JP6178336B2 - ブタ生殖器呼吸器症候群(prrs)の有効な制御のための合成ペプチドベースのマーカーワクチン及び診断システム - Google Patents
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本開示は、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)に対するペプチドベースのマーカーワクチンならびにブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の予防、モニタリング及び制御のための一組の免疫診断テストに関する。
ワクチン製剤に通常含まれる送達ビヒクル及び他の成分もまた、本発明の種々の態様によって提供される。
ペプチド抗原は、免疫反応を検出することができ、あるペプチド抗原は、免疫反応を刺激することもできる。多くのペプチド抗原は、免疫反応の高感度かつ特異的な検出に用いられ得るが、ほとんどの場合、それら自体では免疫原として作用しない。ペプチド免疫原は、免疫反応の刺激及びそれらの検出に用いることができる、特殊な分類のペプチド抗原である。本発明のある態様によれば、PRRSVワクチン中のペプチド抗原は、防御免疫反応の発生を刺激するように共に作用するB細胞(B)エピトープ及びTヘルパー細胞(Th)エピトープの両方を有するペプチド免疫原であり、PRRSV感染に対する免疫反応を検出することができる別の一組のペプチド抗原も存在する。
a)PRRSV B細胞エピトープクラスターペプチド抗原GP5.3(V21−E65)(配列番号9)、GP2B(V111−L136)(配列番号10)、GP3B(C57−C75)(配列番号11)及びGP4B(C52−C69)(配列番号12)のいずれか1つ;
b)(a)のホモログ;
c)(a)又は(b)の抗原的にかつ免疫学的に機能的なアナログ;
d)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換、アミノ酸付加、及び/又はアミノ酸欠失を有する、(a)、(b)、又は(c);ならびに
e)(a)〜(d)の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
i.2つのPRRSV NCペプチド(配列番号1及び配列番号2)の混合物を固体支持体に付着する工程、
ii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
iii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、
を有する。
i.2つのPRRSV NCペプチド(配列番号7及び配列番号8)の混合物を、欧州株配列に由来する配列番号1及び配列番号2のホモログとして、固体支持体に付着する工程、
ii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
iii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、
を有する。
(1)ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、a)配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、及びこれらの任意の組合せ;b)(a)のホモログ;及びc)(a)又は(b)の任意の組合せ;からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、PRRSワクチン組成物。
(2)ペプチド抗原が配列番号9のアミノ酸配列を有する、(1)に記載のPRRSワクチン。
(3)ペプチド抗原が配列番号10のアミノ酸配列を有する、(1)に記載のPRRSワクチン。
(4)ペプチド抗原が配列番号11のアミノ酸配列を有する、(1)に記載のPRRSワクチン。
(5)ペプチド抗原が配列番号12のアミノ酸配列を有する、(1)に記載のPRRSワクチン。
(6)ペプチド抗原が、1〜5個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される、(1)に記載のPRRSワクチン。
(7)ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合したTヘルパーエピトープをさらに有する、(1)に記載のPRRSワクチン。
(8)Tヘルパーエピトープが配列番号35である、(7)に記載のPRRSワクチン。
(9)Tヘルパーエピトープが、ε−リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、(7)に記載のPRRSワクチン。
(10)スペーサーが配列番号36である、(9)に記載のPRRSワクチン。
