜表面，并可能参与受体的相互作用（Yang L,Frey M,Yoon KJ,ZimmermanJ,Platt K.Categorization of North American porcine reproductive and respiratory syndromeviruses:epitopic profiles of the N,M,GP5and GP3proteins and susceptibility to neutralization.Arch Virol.2000;145(8):1599-1619）。

Ivan Díaz等人通过生物信息学和肽库技术，发现了N蛋白的两个T细胞表位，即A表位（I⁶⁴RHHLTQTE⁷²）和B表位（V¹¹³RLIRVTST¹²¹），以及GP4蛋白的两个T细胞表位，即A表位（C¹⁷⁵LFAILLAT¹⁸³）和B表位（F⁷LLAGAQHI¹⁵），并推测N蛋白要比GP4蛋白和GP5蛋白诱导细胞免疫反应的作用强（Diaz I,Pujols J,Ganges L,Gimeno M,Darwich L,Domingo M,et al.In silico prediction and ex vivo evaluationof potential T-cell epitopes in glycoproteins 4and 5and nucleocapsid protein of genotype-I(European)of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Vaccine.2009;27(41):5603-5611）。

另外，蛋白的表达水平与其引起的免疫反应直接相关,而编码氨基酸密码子的摇摆性导致了不同物种的细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性，哺乳动物细胞在蛋白翻译过程中与病毒蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异（Haas J,Park EC,Seed B.Codon usage limitation in the expressionof HIV-1envelope glycoprotein.Curr Biol.1996;6(3):315-324）。因此，将病毒蛋白氨基酸密码子改造为哺乳动物嗜好的密码子能提高其在哺乳动物细胞中的表达。

基于以上的研究进展，为了获得一种免疫原性更好的用于PRRSV新型疫苗研究的基因，申请人通过对PRRSV已知表位进行分析，从高致病性PRRSV编码的GP3、GP4、GP5、M和N蛋白中选择与免疫保护相关的B细胞表位和/或T细胞表位，并把各表位基因的密码子改造为哺乳动物嗜好的密码子，以linker将各表位基因串联，人工合成了PRRSV抗原多表位基因（mMEP），将该基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，获得表达多表位基因的真核表达质粒pcDNA3.1-mMEP，并以小鼠为模型对其免疫原性进行了评价。

发明内容

本发明的第一个目的是人工合成以linker连接的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因，以获得一种免疫原性更好的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究的基因。

本发明的另一个目的是制备一种表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因的DNA疫苗及其在制备猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实施：

一种人工合成的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

一种人工合成的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP是将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白GP3、GP4、GP5、M和N的B细胞表位和/或T细胞表位通过linker相连，并将其密码子改造为哺乳动物嗜好的密码子（见序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列）而获得。

所述的表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP的DNA疫苗是将人工合成的PRRSV多表位基因mMEP插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH I与Not I位点构建而成，并将获得的重组质粒命名为pcDNA3.1-mMEP(具体构建流程见图4)。含有该质粒的大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α/pcDNA3.1-mMEP于2012年5月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2012171。

本发明还包括上述表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因mMEP在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗上的应用。

与现有技术相比，本发明的积极效果见表1所述。

表1本发明与现有技术的主要技术差别

更详细的技术方案和发明效果参见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表中SEQ ID NO：1是本发明设计合成的PRRSV抗原多表位基因mMEP的核苷酸序列。序列全长为557bp。SEQ ID NO：2是本发明设计合成的PRRSV抗原多表位基因mMEP编码的氨基酸序列，共178个氨基酸。

SEQ ID NO：3是GP3的T1细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是GP3的T2细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是GP4的T1细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是GP5的T1细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是GP5的T2细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是M蛋白的T1细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是M蛋白的T2细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是N蛋白的T1细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是N蛋白的T2细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是修饰的GP5蛋白B细胞表位的氨基酸序列。

图1：显示了人工合成的高致病性PRRSV抗原多表位基因的结构图。

图2：显示了空载体pcDNA3.1(+)以及载体pGH-mMEP的酶切图。图中：1：pcDNA3.1(+)/BamH I+Not I，2：pGH-mMEP/BamH I+Not I，3：Marker-15000，4：Marker-2000。

图3：显示了重组质粒pcDNA3.1-mMEP的酶切鉴定结果。图中：1：Marker-2000，2：pcDNA3.1-mMEP/BamHI+Not I，3：Marker-15000。

图4：显示了表达人工合成的高致病性PRRSV抗原多表位基因的DNA疫苗pcDNA3.1-mMEP的构建示意图。

图5：显示了DNA疫苗pcDNA3.1-mMEP免疫Balb/c小鼠后ELISA抗体检测结果。

图6：显示了DNA疫苗pcDNA3.1-mMEP免疫Balb/c小鼠后，用ELISA方法检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-γ的水平。

