KR20140110013A - 돼지 생식기 호흡기 증후군 (prrs)의 효과적인 제어를 위한 합성 펩티드-기반 마커 백신 및 진단 시스템 - Google Patents

돼지 생식기 호흡기 증후군 (prrs)의 효과적인 제어를 위한 합성 펩티드-기반 마커 백신 및 진단 시스템 Download PDF

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Abstract

돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)에 대한 펩티드-기반 마커 백신, 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)의 예방, 모니터링 및 제어를 위한 면역진단 시험 세트가 개시되어 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 백신 제제는 PRRSV GP2, GP3, GP4 또는 GP5 단백질로부터 유도된 펩티드의 혼합물을 함유하고; 각각의 펩티드는 각각의 펩티드의 면역원성의 증진을 위해 인공 T 헬퍼 에피토프에 개별적으로 연결된 B 세포 PRRSV 중화/수용체 결합 에피토프를 개별적으로 함유하고; 이는 세포 매개 면역을 제공하기 위해 PRRSV GP4, GP5, M 및 뉴클레오캡시드 단백질로부터 유도된 T 헬퍼 에피토프를 나타내는 펩티드의 혼합물로 보충될 수 있다. 이러한 바이러스 펩티드 조성물은 백신 제제로서 허용되는 전달 시스템으로 제조되며, PRRSV 항체가 없는 돼지의 PRRSV 시험접종 후의 감염으로부터의 교차 보호를 제공할 수 있다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)의 효과적인 제어를 위한 합성 펩티드-기반 마커 백신 및 진단 시스템 {SYNTHETIC PEPTIDE-BASED MARKER VACCINE AND DIAGNOSTIC SYSTEM FOR EFFECTIVE CONTROL OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (PRRS)}
본 개시내용은 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)에 대한 펩티드-기반 마커 백신 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)의 모니터링 및 제어를 위한 면역진단 시험 세트에 관한 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)는 암퇘지 및 어린 암퇘지에서의 중증 생식 부전의 원인으로서 1980년대 후반에 발견되었으며, 돼지 산업에서 가장 중요한 병원체 중 하나이다. 암퇘지 및 어린 암퇘지의 감염은 후기 유산, 조기 분만, 및 선천적으로 허약한 새끼 돼지의 출생을 유발할 수 있는 반면, 감염된 수퇘지는 감소된 정자 품질 및 정액 중 바이러스 배출을 나타낸다.
추가로, PRRSV는 2차 바이러스 및 박테리아 감염과 함께 호흡 문제를 유발하는 어린 돼지에서의 돼지 호흡기 질환 합병증에 관여하는 것으로도 또한 밝혀졌다. 바이러스는 폐포 대식세포가 주요 표적 세포가 되는 제한된 생체내 세포 향성을 나타낸다.
PRRSV는 9개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로 이루어진, 대략 15kb 길이의 아르테리비리다에(Arteriviridae) 과 니도비랄레스(Nidovirales) 목 (1)의 외피보유 양성 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 비리온은 바이러스 RNA와 회합된 뉴클레오캡시드 단백질 (오픈 리딩 프레임 7, ORF7에 의해 코딩됨)에 의해 구축되는 뉴클레오캡시드 코어로 구성된다. 뉴클레오캡시드는 6종의 구조 단백질: 당단백질 GP2 (ORF2a), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) 및 GP5 (ORF5), 및 비-글리코실화 단백질 M (ORF6) 및 E (ORF2b)가 박혀 있는 지질 외피로 둘러싸여 있다. GP5 및 M은 외피에 가장 풍부한 단백질인 것으로 간주되는 반면, 다른 외피 단백질은 보다 적은 양으로 존재한다. 게놈의 5' 말단에 위치한 ORF1a 및 ORF1b는 비-구조 단백질을 코딩한다.
다수의 다른 RNA 바이러스와 유사하게, PRRSV는 큰 유전적 가변성을 나타내며, 이는 바이러스 단백질의 병독성, 면역계와의 상호작용 및 항원 특성에서의 다양성에 반영된다. 유전자형 내에서 고도의 가변성이 존재할지라도, 바이러스 균주는 통상적으로 ORF5 및/또는 ORF7 서열에 기반하여 유럽 (EU) 및 북아메리카 (NA) 유전자형으로 분류된다.
PRRSV는 숙주의 보호 면역으로부터의 탈출을 허용하는 다수의 특성을 획득하였다. 이들 특성은 감염 1 또는 2주 후의 바이러스-특이적 항체의 늦은 생산이고; 이러한 항체는 1차 돼지 폐포 대식세포 (PAM)에서의 시험관내 바이러스 복제를 감소시킬 수 없으며; 정말 필요한 바이러스-중화 항체는 감염 약 3 내지 4주 후에 낮은 수준으로 나타나고, 따라서 바이러스혈증의 급성기에 영향을 미치기에는 너무 늦다 (1, 2).
이러한 약한 바이러스-중화 항체 반응에도 불구하고, 감염 발생시의 충분한 양의 이러한 바이러스-중화 항체의 존재는 폐에서의 바이러스 복제, 바이러스혈증, 및 바이러스의 태반경유 확산에 대한 보호를 제공할 수 있으며, 이는 PRRSV-특이적 중화 항체가 보호 면역에 부분적으로 기여할 수 있다는 것을 나타낸다 (2,3).
PRRS 바이러스혈증은 중화 항체를 갖는 감염된 돼지의 혈액에서 발견되었으며, 이는 체액성 면역 반응 단독으로는 확실한 보호를 부여하지 않았다는 것을 나타낸다. 세포-매개 면역 (CMI)은 PRRSV를 제거하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있다 (4). 림프구 배발생 및 적응성 시토카인 (예를 들어, 인터페론 감마; IFN-감마) 생산에 의해 결정시, 감염된 돼지에서의 CMI 반응의 발생은 지연되는 것으로 밝혀졌고, 감염 약 4-8주 후에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 시험관내 리콜 반응에서 검출가능하게 되었으며, 이는 중화 항체의 발생과 상호연관되었다 (5-7). IFN-감마는 동물에서의 다양한 세포병변 바이러스 감염에 대한 세포-매개 면역 반응에서 핵심 역할을 한다. PRRSV-감염된 돼지에서, IFN-감마 mRNA는 림프절, 폐 및 말초 혈액 단핵 세포에서 검출되었다 (7).
B 세포 에피토프를 유도하는 바이러스-중화 항체 및 T 세포 에피토프를 도출하는 IFN-감마를 나타내는 전체 PRRSV 구조 프로테옴 전반에 걸친 항원 영역 검색은 지난 20년간 수의학 바이러스 면역학에서 가장 도전적인 주제 중 하나였다. 전세계 PRRSV 연구 커뮤니티에 의한 누적된 노력의 결과로서 이러한 에피토프 맵핑 결과를 보여주는 대표적인 논문이 본원에 참고문헌으로서 제공되어 있다 (8-10).
사멸된 PRRSV 바이러스 용해물 백신 뿐만 아니라 변형-생백신 (MLV)의 상업적 유용성에도 불구하고, PRRSV 관련 질환의 제어는 여전히 문제로 남아 있다. 1가지 주요 문제점은 효능인데, 즉 PRRSV 백신이 동종 시험접종에 대해서는 효능이 있지만 이종 시험접종에서는 그렇지 않다는 것이다. 또한, MLV에 대한 안전성 이슈가 해당 분야에서 보고된 바 있다. 변형 생백신은, 임신중인 암퇘지, 어린 암퇘지에서 사용하기에 적합하지 않으며, 백신접종이 정액 중 백신 바이러스의 누출을 일으킬 수 있기 때문에 수퇘지에서도 적합하지 않다. 변형 생 바이러스 백신은 백신접종된 동물에서 유지될 수 있다. 비-백신접종된 동물로의 전염 및 후속적인 백신-바이러스-유발 질환이 보고된 바 있다. 추가로, 감염된 돼지와 백신접종된 돼지 사이의 구별을 허용하여 이에 따라 PRRSV 감염의 추적 및 제어를 용이하게 하기 위한 마커 백신의 개발에 대한 긴급한 필요성이 있다.
요약하면, 보호 항체 및 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 특징적인 기능성 B 및 T 세포 에피토프를 포함하는 면역원성 PRRSV 펩티드, 뿐만 아니라 이들 디자이너 펩티드를 혼입시켜 돼지에서의 PRRSV 균주의 교차-보호를 허용하기 위한 백신 제제를 설계할 긴급한 필요성이 남아 있다. 이들 합리적으로 설계되고 분자적으로 특성화된 면역원성 펩티드의 이용가능성과 함께, 감염된 돼지로부터의 항체에 의해 인식될 수 있는 항원성 펩티드를 확인할 필요성, 및 이들 디자이너 펩티드를 사용하여 PRRSV 감염의 효과적인 제어를 허용하는 감염된 동물 대 백신접종된 동물의 혈청학적 확인을 위한 진단 시험 세트, 이에 따른 진단 시스템을 개발할 필요성이 또한 존재한다. 최종적으로, PRRS 질환을 효과적으로 모니터링 및 제어하기 위한 광범위한 용도를 위해, 이러한 펩티드-기반 마커 백신 및 진단 시스템의 저가 제작 및 품질 관리를 위한 수단을 개발할 필요성이 있다.
참고문헌:
Figure pct00001
Figure pct00002
발명의 간단한 설명
본 개시내용은 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)에 대한 펩티드-기반 마커 백신, 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)의 예방, 모니터링 및 제어를 위한 면역진단 시험 세트에 관한 것이다.
구조적 PRRSV 프로테옴 전반에 걸친 항원 영역에 대한 이용가능한 과학 정보에도 불구하고, 수십 년의 노력 후에도 감염원에 대한 어떠한 성공적인 펩티드 기반 백신도 개발하지 못한 연구 커뮤니티의 무능으로 인해, 대다수의 병원체에 대해 합성 펩티드 백신이 생산되는 일은 일어나지 않을 것이라는 의견을 갖는 사람들도 있다. 본 발명자는 선택적 PRRSV B 및 T 세포 에피토프를 혼입시키는 합리적 설계 접근법이 목적 바이러스 균주에 대한 합성 펩티드 기반 PRRSV 백신(들) 및 질환의 모니터링 및 제어를 위한 동반 진단 시험의 유효성 확인 및 개발을 허용해야 한다는 점에서 제1 세대 생물학적 백신으로부터 많은 것을 배웠다. B 세포 중화 에피토프가 주로 입체형태적임을 인지하는 것이 중요하며, B 세포 에피토프 관련 펩티드 면역원을 설계할 때 고려되어야 한다. 적절한 B 항원성 에피토프의 확인 및 설계는 표적화된 분자의 구조와 그의 기능 사이의 관계의 이해를 요구할 것이다. 면역원 설계에 적용되는 표적 분자의 구조 및 기능을 이해하는데 있어서의 이러한 원칙은 본 발명자에 의해 "기능적 항원성"으로 지칭된다. 또한, 면역 반응은 복합적이고 다중-측면의 것이다. 준-종 집단으로서 존재하는 빠르게 진화하는 RNA 바이러스에 대한 백신은 항상, 숙주의 면역계를 탈출하는 바이러스 변이체의 등장의 위험을 최소화하기 위해 가능한 한 다수의 상이한 보호 면역 메카니즘을 자극하는 것을 목표로 해야 한다.
성공적인 합성 펩티드 기반 백신은 적응성 및 선천성 면역을 포함하는 면역계의 적절한 구성요소를 자극하는 성분을 포함할 것이다. 에피토프 기반 펩티드 백신을 개발하는데 있어 또 다른 주요 장애물은 이들 에피토프를 나타내는 짧은 길이 펩티드의 비-면역원성 성질에 부분적으로 기인한다. 또한, 병원체의 유전적 변이 뿐만 아니라 숙주의 유전적 가변성으로부터 발생하는 광범위한 교차-보호에 대한 백신의 보편성을 허용하기 위해, B 및 T 에피토프의 큰 레퍼토리의 혼입에 대한 필요성이 있다. 다양한 질환에 대한 합성 펩티드-기반 백신 및 진단 시험에 대한 광범위한 노력 및 실험적 유효성 확인과 함께, 본 발명자는 목적 면역원성의 증진에 적합한 T 세포 에피토프에 의해 보충되는 시험관내 및 생체내 혈청학적 및 기능적 연구를 위한 항체의 도출을 위한 천연 표적 분자 상의 항원 부위를 모방하는 펩티드 면역원의 합리적 설계에 초점을 맞춰왔다. 이는 임상 및 상업 용도를 위한 각각의 표적 질환에서의 최적화된 항원, 면역원 및 백신 제제로 이어졌다 (11-20).
본 발명의 다양한 실시양태에 따른 백신 제제는 PRRSV GP2, GP3, GP4 또는 GP5 단백질로부터 유도된 펩티드의 혼합물을 함유하고; 각각의 펩티드는 각각의 펩티드의 면역원성의 증진을 위해 인공 T 헬퍼 에피토프에 개별적으로 연결된 B 세포 PRRSV 중화/수용체 결합 에피토프를 개별적으로 포함하며; 이는 세포 매개 면역을 제공하기 위해 PRRSV GP4, GP5, M 및 뉴클레오캡시드 단백질로부터 유도된 T 헬퍼 에피토프를 나타내는 펩티드의 혼합물로 보충될 수 있다. 이러한 바이러스 펩티드 조성물은 백신 제제로서 허용되는 전달 시스템으로 제조되며, PRRSV 항체가 없는 돼지의 PRRSV 시험접종 후의 감염으로부터의 교차 보호를 제공할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태에 따른 진단 시스템은, 한 시험은 PRRSV-감염된 동물로부터의 최적 항체 인식에 대한 ELISA 면역검정 포맷으로 2종의 중첩 PRRSV ORF7-코딩된 항원성 펩티드를 제공하고, 다른 시험은 PRRSV 펩티드 백신 면역화 동물로부터의 최적 항체 인식에 대한 ELISA 면역검정 포맷으로 GP2, GP3, GP4 및 GP5 유도된 백신 표적 펩티드를 제공하는 진단 시험 세트를 함유한다. 조합으로, 이들 진단 시험은 백신접종된 동물로부터의 감염된 동물의 구별 (Differentiation of Infected from Vaccinated Animals (DIVA)), 이에 따른 질환의 효과적인 모니터링 및 제어를 위한 진단 시스템을 구성한다.
이것은 또한, PRRSV 감염에 대해 돼지를 보호하기 위한 이러한 백신의 제조, 및 DIVA (이에 따른 질환의 효과적인 제어 허용)를 위한 면역진단 시험 세트의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드 또는 펩티드 조성물은 천연 바이러스와의 교차-반응성을 위한 마커 백신의 개발, PRRSV 항체가 없는 새끼 돼지의 PRRSV 시험접종 후의 감염으로부터의 교차 보호, 및 백신접종된 동물로부터의 감염된 동물의 구별을 위한 펩티드 기반 ELISA 세트의 개발을 위한 표적 종에서의 광범위한 혈청학적 유효성 확인 과정에 의해 설계 및 최적화된다.
본 개시내용은 구체적으로 펩티드의 면역원성을 증진시켜 면역화된 숙주에서 PRRSV와 교차반응성인 항체의 고역가를 비롯한 체액성 면역을 유도하기 위해 각각의 펩티드가 T 헬퍼 에피토프에 임의로 연결되어 있는 PRRSV GP2, GP3, GP4 또는 GP5 단백질의 B 에피토프 기원의 펩티드 및 펩티드 조성물을 포함하는 PRRSV 백신에 관한 것이다.
펩티드 또는 펩티드 조성물은 세포-매개 면역 반응을 마운팅하기 위해 백신 제제에서 PRRSV GP4, GP5, M 및 뉴클레오캡시드 단백질의 T 세포 에피토프를 나타내는 추가의 펩티드에 의해 추가로 보충된다.
본 발명의 다양한 실시양태가 제공된다. 실시양태의 한 세트는 감염된 동물로부터의 뉴클레오캡시드 (NC) 단백질에 대한 항체의 검출을 위한 항원으로서 효과적인 펩티드(들) 및 펩티드 조성물(들)에 관한 것이다. 실시양태의 제2 세트는 백신접종된 동물로부터의 마커 백신 표적화된 GP2, GP3, GP4 및 GP5 에피토프에 대한 항체의 검출에 효과적인 펩티드 및 펩티드 조성물에 관한 것이다. 이들 진단 시험은 DIVA, 이에 따른 질환의 효과적인 제어를 위한 진단 시스템을 구성한다.
PRRSV 단백질의 B 및 T 세포 에피토프 둘 다로부터 유도된 펩티드(들), 그의 상동체 및 유사체에 관한 실시양태의 또 다른 세트가 있다. 이러한 PRRSV 펩티드는 그의 각각의 면역원성을 증진시키기 위해 우선적으로, 그러나 임의로, 인공 조합 T 헬퍼 에피토프에 연결된다.
또한, 실시양태의 또 다른 세트는, 천연 PRRSV 단백질 항원과 교차반응성인 항체 반응 및 세포 매개 면역 반응 둘 다를 함께 도출하여 돼지를 PRRSV 감염에 대해 보호하기 위한 PRRSV B 및 T 세포 에피토프 유래된 펩티드 면역원으로부터의 펩티드 및 펩티드 조성물을 포함하는 백신 제제에 관한 것이다.
각각의 이러한 설계된 펩티드는 산업 용도를 위해 밀리그램 내지 킬로그램 규모로 화학적으로 합성될 수 있고, 품질 제어될 수 있다.
또한, 본 발명의 다양한 실시양태에 의해 백신 제제에 일상적으로 혼입되는 전달 비히클 및 다른 성분이 제공된다.
도 1a. 본 발명의 한 실시양태에 따른, 공동-형질감염된 HTK 세포주 세포의 세포질 내부의 PRRSV GP5 단백질에 대한 항체를 면역형광에 의해 검출하기 위한 메카니즘을 보여주는 예시.
도 1b. 도 1a에 기재된 메카니즘에 따라 수행한 면역형광 검정 (IFA). 세포질 내부의 GP5에 결합된 PRRSV GP5 단백질에 대한 항체를 갖는 공동-형질감염된 HTK 세포주 세포를 검출하였다.
도 2a. PRRSV MD001 균주 (등록 번호 AF121131)의 뉴클레오캡시드 (NC) 단백질 상의 항원 부위의 위치결정, 및 감염된 동물에서의 NC 단백질에 대한 항체의 검출을 위한 UBI PRRSV NC ELISA에 사용하기 위한 항원성 펩티드 (서열 1)의 확인.
도 2b. PRRSV MD001 균주 (등록 번호 AF121131)의 뉴클레오캡시드 (NC) 단백질 상의 항원 부위의 위치결정, 및 감염된 동물에서의 NC 단백질에 대한 항체의 검출을 위한 UBI PRRSV NC ELISA에 사용하기 위한 항원성 펩티드 (서열 2)의 확인.
도 3. PRRSV 균주 MD001 (서열 3), JXA1 (서열 4), NA (서열 5) 및 EU (서열 6)로부터의 상동성 뉴클레오캡시드 단백질 서열에 대한 정렬.
도 4. 마커 백신 설계를 위해 적합화된 PRRSV JXA1 균주 (등록 번호 AY2G2352)의 PRRSV ORF 2 내지 ORF 7 단백질 상의 선택된 B 및 T 세포 에피토프의 위치결정.
도 5. UBI PRRSV NC NA ELISA로 시험된 다양한 기원으로부터의 돼지 혈청의 혈청반응성.
도 6a. UBI PRRSV 마커 백신 제제는 UBI의 진단 시스템 (즉, PRRSV 감염된 돼지를 검출하기 위한 시험, 및 GP2, 3 및 4 단백질로부터 유도된 디자이너 펩티드 면역원을 함유하는 백신 제제를 투여받은 동물을 검출하기 위한 시험)에 의해 검출 및 구별시, PRRSV 감염된 돼지에서 표적 펩티드 면역원에 대한 특이적 고역가 항체를 도출하였다.