(11)抗原ペプチドに結合されていないTヘルパーエピトープをさらに有し、該Tヘルパーエピトープが配列番号47〜90からなる群から選択される、(1)に記載のPRRSワクチン。
(12)ペプチド抗原の総量が約10μg〜約1mgである、(1)に記載のPRRSワクチン。
(13)送達ビヒクル及びアジュバントが、モンタニド(Montanide)ISA 50V、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、(1)に記載のPRRSワクチン。
(14)(1)に記載のワクチンを投与する工程を有する、PRRS感染に対して子ブタを防御する方法。
(15) a)ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、b)配列番号10、11、12、31、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びc)配列番号80〜90及びそれらの組合せからなる群から選択されるPRRSV Thペプチド、を有する、PRRSワクチン組成物。
(16) a)ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、b)配列番号42、44、45、46、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びc)配列番号80〜90及びそれらの組合せからなる群から選択されるPRRSV Thペプチド、を有する、PRRSワクチン組成物。
(17) a)配列番号1及び配列番号2の混合物を固体支持体に付着させる工程、b)前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びc)前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、PRRS感染を診断する方法。
(18) a)配列番号7及び配列番号8の混合物を固体支持体に付着させる工程、b)前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びc)前記支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、抗PRRSV抗体の存在をテストするためのELISAイムノアッセイ。
初めに血清サンプルをPBSで10倍希釈し、次に2倍の段階希釈を行った。各テストランのために、PRRSV感染SPFブタ由来の陽性コントロール血清及び未感染SPFブタ由来の陰性コントロール血清の両方を含めて、pRRSV orf−7プラスミドによるPRRSVヌクレオカプシドタンパク質の発現を検証した。1:10よりも高い希釈度で細胞質に局在した蛍光シグナルを生じる血清サンプル(図1Bに示す)を、>10のIFA力価を有するとスコア化した;これらの力価から、PRRSVに感染した動物が示された。ワクチン接種の結果として「標的ペプチド」特異的抗体を含む、動物ワクチン由来の血清について、特異的標的タンパク質又は完全PRRSVゲノムに対するそれらの抗体の交差反応性を、対応する標的天然PRRSVタンパク質(例えば、GP2、3、4又は5)を用いた免疫蛍光アッセイ(IFA)によって評価することができる。自然感染したブタから、又はPRRSVペプチドベースのワクチンを接種したブタから採取した血清サンプルのすべてのテストを、コード下で行った。
96ウェルプレートのウェルを、特記しない限り10mM NaHCO3緩衝液(pH9.5)中の特記しない限り2μg/mLでの個々の標的ペプチド100μLを用いて、37℃で1時間、個々にコーティングした。
PRRSV分離体JXA1、LV、EU、NAの既に公開された配列由来、及び台湾株MD001由来のPRRSVのゲノム配列を用いて、オープンリーディングフレームからタンパク質配列を推定し、ORF2、3、4、5、6及び7がコードするタンパク質配列から得られたデータを用いて、PRRSV感染した動物由来の血清中の抗体を検出するためのB細胞エピトープクラスター抗原ペプチド、及びマーカーワクチン製剤を投与した動物において誘発される特異的抗体を検出するためにマーカーワクチン製剤に用いられる機能的中和/レセプター結合部位を提示する抗原ペプチドをデザインした。
感染動物とワクチン接種動物の識別のために緊急に必要とされるツール(「DIVA」システムと呼ばれる)の開発は、マーカーワクチン設計プロセスを補完するものである。