图7：显示了DNA疫苗pcDNA3.1-mMEP免疫Balb/c小鼠后，用ELISA方法检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IL-4的水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明的保护范围。

实施例1高致病性PRRSV抗原多表位基因的设计与人工合成

本发明通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH3株（其核苷酸序列来自GenBank：HM853673.2，参见文献：LiB,Xiao S,Wang Y,Xu S,Jiang Y,Chen H,et al.Immunogenicity of the highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5protein encoded by a synthetic ORF5gene.Vaccine.2009;27(13):1957-1963）已知表位的分析，选择与免疫保护相关的B细胞表位和T细胞表位，以linker将各表位基因串联，构建PRRSV抗原多表位基因（mMEP）。所选表位包括：GP3的T1细胞表位（其氨基酸序列：LEPGKSFW，见序列表SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列），T2细胞表位（其氨基酸序列：CRIGHDRCSEN，见序列表SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列）；GP4的T1细胞表位（其氨基酸序列：CLFAILLAI，见序列表SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列）；GP5的T1细胞表位（其氨基酸序列：LAALICFVIRLAKNC，见序列表SEQ ID NO：6所述的氨基酸序列），T2细胞表位（其氨基酸序列：KGRLYRWRSPVIVEK，见序列表SEQID NO：7所述的氨基酸序列）；M蛋白的T1细胞表位（其氨基酸序列：CNDSTAPQKVLLAFS，见序列表SEQ IDNO：8所述的氨基酸序列），T2细胞表位（其氨基酸序列：ALKVSRGRLLGLLHL，见序列表SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列）；N蛋白的T1细胞表位（其氨基酸序列：VRHHFTPSE，见序列表SEQ ID NO：10所述的氨基酸序列），T2细胞表位（其氨基酸序列：VRLIRATAS，见序列表SEQ ID NO：11所述的氨基酸序列）；被通用型辅助性T淋巴细胞表位（PADRE）修饰的两个重复的GP5B细胞表位，该修饰的两个重复的GP5B细胞表位是在两个相同的GP5B细胞表位之间插入通用型辅助性T淋巴细胞表位（PADRE），以使两个B细胞表位能充分展示（其氨基酸序列：SHIQLIYNLAKFVAAWTLKAAASHIQLIYNL，见序列表SEQ ID NO：12所述的氨基酸序列）。将所选表位按以上所述顺序依次相连，并在相邻两个表位之间插入linker（其氨基酸序列：GGGGS）（除了GP3的T1和T2表位之间未插入linker）。同时在串联表位的5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入Not I酶切位点，并根据哺乳动物嗜好的密码子对该PRRSV抗原多表位基因进行密码子优化（其序列见SEQ ID NO：1），申请人将该基因命名为mMEP基因，其结构见图1所述。该基因由北京奥科鼎盛生物技术有限责任公司协作合成，申请人将北京奥科鼎盛生物技术有限责任公司提供的含有该基因原始载体命名为pGH-mMEP。

mMEP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为557bp（其编码区为13-549位碱基），其编码的蛋白质的序列见SEQ ID NO：2所示，共计178个氨基酸。

实施例2pcDNA3.1-mMEP重组质粒的构建

质粒的构建、制备、酶切分析均按常规方法进行（参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002版）。

具体构建步骤是：将实施例1中含有高致病性PRRSV抗原多表位基因mMEP的原始载体pGH-mMEP用BamH I+Not I酶切后（酶切图见图2），纯化回收一条约560bp的酶切产物，与用BamH I+Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表达质粒（酶切图见图2）连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，小量提取质粒(采用天根生化科技(北京)有限公司生产的试剂盒，按照该试剂盒的说明书操作)，经BamH I和Not I双酶切得到一条约560bp和一条约5400bp的带，证实所构建的表达高致病性PRRSV抗原多表位基因的真核表达质粒是正确的，申请人将该质粒命名为pcDNA3.1-mMEP，酶切鉴定结果见图3。质粒pcDNA3.1-mMEP具体构建流程见图4。

含有该质粒的大肠杆菌（Escherichia coli) DH5α/pcDNA3.1-mMEP，于2012年5月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M 2012171。

实施例3质粒DNA疫苗pcDNA3.1-mMEP及空载体质粒pcDNA3.1(+)的大量制备

采用omega公司生产的质粒大量提取试剂盒（按照试剂盒中的说明书操作）进行质粒（疫苗）的大量提取，具体操作步骤如下：

（1）将重组质粒pcDNA3.1-mMEP或空载体质粒pcDNA3.1(+)（购自英潍捷基（上海）贸易有限公司）的大肠杆菌DH5α分别接种于100mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中（氨苄青霉素浓度为100U/mL），振荡培养过夜（12-16h）；