도 6b. UBI PRRSV 마커 백신 제제는 UBI의 진단 시스템 (즉, PRRSV 감염된 돼지를 검출하기 위한 시험, 및 GP3, 4 및 5 단백질로부터 유도된 디자이너 펩티드 면역원을 함유하는 백신 제제를 투여받은 동물을 검출하기 위한 시험)에 의해 검출 및 구별시, PRRSV 감염된 돼지에서 표적 펩티드 면역원에 대한 특이적 고역가 항체를 도출하였다.
도 7a. PRRS 바이러스 시험접종 후의 조직병리학적 병변을 보여주는 사진. 간질성 폐렴을 앓는 대조군으로부터의 동물은 폐에서 림프구성 세포에 의한 폐포 벽의 후벽화를 나타내었다.
도 7b. PRRS 바이러스 시험접종 후의 조직병리학적 병변을 보여주는 사진. 동물을 UBI PRRS GP5 펩티드 백신 제제에 의해 면역화하였다. 폐는 정상 폐포 벽을 유지하였다.
펩티드 항원은 면역학적 반응을 검출할 수 있으며, 특정 펩티드 항원은 또한 면역학적 반응을 자극할 수 있다. 다수의 펩티드 항원이 면역 반응의 민감적 및 특이적 검출에 사용될 수 있으나, 매우 종종 이들은 그 자체로 면역원으로서 작용하지 않는다. 펩티드 면역원은 면역 반응을 자극하고, 뿐만 아니라 이를 검출하는데 사용될 수 있는 펩티드 항원의 특별한 부류이다. 본 발명의 한 실시양태에 따르면, PRRSV 백신에서의 펩티드 항원은 보호 면역 반응의 생성을 자극하기 위해 함께 작용하는 B 세포 (B) 및 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프 둘 다를 갖는 펩티드 면역원이고, PRRSV 감염에 대한 면역 반응을 검출할 수 있는 펩티드 항원의 다양한 세트도 또한 존재한다.
B 세포 에피토프의 확인을 위한 1가지 방법은 전형적으로 길이가 20 내지 60개 잔기의 범위이거나 또는 더 긴 다중 길이의 내포 및 중첩 펩티드의 세트에 의존한다. 상기의 더 긴 펩티드는 힘든 일련의 독립적 고체-상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 생성된 내포 및 중첩 펩티드의 세트는 이어서 불연속 입체형태적 B 세포 에피토프를 비롯한 면역우성 결정자를 가장 잘 제시하는 펩티드를 확인하기 위해 항체 결합 연구에서 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태는 하나가 70개 아미노산 서열 (서열 1, 또한 도 2a에 도시됨)을 포함하고, 또 다른 하나가 73개 아미노산 서열 (서열 2, 또한 도 2b에 도시됨)을 포함하며, 각각은 최적 항체 인식을 위한 고유의 B 세포 에피토프 클러스터를 갖는, 2종의 중첩 PRRSV ORF7-코딩된 뉴클레오캡시드 펩티드를 제공한다. 이들 항원성 펩티드는 PRRSV-감염된 새끼 돼지로부터의 혈청 샘플 및 ELISA 면역검정 포맷을 사용하여 실험적으로 확인 및 최적화되었다. 펩티드 항원을 포함하는 항체 포획 상에 적합화될 수 있는 임의의 면역검정 포맷, 예를 들어 ELISA는 PRRSV-감염된 돼지로부터의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 중의 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질의 특정한 단편에 결합하는 항체를 검출 및 정량화하는데 사용될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 전장 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2 내지 71에 상응하는 약 70개 아미노산의 최적화된 PRRSV 항원성 펩티드 (서열 1), 및 전장 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 잔기 51 내지 123에 상응하는 약 73개 아미노산의 또 다른 최적화된 PRRSV 항원성 펩티드 (서열 2)가 확인되었다. 2종의 펩티드를 등비의 혼합물로 합하여, 감염된 돼지에서의 ELISA에 의한 PRRSV에 대한 항체의 검출을 위한 가장 최적의 항체 포획 상을 구성하였다. 이들 2종의 고도로 항원성인 펩티드는 둘 다 면역우성 B 세포 에피토프의 클러스터를 갖는 것으로 밝혀졌으며, PRRSV 양성 혈청 패널에 대해 가장 중요하고 지속적인 항원성을 가졌다. PRRSV 뉴클레오캡시드 펩티드 (예를 들어, 서열 1 및 2)를 포함하는 진단 시험 키트의 제조 및 용도는 본 발명의 다양한 예시적 실시양태의 범위 내에 있다.
PRRSV 항원성 펩티드 발명의 특정 실시양태는 PRRSV의 돌연변이체 및 변이체 균주로부터의 상응하는 서열 및 입체형태적 구성요소를 갖는 서열 1 및 2의 면역학적으로 기능성인 상동체인 것으로 추가로 정의된다. 상동성 PRRSV 항원성 펩티드는 기원 변이체 PRRSV 북아메리카 균주의 뉴클레오캡시드 단백질 위치 대략 2 내지 71 및 51 내지 123과 상호연관된 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 상동체는 서열 정렬 프로그램, 예컨대 클러스탈W(ClustalW) (독일 소재의 유럽 분자 생물학 실험실의 줄리 디. 톰슨(Julie D. Thompson), 토비 깁슨(Toby Gibson) 및 영국 캠브리지 소재의 유럽 생물정보학 연구소의 데스몬드 히긴스(Desmond Higgins)에 의해 제조됨. 알고리즘)를 통해 용이하게 입증된다. 도 3은 PRRSV MD001 타이완/99Y/AF121131 (서열 3), JXA1 베이징/06Y/EF112445 (서열 4), NA/NJ-a/04Y/AY37282 (서열 5), EU/레나/08Y/EU 909691 (서열 6)의 다양한 균주로부터 취한 4개의 항원 서열의 클러스탈W에 의한 정렬을 보여준다. 도 3에 정렬된 뉴클레오캡시드 상동체의 기원 PRRSV 균주는 유럽 균주의 바이러스를 포함한다. 표 1은 또한 EU가 기원 PRRSV 균주 (유럽 균주/08V204/벨기에/EU/GU737266)인 항원성 펩티드 서열 1 및 서열 2 (북아메리카 균주/MD001/TW/AAC98536)의 상동체 (서열 7 및 서열 8)를 예시한다. 한 실시양태에서, 서열 1에 대한 상동체 (서열 7)는 EU 균주로부터의 PRRSV NC 단백질의 아미노산 위치 대략 2 내지 아미노산 위치 대략 72의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상동체 (서열 8)는 EU 균주로부터의 PRRSV NC 단백질의 아미노산 위치 대략 52 내지 아미노산 위치 대략 128의 아미노산 서열을 갖는다. 이들 2종의 상동성 펩티드를 유사하게 등비의 혼합물로 합하여, 감염된 돼지에서의 ELISA에 의한 PRRSV, 바람직하게는 유럽 균주에 대한 항체의 검출을 위한 가장 최적의 항체 포획 상을 구성할 수 있다.
본 발명의 상동체는 서열 1 및 서열 2에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 것으로서 추가로 정의된다. 한 실시양태에서, 변이체 균주 상동체 (서열 7)는 서열 1에 대해 약 50% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 균주 상동체 (서열 8)는 서열 2에 대해 약 64% 동일성을 갖는다.
감염된 동물의 혈청 샘플로부터의 항체의 검출에 유용한 PRRSV NC 단백질로부터 확인된 항원성 펩티드 뿐만 아니라, 중화 및/또는 수용체 결합 기능적 부위에 상응하는 PRRSV GP2, GP3, GP4 및 GP5 단백질 상에 존재하는 항원 영역이 존재한다. 표적 펩티드 기반 ELISA에 의한 그의 각각의 면역원성의 평가를 위해, 보다 중요하게는 본 발명의 한 실시양태에 따른 면역형광 검정 (IFA)에 의한 천연 PRRSV 단백질에 대한 도출된 항체의 교차반응성을 위해 이들 에피토프 영역 주변에서 다양한 펩티드 면역원이 설계되었다. 또한, PRRSV GP4, GP5, M 및 NC 단백질 상에 존재하는, 관련 증거가 많은 면역우성 T 세포 에피토프가 존재한다. 이들 T 헬퍼 부위로부터의 펩티드는 동물에서의 다양한 세포병변 바이러스 감염에 대한 세포-매개 면역 반응에서 핵심 역할을 하는 시토카인 (IFN-감마 포함) 생산을 유발하는 돼지에서의 림프구 증식 반응을 촉발시킬 것이다.
도 4에 나타낸 바와 같은 한 실시양태는 PRRSV JXA1 (등록 번호 AY2G2352)의 서열에 기반한 PRRSV ORF 2 내지 ORF 7 코딩된 (GP2, GP3, GP4, GP5, M 및 N) 단백질 상의 본 발명의 선택된 B 및 T 세포 에피토프의 분포 및 위치를 예시한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 4개의 최적화 및 선택된 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드의 서열, 즉 GP5.3 (V21-E65) (서열 9), GP2 B (V111-L136) (서열 10), GP3B (C57-C75) (서열 11) 및 GP4B (C52-C69) (서열 12)를 제공한다. 이들 B 세포 에피토프 클러스터는 중화 및 수용체 결합 특징을 갖는 부위 주변에 위치한다.
본 발명의 다른 실시양태는 이들 4종의 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 제공한다. 표 3은 기원 균주가 MD001, JXA1, NA 및 EU인 상동성 GP5 (서열 13-15), GP2 (서열 17-19), GP3 (서열 21-23) 및 GP4 (서열 25-27) 유도된 B 에피토프 클러스터 펩티드 서열에 대한 정렬을 보여준다. 가변성 위치에 할당된 아미노산이 그 위치에 가장 빈번하게 적용되는 것인, 각각의 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드에 대한 컨센서스 서열 (서열 16, 20, 24, 28)도 또한 나타내었다.
B 세포 에피토프 클러스터 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 본래의 항원성 펩티드와 실질적으로 동일한 면역학적 특성을 보유하는 서열 9, 10, 11, 12 및 상동체의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 서열 9의 기능적 유사체 또는 상동체인 변이체는 아미노산 위치에서의 보존적 치환; 전체 전하의 변화; 또 다른 모이어티에의 공유 부착; 또는 소량의 부가, 삽입, 결실 또는 보존적 치환 및/또는 그의 임의의 조합을 가질 수 있다. 따라서, PRRSV GP5.3 B 에피토프 (V21-E65) 항원성 펩티드 (예를 들어, 서열 9)에 결합하는 항체는 또한 실질적으로 유사한 효능을 갖는 PRRSV GP5.3 B 에피토프 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체에도 결합할 것이다. 한 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 9 또는 상동체에 대해 적어도 40% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 11 또는 상동체에 대해 적어도 56% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 12 또는 상동체에 대해 적어도 72% 상동성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 10 또는 상동체에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 기능적 유사체는 서열 12 또는 상동체에 대해 적어도 94% 상동성을 갖는다.
한 실시양태에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, PRRSV GP 5.3 B 에피토프 클러스터 펩티드 (V21-E65)의 면역학적으로 기능성인 유사체는 보존적 치환, 및 삽입 또는 결실에 의해 변형된 PRRSV GP5.3 B 에피토프 클러스터 펩티드의 버전을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 면역학적으로 기능성인 유사체는 보존적인 치환에 의해 서열 9로부터 또는 서열 9의 상동체로부터 변형될 수 있다.
보존적 치환은 1개의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 면역학적으로 기능성인 유사체는 펩티드의 N-말단, C-말단에의 아미노산 부가, 및/또는 펩티드의 중앙 내로의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 부가는 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 대한 것이다. 부가는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 아미노산 잔기의 것일 수 있다 (서열 9 및 30). 이러한 부가는, PRRSV 단백질에 존재하지 않으며 PRRSV B 에피토프 클러스터 펩티드의 면역원성을 변경하지 않는 아미노산 서열을 구성할 수 있다. PRRSV B 에피토프 클러스터 펩티드에 존재하지 않는 부가는 작은 하전된 서열 (예를 들어, 리신-리신-리신), 분지형 구조의 형성을 가능하게 하는 아미노산 (예를 들어, εN-리신) 또는 고리화된 구조의 형성을 가능하게 하는 아미노산 (예를 들어, 시스테인)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, PRRSV에 존재하지 않는 아미노산 서열의 부가는 5개 아미노산 이하의 것이다. 아미노산 부가는 전형적 또는 비-전형적 아미노산 또는 그의 혼합물일 수 있다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 면역학적으로 기능성인 유사체는 펩티드의 N-말단, C-말단 및/또는 중앙에 대한 아미노산 결실에 의해 변형될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 대한 것이다. 결실은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 아미노산 잔기의 것일 수 있다. 구체적 실시양태에서, 표 4에 나타낸 바와 같이, 아미노산 서열의 결실은 9개 아미노산 이하의 것이다 (서열 33 및 34).
또 다른 실시양태에서, 표 7에 나타낸 바와 같이, PRRSV B 에피토프 클러스터 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 전하의 변경에 의해 변형된 PRRSV B 에피토프 클러스터 항원성 펩티드를 포함한다. 이러한 전하의 변경은 아미노산 치환, 부가 또는 결실, 또는 하전된 분자의 공유 부착의 결과일 수 있다. 전하의 변경은 펩티드를 비변형 펩티드와 비교시 보다 염기성으로 만들거나, 보다 산성으로 만들거나, 또는 보다 중성으로 만들 수 있다. 구체적 실시양태에서, 펩티드는 N-말단 또는 C-말단에 1-5개의 리신 잔기를 부가함으로써 보다 염기성이 된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에 3개의 리신 잔기를 부가함으로써 보다 염기성이 된다.
비-제한적인 예를 통해, 본 발명의 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 1 내지 약 5개의 추가 아미노산 (전형적 및 비-전형적)이 말단 아미노산에 부가될 수 있다. 예를 들어, 서열 Lys-Lys-Lys가 전하의 변화를 위해 상기 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드의 아미노 말단에 부가될 수 있다.
펩티드는 표준 기술, 예컨대 메리필드(Merrifield) 고체 상 합성 방법 및 그 방법에 대해 이용가능한 무수한 개선을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다. 펩티드는 또한 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 따라서, PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 항원성 펩티드 및 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체 및 그의 상보체를 코딩하는 핵산 분자는 본 발명의 다양한 예시적 실시양태에 포함된다. 벡터, 특히 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 항원성 펩티드 및 면역학적으로 기능성인 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터도 또한 본 발명의 다양한 예시적 실시양태에 포함된다. 벡터를 함유하는 숙주 세포도 또한 본 발명의 다양한 예시적 실시양태에 포함된다.
본 발명의 다양한 예시적 실시양태는 또한 PRRSV 항원성 펩티드 및 PRRSV 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 생산하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 PRRSV 항원성 펩티드 및/또는 PRRSV 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체가 발현되는 조건 하에서 PRRSV 항원성 펩티드 및/또는 PRRSV 항원성 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 고체-상 합성에 의해 제조된 펩티드 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태는 감염된 세포의 용해물 또는 분비물로부터 유도된 제어되고 잘 규정된 면역원을 사용할 수 있다. 이러한 실시양태의 화학적 방법에 의해 제조된 항원의 품질은 제어되고 규정되며, 그 결과로 항원성, 면역원성 및 수율의 재현성이 보장될 수 있다. 또한, 펩티드 항원의 제조에 생물학적 유해 물질이 사용되지 않으며, 고가의 생물학적 봉쇄에 대한 위험을 감소시키고 그에 대한 필요성을 제거한다. 부위-특이적 면역원은 선택된 에피토프의 높은 몰 농도를 제공하기 때문에, PRRSV 항원성 펩티드 조성물을 사용하는 백신의 안전성 및 면역효력 둘 다가 보장된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 합성된다. 규정된 PRRSV 항원성 합성 펩티드의 사용은, 새끼 돼지에서의 항체 검출 및 진단을 위한 항원으로서 사용되는 경우에, 위양성(false-positive) 결과를 최소화한다. 면역원으로서 공지된 B 세포 및 Th 에피토프를 갖는 규정된 합성 펩티드의 사용은, 백신의 면역원성 성분으로서 사용되는 경우에, PRRS 바이러스 및/또는 재조합 단백질과 공동-정제될 수 있는 PRRSV-감염된 또는 재조합 바이러스-감염된 숙주 세포 및 재조합 단백질 발현 시스템 기원의 항원성 물질의 존재에 의해 유발된 목적하지 않은 비-PRRSV-특이적 면역 반응을 제거한다. 예를 들어, 돼지로부터의 혈청은 숙주 세포에 대한 항체, 또는 재조합 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 효모 또는 바큘로바이러스에 대한 항체를 가질 수 있으며, 상기 항체는 이어서 생물학적으로 유도된 항원에 기반한 진단 시험에 사용된 항원성 물질과 교차-반응성이고, 성분으로서 이들 외인성 면역원을 갖는 백신에 의해 생성된 이러한 면역 반응은 비-보호적일 것이다. 대조적으로, 본 발명의 PRRSV 펩티드 백신을 투여받는 돼지는, 부적합한 항체 및 생물학적으로 유도된 PRRSV 항원과 공동-정제된 숙주 세포 또는 발현 벡터 기원의 단백질, 예를 들어 재조합 에스케리키아 콜라이, 효모 또는 바큘로바이러스로부터의 단백질에 대한 다른 면역 반응을 피하는 집중된 면역 반응을 생성할 것이다.
합성 펩티드의 이러한 실시양태는 또한 제조 동안 생성된 불순물로부터의 간섭을 최소화한다. 긴 합성과 함께, 커플링 효율의 엄격한 제어에도 불구하고, 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 비롯한 신장 주기 동안의 사건으로 인해 펩티드 유사체가 또한 생성되고, 이에 따라 표적 펩티드 합성과 함께 다수의 펩티드 유사체가 생성된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 펩티드 유사체는 면역진단의 목적을 위한 고체 상 항원으로서 또는 백신접종의 목적을 위한 면역원으로서 면역학적 용도에 사용되는 경우에 항원성 및 면역원성에 대한 기여자로서 펩티드 제제에 여전히 적합하다.
합성 펩티드의 면역학적 용도에서의 25년의 경험 동안, 본 발명자는 의도된 면역학적 활성의 보유를 허용하는 구조적 가변성의 범위가 소분자 약물에 의한 특이적 약물 활성 또는 생물학적으로 유도된 약물과 공동-생성되는 대분자에서 발견되는 목적 활성 및 목적하지 않은 독성의 보유에 대해 허용되는 구조적 가변성의 범위보다 훨씬 더 융통성이 있음을 발견하였다. 이는 의도된 펩티드와 유사한 크로마토그래피 및 면역학적 특성을 갖는 결실 서열 부산물의 혼합물로서 의도적으로 설계되거나 또는 합성 과정의 오류에 의해 불가피하게 생성되는 펩티드 유사체가 빈번하게 목적 펩티드의 정제된 제제로서 효과적인 이유이다. 설계된 유사체 및 의도되지 않은 유사체 혼합물은, 분별 QC 절차가 개발되어 제조 과정 및 생성물 평가 과정 둘 다를 모니터링함으로써 이들 펩티드를 사용하는 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보장하는 한 효과적이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 내인성 PRRSV Th 펩티드 및 그의 상동체 (서열 47-79)가 백신 조성물에 포함될 수 있다. Th 펩티드의 존재는 PRRSV 펩티드 백신의 면역원성을 개선할 수 있다. PRRSV B 에피토프 유도된 면역원성 펩티드 (상기 기재된 상동체 및 유사체 포함)는 내인성 PRRSV Th 에피토프와 혼합될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 내인성 PRRSV Th 펩티드는, 아미노산 잔기의 조합이 그 PRRSV Th 펩티드에 대한 상동체의 서열에 기반한 프레임워크 내의 특정 위치에 나타나는 경우에, 조합 서열로서 제시될 수 있다. 조합 펩티드의 어셈블리는 합성 과정 동안 특정된 위치에, 한 특정한 아미노산 대신에 지정된 보호된 아미노산의 혼합물을 첨가함으로써 하나의 합성 과정을 통해 합성될 수 있다. 이러한 조합 PRRSV Th 펩티드 어셈블리는 다양한 유전적 배경의 동물에 대한 광범위한 T 헬퍼 에피토프 범위를 허용할 수 있다. PRRSV Th 펩티드의 대표적인 조합 서열은 각각의 PRRSV Th 에피토프에 대해 표 6 서열 47-79로부터 유도된 바와 같은 표 7 서열 80-90에 나타내었다.