約10〜約70アミノ酸長の配列を有するPRRSV GP2、GP3、GP4、GP5、M及びNCタンパク質由来のPRRSV B細胞及びT細胞の両方のエピトープクラスター部位を提示する、幅広いレパートリーのPRRSV抗原ペプチドを設計した。いくつかのペプチドについて、適切な部位でアミノ酸置換を行うことにより、対応する天然タンパク質との交差反応を最大にするように局所構造維持に制約を与える環状ペプチドの形成が可能になった。他の抗原ペプチドについて、それらの各々の免疫原性を高めるために、人工コンビナトリアルThペプチド(例えば、UBITh3、配列番号15)と結合させた。すべてのペプチドを、ペプチド合成の反復サイクル、ワクチン形成、動物免疫化、及び血清学的テストを含む、大きな労力を要しかつ時間的制約のある「血清学的検証」プロセスに供し、各診断及びワクチンのための本発明者らの最初の適用を受けた標的動物における、さらなるテストのための候補ペプチドを得た。
外部ドメインは、細胞外空間(細胞の外側の空間)へと伸びる膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、標的細胞表面との接触を開始し、感染の間、細胞への付着及び細胞内への侵入の原因となる、ウイルスタンパク質の部分である。中和抗体はウイルスとその細胞レセプターとの相互作用を阻止するので、ウイルス侵入関連ドメインは、中和抗体の誘導にとって重要である。したがって、次世代の有効なPRRSVワクチンを開発する場合、PRRSVのウイルス侵入関連ドメインの機能性を評価することが重要である。マクロファージ特異的レクチンであるシアロアドヘシン(CD163)は、マクロファージ上の極めて重要なウイルスレセプターである。可溶型のシアロアドヘシンを用いて、PRRSVのGP5及びMの複合体のジスルフィド結合ヘテロダイマーが、シアロアドヘシンに対するリガンドであることを見出した。このリガンド−レセプター相互作用は、シアロアドヘシンのレクチン活性、及びGP5糖タンパク質上のシアル酸に依存する。したがって、PRRSV GP5タンパク質の外部ドメイン及びGP5の免疫原性に対するMの影響を調査して、ウイルスM/GP5と宿主細胞レセプターシアロアドヘシンとの間の相互作用を阻止する免疫を誘導する目的で、PRRSVマーカーワクチン製剤に用いるのに最適なGP5ペプチド免疫原を同定した。
本発明のペプチドベースPRRSVワクチンの例示される使用において、アミノ末端又はカルボキシル末端でLys−Lys−Lys−εNLys(配列番号36)又はεNLysスペーサーを介して、人工コンビナトリアルTh配列UBITh(登録商標)3(配列番号35)などの外来性のThエピトープに結合するか又は結合しない、表3〜7に配列番号9〜90としてリスト化されるようなレセプター結合/中和部位又はTヘルパーエピトープクラスター部位を有する免疫原ペプチドとして含むワクチン製剤を、市販の油性ワクチン送達ビヒクルであるモンタニド(Montanide)ISA 50V2を用いて供給業者の推奨手順に基づいて、油中水型エマルションに製剤化した。オレイン酸マンニド(mannide oleate)の油性アジュバント組成物であるモンタニド(Montanide)(登録商標)ISA 50V2(Seppic、パリ、フランス)及びブタワクチンに通常用いられるミネラルオイルを、等容量の水相ペプチドPBS溶液で乳化した。ペプチド免疫原を、特定のプロトコル(例えば、エマルション中のペプチド比及び総ペプチド濃度)に従って、約25〜75μg/mLでそれぞれのエマルションに製剤化した。これらのエマルションベースのワクチン製剤を、他に特記しない限り、1部位当たり0.25mL〜0.5mLでモルモットに、又は1部位当たり1mLで子ブタに筋肉注射した。
モルモットにおいて行った免疫原性研究について、成熟した無感作の雄及び雌Duncan-Hartleyモルモット(体重300〜350g)を、1群当たり3匹で用いた。2回用量として0wpi及び3wpiに筋肉内(IM)に特定のワクチン製剤を投与して動物を免疫化した。これらのワクチン製剤は、免疫化の前に約30分間室温に放置し、約10〜15秒間攪拌しなければならない。初回免疫化後0週目、3週目及び5週目(wpi)に、血清サンプル用に血液を採取した。ペプチド免疫原及びワクチン製剤の免疫原性評価のために、実施例1及び2に記載されるように、直接結合力価について標的ペプチドベースのELISAによって、ならびに交差反応性力価についてPRRSVによりコトランスフェクトされた細胞ベースのIFAによって、これらのサンプルをテストした。
調製した多数のGP5外部ドメインペプチド免疫原の中から9個をエマルション製剤に製剤化して、初回及び追加免疫の免疫化スケジュール後のそれらの相対的な免疫原性を、図示及びランク付けした。表8から分かるように、PRRSV MD001配列に基づくペプチド免疫原4020Kc(配列番号38)は、標的ペプチドELISA(>1 log10)及びIFA力価の両方に基づいて、ペプチド免疫原4020Kb(配列番号37)よりも免疫原性が高い。したがって、アミノ酸配列フレーム2(GP5.2)設計は、フレーム1(GP5.1)よりも優れている。ペプチド免疫原4020Kcを、実施例6に詳述するように、PRRSV MD001によるPRRSV負荷研究の大部分に用いた。表8に示すように、PRRSV MD001由来の配列を有するフレーム3(GP5.3)で設計されたペプチド免疫原4048Kb(配列番号39)は、ペプチド4020Kcとほぼ同じ免疫原性を有することが見出されたが、そのIFA力価は、ペプチド免疫原4020KcのIFA力価よりも高かった。ペプチド免疫原4048Kbと比較した場合に、ELISA及びIFAの両方によって実証されるような類似の免疫原性が、第3フレーム(GP5.3)に基づいて設計された別のペプチド免疫原4050Kb(配列番号40)で見出された。したがって、フレーム3は、GP5 B細胞エピトープクラスター抗原提示のためのより有利な設計フレームとみなされた。