（2）将步骤（1）得到的大肠杆菌菌液转移到2个50mL离心管中，12000r/min离心2min弃上清，收集菌体沉淀；

（3）用2.5mL Solution I（上述试剂盒自带）重悬沉淀后，加入2.5mL Solution II（上述试剂盒自带），轻柔混匀，室温静置3-5min，以充分裂解细胞。加入1.25mL Buffer N3（上述试剂盒自带），轻柔混匀，室温放置2-3min，至形成絮状沉淀；

（4）将回收柱（上述试剂盒自带）放入15mL离心管中，向回收柱中加入2mL GPS缓冲液（上述试剂盒自带），放置3-5min后，3000-5000r/min水平离心，弃离心管中液体；

（5）将步骤（3）中含有絮状物的液体倒入过滤注射器中（上述试剂盒自带），静置2-3min。轻推注射器，使清亮液体进入事先准备好的干净离心管中；

（6）向滤液中加入0.1倍（约600μL）ETR缓冲液（上述试剂盒自带），冰浴10-20min，期间颠倒数次；

（7）于42℃温浴5min，使清亮液体变混浊，3000-5000r/min水平离心5min，使蓝色液体沉于底部；

（8）将上层液体移入另一洁净15mL离心管中（勿吸取蓝色液体），加入0.5倍无水乙醇，轻柔混匀56次，室温静置2min；

（9）将步骤（8）中液体加入到回收柱中（上述试剂盒自带），3000-5000r/min水平离心3-5min，弃离心管中液体；

（10）向回收柱中加入3mL HB Buffer（上述试剂盒自带），3000-5000r/min水平离心3-5min，弃离心管中液体；

（11）向回收柱中加入3.5mL缓冲液（Washing Buffer，上述试剂盒自带），3000-5000r/min水平离心3-5min，弃离心管中液体，重复此步骤后，于3000-5000r/min，空离10-15min；

（12）将回收柱置于另一洁净15mL离心管中，在65℃烘箱中放置10-15min，使乙醇挥发完全；

（13）向回收柱的膜中央加入250μL洗脱液（上述试剂盒自带），3000-5000r/min水平离心10-15min，离心管中液体即为大量提取的表达PRRSV抗原多表位基因的重组质粒（pcDNA3.1-mMEP）（质粒DNA疫苗）或作为对照的空载体质粒pcDNA3.1(+)。

实施例4质粒浓度的测定与稀释

利用分光光度计测定大量制备的质粒的浓度，根据测定的浓度用磷酸盐缓冲液（简称PBS，8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄加ddH₂O至1000mL）（PBS pH7.4）将其稀释到1μg/μL，即可用于动物免疫。

实施例5本发明制备的质粒DNA疫苗（或称DNA疫苗）对Balb/c小鼠的免疫效力试验

1.Balb/c小鼠的免疫程序

将4-6周龄的雌性Balb/c小鼠（购自湖北省预防医学科学院动物实验中心）分为2组，分别为pcDNA3.1(+)对照组和pcDNA3.1-mMEP实验组，每组6只，将质粒经后腿肌肉注射免疫Balb/c小鼠，每只100μg，共免疫2次，间隔3周。在首免后3、6周分别经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体。于首免后6周，断颈处死所有实验小鼠，无菌取出脾脏，利用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用紫外线照射灭活的PRRSV WUH3株作为刺激原刺激培养后进行细胞免疫的检测（检测IFN-γ和IL-4的表达）。检测方法参见：（Xiao et al.Comparison of immune responses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine and conventional DNA vaccine encoding glycoprotein C of pseudorabies virusin mice.Vaccine.2004，22,345-351）。

2.ELISA抗体检测

采用大肠杆菌表达和纯化的PRRSV抗原多表位蛋白作为抗原建立ELISA方法（参考文献：张文学主编，免疫学实验技术，科学出版社，2007版），检测实验小鼠血清中的特异性ELISA抗体，结果显示本发明的DNA疫苗pcDNA3.1-mMEP免疫组，免疫后第3周即可产生PRRSV特异性ELISA抗体，加强免疫后，pcDNA3.1-mMEP免疫组特异性ELISA抗体水平显著提高，但空载体pcDNA3.1(+)对照组未检测到PRRSV特异性ELISA抗体。说明本发明的DNA疫苗能诱导免疫小鼠产生良好的特异性体液免疫反应，结果如图5。