한 실시양태에서, JXA1 서열에 기반하여 서열 47, 51, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76으로서 기재되고 (표 6에도 또한 나타냄) PRRSV B 펩티드 면역원에 연결되어 있지 않은 ORF 4, ORF5, ORF6 및 ORF7로부터의 면역우성 PRRSV Th 에피토프의 클러스터를 갖는 Th 펩티드는, PRRSV B 에피토프 펩티드 면역원의 면역원성을 보충하여 실시예 5에 나타낸 바와 같은 펩티드 기반 PRRSV 백신 제제의 면역원성을 증진시키는데 사용될 수 있다. B 에피토프 펩티드 면역원에 대한 공유 연결 없이 유리 펩티드로서 서열 47, 51, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76을 포함하는 것은 백신 제제의 면역원성을 개선할 수 있다. 실시예 10에 기재된 바와 같은 또 다른 실시양태에서, B 에피토프 펩티드 면역원에 대한 공유 연결 없이 유리 펩티드로서 군 2의 경우에는 서열 47, 51, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76, 및 군 1, 3 및 4의 경우에는 서열 80 내지 90을 포함하는 것은 백신 제제의 면역원성을 개선할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PRRSV 펩티드 (상기 기재된 상동체 및 유사체 포함)는, 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이, Th 에피토프를 함유하는 것으로 공지된 서열을 함유하는 펩티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 실시양태는 공유적으로 연결된 Th 에피토프가 없는 동등한 면역원에 비해 증진된 면역원성을 제공할 수 있다. 구체적 실시양태에서, Th 에피토프를 함유하는 펩티드는 PRRSV 펩티드의 N-말단 (서열 38) 및/또는 C-말단 (서열 39)에 공유적으로 연결된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 스페이서는 표 5에도 또한 나타낸 서열 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 36) 또는 단일 아미노산 εNLys를 갖는다 (각각 서열 43 및 42). 한 실시양태에서, Th 에피토프를 함유하는 펩티드는 PRRSV 펩티드의 아미노 말단에 공유적으로 연결된다. 특정 실시양태에서, Th 에피토프를 함유하는 표 5에 나타낸 바와 같은 펩티드 (서열 40)는 Lys-Lys-Lys-εNLys 스페이서 (서열 36)를 통해 아미노 말단에 연결된 인공 조합 Th 펩티드 서열 35 (표 5에 나타냄)이고, 서열 40으로서 제시된다.
본 발명의 다양한 실시양태는 PRRSV에 대해 돼지를 보호하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 백신은 면역원성 펩티드 항원 또는 펩티드 면역원 조성물 및 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 포함한다. 다양한 실시양태에서, PRRSV 백신 조성물은 펩티드 항원 또는 펩티드 항원 조성물 및 수의학적으로 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a) PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원 GP5.3 (V21-E65) (서열 9), GP 2 B (V111-L136) (서열 10), GP3B (C57-C75) (서열 11) 및 GP4 B (C52-C69) (서열 12) 중 임의의 하나;
b) (a)의 상동체;
c) (a) 또는 (b)의 항원학적으로 및 면역학적으로 기능성인 유사체,
d) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 아미노산 부가 및/또는 아미노산 결실을 갖는 (a), (b) 또는 (c); 및
e) (a)-(d)의 임의의 조합.
PRRSV 백신의 한 실시양태에서, 펩티드 항원의 전하는 1 내지 5개의 아미노산을 부가하거나 결실시킴으로써 변경된다. PRRSV 백신의 또 다른 실시양태에서, 항원학적으로 및 면역학적으로 기능성인 상동체 또는 유사체는, GP2, GP3, GP4 및 GP5로부터 유도된 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원 GP5.3 (V21-E65) (서열 9), GP 2 B (V111-L136) (서열 10), GP3B (C57-C75) (서열 11) 및 GP4 B (C52-C69) (서열 12) 중 임의의 하나로부터의 것인 아미노산 서열의 항원에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 펩티드 항원은 서열 9, 10, 11, 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
PRRSV 백신의 또 다른 실시양태에서, 펩티드 항원은 펩티드 항원의 N-말단 또는 C-말단에 공유적으로 연결된 T 헬퍼 에피토프를 추가로 포함한다. 구체적 실시양태에서, T 헬퍼 에피토프는 펩티드 항원의 아미노 말단에 공유적으로 연결된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, T 헬퍼 에피토프는 하나 이상의 아미노산을 갖는 스페이서를 통해 펩티드 항원에 공유적으로 연결된다. 특정한 실시양태에서, T 헬퍼 에피토프는 서열 35이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 스페이서는 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 36)이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 스페이서는 εNLys이다. 구체적 실시양태에서, 펩티드 항원은 서열 42, 43, 44, 45 또는 46이다.
다양한 예시적 실시양태에서, 면역원성 펩티드 항원의 임의의 양이 동물에서 면역 반응을 도출하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 펩티드 항원의 양은 약 0.1 μg 내지 약 100 mg이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 펩티드 항원의 양은 약 1 μg 내지 약 10 mg이다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 항원의 양은 약 10 μg 내지 약 1 mg이다.
PRRSV 백신 조성물의 다양한 실시양태에서, 조성물은 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74 및 76의 11종의 PRRSV T 헬퍼 에피토프 펩티드의 등몰 혼합물을 추가로 포함한다. 구체적 실시양태에서, 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74 및 76의 등몰 혼합물의 양은 약 0.1 μg 내지 약 1 mg이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74 및 76의 등몰 혼합물의 양은 약 1 μg 내지 약 100 μg이다.
다양한 예시적 실시양태에서, 임의의 유형 또는 양의 전달 비히클 또는 아주반트가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 전달 비히클 및 아주반트는 몬타니드(Montanide)™ ISA 50V (유중수 에멀젼의 제조를 위한 식물성 오일 및 만니드 올레에이트로 구성된 오일 백신 아주반트 조성물), 트윈(Tween)® 80 (폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트로도 또한 공지됨), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 그의 임의의 조합물이다.
구체적 실시양태에서, PRRSV 백신 조성물은 서열 33의 펩티드 항원 및 수의학적으로 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원의 양은 약 10 μg 내지 약 1 mg이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 기재된 바와 같은 임의의 예시적 실시양태에 포함되는 백신을 투여하는 것을 포함하는, PRRSV 감염에 대해 PRRSV 모계 유래 항체 (MDA) 양성이거나 또는 양성이 아닌 새끼 돼지를 보호하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용에 따라 제조된 서열 1 및 2를 갖는 2종의 PRRSV NC 펩티드의 혼합물은 또한 면역검정의 포획 상에, 예를 들어 ELISA 시험 키트의 고체 상 면역흡착제에 항원적 유효량의 펩티드를 사용함으로써 PRRSV 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따라, 임의의 상용성 면역검정 포맷이 대상 펩티드와 함께 사용될 수 있다. 이러한 포맷은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 다수의 표준 면역학 안내서 및 교과서에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al.1988 (24)] 참조). 이들은, 다른 널리 공지된 면역검정 포맷 중에서도, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역도트 검정, 응집 검정, 항체-펩티드-항체 샌드위치 검정, 펩티드-항체-펩티드 샌드위치 검정을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역검정은 2종의 PRRSV NC 항원성 펩티드 (서열 1 및 2)를 포함하는 펩티드 조성물로 코팅된 고체 상을 이용하는 ELISA이다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 펩티드는 스크리닝 ELISA에 의해 PRRSV 감염에 대해, 모계 유래 항-PRRSV 항체의 수준에 대해 예비-백신접종된 새끼 돼지로부터의 혈청을 평가하기 위해, 및 PRRSV 항원성 펩티드를 사용하는 백신으로 백신접종된 새끼 돼지에서의 면역 반응의 수준을 결정하기 위해, 암퇘지 및 어린 암퇘지, 수퇘지(boar 및 barrow) 및 새끼 돼지로부터의 혈청을 시험할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는 ELISA 면역검정을 이용하여 항-PRRSV 항체의 존재에 대해 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 시험할 수 있다:
i. 2종의 PRRSV NC 펩티드 (서열 1 및 2)의 혼합물을 고체 지지체에 부착시키는 단계,
ii. 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에 대한 항체의 결합에 유리한 조건 하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및
iii. 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계.
또 다른 구체적 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는 ELISA 면역검정을 이용하여 항-PRRSV 항체의 존재에 대해 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 시험할 수 있다:
i. 유럽 균주 서열 기원의 서열 1 및 2의 상동체로서의 2종의 PRRSV NC 펩티드 (서열 7 및 8)의 혼합물을 고체 지지체에 부착시키는 단계,
ii. 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에 대한 항체의 결합에 유리한 조건 하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및
iii. 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계.
대상 ELISA 키트의 예시된 사용에 있어서, 시험할 돼지 혈청 샘플을 샘플 희석제 중에 희석한 다음, 임의의 항체 (존재하는 경우)가 펩티드-감작화 고체 상에 결합하는 시간 동안 및 조건 하에 상기 기재된 1종 이상의 PRRSV NC 펩티드와 접촉시킨다. 비결합 물질의 제거 후 (예를 들어, 포스페이트-완충-염수로 세척함), 2차 복합체를 돼지-특이적 IgG에 대한 표지된 항체 또는 표지된 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G와 접촉시킨다. 이들 항체 또는 단백질 A, G 또는 A/G는 2차 복합체에 결합하여 3차 복합체를 형성하고, 제2 항체 또는 단백질 A, 또는 G 또는 A/G는 리포터 분자로 표지되어 있기 때문에, 검출 수단에 적용시켰을 때, 3차 복합체가 검출된다. 리포터 분자는 효소, 방사성동위원소, 형광단, 생물발광 분자, 화학발광 분자, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 등일 수 있다. ELISA의 경우에, 리포터 분자는 바람직하게는 효소이다.
본 발명의 구체적 실시양태는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
(1) 펩티드 항원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원은 a) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 그의 임의의 조합; b) (a)의 상동체; 및 c) (a) 또는 (b)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 백신 조성물.
(2) (1)에 있어서, 펩티드 항원이 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
(3) (1)에 있어서, 펩티드 항원이 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
(4) (1)에 있어서, 펩티드 항원이 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
(5) (1)에 있어서, 펩티드 항원이 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
(6) (1)에 있어서, 펩티드 항원이 1 내지 5개의 아미노산을 부가하거나 또는 결실시킴으로써 변경된 것인 PRRS 백신.
(7) (1)에 있어서, 펩티드 항원의 아미노- 또는 카르복실-말단에 공유적으로 연결된 T 헬퍼 에피토프를 추가로 포함하는 PRRS 백신.
(8) (7)에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 서열 35인 PRRS 백신.
(9) (7)에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 엡실론 리신 잔기를 포함하는 스페이서를 통해 펩티드 항원에 공유적으로 연결된 것인 PRRS 백신.
(10) (9)에 있어서, 스페이서가 서열 36인 PRRS 백신.
(11) (1)에 있어서, 항원성 펩티드에 연결되지 않은 T 헬퍼 에피토프를 추가로 포함하며, 여기서 T 헬퍼 에피토프는 서열 47-90으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 PRRS 백신.
(12) (1)에 있어서, 펩티드 항원의 총량이 약 10 μg 내지 약 1 mg인 PRRS 백신.
(13) (1)에 있어서, 전달 비히클 및 아주반트가 몬타니드 ISA 50V, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 PRRS 백신.
(14) (1)에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, PRRS 감염에 대해 새끼 돼지를 보호하는 방법.
(15) a) 펩티드 항원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트, b) 서열 10, 11, 12, 31, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 항원, 및 c) 서열 80-90 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 PRRSV Th 펩티드를 포함하는 PRRS 백신 조성물.
(16) a) 펩티드 항원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트, b) 서열 42, 44, 45, 46, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 항원, 및 c) 서열 80-90 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 PRRSV Th 펩티드를 포함하는 PRRS 백신 조성물.
(17) a) 서열 1 및 서열 2의 혼합물을 고체 지지체에 부착시키는 단계, b) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에 대한 항체의 결합에 유리한 조건 하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및 c) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, PRRS 감염을 진단하는 방법.
(18) a) 서열 7 및 서열 8의 혼합물을 고체 지지체에 부착시키는 단계, b) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에 대한 항체의 결합에 유리한 조건 하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및 c) 상기 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 항-PRRSV 항체의 존재를 시험하기 위한 ELISA 면역검정.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는데 사용되며 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않는다.
실시예 1
PRRSV 공동-형질감염된 HTK 세포를 사용한 면역형광 검정 (IFA)에 의한 표적 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원과 천연 PRRSV 단백질 항원 사이의 교차반응성에 대한 면역 혈청 역가의 평가를 위한 혈청학적 검정
PRRSV 서브유닛 단백질 GP3, GP4 및 GP5에 대해 지시된 항체는 플라스미드가 각각 T7 프로모터 하류의 PRRSV orf3, orf4 및 orf5를 코딩하는 HTK 세포 공동-형질감염 재조합 백시니아 바이러스 rVVT7 (T7 폴리머라제 재조합 백시니아 바이러스)을 이용한 면역형광에 의해 검출될 수 있다. 이 방법은 그의 본래의 바이러스 복제에 의해 높은 정확도를 갖는 포유동물 세포에서의 이들 PRRSV 단백질의 일시적 발현을 제공한다. PRRSV GP3, GP4 및 GP5는 막횡단 도메인 및 측쇄 변형으로 구성되기 때문에, 최상의 PRRSV 단백질 구조는 단지 신생으로만 제조될 수 있다. 각각의 PRRSV 서브유닛 단백질 GP2, GP3, GP4 또는 GP5를 신생 합성하고, PRRSV에 대한 특이적 항체의 존재에 대한 면역검정에서의 평가를 위해 면역 혈청에 의한 세포내 염색을 수행하기 위한 표적 세포로서 공동-형질감염된 HTK 세포를 사용하였다. 이 면역형광 검정 시스템은 높은 특이성 및 감수성을 갖는 천연 PRRSV 항원에 대한 항체의 검출을 위한 최상의 조건을 허용한다.
도 1a에 예시된 메카니즘에 따라, HTK 세포주 세포를 T7 폴리머라제 재조합 백시니아 바이러스 (rVVT7)로 감염시키고 (21), 리포펙타민™ (인비트로젠(Invitrogen))에 의해 PRRSV- orf3, orf4 및 orf5 플라스미드로 공동-형질감염시켰다 (22). 구체적으로, T7 폴리머라제 프로모터에 의해 매개되는 천연 PRRSV 단백질의 발현을 위한 pRRSV 플라스미드의 구축을 하기와 같이 달성하였다: 전장 pRRSV 유전자 (타이완 PRRSV MD001 균주 등록 번호 AF035409로부터의 것)를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키고, pCR2.1Topo® 플라스미드 벡터 (인비트로젠) 내로 클로닝하였다. pRRSV 플라스미드의 발현 능력을 PRRSV 균주 MD001로부터의 orf3, orf4 및 orf5에 대한 전체 뉴클레오티드 서열을 보여주는 서열분석에 의해 확인하였다.
HTK 세포를 96-웰 플레이트에서 80% 전면생장률로 성장시키고, rVVT7로 감염시킨 다음 (22), 리포펙타민™ (인비트로젠)에 의해 개별적으로 pRRSV orf3, orf4 및 orf5 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 공동-형질감염 24시간 후, 세포를 80% 아세톤에 의해 고정하고, 면역형광 검정 (IFA)을 통한 PRRSV 단백질에 대한 항체의 검출을 위해 플레이트를 -80℃에서 보존하였다.
도 1a의 예시는 T7 폴리머라제 재조합 백시니아 바이러스 (T7/vac)로 감염되고 (21) 리포펙타민™ (인비트로젠)에 의해 pCR-orf5 플라스미드로 공동-형질감염된 HTK 세포를 보여준다. 재조합 GP5 단백질은 번역된 후에 세포질로 수송된다 (22). 항-GP5 항체는, 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 형질감염된 HTK 숙주 세포의 세포질에 결합하게 되고, 여기서 표지된 2차 항체의 면역형광에 의해 검출된다. 이 방법은 원핵 T7 프로모터에 의해 매개되는 전장 PRRSV GP5 단백질의 HTK 세포에서의 일시적 진핵 발현을 통해 높은 특이성을 갖는 진정한 PRRSV GP5 단백질에 대한 항체의 검출을 제공한다. pCR-전장 PRRSV 게놈으로의 유사한 형질감염 또한, 원핵 T7 프로모터에 의해 매개되는 전장 PRRSV 게놈의 HTK 세포에서의 일시적 진핵 발현을 통한 높은 특이성을 갖는 PRRSV GP2, GP3, GP4, M 및 N 단백질의 검출에 사용될 수 있다.
면역형광 검정 (IFA)에 의한 PRRSV 항체의 적정.
혈청 샘플을 PBS 중에 최초 10배 희석한 후, 2배 연속 희석하였다. 각 시험 실행에 대해, PRRSV-감염된 SPF 돼지로부터의 양성 대조군 혈청 및 감염되지 않은 SPF 돼지로부터의 음성 대조군 혈청을 둘 다 포함시켜, pRRSV orf-7 플라스미드에 의한 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질의 발현을 유효성 확인하였다. 1:10보다 높게 희석된 세포질에 국부적 형광 신호를 제공하는 혈청 샘플 (도 1b에 나타낸 바와 같음)은 >10의 IFA 역가를 갖는 것으로 점수화되었고; 이러한 역가는 PRRSV에 의해 감염된 동물을 나타내었다. 백신접종의 결과로서 "표적 펩티드" 특이적 항체를 함유하는 동물 백신으로부터의 혈청에 대해, 특이적 표적 단백질 또는 전체 PRRSV 게놈에 대한 교차반응성은 상응하는 표적화된 천연 PRRSV 단백질 (예를 들어, GP2, 3, 4 또는 5)과의 면역형광 검정 (IFA)에 의해 평가될 수 있다. 자연 감염된 돼지 또는 PRRSV 펩티드-기반 백신을 제공받은 돼지로부터 수집된 혈청 샘플의 모든 시험은 코드 하에 수행하였다.
실시예 2
PRRSV의 중화/수용체 결합 부위를 나타내는 디자이너 펩티드의 면역원성 평가를 위한 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원 기반 ELISA
96-웰 플레이트의 웰을, 달리 나타내지 않는 한 10mM NaHCO3 완충제, pH 9.5 중 구체적으로 언급되지 않는 한 2 μg/mL의 개별 표적 펩티드 100 μL로 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 코팅하였다.
펩티드-코팅된 웰을 PBS 중 3 중량%의 젤라틴 250 μL와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단한 후, 0.05 부피%의 트윈® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 건조시켰다. IFA에 의하면 PRRSV 항체에 대해 양성인 돼지 혈청 및 음성 대조군 혈청을, 20 부피%의 정상 염소 혈청, 1 중량%의 젤라틴 및 0.05 부피%의 트윈® 20을 함유하는 PBS로 달리 나타내지 않는 한 1:20 희석하였다. 희석된 시편 100 마이크로리터를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 반응하도록 하였다.
이어서, 비결합 항체를 제거하기 위해, 웰을 PBS 중 0.05 부피%의 트윈® 20으로 6회 세척하였다. 양성 웰에서 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하는 표지된 추적자로서 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-돼지 IgG를 사용하였다. 예비-적정된 최적의 희석 농도의, PBS 중 0.05 부피%의 트윈® 20을 함유하는 1 부피%의 정상 염소 혈청 중의 퍼옥시다제-표지된 염소 항-돼지 IgG 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 웰을 PBS 중 0.05 부피%의 트윈® 20으로 6회 세척하여 비결합 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충제 중 0.04 중량%의 3',3',5',5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 0.12 부피%의 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100 μL와 추가로 15분 동안 반응시켰다. 상기 기질 혼합물을 사용하여 착색된 생성물을 형성함으로써 퍼옥시다제 표지를 검출하였다. 1.0M H2SO4 100 μL를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450nm에서의 흡광도 (A450)를 결정하였다.