GP5及びMは、PRRSVエンベロープ内で最も豊富なタンパク質であり、これらの2つのタンパク質は、それらの外部ドメイン中にジスルフィド結合ヘテロダイマーを形成して、マクロファージの細胞表面上のシアロアドヘシンレセプター(CD163)に対するリガンドとして作用する。完全長M外部ドメインペプチド抗原(26merの長さ)を調製し、1:1及び1:10の比で完全長GP5外部ドメインペプチド免疫原4020Kb又は4020Kcと混合して、GP5外部ドメインペプチド抗原4020Kb及び4020Kcの両方の免疫原性に対するこの外部ドメインMペプチドの影響を評価した。
最適以下の免疫原性を有するGP5外部ドメインの中央ループ構造を提示するGP5ペプチド抗原4094a(C24−C48)を、子ブタにおける本研究に用いて、B細胞エピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性に対する様々な用量のPRRSV Thペプチドの効果を調査した。PRRSV Thエピトープクラスターペプチドの等比での混合物を、5%、10%、20%〜50%で4094aペプチド抗原(配列番号31)にさらに補充した。B細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及びT細胞エピトープクラスターペプチド抗原の両方を含むワクチン製剤を、30μg/mLの最適以下用量での初回及び追加免疫プロトコルを含む標準免疫化プロトコルによって子ブタに投与して、ペプチド抗原4094aの免疫原性に対するこのようなPRRSV Thペプチドの効果をモニタリングした(群1〜群4)。ELISAによって測定される免疫原性は、これらのモニタリングした群についてそれほど変化しなかったが、IFA力価により、天然PRRSV GP5タンパク質に対するこれらの子ブタにおいて誘発された抗ペプチド抗体の交差反応性の用量依存的な改善が実証された。比較のために、コンビナトリアルThエピトープを4094a(配列番号31)(群5)に共有結合させて含む、GP5 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原4094Kb(配列番号43)が、ペプチド抗原4094a単独と比較して改善された免疫原性を有することも示した。これらの短いPRRSV Thペプチド(配列番号47〜79)は、免疫化宿主を刺激後にPRRSVに曝露すると再現応答(recall response)によってPRRSVに対する細胞性免疫を開始することが知られているが、B細胞エピトープクラスターペプチド抗原に共有結合しなかった。改善されたIFA力価によって示される抗体反応性の質の改善により、このようなT細胞性免疫反応の利点が示唆された。PRRSVへの曝露時にPRRSVに対するサイトカイン産生を含む広範な細胞性免疫を開始するために、これらの厳選されたPRRSV Thペプチドを、すべての追跡負荷研究において、20%(重量/重量)でPRRSV B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原と共にワクチン製剤中に含めた。
GP2、GP3及びGP4タンパク質由来の抗原ペプチドに結合するポリクローナル抗体も、PRRSVに対する中和活性を示し、これらのPRRSVエンベロープの微量タンパク質も、PRRSVに対する臨床学的及びウイルス学的防御にいくらか関わっているという最新の知見を考慮して、表3に示すような特異的抗原ペプチドGP2Bエピトープ(V111−L136)(配列番号6)、GP3 Bエピトープ(C57−C75)(配列番号11)、GP4 Bエピトープ(C52−C69)(配列番号12)を、免疫原性及び交差反応性評価のために、PRRSV JXA1株配列に基づき設計し、候補ペプチド抗原として同定した。これらのBエピトープクラスターペプチド抗原を、そのN末端で人工コンビナトリアルThペプチド(配列番号35)に個々に結合し、モルモットにおける免疫原性評価のためのGP2、3、及び4 B細胞エピトープクラスター抗原ペプチド(配列番号44〜46)とした。