3.中和抗体检测

采用Yoon等（Yoon IJ,Joo HS,Goyal SM.A modified serum neutralization test for the detectionof antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera.J Vet DiagnInvest,1994,6:289-292）报道的改良的中和抗体检测方法，检测血清中的中和抗体水平。结果pcDNA3.1-mMEP免疫组，首免后3周即可检测到PRRSV特异的中和抗体，其中3只小鼠的中和抗体滴度达1:4。加强免疫后，4只小鼠的中和抗体滴度达1:4，而空载体对照组未检测到PRRSV特异性中和抗体。

4.ELISA方法检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平

采用购自R&D Systems公司生产的IFN-γELISA检测试剂盒检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-γ的水平，具体操作步骤如下：

（1）使用前将试剂盒自带的所有试剂从4℃冰箱取出平衡至室温；

（2）准备实验中所需数量的试剂（上述试剂盒自带）和待检样品（特异抗原刺激后的小鼠脾淋巴细胞培养上清）；

（3）每孔加入稀释剂RD1-21（上述试剂盒自带）50μL；

（4）分别在各孔中加入50μL标准液（上述试剂盒自带）或待检样品，并设对照组。轻拍板子混匀1min。覆盖粘性塑料膜，室温孵育2h；

（5）弃掉孔内液体，每孔用400μL洗涤液（上述试剂盒自带）清洗5次。每次保证彻底弃掉孔内液体；

（6）每孔加入100μL鼠IFN-γConjugate（上述试剂盒自带）。覆盖新的粘性塑料膜，室温孵育2h；

（7）重复步骤（5）；

（8）每孔加入100μL底物液（上述试剂盒自带），室温避光孵育30min；

（9）每孔加入100μL终止液（上述试剂盒自带），温和地轻拍板子以确保混匀；

（10）在30min内，用酶标仪测定450nm波长下的OD值。

结果pcDNA3.1-mMEP免疫组小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-γ的平均值达1415.2pg/ml，而对照pcDNA3.1免疫组小鼠分泌IFN-γ的平均值只有394.4pg/ml，试验组是对照组的3.6倍，说明pcDNA3.1-mMEP能诱导免疫小鼠分泌较高水平的IFN-γ。试验结果如图6。

5.ELISA方法检测脾淋巴细胞分泌IL-4的水平

采用IL-4ELISA检测试剂盒（购自R&D Systems公司）检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IL-4的水平，具体操作步骤如下：

（3）每孔加入稀释剂RD1-18（上述试剂盒自带）50μL；

（6）每孔加入100μL鼠IL-4Conjugate（上述试剂盒自带）。覆盖新的粘性塑料膜，室温孵育2h；

（7）重复步骤（5）；

（10）在30min内，用酶标仪（商购）测定450nm波长下的OD值。

结果pcDNA3.1-mMEP免疫组小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IL-4的平均值为20.3pg/ml，而对照pcDNA3.1免疫组小鼠分泌IL-4的平均值为11.0pg/ml，试验组约是对照组的2倍，说明本发明制备的pcDNA3.1-mMEP能诱导免疫小鼠分泌较高水平的IL-4。试验结果如图7。

6.附录（术语定义）：

英文名称中文名称

pcDNA3.1(+) 空白质粒载体

pcDNA3.1-mMEP 表达PRRSV抗原多表位基因的质粒

PRRSV 猪繁殖与呼吸综合征病毒。

Claims

1.一种人工合成的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的基因，其特征在于：将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSVWUH3株的GP3、GP4、GP5、M和N蛋白的T细胞表位和修饰的GP5B细胞表位通过linker相连，并根据哺乳动物对密码子的偏爱性进行改造后人工合成，人工合成的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；

其中：GP3的T1细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；

GP3的T2细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；

GP4的T1细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；

GP5的T1细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示；

GP5的T2细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示；

M蛋白的T1细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：8所示；

M蛋白的T2细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示；

N蛋白的T1细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：10所示；

N蛋白的T2细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：11所示；

修饰的GP5B细胞表位氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：12所示。

3.一种重组的大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α/pcDNA3.1-mMEP，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCC NO：M 2012171，该大肠杆菌含有真核表达质粒pcDNA3.1-mMEP，该质粒中含有如权利要求1所述的多表位基因mMEP。

4.一种包含表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP的DNA疫苗，其特征在于，所述的DNA疫苗为质粒pcDNA3.1-mMEP，它是由SEQ ID NO:1所示的基因mMEP用BamHI+NotI酶切后，纯化回收酶切产物，与用BamHI+NotI酶切的真核表达质粒pcDNA3.1(+)连接，获得表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP的真核表达质粒pcDNA3.1-mMEP，以该真核表达质粒转化大肠杆菌得到，所述的大肠杆菌Escherichia coli DH5α/pcDNA3.1-mMEP的保藏号为CCTCC NO：M 2012171。

5.权利要求1所述人工合成的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多表位基因mMEP在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

6.权利要求3所述的重组的大肠杆菌在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。