동물 혈청에서 PRRSV 항체를 검출하기 위한 목적에 따라 혈청 희석을 수행하였다: (a) 잠재적 자연 감염의 확인을 위해, 1:20의 희석물을 사용하고, A450 판독치를 기록하고, 컷오프 계산을 위해 내재된 고유의 음성 대조군을 사용하거나; 또는 (b) 펩티드-기반 PRRSV 백신 제제를 투여받은 돼지의 항체 역가를 결정하기 위해, 1:10에서 1:10,000까지의 혈청의 10배 연속 희석물을 시험하고, 시험된 혈청의 역가 (Log10으로 표현)를 A450의 선형 회귀 분석에 의해 계산하였다.
실시예 3
감염된 동물을 백신접종된 동물로부터 구별하기 위한 진단 용도의 최적 PRRSV 항원성 펩티드의 확인
PRRSV 분리주 JXA1, LV, EU, NA의 이전에 공개된 서열 및 타이완 균주 MD001로부터의 PRRSV의 게놈 서열을 이용하여 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질 서열을 추론하였고, ORF 2, 3, 4, 5, 6 및 7 코딩된 단백질 서열로부터 얻은 데이터를 이용하여 PRRSV 감염을 앓는 동물로부터의 혈청 중 항체의 검출을 위한 B 세포 에피토프 클러스터 항원성 펩티드, 및 마커 백신 제제를 투여받은 동물에서 도출된 특이적 항체의 검출을 위한 마커 백신 제제에 이용된 기능적 중화/수용체 결합 부위를 나타내는 항원성 펩티드를 설계하였다.
본 발명자는 진단 및 백신 용도를 위한 최적 B 및 T 세포 에피토프 클러스터 펩티드의 확인을 위해 스크리닝할 펩티드의 수를 제한하기 위해 생물정보학적 정보 및 전형적 면역화 실험을 이용하는 전략을 사용하였다.
"DIVA" 시스템으로 지칭되는 백신접종된 동물로부터의 감염된 동물의 구별을 위한 긴급히 필요한 도구의 개발은 마커 백신 설계 과정과 상호보완적이다.
돼지에서 PRRSV 감염 동안 생산된 항체의 대부분은 주요 항원 결정기가 동일한 대륙으로부터의 균주 사이에 상대적으로 잘 보존되어 있는 PRRSV ORF 7 코딩된 뉴클레오캡시드 (NC) 단백질에 특이적이기 때문에, 이에 따라 NC 단백질은 바이러스-특이적 항체의 검출, 및 감염 및 질환의 진단에 적합한 후보로서 표적화되었다. 항체 포획에 합성 펩티드 기반 항원을 사용하는 장점은, 위양성을 유발하는 PRRSV와 관련되지 않은 세포 성분이 전혀 없는 것으로 인한 개선된 특이성, 뿐만 아니라 에피토프 클러스터 펩티드의 내재적 성질로 인한 개선된 감수성을 비롯하여 널리 공지되어 있다.
PRRSV 감염을 앓는 것으로 알려진 동물로부터의 양성 혈청을 사용하여 항체 검출에 유용할 수 있는 강하고 지속적인 항원성에 대해 중첩 PRRSV ORF 7 코딩된 NC 펩티드를 스크리닝하였다. 음성 혈청은 정상 돼지 및 PRRSV 감염이 없는 것으로 알려진 SPF 돼지로부터 수집하였다. 북아메리카 MD001 균주의 NC 단백질의 에피토프 맵핑에 대한 데이터를 도 2에 요약하였다. 플레이트 코팅에 2ug/mL로 웰당 0.1mL의 디자이너 펩티드를 사용하는 간접 ELISA를 수행하였다. MD001 NC 단백질로부터 유도된 서열을 갖는 증가하는 길이의 2종의 펩티드 시리즈 (a 내지 e)를 합성하였다. C-말단이 잔기 71에서 시작하는 4171 펩티드 시리즈 (도 2a에 나타냄)를 합성하는 한편 C-말단이 잔기 123에서 시작하는 4172 펩티드 시리즈 (도 2b에 나타냄)를 합성하였다. 이들 펩티드를 개별적으로 플레이트 코팅에 사용하고, 각각의 펩티드에 대한 감수성 및 특이성에 대해 12개의 유효성 확인된 PRRSV 음성 혈청의 패널과 함께 3개의 풀링된 PRRSV 양성 혈청으로 시험하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 펩티드 4171e (서열 1)는 펩티드 4171e의 N-말단에 위치한 서열 "PNNNGKQQKKK" (서열 91)를 갖는 11량체 항원성 에피토프로 시험된 상기 4171 시리즈로부터의 펩티드 중에 가장 항원성인 것으로 밝혀졌다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 펩티드 4172e (서열 2)는 N-말단에 위치한 "EKPHFPLATEDDVRHHFT" (서열 92)의 서열을 갖는 18량체 항원성 에피토프로 시험된 상기 4172 시리즈로부터의 펩티드 중에 가장 항원성인 것으로 밝혀졌다.
18량체 항원성 에피토프 "EKPHFPLATEDDVRHHFT" (서열 92)는 펩티드 4171a-d내에서 제시된 경우에는 항원성이 아니었다. 그러나, 상기 18량체 펩티드 에피토프는 전장 4171e 분자 (서열 1) 내에서 그 자체로 제시되어 서열 1 상의 11량체 항원성 에피토프 "PNNNGKQQKKK"와 조합되어 큰 입체형태적 에피토프를 형성한다. 추가로, 2개의 70 및 73량체 펩티드 (각각 서열 1 및 2)의 예상치 못한 면역우성 항원성은 긴 연속 및 불연속 에피토프의 행렬을 제시하는 NC 단백질 상의 큰 노출된 표면을 나타내는 긴 펩티드와 일치한다.
항원성 펩티드 4171e (서열 1) 및 4172e (서열 2)를 3ug/mL로 웰당 0.1mL를 2:1 비 혼합물로 플레이트 코팅에 사용하여, PRRSV 북아메리카 균주에 대한 항체의 포획 / 검출을 위한 UBI PRRSV NC ELISA의 일부를 형성하였다.
다양한 PRRSV 균주 (MD001, JXA1, NA 및 EU)로부터의 상동성 NC 단백질 서열을 도 3에 나타낸 바와 같이 정렬시켰다. 모 MD001 서열과 비교시에 기원 EU 서열에 대한 아미노산 잔기의 유의한 치환, 삽입 및 결실이 있을지라도, 기원 EU 균주의 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열에 기반한 표 1에 나타낸 바와 같은 치환 펩티드 상동체 (서열 3 및 서열 4)는 PRRSV 유럽 균주에 대한 항체의 포획/검출을 위한 UBI PRRSV NC EU ELISA에서 항원으로서 유사하게 사용된다.
이전에 IFA 시험에 의해 항-PRRSV NC 단백질 반응성에 대해 특성화된 30개의 혈청의 패널을 양성 혈청 패널로 사용하여, UBI PRRSV NC ELISA의 감수성 및 특이성을 추가로 유효성 확인하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, UBI PRRSV NC ELISA는 IFA에 의한 검출 한계가 약 1:16 희석인 경우에 NC 단백질에 대한 IFA 시험과 거의 동일한 수준의 감수성을 갖는다. UBI PRRSV NC ELISA 시험을 보충적인 혈청학적 도구로 이용하여 현장 샘플을 평가하고, 감염된 동물과 백신접종된 동물을 확인하고, 뿐만 아니라 다른 실시예에 기재된 바와 같은 PRRSV 마커 펩티드 기반 백신을 평가하였다.
실시예 4
PRRSV 마커 백신에 사용하기 위한 항원성 펩티드를 확인하는 혈청학적 유효성 확인을 위한 펩티드의 설계 및 합성.
약 10 내지 약 70개 아미노산 길이의 서열을 갖는 PRRSV GP2, GP3, GP4, GP5, M 및 NC 단백질로부터의 PRRSV B 및 T 세포 에피토프 클러스터 부위 둘 다를 나타내는 PRRSV 항원성 펩티드의 큰 레퍼토리를 설계하였다. 일부 펩티드의 경우에, 적합한 부위에서의 아미노산 치환을 생성하여, 상응하는 천연 단백질과의 교차-반응을 극대화하도록 국부 구조 보존을 위한 제약을 가하기 위한 시클릭 펩티드의 형성을 허용하였다. 다른 항원성 펩티드의 경우에, 인공 조합 Th 펩티드 (예를 들어, UBITh3, 서열 15)에 대한 연결을 생성하여 그의 각각의 면역원성을 증진시켰다. 모든 펩티드를 반복 주기의 펩티드 합성, 백신 제제화, 동물 면역화 및 혈청학적 시험을 포함하는 노동집약적이고 시간에 민감한 "혈청학적 유효성 확인" 과정에 적용시켜, 본 발명자의 초기 적용을 통과한 각각의 진단 및 백신에 대한 표적 동물에서의 추가의 시험을 위한 후보 펩티드를 얻었다.
면역원성 시험에 사용된 모든 펩티드는 Fmoc 화학을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈(Applied BioSystems) 펩티드 합성기 모델 430A, 431 및 433을 사용하여 합성하였다. 삼관능성 아미노산의 N-말단 및 측쇄 보호기에 대한 Fmoc 보호를 이용하여 고체-상 지지체 상에서의 독립적인 합성으로 각각의 펩티드를 생성하였다. 완성된 펩티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 측쇄 보호기를 90% 트리플루오로아세트산으로 제거하였다. 합성 펩티드 제제를 매트릭스-보조 레이저 탈착 비행 시간(Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight, MALDTOF) 질량 분광측정법에 의한 정확한 조성, 및 역상 HPLC에 의한 합성 프로파일 및 농도를 포함한 내용물에 대해 특성화하였다. 긴 합성과 함께, 커플링 효율의 엄격한 제어에도 불구하고, 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 비롯한 신장 주기 동안의 사건으로 인해 펩티드 유사체가 또한 생성되었고, 이에 따라 표적 펩티드와 함께 다수의 펩티드 유사체가 생성되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 펩티드 유사체는 면역진단의 목적을 위한 항체 포획 항원으로서 또는 백신접종의 목적을 위한 면역원으로서 면역학적 용도에 사용되는 경우에 항원성 및 면역원성에 대한 기여자로서 펩티드 제제에 여전히 적합하였다. 전형적으로, 부산물의 혼합물로서 합성 과정을 통해 계획적으로 설계되거나 생성된 이러한 펩티드 유사체는 종종, 분별 QC 절차가 개발되어 제조 과정 및 생성물 평가 과정 둘 다를 모니터링함으로써 이들 펩티드를 사용하는 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보장하는 한, 목적하는 펩티드의 정제된 제제만큼 효과적이다.
도 4는 후속 백신 제제 용도로 사용하기 위한 본 발명자의 초기 조사 및 유효성 확인을 통과한 ORF 7 코딩된 단백질 (GP2, GP3, GP4, GP5, M 및 NC 단백질)에 대한 PRRSV 2 상의 선택된 B 및 T 세포 에피토프의 분포/위치결정을 보여준다. B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원에 대한 설계 목표는, 중화 항체를 유도할 수 있거나 또는 표적 세포에 대한 PRRSV 수용체 결합에 관여하는 선택된 기능적 부위를 모방하는 항원성 펩티드를 생성하는 것이다. 단일 PRRSV 균주 서열 또는 폭넓은 바이러스 범위를 위해 여러 PRRSV 균주 서열로부터 유도된 바와 같은 조합 서열에 기반하여, 천연 PRRSV GP5 단백질 항원에 대한 상대적 면역원성 및 교차-반응성을 시험하기 위해 표 4에 나타낸 바와 같은 수용체 결합/중화 부위 주변의 4개의 아미노산 프레임 GP5.1, 5.2, 5.3 및 5.4에 걸쳐 특이적 GP5 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드를 설계하였다 (서열 9 내지 14).
GP2 B 에피토프 (V111-L136), GP3 B 에피토프 (C57-C75) 및 GP4 B 에피토프 (C52-C69)의 명칭을 갖는, PRRSV JXA1 서열에 기반한 구조 단백질 GP2 내지 GP4로부터의 중화 부위 주변에서 설계된 추가의 B 세포 클러스터 항원성 펩티드를 표 3에 나타내었다. GP2 B (V111-L136)는 선형 펩티드 (서열 6)로서 제시되는 반면, GP3 B 에피토프 (C57-C75) 및 GP4 B 에피토프 (C52-C69)는 시클릭 펩티드 (서열 7 및 8)로서 제시되어 입체형태 보존을 위한 국부 제약을 허용한다. 이들 항원성 펩티드를 또한 GP5.1 및 GP5.2 프레임의 경우에는 C-말단 (서열 29 및 30)에서 또는 표 5에 나타난 바와 같이 N-말단 (서열 39-46)에서 인공 조합 Th 펩티드 (서열 15)에 개별적으로 연결시켜 그들의 짧은 길이 성질로 인한 이들 펩티드 항원의 면역원성을 증진시켰다. 이들 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원을 백신 제제 내로 혼입시키고, 잘 설계된 프로토콜에 따라 기니 피그 또는 돼지 내로 면역화하고, 면역 혈청을 광범위한 혈청학적 평가를 위해 시기적절하게 수집하였다. 이들 면역 혈청을 면역원성에 대한 각각의 표적 펩티드 항원 기반 ELISA에 대한 그들의 항체 역가에 대한 시험에 적용시켰다.
면역형광 검정 (IFA)에 의한 PRRSV 천연 단백질 항원에 대한 교차-반응성의 검출을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이는 최종 백신 제제에 사용하기 위해 설계된 펩티드 면역원의 적합성을 평가하기 위한 것이다. 펩티드 면역원으로서 검증된 펩티드 항원에 대해, 기원 PRRSV 균주 (예를 들어, MD001, JXA1, NA 및 EU 균주)로부터 유도된 서열, 또는 표 3에 나타낸 바와 같은 컨센서스 (cons) 서열, 또는 그의 유도된 서열 32, 33 및 34에 대해 표 4에 나타낸 바와 같은 조합 서열을 갖는 펩티드 상동체를 펩티드 면역원으로서 추가로 설계하여, 다양한 균주의 PRRSV와의 광범위한 교차-반응성을 위한 면역화된 숙주에서의 항체의 도출을 허용하였다.
T 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원에 대한 설계는 훨씬 더 단순하다. PRRSV-면역화 및 이후 시험접종된 돼지로부터 수득한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 배양물에서 IFN-감마 반응을 유도하는 그의 능력에 기반하여 잘 특성화된 면역우성 T 세포 에피토프를 백신 제제 내로의 혼입을 위해 선택함으로써 면역화된 숙주에서의 세포 매개 면역 반응의 범위를 넓혔다. GP4, GP5, M 및 NC 단백질로부터의 PRRSV JXA1 균주에 기반한 T 세포 에피토프 클러스터 펩티드의 서열, 및 다양한 PRRSV 균주 (MD001, NA 및 EU)에서의 상동성 PRRSV T 헬퍼 에피토프 서열에 대한 정렬을 표 6에 서열 47-79로서 나타내었다. 이들 약간 소수성인 펩티드 항원의 용해도를 개선하기 위해, 3개의 리신 잔기 (KKK)를 개별 T 헬퍼 펩티드의 N-말단에 부가하여 이들이 펩티드 면역원으로서 작용하게 하였다. 모든 확인된 Th 펩티드 면역원 (서열 47-79)을 등비로 혼합함으로써 백신 제제에서의 보충물로서의 이들 T 세포 클러스터 펩티드의 풀 (T 세포 에피토프 풀 1)을 제조하여, 세포 매개 면역을 위한 PRRSV B 세포 클러스터 펩티드 면역원 및 PRRSV T 세포 펩티드 면역원 그 자신의 면역원성을 추가로 증진시켰다.
동물의 다양한 유전적 배경에 걸친 T 세포 에피토프 범위를 추가로 넓히기 위해, 특정 에피토프에 대한 4개의 상동성 T 에피토프 서열에 기반한 조합 펩티드를 각각의 T 세포 에피토프에 대해 제조하였다. 유사하게, 3개의 리신 잔기 (KKK)를 표 7에 나타낸 바와 같은 각각의 조합 T 에피토프 클러스터 펩티드 면역원 (서열 80-90)의 N-말단에 부가하였다. 이들 T 에피토프 클러스터 조합 펩티드 면역원의 풀 (풀 2)을 백신 제제에 보충물로서 사용하여, 세포 매개 면역을 위한 PRRSV B 세포 클러스터 펩티드 면역원 및 PRRSV T 세포 펩티드 면역원 그 자신의 면역원성을 추가로 증진시켰다.
실시예 5
면역원성 및 천연 PRRSV 단백질과의 교차반응성의 평가를 위한 GP5, 2, 3 및 4 단백질로부터의 PRRSV B 에피토프 클러스터 펩티드 항원을 함유하는 백신 제제로의 기니 피그 및 돼지의 면역화
엑토도메인은 세포외 공간 (세포 외부의 공간)으로 뻗어 있는 막단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 통상적으로 표적 세포 표면과의 접촉을 개시하는 바이러스 단백질의 부분이며, 감염 동안 세포에의 부착 및 진입을 담당한다. 중화 항체는 바이러스의 세포 수용체와의 상호작용을 차단하기 때문에 바이러스 진입-연관 도메인은 중화 항체의 유도에 있어 중요하다. 따라서, 효과적인 차세대 PRRSV 백신을 개발할 때, PRRSV의 바이러스 진입-연관 도메인의 기능성을 평가하는 것이 중요하다. 대식세포-특이적 렉틴 시알로어드헤신 (CD163)은 대식세포 상의 결정적 바이러스 수용체이다. 시알로어드헤신의 가용성 형태를 사용하여, PRRSV의 GP5 및 M 복합체의 디술피드 연결된 이종이량체가 시알로어드헤신에 대한 리간드임을 발견하였다. 상기 리간드-수용체 상호작용은 시알로어드헤신의 렉틴 활성 및 GP5 당단백질 상의 시알산에 의존한다. 따라서, 바이러스 M/GP5와 숙주 세포 수용체 시알로어드헤신 사이의 상호작용을 차단하는 면역을 유도하기 위한 목적으로, PRRSV GP5 단백질의 엑토도메인 및 GP5의 면역원성에 대한 M의 영향을 조사하여 PRRSV 마커 백신 제제에 사용하기 위한 최적 GP5 펩티드 면역원을 확인하였다.
PRRSV GP5 단백질의 엑토도메인 내의 수용체 결합/중화 부위 주변에서 45종 초과의 펩티드 항원을 설계하고, 면역원성 평가를 위해 4종의 아미노산 서열 프레임으로 그룹화하였다.
제1 프레임은 GP5 엑토도메인의 C-말단 잔기 "E" (글루탐산)에서 시작하여 GP5 단백질의 신호 서열 내에 5개의 추가의 아미노산 잔기를 포함하는 엑토도메인의 N-말단까지 연장됨으로써, PRRSV 균주 MD 001의 서열에 기반한 GP5.1 MD001(A26-E65) 펩티드 항원 (서열 29)으로서 표 4에 나타낸 바와 같은 40량체 펩티드 항원을 제조하였다. 상기 설계는 원하는 경우에, M 펩티드의 엑토도메인과의 디술피드 결합 형성을 위해 GP5 펩티드 항원의 중심부에서의 Cys 잔기를 허용한다.
제2 도메인은 C24와 C48 사이의 분자내 디술피드 결합이 GP5의 엑토도메인의 구역 입체형태의 보존을 허용할 수 있는 45량체 펩티드 GP5.2 MD001 (V21-E65) (서열 30)을 생성하는 신호 서열 내로의 또 다른 5개의 아미노산 잔기에 대한 N-말단에서의 GP5.1 MD001 (A26-E65) 펩티드 항원의 연장이다. 상기 설계는 M 단백질의 부재 하에 GP5의 대부분의 엑토도메인에 대한 특이적 항체의 유도를 허용할 것이다.
제3 프레임은 엑토도메인의 11량체 GP5 HV2 영역을 생략하여 34량체 펩티드 항원 GP5.3 (V21-D54) (서열 9)을 수득하는 것을 제외하고는 제2 프레임 펩티드 항원 GP5.2 MD001 (V21-E65)을 본떠서 제조하였다. 상기 설계는 GP5의 엑토도메인의 고도로 보존된 중심 영역의 B 세포 인식을 허용할 것이다.