PRRSV GP2、3、4及び5タンパク質由来のB細胞エピトープクラスターペプチド抗原の各々について設計を改良した後、初回刺激については総ペプチド濃度30μg/mLで、及び追跡追加免疫については3wpiに15μg/mLで、標準エマルションベースワクチン製剤中に等比で混合したこれらのペプチドの組合せを、他のペプチド抗原と混合した(admixed)場合には個々のペプチド抗原の免疫原性についてテストし、且つ混合物中の1つ以上の抗原の免疫原性のいかなる意図されない抑制も評価及び回避するために、ペプチド抗原混合物の全体の免疫原性も評価した。この評価を行って、GP5/Mペプチド抗原混合物に対するMペプチドによる負の影響を回避した。
PRRSV感染からのブタの防御において、PRRSV GP5 B細胞エピトープクラスターペプチド抗原の有効性を証明するために、3つの連続した免疫化及び負荷研究が台湾動物技術研究所(ATIT)によって行われた。PRRSV GP5 Bエピトープクラスターペプチド抗原によって生成されたワクチン製剤を客観的に評価するために、すべての製剤をコード化した。ブタコレラ、仮性狂犬病、萎縮性鼻炎、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、口蹄疫、ブタ赤痢、疥癬、及びアクチノバチルス・プルロニューモニアを含めた病原体がないことを保証するために、SPFブタを定期的にモニタリングした。PRRS 1001S、1002S及び1003S研究のすべての群で、GP5 Bエピトープクラスターペプチド免疫原4020Kc(配列番号38)及び4052Kb(配列番号41)を使用し、いくつかの製剤パラメータにわずかな変動があった。これらの製剤は、4020Kc抗原ペプチドとして群1及び2で、ならびに4052Kb抗原ペプチド由来ワクチン製剤として群3及び4で等価であるとみなされた。プールされた等比のPRRSV Thエピトープペプチド混合物(JXA1配列に基づく配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、76)を10重量%でそれぞれのワクチン製剤に補充して、細胞性免疫を付与することによって、PRRSV GP5ペプチド抗原の免疫原性をさらに増強した。
各々のワクチン投与の前及び後の全ての子ブタを、局所の(反応源性及びアレルギー反応を含む)反応及び全身性の(呼吸困難、食欲、下痢、咳、CNS/SS、及びアレルギー反応を含む)反応についての臨床的観察に供した。研究の間、局所反応源性に関連した腫脹が時折見出されたが、わずか3〜4日間しか持続せず、それ以上の差は観察されずに正常な状態に戻った。研究対象の全ての動物について、全身性の有害反応は観察されなかった。
全ての免疫化ブタは、ウイルス負荷を受けた後のモニタリングの期間中、PRRSに特有の臨床徴候を示さなかった。
PRRSVに対する特異的抗体は、免疫化後に生成し、表14に示すように、4及び6wpi(免疫化後の週数)にIFAによって検出されたように、高力価に達した。表14に示すように、コントロール群の動物はいずれも、負荷ウイルスストックで表される場合にPRRSV GP5タンパク質の免疫原性が弱いという性質に大部分起因して、PRRSV負荷研究の後でもPRRSV GP5タンパク質に対する抗体を誘発しなかった。ワクチン接種群は、ウイルス負荷後2wpc(負荷後の週数)に、高いIFA力価を維持した。PRRSV GP5 Bエピトープクラスターペプチド抗原ワクチン製剤(群1及び2について4020KCならびに群3及び4について4052Kb)で免疫化した20頭の子ブタのうち18頭は、1つの病変も検出されることなく、完全に防御された(防御率90%)。群3及び4の子ブタのうち2頭には、軽微な病変が検出された。対照的に、図7A及び7Bに示すように、80%(4頭/5頭)のブタには、間質性肺炎の重度の病変が認められた。ATITのPRRSV研究室で行われた広範な負荷テストに基づいて、PRRSV GP5タンパク質のより高いIFA力価は、PRRSV負荷に対する完全防御とよく相関した。
PRRSVウイルス量検出のためにPR−PCR法を用いたところ、全てのワクチン接種ブタにおいて、検出可能なウイルス量は認められなかった。これは、肺における防御有効性の結果と一致している。これらの2つのウイルス株は、感染後に重篤な症状を引き起こさないが、20頭中18頭のワクチン接種ブタにおいて、ウイルス血症が認められず、かつ病理学的結果がまったく認められなかったことから、PRRSV GP5ベースのワクチン製剤によって付与される防御有効性の証明概念が実証された。