제4 프레임 (GP5.4)은 PRRSV 균주 MD001 서열에 기반한 25량체 시클릭 펩티드 GP5.4 (C24-C48)에 도달하기 위한 GP5 단백질의 엑토도메인의 중심에 위치한 루프 구조에 관한 것이다. 균주에서 균주로의 변이를 수용하기 위해, 북아메리카 유형의 JXA1/MD001 및 JXA1/NJ-a의 PRRSV 균주 서열에 따른 제3 및 제4 아미노산 프레임의 펩티드 항원을 본떠서 제조한 조합 펩티드를 GP5.3 JXA1/MD001 (V21-D54) (서열 32), GP5.3 JXA1/NJ-a (V21-D54) (서열 33) 및 GP5.4 NJ-a/JXA1/MD001 (C24-C48) (서열 34)로서 설계하였다. GP5 엑토도메인 펩티드 면역원성에 대한 M 단백질의 엑토도메인의 영향을 평가하기 위해, MD001 서열에 기반한 하기의 서열: "MGSSLDDRCHDSTAPQKVLLAFSITY" (서열 93)을 갖는 26량체 엑토도메인 펩티드를 평가를 위해 설계하였다 (M1-Y26).
PRRSV의 구조는 바이러스 RNA와 회합된 뉴클레오캡시드 단백질로 구성된다. 핵단백질은 6종의 구조 단백질이 박혀있는 지질 외피로 둘러싸여 있다: GP2, GP3, GP4, GP5 및 비글리코실화 단백질 M 및 E (ORF2b). GP5 및 M은 외피에서 가장 풍부한 단백질인 반면, 다른 외피 단백질은 보다 적은 양으로 존재한다. GP5가 PRRSV 보호 면역의 주요 표적이 되어왔지만, PRRSV의 가변성 및 GP2 및 GP3도 또한 임상적 및 바이러스학적 보호에 다소 관여한다는 최근 발견에 비추어, GP2, GP3 및 GP4로부터 유도된 항원성 펩티드에 결합된 폴리클로날 항체도 또한 PRRSV에 대한 중화 활성을 또한 발휘한다는 증거가 있으므로, GP2, GP3 및 GP4로부터의 선택된 펩티드 항원도 또한 PRRSV 백신 제제에의 혼입에 대해 설계, 스크리닝 및 확인하였다. 구체적으로, 표 3에 나타낸 바와 같은 항원성 펩티드 GP2B 에피토프 (V111-L136) (서열 10), GP3 B 에피토프 (C57-C75) (서열 11), GP4 B 에피토프 (C52-C69) (서열 12)를 면역원성 및 교차-반응성 평가를 위해 PRRSV JXA1 균주 서열에 기반하여 설계하였다. 다양한 PRRSV 균주로부터의 상동성 GP5, GP2, GP4 및 GP4 유도된 B 에피토프 서열을 또한 펩티드 항원 설계 기준에 대한 예로서 표 3에 열거하였다.
GP5, GP2, GP3 및 GP4로부터의 이들 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원은 또한 그들의 짧은 길이 성질을 극복하여 이들 펩티드 항원의 면역원성을 증진시키기 위해, GP5.1 및 GP5.2 프레임의 경우에는 C-말단 (서열 37 및 38)에서 또는 표 5에 나타낸 바와 같은 N-말단 (서열 39-46)에서 인공 조합 Th 펩티드 (서열 35)에 개별적으로 연결시켰다.
백신 제제
본 발명의 펩티드 기반 PRRSV 백신의 예시된 사용에서, 아미노 또는 카르복실 말단을 통한 외래 Th 에피토프에 대한 연결 및 외래 T 헬퍼 에피토프, 예컨대 인공 조합 Th 서열 UBITh®3 (서열 35)에 대한 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 36) 또는 εNLys 스페이서를 갖거나 또는 갖지 않는 표 3 내지 7에 서열 9-90으로 열거된 바와 같은 수용체 결합/중화 또는 T 헬퍼 에피토프 클러스터 부위를 포함하는 펩티드를 면역원으로서 갖는 백신 제제를, 상업적으로 입수가능한 오일 백신 전달 비히클 몬타니드 ISA 50V2를 공급업체가 권고한 절차에 기반하여 사용하여 유중수 에멀젼으로 제제화하였다. 돼지 백신에 흔히 사용되는 만니드 올레에이트 및 미네랄 오일의 유성 아주반트 조성물인 몬타니드™ ISA 50V2 (세픽(Seppic), 프랑스 파리)를 동등 부피의 PBS 중 수성 상 펩티드 용액으로 유화시켰다. 펩티드 면역원을 구체적 프로토콜 (예를 들어, 에멀젼 중 펩티드 비 및 총 펩티드 농도)에 따라 약 25 내지 75 ug/mL의 각각의 에멀젼으로 제제화하였다. 에멀젼 기반 백신 제제를 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 부위당 0.25mL 내지 0.5mL로 기니 피그에, 또는 부위당 1mL로 새끼 돼지에 근육내로 주사하였다.
디자이너 펩티드 백신 제제로의 기니 피그 및 새끼 돼지의 면역화.
기니 피그에서 수행되는 면역원성 연구를 위해, 성체 성숙 및 미감작 수컷 및 암컷 던컨-하틀리(Duncan-Hartley) 기니 피그 (300-350g/BW)를 군당 3마리 사용하였다. 동물을 특정 백신 제제로 0 및 3 wpi에 근육내로 (IM) 2회의 용량으로 면역화하였다. 백신 제제는 면역화 전에 약 30분 동안 실온에 두고, 약 10 내지 15초 동안 볼텍싱하여야 한다. 최초 면역화 후 0, 3 및 5주 (wpi)에 혈청 샘플을 위해 혈액을 수집하였다. 이들 샘플을 펩티드 면역원 및 백신 제제의 면역원성 평가를 위해, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 직접 결합 역가를 위한 표적 펩티드 기반 ELISA 및 교차-반응성 역가를 위한 PRRSV 공동-형질감염된 세포 기반 IFA에 의해 시험하였다.
특정 병원체가 없는 (SPF) 농장으로부터의 대략 4주령의 새끼 돼지를 면역원성 연구를 위해 귀에 표시하고, 연구 프로토콜에 따라 군 (3 내지 5마리의 새끼 돼지/군)으로 나누었다. 이들 군을 백신 제제로 근육내로 0 및 4주에 면역화하였다. 한 연구에서, 감염된 돼지를 본 발명의 마커 백신 제제로 백신접종된 돼지로부터 구별하고 또한 PRRSV 마커 백신 제제에 대한 돼지의 반응을 측정하기 위한 진단 ELISA 시험의 조합의 이용을 통해 항 PRRSV 항체의 존재 하에서의 디자이너 PRRSV 펩티드 항원의 독립적 면역원성을 평가하기 위해, 이전에 PRRSV 감염을 앓은 통상의 농장으로부터의 새끼 돼지를 사용하였다.
혈액 샘플을 제1 면역화의 시점에, 3-4주에 제1 부스팅 시에, 및 부스팅 2주 후 5-6주에 수집하고, 혈청 샘플을 실시예 1 및 2에 상세히 기재된 바와 같이 제조하여 면역원성 및 교차-반응성의 평가를 위한 다중 혈청학적 시험에 적용시켰다.
PRRSV GP5 단백질 엑토도메인 서열로부터 설계된 펩티드 면역원의 최적화 및 순위결정
제조된 다수의 GP5 엑토도메인 펩티드 면역원 중 9종을 프라이밍 및 부스팅 면역화 스케줄 후의 상대적 면역원성의 예시 및 순위결정을 위해 에멀젼 제제로 제제화하였다. 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, PRRSV MD001 서열에 기반한 펩티드 면역원 4020Kc (서열 38)는 표적 펩티드 ELISA (>1 log10) 및 IFA 역가 둘 다에 기반하여 펩티드 면역원 4020 Kb (서열 37)보다 더 면역원성이다. 따라서, 아미노산 서열 프레임 2 (GP5.2) 설계가 프레임 1 (GP 5.1)보다 우수하다. 펩티드 면역원 4020Kc를 실시예 6에 상세히 기재된 바와 같은 PRRSV MD001에 의한 대부분의 PRRSV 시험접종 연구에 사용하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, PRRSV MD001로부터 유도된 서열을 갖는 프레임 3 (GP5.3)으로 설계된 펩티드 면역원 4048Kb (서열 39)는 펩티드 4020Kc와 거의 동일한 면역원성을 갖는 것으로 밝혀졌지만, 그의 IFA 역가는 펩티드 면역원 4020Kc의 것보다 높았다. ELISA 및 IFA 둘 다에 의해 입증된 유사한 면역원성이, 펩티드 면역원 4048Kb와 비교시에 제3 프레임 (GP5.3)에 기반하여 설계된 또 다른 펩티드 면역원 4050Kb (서열 40)로 발견되었다. 프레임 3은 따라서 GP5 B 세포 에피토프 클러스터 항원 제시를 위한 보다 유리한 설계 프레임으로 간주되었다.
바이러스 균주 범위를 넓히기 위해, 본 발명자는 따라서 아미노산 서열 프레임 3에 기반한 몇몇 관련 조합 펩티드 항원, 예컨대 펩티드 면역원 4052Kb (서열 41) 및 펩티드 4124 Kb (서열 42)를 설계하여 단일 서열 GP5 펩티드 4048a (서열 9) 및 4050a (서열 31)와 비교시의 항체 반응성의 폭에 대한 시험을 진행하였다. MD001 및 JXA1 유도된 GP5.3 프레임 서열과의 이중 반응성이 펩티드 4052Kb (서열 41)로의 면역화로부터 유도된 면역 혈청에 대해 발견되었고, 따라서 MD001 및 JXA1 둘 다의 범위의 폭이 입증되었다. GP5.3 펩티드 항원 4124a (서열 30) 및 4124Kb (서열 42)를 설계하여 펩티드 면역원의 조합 성질을 추가로 확장하고, 그의 각각의 면역원성에 대해 비교하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 펩티드 4124Kb를 사용하여 면역원성의 유의한 증진이 펩티드 항원 4124a와 비교시에 ELISA 및 IFA 둘 다에 의해 나타난 바와 같이 발견되었다 (펩티드 항원 4124a에 연결되었을 때 인공 조합 Th 펩티드 (서열 35)의 면역원성 증진 효과를 나타냄). GP5의 루프 구조를 유지하기 위한 N- 및 C-말단 둘 다에서의 아미노산의 감소는 펩티드 항원 4094a (서열 35) 및 그의 보다 면역원성인 형태 펩티드 항원 4094Kb (서열 43)의 설계로 이어졌다. 펩티드 항원은 둘 다 이러한 서열 트리밍 후에 감소된 면역원성을 보여주었고, 따라서 인공적으로 구축된 루프 구조 (C24-C48)는 GP5 엑토도메인의 결정적인 부분으로 남았으며, 그로부터의 증진된 면역원성은 펩티드 항원 4124a 및 4124Kb의 구조 내로의 N- 및 C-말단 둘 다로부터의 연장에 의해 최적으로 구성될 수 있다.
모든 평가에서, 4020Kb 및 4020Kc를 생성하는 펩티드 항원 4020b 및 4020c의 경우에 나타난 바와 같은 C-말단에의 인공 조합 Th 펩티드 (서열 35)의 부착, 또는 4124Kb를 생성하는 4124a와 같은 N-말단에의 부착은 모두 각각의 펩티드 항원이 보다 우수한 펩티드 면역원이 되는 것을 용이하게 하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같은 PRRSV JXA1 균주에 의한 추적 PRRSV GP5 기반 시험접종 연구를 위해 펩티드 4094 및 4124 시리즈의 펩티드 항원을 에멀젼 백신 제제로 제조하였고, 펩티드 면역원 4124Kb는 심지어 에멀젼의 단일 투여 (군 5)로도 고병원성 PRRSV JXA1 균주에 의한 감염으로부터 미감작 새끼 돼지를 완전히 보호 (20/20=100%)하는 성공을 나타낸 반면, 펩티드 면역원 4094 시리즈는 2회 용량의 면역화 후에 준최적 보호 (4/5=80%)를 발휘하였다.
GP5 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원의 면역원성에 대한 PRRSV 엑토도메인 M 펩티드의 효과.
GP5 및 M은 PRRSV 외피에서 가장 풍부한 단백질이고, 2종의 단백질은 그의 엑토도메인에서 디술피드 연결된 이종이량체를 형성하여 대식세포의 세포 표면 상의 시알로어드헤신 수용체 (CD163)에 대한 리간드로서 작용한다. 전장 M 엑토도메인 펩티드 항원 (26량체 길이)을 제조하고, 전장 GP5 엑토도메인 펩티드 면역원 4020Kb 또는 4020Kc와 1:1 및 1:10의 비로 혼합하여, GP5 엑토도메인 펩티드 항원 4020Kb 및 4020Kc 둘 다의 면역원성에 대한 상기 엑토도메인 M 펩티드의 영향을 평가하였다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 26량체 엑토도메인 M 펩티드는 GP5 펩티드 면역원 4020Kb 및 4020Kc와 등비로 혼합하였을 때 놀라울 만큼 면역원성인 것으로 밝혀졌고, GP5 펩티드 면역원 4020Kb 및 4020Kc에 대한 M의 상대적 면역원성은 펩티드 기반 ELISA에 의해 측정시 각각 약 1000- 및 100-배에 랭크되었다 (군 1 및 2; 군 3, 4 및 5의 비교). GP5 펩티드 면역원 4020Kc에 대한 IFA 역가는 또한 용량 의존적 방식으로 유의하게 억제되었다 (군 3, 4 및 5의 비교). 리간드-수용체 상호작용이 대식세포 상의 시알로어드헤신 및 GP5 당단백질 상의 시알산의 렉틴 활성에 의존성이기 때문에, 따라서 GP5의 면역원성을 보존하여 PRRSV 외피에서의 상기 주요 단백질에 결합하는 항체의 도출을 허용하는 것은 중요하다. 외피 상의 GP5에의 공유 연결, 이에 따라 리간드로서 GP5/M 복합체의 일부분임이 시사되었음에도 불구하고, M 펩티드는 따라서 본 발명자의 추적 PRRSV 백신 설계에서 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원 기반 성분으로 남겨졌다.
PRRSV GP5 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원의 IFA 역가에 대한 PRRSV Th 풀의 용량 변화의 효과.
준최적 면역원성을 갖는 GP5 엑토도메인 도메인의 중심 루프 구조 (C24-C48)를 나타내는 GP5 펩티드 항원 4094a를 새끼 돼지에서의 본 연구에 사용하여 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원의 면역원성에 대한 PRRSV Th 펩티드의 용량 변화의 효과를 조사하였다. 등비의 PRRSV Th 에피토프 클러스터 펩티드의 혼합물을 5%, 10%, 20% 내지 50%로 4094a 펩티드 항원 (서열 31)에 추가로 보충하였다. B 세포 에피토프 클러스터 항원성 펩티드 및 T 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원 둘 다를 함유하는 백신 제제를 30ug/mL의 준최적 용량으로 프라이밍 및 부스팅 프로토콜을 갖는 표준 면역화 프로토콜을 통해 새끼 돼지에 제공하여, 펩티드 항원 4094a의 면역원성에 대한 이러한 PRRSV Th 펩티드의 효과를 모니터링하였다 (군 1 내지 군 4). ELISA에 의해 측정시의 면역원성은 모니터링된 이들 군에 경우에 유의하게 변화하지 않았지만, IFA 역가는 천연 PRRSV GP5 단백질에 대한 이들 새끼 돼지에서 도출된 항-펩티드 항체의 교차-반응성에서 용량 의존적 방식으로 개선을 나타내었다. 비교를 위해, 4094a (서열 31)에 공유적으로 연결된 조합 Th 에피토프를 갖는 GP5 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원 4094Kb (서열 43) (군 5)는 또한 펩티드 항원 4094a 단독에 비해 개선된 면역원성을 갖는 것으로 나타났다. 면역화된 숙주의 프라이밍 후의 PRRSV에 대한 노출시의 리콜 반응을 통해 PRRSV에 대한 세포 매개 면역을 마운팅하는 것으로 공지된 짧은 PRRSV Th 펩티드 (서열 47-79)는 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원에 공유적으로 연결되지 않았다. 개선된 IFA 역가에 의해 나타난 바와 같은 항체 반응성의 품질의 개선은 이러한 T 세포 매개 면역 반응의 이익을 나타내었다. PRRSV에 대한 노출시에 PRRSV에 대한 시토카인 생산을 비롯한 광범위한 세포 매개 면역을 마운팅하기 위해, 이들 주의깊게 선택된 PRRSV Th 펩티드는 모든 추적 시험접종 연구에서 20% (w/w)의 PRRSV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원과 함께 백신 제제 중에 포함되었다.
중화 활성을 갖는 항원성 부위 주변의 고도로 면역원성인 GP2, GP3 및 GP4 B 세포 클러스터 펩티드의 확인 및 설계.
GP2, GP3 및 GP4 단백질로부터 유도된 항원성 펩티드에 결합된 폴리클로날 항체도 또한 PRRSV에 대한 중화 활성을 발휘하였으며, 이들 PRRSV 외피의 부수 단백질이 PRRSV에 대한 임상적 및 바이러스학적 보호에 다소 관여한다는 최근의 발견에 비추어, 표 3에 나타낸 바와 같은 특정 항원성 펩티드 GP2 B 에피토프 (V111-L136) (서열 6), GP3 B 에피토프 (C57-C75) (서열 11), GP4 B 에피토프 (C52-C69) (서열 12)를 PRRSV JXA1 균주 서열에 기반하여 설계하고, 면역원성 및 교차-반응성 평가를 위한 후보 펩티드 항원으로서 확인하였다. 기니 피그에서의 면역원성 평가를 위해 이들 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원을 GP2, 3 및 4 B 세포 에피토프 클러스터 항원성 펩티드 (서열 44-46)로서 N-말단에서 인공 조합 Th 펩티드 (서열 35)에 개별적으로 연결시켰다.
인공 조합 Th 서열에 대한 연결을 갖거나 또는 갖지 않는, 중화 활성을 갖는 항원성 부위 주변에서 구체적으로 설계된 GP2, GP3 및 GP4 B 세포 클러스터 펩티드를 개별적으로 함유하는 백신 제제를 그의 각각의 면역원성의 평가를 위해 기니 피그에서 시험하였다. 설계된 다수의 펩티드 면역원 중에서, N-말단에 인공 조합 Th 펩티드 연결을 갖는 3종의 펩티드 (서열 44, 45 및 46)는 놀랍게도 표 11에 나타낸 바와 같이 심지어 30ug 용량의 단일 투여시에 높은 면역원성을 보여주었다. 이들 고도로 면역원성인 펩티드는 따라서 PRRSV 백신을 위한 최종 제제 내로의 혼입에 대한 탁월한 후보이다.
기니 피그에서의 조합된 GP2, GP3, GP4 및 GP5 에피토프 클러스터 펩티드 면역원에 대한 면역원성 평가.
PRRSV GP2, 3, 4 및 5 단백질로부터 유도된 각각의 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원에 대한 설계의 정밀화 후, 최초 프라이밍의 경우에 30ug/mL 및 추적 부스팅의 경우에 3 wpi에 15ug/mL의 총 펩티드 농도로 표준 에멀젼 기반 백신 제제 중에 등비로 혼합된 이들 펩티드의 조합물을 다른 펩티드 항원과 혼합되었을 때의 개별 펩티드 항원의 면역원성에 대해 시험하고, 또한 펩티드 항원 혼합물의 전반적 면역원성을 평가하여 혼합물 중 하나 이상의 항원의 면역원성의 임의의 의도되지 않은 억제를 평가 및 회피하였다. 본 평가를 수행하여 GP5/M 펩티드 항원 혼합물에 대한 M 펩티드에 의한 음성 영향을 회피하였다.
표 12에 나타낸 바와 같이, GP4 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원 (서열 46)을 GP3/4 콤보 제제로서 GP3 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원 (서열 45)과 혼합하고, GP3/4/5 콤보 제제로서 GP3 (서열 45) 및 GP 5 (서열 42)와 혼합하거나, 또는 GP2/3/4 콤보 제제로서 GP2 (서열 44) 및 GP3 (서열 45)과 혼합하였을 때, 표적 펩티드 기반 ELISA에 의해 추정된 GP4 펩티드 항원의 면역원성은 GP3 표적 펩티드와 혼합된 경우에는 강하게 남아있었지만, 삼중 펩티드 항원 혼합물로 제시된 경우에는 유의하게 약화되었다. GP2 및 GP3 에피토프 클러스터 펩티드 항원의 면역원성은 GP4 펩티드 항원과 비교하였을 때 단일 펩티드 항원만큼 면역원성으로 남아있었다. GP2 및 GP3 에피토프 클러스터 펩티드 항원은 따라서 면역 반응 범위의 폭을 증진시키기 위해 임의의 PRRSV 펩티드 항원 혼합물에서 보다 견실하게 사용될 수 있다. GP2, GP3 및 GP4가 바이러스 외피 상의 부수 성분이라는 사실에도 불구하고, 상응하는 천연 PRRSV 단백질 항원과의 교차-반응성을 보여주는 합리적 IFA 역가가 GP5 항원 펩티드의 부재 하에 펩티드 항원 혼합물에 의해 획득되었다 (예를 들어, 군 1, 2 및 4).
실시예 6
PRRSV MD001 균주에 의한 시험접종으로부터, PRRSV Th 에피토프 클러스터 펩티드 항원으로 보충된 GP5 유도된 펩티드 기반 PRRSV 백신으로 보호된 새끼 돼지.
돼지를 PRRSV 감염으로부터 보호하는데 있어서의 PRRSV GP5 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 항원의 효능을 입증하기 위해, 3회의 연속적 면역화 및 시험접종 연구를 대만 동물 기술 연구소 (ATIT)에서 수행하였다. PRRSV GP5 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원에 의해 생산된 백신 제제를 객관적으로 평가하기 위해, 모든 제제를 코드화하였다. SPF 돼지를 정기적으로 모니터링하여 전형적 돼지열, 가광견병, 위축성 비염, 미코플라스마 히오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 구제역, 돼지 이질, 옴, 및 악티노바실루스 플루로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae)를 비롯한 병원체로부터 자유롭다는 것을 보증하였다. PRRS 1001S, 1002S 및 1003S 연구로부터의 모든 군은 GP5 B 에피토프 클러스터 펩티드 면역원 4020Kc (서열 38) 및 4052Kb (서열 41)를 사용하였고, 일부 제제 파라미터의 사소한 변화를 가졌다. 이들 제제는 4020Kc 항원성 펩티드 유도된 백신 제제로서 군 1 및 2, 및 4052Kb 항원성 펩티드 유도된 백신 제제로서 군 3 및 4에서 동등한 것으로 간주되었다. 풀링된 등비 PRRSV Th 에피토프 펩티드 혼합물 (JXA1 서열에 기반한 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76)을 각각의 백신 제제 중에 10 중량%로 보충하여, 세포-매개 면역의 제공을 통해 면역원성, PRRSV GP5 펩티드 항원의 면역원성을 추가로 증진시켰다.
트랜스제닉 SPF 농장을 오염시키지 않기 위해, 단지 면역화 부분만을 이들 면역화/시험접종 연구에의 진입을 위한 4주령의 SPF 돼지를 제공하는 트랜스제닉 SPF 농장에서 수행하여, 연구를 2개의 장소에서 수행하였다. 상기 농장은 ATIT에 의해 운영되며, 대만 북부에 있는 시안 샨, 신 추(Hsian Shan, Hsin Chu)의 고립된 지역에 위치해 있다. 4주의 프라이밍 및 부스팅 면역화 프로토콜이 완결된 후, SPF 돼지를 시험접종 연구를 위해 대만 남부의 또 다른 잘 제어된 농장으로 옮겼다. PRRSV의 미국 균주는 대만에서 보편적이기 때문에, 2종의 미국 균주 MD-001 및 AMERVAC-PRRS를 이들 시험접종 연구에 사용하기 위해 채택하였다. 바이러스 시험접종 후, 혈청 샘플을 IFA 및 바이러스혈증 시험을 위해 수집하였다. 최종적으로, 동물을 안락사시키고, 시진 및 병리상태 검사에 적용시켰다. SPF 새끼 돼지를 군당 5마리의 동물을 갖는 연구 설계에 기반하여 군으로 나누었다. 혈액 샘플을 표 13에 나타낸 바와 같이 수집하였다. 수집된 모든 혈청 샘플을 PRRSV-ORF5 IFA 시험에 의해 (rVV-PRRS ORF5 발현 방법에 의해) 시험하였다.
주사 후의 임상 관찰
각각의 백신 투여 전후에 모든 새끼 돼지를 국부 (부위 반응원성 및 알레르기 반응 포함) 및 전신 (호흡곤란, 식욕, 설사, 기침, CNS/SS, 및 알레르기 반응 포함) 반응에 대한 임상 관찰에 적용시켰다. 연구 동안, 간헐적인 국부 반응원성 관련 종창이 발견되었으며, 이는 3-4일 이하로 지속되었고 관찰되는 추가의 차이 없이 정상 상태로 복귀하였다. 연구된 모든 동물에 대해 전신성 유해 반응은 관찰되지 않았다.
바이러스 시험접종 후의 임상 관찰
모든 면역화된 돼지는 바이러스 시험접종을 받은 후에 모니터링된 기간 동안 PRRS를 대표하는 임상 징후를 보이지 않았다.
면역화 및 시험접종 후의 IFA 검출 및 폐 병변
표 14에 나타낸 바와 같이, PRRSV에 대한 특이적 항체가 면역화 후에 생산되었고, 4 및 6 wpi (면역화 후 주수)에 IFA에 의해 검출시 고역가에 도달하였다. 표 14에 나타낸 바와 같이, 대조군의 동물은 PRRSV 시험접종 연구 후에 PRRSV GP5 단백질에 대한 항체를 도출하지 않았으며, 이는 주로 시험접종 바이러스 원액에서 제시되었을 때의 PRRSV GP5 단백질의 약한 면역원성 성질에 기인한다. 백신접종된 군은 바이러스 시험접종 후에 2 wpc (시험접종 후 주수)에 높은 IFA 역가를 유지하였다. PRRSV GP 5 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원 백신 제제 (군 1 및 2의 경우에 4020KC, 및 군 3 및 4의 경우에 4052Kb)로 면역화된 20마리의 새끼 돼지 중 18마리는 검출된 어떠한 병변도 없이 완전히 보호되었다 (90%의 보호율). 군 3 및 4의 2마리의 새끼 돼지에서, 경미한 병변이 검출되었다. 대조적으로, 돼지의 80% (4/5)는 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이 간질성 폐렴과 함께 중증의 병변이 발견되었다. ATIT의 PRRSV 실험실에서 수행된 광범위한 시험접종 시험에 기반하여, PRRSV GP5 단백질에 의한 보다 높은 IFA 역가는 PRRSV 시험접종에 대한 완전한 보호와 크게 상호연관되었다.
바이러스혈증 검출
PRRSV 바이러스 로드 검출을 위한 PR-PCR 방법을 이용하여, 모든 백신접종된 돼지에서 검출가능한 바이러스 로드가 발견되지 않았다. 이는 폐에서의 보호 효능의 결과와의 일치성을 나타낸다. 2종의 바이러스 균주가 감염 후에 심각한 증상을 유발하지 않을지라도, 18/20 백신접종된 돼지에서의 바이러스혈증의 부재 및 병리학적 결과의 완전한 부재는 PRRSV GP5 펩티드 기반 백신 제제에 의해 제공되는 양성 보호 효능의 입증된 개념을 나타내었다.
실시예 7
단일 및 프라이밍-및-부스팅 면역화 스케줄 둘 다 후의 고병원성 PRRSV (NVDC-JXA1 균주)에 의한 시험접종으로부터, PRRSV Th 에피토프 클러스터 펩티드 항원으로 보충된 GP5 유래된 펩티드 기반 PRRSV 백신으로 보호된 새끼 돼지.
중국 PRRSV JXA1 시험접종 모델의 배경기술:
2006년에, 중국에서 PRRS의 본질을 갖는, 처음에는 알려지지 않았던 소위 "고열"병의 유례 없는 대규모 발생이 있었고, 이는 10개 초과의 성 (자치 도시 또는 구역)으로 확산되었고, 2,000,000마리 초과의 돼지에 대략 400,000건의 치사 사례와 함께 영향을 미쳤다. 전형적 PRRS와 달리, 다수의 성체 암퇘지도 또한 "고열"병에 감염되었다. 상기 이례적인 PRRS 대유행은 처음에는 신경학적 증상 (예를 들어, 전율), 고열 (40-42℃), 홍반성 창백 발진 등을 나타내는 돼지 콜레라-유사 질환으로서 확인되었다. 면역학적 분석과 조합된 부검은 다중 기관이 고병원성 PRRSV에 의해 감염되었고, 중증의 병리학적 변화가 관찰되었음을 명백히 보여주었다. 케공 티안(Kegong Tian) 등에 의한 협동 노력 (문헌 [(2007 PLosOne doi: 10.1371/ journal.pone.0000526) on Emergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China 및 Molecular Dissection of the Unique Hallmark])으로 중국에서의 돼지 감염 모델이 확립되어, 12마리의 SPF-돼지 (4마리의 새끼 돼지/군)의 시험접종을 위한 상이한 기원을 갖는 3종의 대표적인 PRRSV 분리주 (JXA1, HEB1 및 HUB2)로 단리된 PRRSV의 높은 병원성을 재현하였다.
각각의 군에서, 새끼 돼지 중 2마리는 정맥내로 주사되었고, 둘 다 6-8일 이내에 사망하였으며, 이는 시험된 PRRSV 균주의 높은 병독성을 암시한다. 유사하게, 각각의 군에서 2마리의 다른 새끼 돼지는 비강내로 접종되었고, 이들은 3-6일 이내에 "고열"병의 뚜렷한 징후 (예를 들어, 고열, 혈반, 점출혈, 전율 및 파행 등)를 나타내었고, 둘 다 감염후 제10일에 사망하였다. 후속적으로, 바이러스 분리주를 감염된 돼지로부터 성공적으로 복구하였고, PCR 검출 및 EM에 의해 확인하였다. 부검에 착수하여 면역학적 효과 및 병리학적 병변을 평가하였다. 거의 동일한 병리학적 변화 (폐, 심장, 뇌, 신장, 간 등에서)가 "고열" 유행 동안 도살된 돼지에서 관찰되었고, 따라서 중국에서의 "고열"병의 2006년 발생이 돼지 집단에서의 고병원성 PRRSV 감염에 의해 유발된 것임을 확인하였다. PRC 가이드라인에 따라 새끼 돼지에서의 PRRSV 백신의 보호 효능을 유효성 확인하기 위해, 이제 PRRSV 분리주 중 하나인 JXA1을 표준화된 시험접종 연구에서의 표준 바이러스로 사용한다.
PRC 정부 백신 생산 가이드라인에 따른 유효한 PRRSV 시험접종의 규정 및 백신의 효능:
4주령의 새끼 돼지를 2주 간격으로 펩티드 기반 PRSRV 백신 제제로 1 또는 2회 백신접종하는 한편 한 군은 비-백신접종 대조군으로서 유지하였다. 이들 모두를 PRRSV NVDC-JXA1 고병원성 바이러스 3mL (10E5 TCID50 함유)로 귀 뒤에 근육내로 시험접종하였다. 체온을 21일 동안 매일 관찰하였다. 시험접종 연구는 5/5 동물이 시험접종시 열을 앓고 적어도 2/5가 사망하는 경우에 유효한 것으로 간주된다. 면역화된 돼지는 백신이 보호적인 것으로 간주되기 위해 적어도 4/5가 건강하게 남아있을 필요가 있다.
요약 보고서와 함께 2011년에 PRC 난징의 동물 건강 백신 회사와 협력하여 UBI에 의해 수행된 시험접종 연구:
총 35마리의 돼지를 혈청음성에 대해 스크리닝하고, 이들 중 30마리를 상기 기재된 바와 같은 PRC의 농림부에 의해 발표된 가이드라인에 따른 본 시험접종 연구를 위해 선택하였다. 상세한 동물 선택, 무작위화, 그룹화, 면역화 및 시험접종 연구, 온도 관찰 및 기록, 및 사망률은 하기 기재되어 있다:
중국 장쑤성 우시의 농장으로부터 28일령의 건강한 새끼 돼지를 선택하였다. 시험은 난징에 본사를 둔 동물 건강 백신 회사의 백신 효력/바이러스 시험접종 시험 센터에서 수행하였다. PRRS 항체 시험 키트 (LSI 사, 프랑스), 로트 #: 2-VERPRA-001, Exp. 2012-01 및 PRRS 항원 시험 키트: PRRS RT-PCR 시험관내 진단 키트 (NSP2 1594-1680 변이체 균주)를 사용하여 PRRSV가 없는 동물을 선택하였다. PRRS 병독성 균주 (NVCD-JXA1)를 원액의 10배 희석물을 제조함으로써 시험접종 시험에 사용하였고, 동물당 3 ml로 동물에 투여하였다.
농장으로부터의 총 35마리의 건강한 새끼 돼지를 스크리닝을 위해 선택하였고, 30마리를 본 연구를 위해 등록시켰다. 모든 선택된 새끼 돼지는 혈청 중 PRRS 항원 및 항체에 대해 음성인 것으로 시험되었다. 모든 등록된 새끼 돼지를 6개의 군, 군당 5마리의 동물을 갖는 군 1 - 6으로 무작위로 할당하였다. 근육내 주사는 귀 바로 뒤의 돼지의 목 근육의 측면 상에 위치한 부위에 수행하였다. 면역화 투여량 및 군은 표 15에 열거하였다 (객관적이도록 코드 하에 수행함).
군 1을 20 중량%의 등비 PRRSV 내인성 T 헬퍼 에피토프 펩티드의 풀 (JXA1 서열에 기반한 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76)로 보충된 PRRSV GP5 펩티드 (GP5 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원 4094 시리즈, 서열 43) 기반 백신으로 면역화하였다.
군 2 내지 5의 경우에는, PRRSV GP5 펩티드 (GP5 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원 4124, 서열 42)를 면역원으로 사용하였다. 백신 제제의 최종 펩티드 농도는 30ug/mL였다. 상기 제제는 또한 등비로 혼합되고 각각 군 2, 3 및 4에 대해 10 중량% (즉, 27.5ug B : 2.5ug T 풀), 20 중량% (즉, 25ug B : 5ug T 풀) 및 50% (즉, 20ug B : 10ug T 풀)의 PRRSV B 에피토프 면역원 (서열 42)으로 보충된 PRRSV 내인성 T 헬퍼 에피토프 펩티드의 풀 (JXA1 서열에 기반한 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76)을 포함하였다. 군 5의 동물은 이들이 단일 투여만을 제공받았다는 것을 제외하고는 군 4와 동일한 백신 제제를 투여받았다.
군 6은 어떠한 펩티드로도 면역화되지 않은 음성 대조군이었다.
처음에 연구에 등록된 모든 30마리의 새끼 돼지에 대한 항체 스크리닝 결과를 표 16에 나타내었다. 면역화 전에 RT-PCR에 의해 PRRSV 항원에 대해 시험된 돼지로부터의 모든 샘플의 결과는 30마리 중 30마리가 음성임을 보여주었고, 반면에 시험 키트의 양성 대조군은 185개 염기 쌍의 증폭된 밴드를 발견하였으며, 이는 시험 시스템을 유효성 확인시켰다. 무작위화 후의 모든 동물의 수를 표 17에 나타내었다. PRRSV 항체 OD 값의 결과를 표 18에 최초 면역화 후 제0일 및 제28일에 대해 나타내었다. PRRSV JXA1 시험접종 후의 체온 및 사망률을 표 19에 나타낸 온도 (℃ 단위)로 관찰하였다.
요약하면, 대조군 (군 6)의 모든 새끼 돼지는 표 19에 나타낸 바와 같이 바이러스 시험접종 후에 처음 수일 동안 앓게 되었고, 표 20에 나타낸 바와 같이 2마리가 사망하였다 (2/5=40% 사망률). 시험접종 연구 하에 백신접종을 받지 않는 대조군의 결과는 PRC 농림부에 의해 도입된 바와 같은 시험접종 연구의 유효성 기준 및 가이드라인을 충족시켰다. 대조군과 대조적으로, 군 1의 동물은 80%의 생존율 (5마리 중 4마리의 동물) 및 단지 20%의 사망률로 보호되었다. 추가로, 군 2 - 5의 모든 동물 (20마리 중 20마리)이 보호되어, 이에 따라 100% 보호를 일으켰다.
하나의 주요 연구로서 GP5 B 에피토프 클러스터 펩티드 항원 기반 백신 제제를 투여받은 모든 25마리의 동물을 조합하는 경우에 (즉, 군 1 - 5), 25마리 중 24마리의 동물이 고병원성 PRRSV 바이러스 균주 JXA1에 의한 시험접종에서 단지 4%의 사망률로 생존하였다. 이러한 결과는 시험접종시 돼지의 40%가 초기 며칠 동안 사망하고 그후 모든 5마리의 새끼 돼지가 앓게 되어 100% 이환율을 생성한 대조군과 비교할 때 놀라운 결과이다.
실시예 8
PRRSV에 대한 광범위한 보호 항체를 도출하기 위한 다중-성분 PRRSV 펩티드 백신.
PRRSV는 비리온 외피 상에 주요 당단백질 GP5, 뿐만 아니라 3종의 다른 부수적 당단백질, 즉 GP2a, GP3 및 GP4를 함유하며, 감염성 비리온의 생성을 위해서는 이들 모두가 요구된다. 다른 부수적 외피 당단백질 (GP2 및 GP3)과 GP5 사이에도 또한 다중단백질 복합체의 형성을 일으키는 약한 상호작용이 검출되었지만, 강한 상호작용은 GP4와 GP5 단백질 사이에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 전반적으로, GP4 단백질은 당단백질간 상호작용을 매개하는데 결정적이고, 민감성 숙주 세포 내로의 바이러스 진입을 위한 CD163과의 상호작용을 매개하는 것을 담당하는 GP5에 더하여 GP2a와 함께 바이러스 부착 단백질의 역할을 하는 것으로 결론지어졌다.
PRRSV의 높은 가변성으로 인해, 광범위하게 효과적인 PRRSV 백신의 개발은 다중 바이러스 균주의 보호를 요구할 것이다. PRRSV 마커 백신 성분의 초석으로서 내인성 PRRSV Th 펩티드의 풀 (풀 1의 경우에는 JXA1 서열에 기반한 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74, 76, 및 풀 2의 경우에는 서열 80-90)의 보충물을 함유하는 4종의 GP5 기반 PRRSV 백신 제제 (서열 38의 GP5 B 에피토프 펩티드 항원 4020Kc, 서열 41의 펩티드 항원 4052Kb, 서열 43의 4094Kb 및 서열 42의 4124Kb)의 이미 입증된 보호 효능과 함께, 다중-단백질 수용체 복합체에서의 폴리클로날 항체의 도출을 위해 펩티드 혼합물에 입증된 기능성 중화/수용체 결합 부위를 나타내는 항원성 펩티드를 혼입시켜 광범위한 바이러스 범위를 갖는 강력한 다중-성분 PRRSV 백신의 개발을 허용하는 것은 매우 바람직할 것이다.
PRRSV에 대한 유의한 중화 특성을 보여주는 GP2, GP3 및 GP4 항원성 펩티드 결합 항체와 함께 (8), 이들 선택된 영역 주변에서의 펩티드 항원을 설계하고, 실시예 5에 나타낸 바와 같은 각각의 단백질로부터의 가장 강력한 펩티드 면역원에 대해 스크리닝하였다. 이들 펩티드 면역원을 바이러스 균주의 넓은 범위를 목표로 하는 다중-성분 PRRSV 펩티드 백신으로서 다양한 제제에 혼입시켰다. 정교한 분석 LC/MS/MS 도구 및 잘 제어된 GMP 펩티드 제조 방법의 이용가능성과 함께, 지역적 사용 (예를 들어, 북아메리카 대 유럽)에 대해 적합화된 재생산가능한 백신 제제가 합리적으로 개발될 수 있다.