2006年、中国において、当初は知られていなかった、PRRSの症状を伴ういわゆる「高熱」病の未曾有の大規模流行があり、これは10を超える省(自治都市又は自治区)に蔓延して、2,000,000頭を超えるブタに発症し、約400,000頭の致死例を出した。典型的なPRRSとは異なり、多数の成熟雌ブタも「高熱」病に感染した。この非定型PRRSの大流行は、当初、神経症状(例えば、震え)、高熱(40〜42℃)、紅斑性白化皮疹などを示すブタコレラ様疾患として同定された。免疫学的分析と共に行われた剖検により、複数の臓器が高病原性PRRSVに感染していることが明確に示され、重度の病理学的変化が観察された。「Emergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark」におけるKegong Tianら(2007 PLosOne doi: 10.1371/ journal.pone.0000526)による協力で、ブタ感染モデルが中国において確立され、12頭のSPFブタ(1群当たり4頭の子ブタ)の負荷のために、異なる起源を有する3つの代表的なPRRSV分離体(JXA1、HEB1、及びHUB2)を用いて、分離PRRSVの高病原性を再現した。
4週齢の子ブタを、ペプチドベースのPRRSVワクチン製剤で1回又は2回、2週間の間隔でワクチン接種した一方、1群はワクチン未接種コントロールとして保持した。それらの全ての子ブタを、PRRSV NVDC−JXA1高抗原性ウイルス3mL(10E5 TCID50を含む)を用いて耳の後ろに筋肉注射で負荷した。体温を21日間毎日観察した。この負荷研究は、5頭中5頭の動物が負荷時に発熱を伴う病気になり、かつ5頭中少なくとも2頭の動物が死亡する場合に、妥当とみなす。ワクチンが防御的であるとみなされるためには、免疫化したブタの5頭中少なくとも4頭が健康を維持していることが必要である。
上述のようにPRCの農業部刊行のガイドラインに従って、合計35頭のブタを血清陰性についてスクリーニングし、そのうち30頭をこの負荷研究のために選択した。詳細な動物の選択、ランダム化、グループ化、免疫化及び負荷研究、温度観察及び記録、ならびに死亡数を以下に記載する。
PRRSVは、主要な糖タンパク質であるGP5と、3つの他の微量な糖タンパク質、すなわち、GP2a、GP3、及びGP4を、ビリオンエンベロープ上に含み、これらの全てが感染性ビリオンの生成に必要である。GP4とGP5タンパク質との間に強い相互作用が存在することが見出されたが、他の微量なエンベロープ糖タンパク質(GP2及びGP3)とGP5との間の弱い相互作用も検出されており、その結果、多タンパク質複合体の形成を生じる。全体として、GP4タンパク質は、糖タンパク質間の相互作用を媒介するために重要であり、感受性宿主細胞へのウイルス侵入のためにCD163との相互作用を媒介する原因となるGP5に加えて、GP2aと共に、ウイルス付着タンパク質としての役割を果たすという結論に達した。
実施例1に示すように、プレートコーティングのための混合物としてPRRSVヌクレオカプシドタンパク質由来の2つの抗原ペプチド(4171e、配列番号1及び4172e、配列番号2)を組合せた後、PRRSV感染動物を検出するためのトレーサーとしてタンパク質−HRPコンジュゲートを用いることにより、UBI PRRSV NC ELISAテストキットを確立した。このテストを、効果的なPRRSVマーカーペプチドワクチンの免疫原性をモニタリングするためにカスタマイズされた標的ペプチドベースのELISAと併用して、感染動物とワクチン接種動物の識別のためのPRRSV DIVAシステムを形成することができる。
マーカーワクチン製剤に用いられるPRRSV Bエピトープクラスターペプチド抗原は、PRRSVヌクレオカプシドタンパク質由来の抗原ペプチドを含まない一方、感染ブタは通常、この主要な構造タンパク質に対する早期抗体を発現しているので、感染動物とワクチン接種動物を識別するための診断システム、従って診断DIVAシステムに、PRRSV NC ELISA及びPRRSV Bエピトープマーカーワクチン標的ペプチドベースのELISAを組み込むことは論理的である。
この農場は、少なくとも2年間、UBIのPRRSVペプチドベースのマーカーワクチンを用いたワクチン接種プログラムを継続する。農場内の全てのブタを、0週間、4週間及び8週間、免疫化スケジュールを用いてワクチン接種し、少なくとも6ヶ月間モニタリングする。NC及びマーカーワクチン標的ペプチドに対する血清抗体力価を、PRRSVウイルス血症レベルと共に、PRRSV NC ELISA、IFA及び定量的PCR(qPCR)を含めたアッセイによってモニタリングする。ワクチン接種プログラム開始6ヶ月後、ワクチン接種を受けた母親から生まれた子ブタはワクチン接種を受けずに、これらの子ブタにおける感染率についてUBI PRRSV NCによって1〜3ヶ月間モニタリングする。全ての子ブタがUBI PRRSV NC ELISAでの陰性反応性を示せば、この農場は、PRRSV感染に対して制御下にあるとみなすことができる。この農場はその後、先にPRRSV感染していた全てのブタを退去させる。このような退去までは、農場内の全てのブタは、PRRSVペプチドベースのマーカーワクチンで継続的にワクチン接種する。