실시예 9
PRRSV 감염된 동물, 백신접종되었지만 PRRSV가 없는 동물, 또는 백신접종되었고 PRRSV 감염된 동물을 확인하기 위한 UBI DIVA 시스템 및 에피토프 기반 마커 백신의 용도
실시예 1에 나타낸 바와 같이, 플레이트 코팅을 위한 혼합물로서 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질로부터의 2종의 항원성 펩티드 (4171e, 서열 1 및 4172e, 서열 2)를 조합하고, 이어서 PRRSV 감염된 동물의 검출을 위한 추적자로서 단백질-HRP 접합체를 사용함으로써 UBI PRRSV NC ELISA 시험 키트를 구축하였다. 상기 시험은 효능 있는 PRRSV 마커 펩티드 백신의 면역원성을 모니터링하기 위해 적합화된 표적 펩티드 기반 ELISA와 함께 사용되어, 감염된 동물과 백신접종된 동물을 구별하기 위한 PRRSV DIVA 시스템을 형성할 수 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 사전 스크리닝을 통해 PRRSV 백신 면역원성 연구에 진입하기 전에 PRRSV 음성인 것으로 알려진 정상 새끼 돼지 (n=109)로부터의 혈청은 UBI PRRSV NC ELISA 시험에 의해 높은 특이성 (109-1/109=99%)을 나타내었다. 상기 군 다음으로, PRRSV NC ELISA 시험에 의해 음성인 것으로 점수화된, 천연 PRRSV GP5 단백질에 대한 교차-반응성을 갖는, 표적 펩티드 기반 ELISA에 의해 나타난 바와 같이 GP5에 대한 항체의 고역가 (Log10 역가>=3)를 갖는 것으로 알려진 PRRSV GP5 마커 백신 제제를 투여받은 돼지 (n= 45)로부터의 혈청은 시험의 특이성을 추가로 입증하였다. 중앙에 나타낸 3개의 혈청 군에 대한 ELISA 판독은, 감염된 동물로부터의 혈통이 분명한 IFA 양성 혈청으로부터의 것이었다. 이들 샘플은 IFA 역가와 평행하게 증가하는 ELSIA OD450nm 판독치를 보여주었다. 최우측으로부터의 혈청은 PRRSV 감염을 갖는 것으로 알려져 있는 미국 농장으로부터 수집된 샘플 (n=100)이었다. UBI PRRSV NC ELISA에 의해 >56%의 혈청양성 비율이 발견되었고, 이는 상기 농장에서의 PRRSV 감염의 높은 유병률을 나타낸다.
PRRSV 감염을 갖는 것으로 알려져 있는 대만의 농장에서 PRRSV 마커 백신 제제의 면역원성을 모니터링하기 위해 UBI PRRSV NC ELISA 및 UBI PRRSV B 에피토프 마커 백신 표적 펩티드 기반 ELISA를 조합하여 이용하였을 때, 여러 조각의 통찰력 있는 정보가 획득되었다.
첫째로, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, PRRSV 백신 면역원성 연구를 위해 등록시킨 모든 돼지는 컷오프 값보다 훨씬 더 높은 s/c 비로 PRRSV NS ELISA에 의해 양성인 것으로 발견되었다. 이러한 감염은 회색 배경 하에 강조된 도면에서 시험된 모든 동물이 감염된 것으로 나타났다. 둘째로, 대부분 모계 유래된 (MDA) 이들 새끼 돼지에서의 PRRSV NC 반응성 항체의 높은 수준의 존재에도 불구하고, 모든 펩티드 기반 PRRSV 백신 제제는 각각 표적 펩티드 기반 ELISA에 의해 검출시 유의한 면역원성을 나타내었다. 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 모든 동물을 최초 면역화 후 0, 4 및 6주의 기간에 걸쳐 투여한 백신 제제에 함유된 성분 펩티드 항원에 대한 그의 펩티드 특이적 항체 역가를 모니터링하였다. 각각 0 및 4주 스케줄의 프라이밍 및 부스팅으로 용량 당 총 30ug/mL를 함유하는 백신 제제 (GP2+GP3, GP3, GP3+GP4, GP4, 또는 GP5 펩티드 항원) 중에서, 독립적이고 높은 면역원성이 거의 모든 PRRSV GP2 및 GP3 중화 부위 유도된 펩티드 백신 제제, 이어서 "GP5 펩티드 단독" 백신 제제와 연관되어 있는 것으로 밝혀졌고, GP4 중화 부위 유도된 펩티드 항원은 다른 PRRSV (GP3) 펩티드 항원과 조합되었을 때 다소 손상된 면역원성을 보여주었다.
세포 매개 면역을 용이하게 하기 위해 내인성 PRRSV T 헬퍼 펩티드의 혼합물에 의해 보충된, 중화 항체의 도출을 위해 GP2, GP3, GP4 및 GP5 단백질로부터 중화 및 수용체 결합 부위 주변에서 설계된 PRRSV B 에피토프 클러스터 펩티드 면역원을 혼입시키는 조합 펩티드 기반 PRRSV 백신에 대해, PRRSV MD001 및 JXA1 균주 (둘 다 북아메리카 유형의 것)에 의한 시험접종 연구가 계획되고 있다.
실시예 10
SPF 농장에서의 PRRSV 감염의 박멸을 위한 UBI의 PRRSV 펩티드 기반 마커 백신 및 그의 진단 DIVA 시스템의 채택
마커 백신 제제에 사용된 PRRSV B 에피토프 클러스터 펩티드 항원은 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질로부터의 항원성 펩티드를 포함하지 않는 반면에 감염된 돼지는 전형적으로 상기 주요 구조 단백질에 대한 초기 항체를 발생시키기 때문에, 감염된 동물을 백신접종된 동물로부터 구별하기 위한 진단 시스템, 이에 따른 진단 DIVA 시스템에 PRRSV NC ELISA 및 PRRSV B 에피토프 마커 백신 표적 펩티드 기반 ELISA를 혼입시키는 것은 논리적이다.
UBI의 PRRSV 펩티드 기반 마커 백신은 PRRSV 단백질 상의 중화 및 수용체 결합 부위에 대한 IFA 양성 교차-반응성 항체의 고역가를 도출할 수 있다. 이러한 마커 백신 제제는 MLV 또는 바이러스 용해물 기반 PRRSV 백신 (현재의 생물학적 백신 포맷에서 제시되었을 때의 이들 단백질의 매우 약한 면역원성 성질에 기인함)보다 더 효과적으로 PRRSV 감염을 예방할 수 있다.
UBI의 진단 DIVA 시스템 및 그의 PRRSV 마커 백신의 조합 사용은 하기 전략에 기반하여 대만 SPF 농장에서 PRRSV 감염에 의한 그의 장기간의 문제점을 제거하기 위해 수행될 것이다. 상기 SPF 농장은 모든 병원체에 대한 철저한 모니터링 기록을 유지하였고, 단지 PRRSV 감염만을 갖는다. 농장은 유의한 생물보안 위험을 초래하지 않으면서 통상의 생물학적 백신에 의해 그의 현재 PRRSV 감염을 제거할 수 없다. UBI의 PRRSV 펩티드 기반 마커 백신을 사용하는 것은 백신의 화학적 성질로 인해 임의의 이러한 생물보안 위험을 나타내지 않을 것이다.
PRRSV 감염된 SPF 농장에서의 PRRSV 박멸을 위한 전략.
농장은 적어도 2년 동안 UBI의 PRRSV 펩티드 기반 마커 백신을 사용한 백신접종 프로그램을 유지할 것이다. 농장 내부의 모든 돼지를 0, 4 및 8주의 면역화 스케줄을 이용하여 백신접종하고, 적어도 6개월 동안 모니터링할 것이다. NC 및 마커 백신 표적 펩티드에 대한 혈청 항체 역가를 PRRSV NC ELISA, IFA 및 정량적 PCR (qPCR)을 비롯한 검정에 의해 PRRSV 바이러스혈증 수준과 함께 모니터링할 것이다. 백신접종 프로그램 6개월 후, 백신접종된 모체로부터 출생한 새끼 돼지는 백신접종을 받지 않을 것이고, 이들 새끼 돼지에서의 감염률에 대해 UBI PRRSV NC에 의해 1 내지 3개월 동안 모니터링할 것이다. 모든 새끼 돼지가 UBI PRRSV NC ELISA에 의한 음성 반응성을 나타내는 경우에, 농장은 PRRSV 감염에 대한 제어 하에 있는 것으로 간주될 수 있다. 이어서, 농장은 이전에 PRRSV 감염을 앓은 모든 돼지를 퇴거시킬 것이다. 이러한 퇴거까지, 농장의 모든 돼지는 PRRSV 펩티드 기반 마커 백신에 의해 계속 백신접종될 것이다.
농장은 PRRSV에 대한 돼지의 면역을 증진시키기 위해 PRRSV 펩티드 기반 마커 백신을 사용한 모든 돼지의 백신접종을 계속할 것이다.
새로 이주된 새끼 돼지 및 암퇘지가 PRRSV NC ELISA에 의한 그의 혈청의 음성 반응성에 기반하여 PRRSV가 없는 것으로 밝혀지는 경우에, 농장은 PRRSV가 없음을 선언할 수 있고, 따라서 PRRSV 박멸 프로그램의 성공을 선언할 수 있다.
모니터링에 사용하기 위한 지표:
UBI의 PRRSV NC ELISA 및 PRRSV 마커 백신 표적 펩티드 기반 ELISA, 이에 따른 DIVA를 이용하여 농장의 모든 동물로부터의 혈청을 반응성 일관성에 대해 모니터링할 수 있다. PRRSV NC ELISA로부터 유도된 퍼센트 양성 비율 및 평균 OD 값은 백신접종 및 모니터링의 기간 동안 기록된다.
PRRSV NC 단백질에 대한 모계 항체를 가질 수 있는, 따라서 PRRSV NC ELISA에 의해 양성인 것으로 보이는 1개월령 미만의 새끼 돼지는 시간 경과에 따라 감소할 것이다. 환경에서의 순환에 PRRSV가 없는 경우에, 즉 신규 감염이 없는 경우에, 이들 새끼 돼지는 또한 PRRSV가 없게 될 것이다. 농장은 PRRSV 감염된 암퇘지를 퇴거시키는 일을 가속화할 것이다. PRRSV 마커 펩티드 백신으로 처리하는 것은 이전에 감염된 암퇘지로부터 환경으로의 PRRSV의 방출에 대한 잔류 위험을 추가로 감소시킬 것이며, 따라서 전체 농장이 PRRSV가 없는 상태에 도달하게 할 것이다. 표 21은 95% 신뢰 수준으로 1마리의 PRRSV 양성 돼지를 검출할 확률에 대해, 이러한 시험에 대한 샘플 크기 요구치를 설정한다.
DIVA 및 다중-성분 PRRSV 펩티드 면역원 기반 백신 제제를 사용하는 파일럿 PRRSV 클리어런스 연구:
DIVA를 통해 혈청학적 수단에 의해 모니터링되는 파일럿 PRRSV 클리어런스 연구를 다중-성분 PRRSV 펩티드 면역원을 함유하는 유중수 (ISA 50) 에멀젼 기반 백신 제제를 사용하여 일반적인 PRRSV 감염된 농장에서 수행함으로써, 이러한 다중-성분 PRRSV 펩티드 면역원 기반 백신 제제를 투여받는 것에 의한 PRRSV NC 항체에 대한 음성 혈청전환에 대한 잠재력을 평가하였다.
보다 구체적으로, PRRSV NC ELISA에 의해 양성인 것으로 시험된 4주령의 총 15마리의 새끼 돼지를 연구를 위해 5개의 실험군에 배치하였다. 새끼 돼지를 0, 4, 8주의 면역화 및 채혈 스케줄에 기반하여 면역화하고, 최초 면역화 날짜로부터 13주의 기간 동안 모니터링하였다. GP5 (서열 42), GP2 (서열 44), GP3 (서열 45) 및 GP4 (서열 46)로부터의 PRRSV B 펩티드 면역원을 다양한 조합 (예를 들어, 군 1 및 2의 경우에 GP5, GP2, GP3 및 GP4; 군 3의 경우에 GP5, GP3 및 GP4; 군 4의 경우에 GP3 및 GP4)으로 PRRSV B 펩티드 면역원에 대해 용량 당 총 25 ug/mL로 등비로 혼합하였다. 제제를 군 2의 경우에 20 중량% (즉, 용량 당 5ug/mL)의 PRRSV Th 펩티드 (또한 등비로 혼합된 서열 47, 51, 52, 55, 59, 61, 63, 67, 70, 74 및 76), 및 군 1, 3 및 4의 경우에 PRRSV Th 조합 펩티드 (서열 80-90)로 추가로 보충하였다. NC에 대한 혈청 항체 반응성을 PRRSV NC ELISA에 의해 모니터링하여 PRRSV 감염을 결정하였고, 반면에 PRRSV 마커 펩티드 백신 B 에피토프 성분에 대한 혈청 항체 역가를 다양한 백신 제제에 의해 제공된 면역원성에 대해 상응하는 PRRSV GP2, GP3, GP4 및 GP5 펩티드 기반 ELISA에 의해 모니터링하였다. 군 5의 동물은 PRRSV 펩티드 기반 백신 제제를 투여받지 않았고, 음성 대조군의 역할을 하였다.
각각의 PRRSV 펩티드 기반 ELISA에 의해 검출시, 군 1 내지 4로부터의 모든 돼지는 최초 면역화로부터 4주에 제2 면역화 후에 3Log10보다 높은 특이적 항체 역가로 그의 각각의 마커 백신 표적 PRRSV B GP2, GP3, GP4 및 GP5 펩티드에 대한 항체를 발생시켰고, 이는 모니터링된 13주의 기간에 걸쳐 높은 역가로 남아있었다. 그러나, PRRSV NC 단백질에 대한 항체 반응성은 표 22에 나타낸 바와 같이 모니터링 기간 동안 최초 면역화 후 약 6 내지 8주에 최고 반응성으로 증가한 다음, 최초 면역화 후 10주까지 기준선 근처로 감소하고, 최초 면역화 후 13주에 기준선에 남아있었다.
대조적으로, PRRSV 펩티드 기반 면역원을 함유하는 백신 제제를 투여받지 않은 군 5의 동물로부터의 혈청은 모두 PRRSV NC 단백질과의 높은 반응성을 유지하였다. PRRSV NC 단백질에 대한 항체가 감염된 돼지에 존재하는 것으로 알려져 있기 때문에, 다중-성분 PRRSV 펩티드 면역원 기반 백신 제제로 백신접종된 돼지에서의 PRRSV NC에 대한 이러한 음성 혈청전환의 놀라운 발견은 다중-성분 PRRSV 펩티드 기반 백신 제제의 효능을 추가로 유효성 확인시켰다. DIVA 및 다중-성분 PRRSV 펩티드 면역원 기반 백신 제제의 용도는 따라서 광범위한 용도를 가지며, PRRSV 감염의 모니터링, 예방, 클리어런스 및 박멸에 대한 긴급한 필요성을 충족시킨다.
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Figure pct00023
표 17
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표 18
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표 19
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Figure pct00029
SEQUENCE LISTING <110> Wang, Chang-Yi <120> Synthetic Peptide-based Marker Vaccine and Diagnostic System for Effective Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) <130> 1004263.208WO <140> TBD <141> 2011-12-30 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> PRRSV MD001/TW/AAC98536/nucleocapsid protein (P2-E71). <400> 1 Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly Gln 1 5 10 15 Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln 20 25 30 Ser Gln Ser Arg Val Lys Gly Pro Gly Arg Lys Asn Lys Lys Lys Asn 35 40 45 Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His 50 55 60 His Phe Thr Pro Ser Glu 65 70 <210> 2 <211> 73 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(73) <223> PRRSV MD001/TW/AAC98536/nucleocapsid protein (E51-A123) <400> 2 Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His 1 5 10 15 Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala 20 25 30 Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Ile Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu 50 55 60 Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 65 70 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> PRRSV MD001 isolate/AAC98536/nucleocapsid protein (M1-A123) <400> 3 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Ser Gln Ser Arg Val Lys Gly Pro Gly Arg Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Ile Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 115 120 <210> 4 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> PRRSV JXA1 isolate/ACN93875/nucleocapsid protein (M1-A123). <400> 4 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Arg Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Ala Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Gln His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Ala Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> PRRSV North American strain of VR-2332 /AAD12131/nucleocapsid protein (M1-A123). <400> 5 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(128) <223> PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266/nucleocapsid protein (M1-N128). <400> 6 Met Ala Gly Arg Asn Arg Ser Gln Lys Lys Lys Lys Asn Pro Ala Pro 1 5 10 15 Met Gly Asn Asp Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Met Met Lys Ser Arg Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys 35 40 45 Arg Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Val 50 55 60 Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Val Ala Ser Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr 100 105 110 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Asp Ala Asn 115 120 125 <210> 7 <211> 71 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(71) <223> PRRSV European strain/08V204/Belgium/GU737266/nucleocapsid protein (A2-E72). <400> 7 Ala Gly Arg Asn Arg Ser Gln Lys Lys Lys Lys Asn Pro Ala Pro Met 1 5 10 15 Gly Asn Asp Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala Met 20 25 30 Met Lys Ser Arg Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Arg 35 40 45 Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Leu Thr Gln Thr Glu 65 70 <210> 8 <211> 78 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(78) <223> PRRSV European strain/08V204/Belgium/GU737266/nucleocapsid protein (P51-N128). <400> 8 Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Val Arg His 1 5 10 15 His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr 20 25 30 Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Val Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Lys 35 40 45 Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg 50 55 60 Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Asp Ala Asn 65 70 75 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> PRRSV MD001 isolate/AAC98534/envelope protein GP5 (V21-D54). <400> 9 Val Pro Phe Cys Leu Ala Ala Leu Val Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ser 1 5 10 15 Ser His Ser Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> PRRSV JXA1 isolate/ACN93870/envelope protein GP2 (V111-L136). <400> 10 Val Ser Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala 1 5 10 15 Trp Lys Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu 20 25 <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> PRRSV JXA1 isolate/ACN93871/envelope protein GP3(C57-C75). <400> 11 Cys Pro Thr Arg Gln Ala Ala Ala Glu Ile Leu Glu Pro Gly Lys Ser 1 5 10 15 Phe Trp Cys <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> PRRSV JXA1 isolate/ACN93872/envelope protein GP4 (C52-C69). <400> 12 Cys Leu Arg His Gly Asp Ser Ser Ser Pro Thr Ile Arg Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gln Cys <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> PRRSV JXA1/ACN93873/envelope protein GP5 (V21-D54). <400> 13 Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser Asn Asn Asn Ser 1 5 10 15 Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> PRRSV North American VR-2332/AAD12129/envelope protein GP5 (V21-D54). <400> 14 Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser Asn Asp Ser Ser 1 5 10 15 Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp <210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266/envelope protein GP5 (F21-T56). <400> 15 Phe Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala Asp Gly Asn Gly 1 5 10 15 Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys Glu Leu 20 25 30 Asn Gly Thr Thr 35 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> Consensus sequence from PRRSV MD001, JXA1, VR-2332 and EU 08V204/ envelope protein GP5 (V21-D54). <400> 16 Val Pro Phe Cys Leu Ala Val Leu Val Ser Ala Ser Asp Gly Asn Asn 1 5 10 15 Asn Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu 20 25 30 Asn Gly Thr Asp 35 <210> 17 <211> 26 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> PRRSV MD001 isolate/AAC98531/envelope protein GP2 (V111-L136). <400> 17 Val Ser Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala 1 5 10 15 Trp Lys Gln Val Val Asn Glu Ala Thr Leu 20 25 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> PRRSV North American VR-2332 /AAD12126/envelope protein GP2 (V111-L136) <400> 18 Val Ser Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala 1 5 10 15 Trp Lys Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu 20 25 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266/envelope protein GP2 (V111-L136). <400> 19 Val Ser Arg Arg Ile Tyr Gln Thr Met Glu His Ser Gly Gln Ala Ala 1 5 10 15 Trp Lys Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu 20 25 <210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> Consensus sequence from PRRSV MD001, JXA1, VR-2332 and EU 08V204 envelope protein of GP2 (V11-L136). <400> 20 Val Ser Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala 1 5 10 15 Trp Lys Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu 20 25 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> PRRSV MD001/AAC98532/envelope protein GP3 (C57-C75). <400> 21 Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Ala Gln Leu Tyr Glu Pro Ser Arg Ser 1 5 10 15 Leu Trp Cys <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> PRRSV North American VR-2332 /AAD12127/envelope protein GP3 (C57-C75). <400> 22 Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Thr Glu Ile Tyr Glu Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Trp Cys <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266/envelope protein GP3 (C57-C75). <400> 23 Cys Leu Thr Ser Gln Ala Ala Lys Gln Arg Leu Glu Pro Gly Arg Asn 1 5 10 15 Met Trp Cys <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Consensus sequence from PRRSV MD001, JXA1, VR-2332 and EU 08V204 envelope protein of GP3 (C57-C75). <400> 24 Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Ala Glu Ile Leu Glu Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Trp Cys <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> PRRSV MD001 isolate/AAC98533/envelope protein GP4 (C52-C69). <400> 25 Cys Leu Arg His Gly Asn Pro Ser Ser Glu Ala Ile Arg Lys Ile Pro 1 5 10 15 Gln Cys <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> PRRSV North American VR-2332 /AAD12128/envelope protein GP4 (C52-C69). <400> 26 Cys Leu Arg His Arg Asp Ser Ala Ser Glu Ala Ile Arg Lys Ile Pro 1 5 10 15 Gln Cys <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266/envelope protein GP4 (C52-C69). <400> 27 Cys Leu Arg Pro Tyr Arg Thr Asn Thr Thr Gln Gly Lys Val Pro Ser 1 5 10 15 Gln Cys <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Consensus sequence from PRRSV MD001, JXA1, VR-2332 and EU 08V204 envelope protein of GP4 (C52-C69). <400> 28 Cys Leu Arg Pro Gly Asp Ser Ser Ser Glu Ala Ile Arg Lys Ile Ser 1 5 10 15 Gln Cys <210> 29 <211> 40 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> PRRSV MD001 isolate/AAC98534/envelope protein GP5 (A26-E65). <400> 29 Ala Ala Leu Val Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ser Ser His Ser Gln Leu 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala 20 25 30 Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu 35 40 <210> 30 <211> 45 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(45) <223> PRRSV MD001 isolate/AAC98534/envelope protein GP5 (V21-E65) <400> 30 Val Pro Phe Cys Leu Ala Ala Leu Val Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ser 1 5 10 15 Ser His Ser Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp Trp Leu Ala Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu 35 40 45 <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> PRRSV JXA1isolate/AAC98534/envelope protein GP5 (V21-D54). <400> 31 Val Pro Phe Cys Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser Asn Asn Asn Ser 1 5 10 15 Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp <210> 32 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Combinatorial sequence of PRRSV JXA1/ACN93873 and MD001/AAC98534/envelope protein GP5 (V21-D54). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> I or S <400> 32 Val Pro Phe Cys Leu Ala Xaa Leu Val Xaa Ala Xaa Xaa Asn Xaa Ser 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp <210> 33 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Combinatorial sequence from PRRSV JXA1/ACN93873 and NJ-a/AY737282 of envelope protein GP5 (V21-D54). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> L or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> I or L or S <400> 33 Val Pro Phe Cys Xaa Ala Xaa Leu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Combinatorial sequence from PRRSV NJ-a/AY737282, JXA1/ACN93873 and MD001/AAC98534 of envelope protein GP5 (C24-C48). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> L or I or S <400> 34 Cys Xaa Ala Xaa Leu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 20 25 <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial modified T helper peptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 35 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> xxxxxxxx <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> Artificial linked spacer sequence. <400> 36 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 37 <211> 63 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> PRRSV MD001/AAC98534 of evelope protein GP5 (A26-E65). <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(44) <223> linked specer, K (41) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (45)..(63) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> K or R <400> 37 Ala Ala Leu Val Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ser Ser His Ser Gln Leu 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala 20 25 30 Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa 35 40 45 Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 60 <210> 38 <211> 68 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(45) <223> PRRSV MD001/AAC98534 of envelope protein GP5 (V21-E65). <220> <221> PEPTIDE <222> (46)..(49) <223> linked spacer; K (46) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (50)..(68) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> K or R <400> 38 Val Pro Phe Cys Leu Ala Ala Leu Val Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ser 1 5 10 15 Ser His Ser Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly 20 25 30 Thr Asp Trp Leu Ala Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu Lys Lys Lys 35 40 45 Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu 50 55 60 Thr Ile Leu Phe 65 <210> 39 <211> 57 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> Linked spacer, K (23) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(57) <223> PRRSV MD001/AF121131 of envelope protein GP5 (V21-D54). <400> 39 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Pro Phe Cys Leu Ala Ala Leu Val 20 25 30 Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ser Ser Tyr Ser Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 35 40 45 Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp 50 55 <210> 40 <211> 57 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> linked spacer, K (23) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(57) <223> PRRSV JXA1/EF112445 of envelope protein GP5 (V21-D54); <400> 40 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Pro Phe Cys Leu Ala Val Leu Val 20 25 30 Asn Ala Ser Asn Asn Asn Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 35 40 45 Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp 50 55 <210> 41 <211> 57 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> linked spacer, K (23) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(57) <223> Combinatorial sequence from GP5 (V21-D54) of PRRSV JXA1/EF112445 and MD001/AF121131. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> I or S <400> 41 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Pro Phe Cys Leu Ala Xaa Leu Val 20 25 30 Xaa Ala Xaa Xaa Asn Xaa Ser Ser Xaa Xaa Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 35 40 45 Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp 50 55 <210> 42 <211> 57 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> linked spacer, K (23) is episilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(57) <223> Combinatorial sequence from envelope protein GP5 (V21-D54 ) of PRRSV JXA1/EF112445 and NJ-a/AY737282. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> L or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> I or L or S <400> 42 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Pro Phe Cys Xaa Ala Xaa Leu Xaa 20 25 30 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Xaa Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 35 40 45 Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp 50 55 <210> 43 <211> 48 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> Linked spacer, K (23) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(48) <223> Combinatorial sequence from envelope protein GP5 (C24-C48) of PRRSV NJ-a/AY737282, JXA1/EF112445 and MD001/AF121131. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> L or I or S <400> 43 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Xaa Ala Xaa Leu Xaa Xaa Ala Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Xaa Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 <210> 44 <211> 46 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(46) <223> PRRSV JXA1 isolate/ACN93870/envelope protein GP2 (V111-L136) <400> 44 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Ser Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala 20 25 30 Gly Gln Ala Ala Trp Lys Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu 35 40 45 <210> 45 <211> 39 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(20) <223> Linker spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(39) <223> PRRSV JXA1/ACN93871 of GP3 (C57-C75). <400> 45 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Cys Pro Thr Arg Gln Ala Ala Ala Glu Ile Leu Glu 20 25 30 Pro Gly Lys Ser Phe Trp Cys 35 <210> 46 <211> 38 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial T helper sequence (modified T helper site). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(38) <223> PRRSV JXA1/ACN93872 of GP4 (C52-C69). <400> 46 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Cys Leu Arg His Gly Asp Ser Ser Ser Pro Thr Ile 20 25 30 Arg Lys Ser Ser Gln Cys 35 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> GP4 (F7-L15) of PRRSV JXA1/ACN93872. <400> 47 Phe Leu Leu Val Gly Phe Lys Cys Phe 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> GP4 (F7-L15) of PRRSV MD001/AAC98533. <400> 48 Phe Leu Leu Val Gly Phe Lys Cys Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> GP4 (F7-L15) of PRRSV North American strain VR-2332/AAD12128. <400> 49 Phe Leu Val Val Gly Phe Lys Cys Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> GP4 (F7-L15) of PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 50 Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln His Leu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> From GP4 (C170-I178) of PRRSVJXA1/ACN93872, MD001/AAC98533, VR-2332 /AAD12128 and EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 51 Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile 1 5 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> From GP5 (L117-C131) of PRRSV JXA1/ACN93873 and MD001/AAC98534. <400> 52 Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn Cys 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> GP5 (L117-C131) of PRRSV North American VR-2332/AAD12129. <400> 53 Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Ala Lys Asn Cys 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> GP5 (F119-C133) of PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 54 Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Ala Ile Arg Ala Thr Lys Asn Cys 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> GP5 (K149-K163) of PRRSV JXA1 isolate/ACN93873. <400> 55 Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu Lys 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> GP5 (K149-K163) of PRRSV MD001 isolate/AAC98534. <400> 56 Lys Gly Arg Ile Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu Lys 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> GP5 (K149-K163) of PRRSV North American VR-2332/AAD12129. <400> 57 Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu Lys 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> GP5 (R151-K165) of RPRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 58 Arg Gly Arg Ile His Arg Trp Lys Ser Pro Ile Val Ile Glu Lys 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> From M protein (C9-S23) of PRRSV JXA1/ACN93874, MD001/AAC98535 and VR-2332/AAD12130. <400> 59 Cys Asn Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (C8-S22) of PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 60 Cys His Asp Pro Thr Ala Ala Gln Lys Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> From M protein (A33-L47) of PRRSV JXA1/ACN93874/, MD001/AAC98535 and VR-2332/AAD12130. <400> 61 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266/M protein (A32-I46) <400> 62 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Ile 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (F57-V71) of PRRSV JXA1 isolate/ACN93874. <400> 63 Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His Phe Glu Ser Thr Asn Arg Val 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (F57-V71) of PRRSV MD001/AAC98535. <400> 64 Phe Gly Tyr Met Thr Phe Thr His Phe Gln Ser Thr Asn Arg Val 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (F57-V71) of PRRSV VR-2332/AAD12130. <400> 65 Phe Gly Tyr Met Thr Phe Ala His Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (F56-V70) of PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 66 Phe Gly Tyr Met Thr Tyr Val His Phe Glu Ser Thr Asn Arg Val 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> From M protein (K93-K107) of PRRSV JXA1/ACN93874 and VR-2332 /AAD12130. <400> 67 Lys Phe Ile Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (R93-K107) of PRRSV MD001/AAC98534. <400> 68 Arg Phe Ile Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> M protein (K92-R106) of PRRSV EU 08V204/Belgium/GU737266. <400> 69 Lys Phe Val Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Cys Leu Gly Arg Arg 1 5 10 15 <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Nucleocapsid protein (G40-L57) of PRRSV JXA1 isolate/ACN93875. <400> 70 Gly Pro Gly Lys Lys Asn Arg Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe 1 5 10 15 Pro Leu <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Nucleocapsid protein (G40-L57) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 71 Gly Pro Gly Arg Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe 1 5 10 15 Pro Leu <210> 72 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Nucleocapsid protein (G40-L57) of PRRSV VR-2332 isolate/AAD12131. <400> 72 Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe 1 5 10 15 Pro Leu <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Nucleocapsid protein (P41-L58) of PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 73 Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Arg Lys Pro Glu Lys Pro His Phe 1 5 10 15 Pro Leu <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> From nucleocapsid protein (V63-E71) of PRRSV JXA1/ACN93875, MD001/AAC98536 and VR-2332 /AAD12131. <400> 74 Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Nucleocapsid protein (V64-E72) of PRRSV EU 08V204/Belgium/GU737266 <400> 75 Val Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu 1 5 <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Nucleocapsid protein (S105-A123)of PRRSV JXA1/ACN93875. <400> 76 Ser Leu Pro Thr Gln His Thr Val Arg Leu Ile Arg Ala Thr Ala Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ala <210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Nucleocapsid protein (S105-A123) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 77 Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ser Ala <210> 78 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Nucleocapsid protein (S105-A123) of PRRSV VR-2332 isolate/AAD12131. <400> 78 Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ala <210> 79 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Nucleocapsid protein (M106-S124) of PRRSV EU isolate 08V204/Belgium/GU737266. <400> 79 Met Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr 1 5 10 15 Ser Ala Ser <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> linked spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> GP4 (F7-L15) of PRRSV MD001/AAC98533. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> L or I <400> 80 Lys Lys Lys Phe Xaa Xaa Val Gly Phe Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> GP4 (C170-I178) of PRRSV MD001/AAC98533. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> A or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> I or L <400> 81 Lys Lys Lys Cys Xaa Phe Xaa Ile Xaa Xaa Ala Xaa 1 5 10 <210> 82 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> GP5 (L117-C131) of PRRSV JXA1/ACN93873. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> K or R <400> 82 Lys Lys Lys Xaa Ala Ala Xaa Xaa Cys Phe Val Ile Xaa Xaa Ala Xaa 1 5 10 15 Asn Cys <210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> GP5 (K149-K163) of PRRSV MD001/AAC98534. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> K or R <400> 83 Lys Lys Lys Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Trp Xaa Ser Pro Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Glu Xaa <210> 84 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> Consensus M protein (C9-S23) from PRRSV JXA1/ACN93874, MD001/AAC98535 and other 42 North American genotypes. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> N or H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Q or F or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> L or I <400> 84 Lys Lys Lys Cys Xaa Asp Ser Thr Ala Pro Xaa Lys Val Xaa Leu Ala 1 5 10 15 Phe Ser <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> Consensus M protein (A33-L47) from PRRSV JXA1/ACN93874, MD001/AAC98535 and other 42 North American genotypes. <400> 85 Lys Lys Lys Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 His Leu <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> Consensus M protein (F57-V71) of PRRSV JXA1/ACN93874 and MD001/AAC98535 and other 42 North American genotypes. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> F or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> V or A or T or F or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> E or Q or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> R or K <400> 86 Lys Lys Lys Phe Gly Tyr Met Thr Xaa Xaa His Xaa Xaa Ser Thr Asn 1 5 10 15 Xaa Val <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> Consensus M protein (K93-K107) from JXA1 isolate/ACN93874, MD001 strain/AAC98535 and other 42 other NA genotypes. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> K or R <400> 87 Lys Lys Lys Xaa Phe Ile Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly 1 5 10 15 Arg Xaa <210> 88 <211> 21 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(21) <223> Nucleocapsid protein (G40-L57) of PRRSV MD001/AF121131 and nucleocapsid protein (P41-L58) of Lena/EU909691. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> G or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> K or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> N or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> N or K <400> 88 Lys Lys Lys Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa Lys Lys Lys Xaa Pro Glu Lys 1 5 10 15 Pro His Phe Pro Leu 20 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> Nucleocapsid protein (V63-E71) of PRRSV Europe/EU880437 and nucleocapsid protein (V64-E72) of Lena/EU909691. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> S or T <400> 89 Lys Lys Lys Val Arg His His Xaa Thr Xaa Xaa Glu 1 5 10 <210> 90 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Linked spacer. <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(22) <223> Nucleocapsid protein (S105-A123) of PRRSV MD001/AF121131 and nucleocapsid protein (N106-A124) of Lena/EU909691. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> T or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> P or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> S or A <400> 90 Lys Lys Lys Xaa Leu Pro Xaa His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val 1 5 10 15 Thr Xaa Xaa Pro Xaa Ala 20 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Nucleocapsid protein (P2-K12) of PRRSV MD001/AAC98536 and nucleocapsid protein (P2-K12) of PRRSV JXA1/ACN93875. <400> 91 Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys 1 5 10 <210> 92 <211> 18 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Nucleocapsid protein (E51-T68) of PRRSV MD001/AAC98536, nucleocapsid protein (E51-T68) of PRRSV JXA1/ACN93875 and nucleocapsid protein (E51-T68) of PRRSV VR-2332 /AAD12131. <400> 92 Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His 1 5 10 15 Phe Thr <210> 93 <211> 26 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> M protein (M1-Y26) of PRRSV MD001/AAC98535. <400> 93 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Arg Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln 1 5 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr 20 25 <210> 94 <211> 20 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Nucleocapsid protein (K52-E71) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 94 Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe 1 5 10 15 Thr Pro Ser Glu 20 <210> 95 <211> 42 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> Nucleocapsid protein (I30-E71) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 95 Ile Ala Gln Gln Ser Gln Ser Arg Val Lys Gly Pro Gly Arg Lys Asn 1 5 10 15 Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp 20 25 30 Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu 35 40 <210> 96 <211> 49 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(49) <223> Nucleocapsid protein (C23-E71) of PRRSV MD001/TW/AAC98536. <400> 96 Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Ser Gln Ser Arg Val 1 5 10 15 Lys Gly Pro Gly Arg Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His 20 25 30 Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser 35 40 45 Glu <210> 97 <211> 59 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(59) <223> Nucleocapsid protein (K13-E71) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 97 Lys Gly Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys 1 5 10 15 Ile Ile Ala Gln Gln Ser Gln Ser Arg Val Lys Gly Pro Gly Arg Lys 20 25 30 Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu 35 40 45 Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu 50 55 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Nucleocapsid protein (V112-A123) of PRRSV MD001/TW/AAC98536. <400> 98 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 34 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Nucleocapsid protein (C90-A123) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 99 Cys Ile Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro 20 25 30 Ser Ala <210> 100 <211> 44 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(44) <223> Nucleocapsid protein (Q80-A123) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 100 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Ile Leu Ser Asp Ser 1 5 10 15 Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr 20 25 30 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 35 40 <210> 101 <211> 55 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(55) <223> Nucleocapsid protein (P69-A123) of PRRSV MD001/AAC98536. <400> 101 Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn 1 5 10 15 Gln Gly Ala Gly Thr Cys Ile Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr 20 25 30 Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg 35 40 45 Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 50 55

Claims (18)

  1. 펩티드 항원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 포함하며, 여기서 펩티드 항원은
    a) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 그의 임의의 조합;
    b) (a)의 상동체; 및
    c) (a) 또는 (b)의 임의의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
  4. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
  5. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PRRS 백신.
  6. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 1 내지 5개의 아미노산을 부가하거나 또는 결실시킴으로써 변경된 것인 PRRS 백신.
  7. 제1항에 있어서, 펩티드 항원의 아미노- 또는 카르복실-말단에 공유적으로 연결된 T 헬퍼 에피토프를 추가로 포함하는 PRRS 백신.
  8. 제7항에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 서열 35인 PRRS 백신.
  9. 제7항에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 엡실론 리신 잔기를 포함하는 스페이서를 통해 펩티드 항원에 공유적으로 연결된 것인 PRRS 백신.
  10. 제9항에 있어서, 스페이서가 서열 36인 PRRS 백신.
  11. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드에 연결되지 않은 T 헬퍼 에피토프를 추가로 포함하며, 여기서 T 헬퍼 에피토프는 서열 47-90으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 PRRS 백신.
  12. 제1항에 있어서, 펩티드 항원의 총량이 약 10 μg 내지 약 1 mg인 PRRS 백신.
  13. 제1항에 있어서, 전달 비히클 및 아주반트가 몬타니드(Montanide) ISA 50V, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 PRRS 백신.
  14. 제1항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, PRRS 감염에 대해 새끼 돼지를 보호하는 방법.
  15. a) 펩티드 항원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트,
    b) 서열 10, 11, 12, 31, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 항원, 및
    c) 서열 80-90 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 PRRSV Th 펩티드
    를 포함하는 PRRS 백신 조성물.
  16. a) 펩티드 항원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트,
    b) 서열 42, 44, 45, 46, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 항원, 및
    c) 서열 80-90 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 PRRSV Th 펩티드
    를 포함하는 PRRS 백신 조성물.
  17. a) 서열 1 및 서열 2의 혼합물을 고체 지지체에 부착시키는 단계,
    b) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에 대한 항체의 결합에 유리한 조건 하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및
    c) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는, PRRS 감염을 진단하는 방법.
  18. a) 서열 7 및 서열 8의 혼합물을 고체 지지체에 부착시키는 단계,
    b) 상기 고체 지지체에 부착된 상기 펩티드를, 펩티드에 대한 항체의 결합에 유리한 조건 하에 항체를 함유하는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에 노출시키는 단계, 및
    c) 상기 지지체에 부착된 상기 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는, 항-PRRSV 항체의 존재를 시험하기 위한 ELISA 면역검정.
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