UBIのPRRSV NC ELISA及びPRRSVマーカーワクチン標的ペプチドベースのELISA、したがってDIVAは、この農場の全ての動物由来の血清を、反応性一貫性についてモニタリングするのに用いることができる。PRRSV NC ELISAから導き出される陽性率(%)及び平均OD値は、ワクチン接種及びモニタリングの期間中記録される。
DIVAによる血清学的手段によってモニタリングされる、パイロットPRRSV排除研究は、通常のPRRSV感染農場において、多成分PRRSVペプチド免疫原を含む油中水型(ISA50)エマルションベースのワクチン製剤を用いることによって行われ、このような多成分PRRSVペプチド免疫原ベースのワクチン製剤を受けた動物による、PRRSV NC抗体陰性化の潜在力を評価した。
Claims (14)
- ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ワクチン組成物であって、
該ペプチド抗原が、
a)配列番号9、13、14、15、16、31、32、又は33で表されるGP5.3 B細胞エピトープクラスターアミノ酸配列であるか;
b)前記a)GP5.3 B細胞エピトープクラスターアミノ酸配列に、スペーサーを伴うか又は伴わずに、共有結合したTヘルパーエピトープであるか;又は
c) 前記a)又は前記b)の任意の組合せである;
上記PRRSワクチン組成物。 - 前記GP5.3 B細胞エピトープクラスターアミノ酸配列が、配列番号9である請求項1記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記GP5.3 B細胞エピトープクラスターアミノ酸配列が、配列番号13、14、15、16、31、32、及び33からなる群から選ばれる請求項1記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記組成物が、
i)配列番号10、17、18、19、又は20で表されるGP2 B細胞エピトープクラスターを有するアミノ酸配列;
ii)配列番号11、21、22、23、又は24で表されるGP3 B細胞エピトープクラスターを有するアミノ酸配列;
iii)配列番号12、25、26、27、又は28で表されるGP4 B細胞エピトープクラスターを有するアミノ酸配列;及び
iv) i)、ii)及び/又はiii)のいずれかの組み合わせ;
からなる群から選ばれる、さらなるペプチド抗原をさらに有する、請求項1〜3のいずれか1項記載のPRRSワクチン組成物。 - さらなるペプチド抗原が、配列番号44、45、46、又はそれらの組み合わせによって表されるアミノ酸配列である請求項4記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記組成物が、1を超えるペプチド抗原を有する、請求項1〜5のいずれかに記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記b)Tヘルパーエピトープが、スペーサーを介して、前記ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合する、請求項1〜6のいずれかに記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記Tヘルパーエピトープが配列番号35である、請求項7記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記Tヘルパーエピトープが、ε−リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、請求項7又は8に記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記スペーサーが配列番号36である、請求項9に記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記抗原ペプチドに結合されていないTヘルパーエピトープをさらに有し、該Tヘルパーエピトープが配列番号47〜90からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記ペプチド抗原の総量が約10μg〜約1mgである、請求項1〜11のいずれか1項に記載のPRRSワクチン組成物。
- 前記送達ビヒクル及びアジュバントが、油中水型エマルションを生成するための、植物油及びオレイン酸マンニド(mannide oleate)を有してなる油性ワクチンアジュバント組成物、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載のPRRSワクチン組成物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のPRRSワクチン組成物を投与する工程を有する、PRRS感染に対して子ブタを防御する方法。
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