CZ297371B6 - Peptid mající 5 az 15 aminokyselinových zbytku vyvolávající tvorbu protilátek, protilátka reaktivnís tímto peptidem a diagnostická testovací souprava - Google Patents
Peptid mající 5 az 15 aminokyselinových zbytku vyvolávající tvorbu protilátek, protilátka reaktivnís tímto peptidem a diagnostická testovací souprava Download PDFInfo
- Publication number
- CZ297371B6 CZ297371B6 CZ0393299A CZ393299A CZ297371B6 CZ 297371 B6 CZ297371 B6 CZ 297371B6 CZ 0393299 A CZ0393299 A CZ 0393299A CZ 393299 A CZ393299 A CZ 393299A CZ 297371 B6 CZ297371 B6 CZ 297371B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- prrsv
- protein
- amino acid
- peptide
- site
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 title claims abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 claims abstract 10
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 43
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 70
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 65
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 34
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 33
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 28
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 26
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 17
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 241000710789 Lactate dehydrogenase-elevating virus Species 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 9
- 238000011999 immunoperoxidase monolayer assay Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 244000144980 herd Species 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101000836906 Homo sapiens Signal-induced proliferation-associated protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101150000233 ORF4 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150012812 SPA2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100027163 Signal-induced proliferation-associated protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150082475 ORF7 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100028161 Porcine circovirus 2 ORF4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000714195 Varicella-zoster virus (strain Dumas) Tegument protein UL51 homolog Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000977065 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 11.6 kDa protein in mobS 3'region Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 101000861180 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) Uncharacterized protein H16_B0147 Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 101001130286 Homo sapiens Rab GTPase-binding effector protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 3654-96-4 Chemical compound C[35S]CC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 0.000 description 1
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 101000787133 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 12.3 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000977023 Azospirillum brasilense Uncharacterized 17.8 kDa protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101000827603 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 10.2 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000765604 Bacillus subtilis (strain 168) FlaA locus 22.9 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 1
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 1
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000961984 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 30.3 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000653197 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Movement protein TGB3 Proteins 0.000 description 1
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 1
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000964402 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized protein in xynC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101000644901 Drosophila melanogaster Putative 115 kDa protein in type-1 retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- 101000747702 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp2 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101000758599 Escherichia coli Uncharacterized 14.7 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 description 1
- 101000602237 Homo sapiens Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001113490 Homo sapiens Poly(A)-specific ribonuclease PARN Proteins 0.000 description 1
- 101710126256 Hydrolase in agr operon Proteins 0.000 description 1
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000768930 Lactococcus lactis subsp. cremoris Uncharacterized protein in pepC 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000976302 Leptospira interrogans Uncharacterized protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778886 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai (strain 56601) Uncharacterized protein LA_2151 Proteins 0.000 description 1
- 101000977779 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 33.9 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000977786 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 9.7 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 1
- 101000827630 Narcissus mosaic virus Uncharacterized 10 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101100116474 Rattus norvegicus Ddn gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 1
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 1
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 101001113905 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P4 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000818098 Spirochaeta aurantia Uncharacterized protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 1
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 1
- 101001026590 Streptomyces cinnamonensis Putative polyketide beta-ketoacyl synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000750896 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized protein Synpcc7942_2318 Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000916321 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000760088 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 20.9 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000011997 immunoflourescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002623 insulin potentiation therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940031462 non-live vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Peptid mající 5 az 15 aminokyselinových zbytku, vyvolávající tvorbu protilátek, které reagují s alespon dvema ruznými PRRSV izoláty, obsahující aminokyselinovou sekvenci odvozenou od aminokyselinové sekvence odpovídající konzervovanému místu proteinu N PRRSV, pricemz aminosekvence odpovídající konzervovanému místu proteinu N PRRSV je vybraná ze skupiny skládající se z VNQLCQLLGA A VNQLCQMLGK. Protilátka reaktivní s tímto peptidem. Diagnostická testovací souprava pro detekci nebo identifikaci protilátek namírených proti PRRSV izolátu obsahujícíalespon jeden uvedený peptid spolecne s vhodnými detekcními prostredky nebo diagnostická testovací souprava pro detekci nebo identifikaci protilátek namírených proti antigenum odvozených od PRRSV izolátu obsahující uvedenou protilátku spolecne s vhodnými detekcními prostredky.
Description
Peptid mající 5 až 15 aminokyselinových zbytků vyvolávající tvorbu protilátek, protilátka reaktivní s tímto peptidem a diagnostická testovací souprava
Oblast techniky
Vynález se týká peptových sekvencí majících 5 až 15 aminokyselinových zbytků, které vyvolávají tvorbu protilátek, které reagují s PRRSV izoláty, protilátkou reaktivní s těmito peptidovými sekvencemi a začleněním zmíněných sekvencí do vakcín a diagnostických testů.
Dosavadní stav techniky
PRRS virus (PRRSV) je původcem onemocnění prasat, které se nyní nazývá reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS z anglického „porcine reproductive and respirátory syndrom“). Virus je původcem prasečího onemocnění, které je ve Spojených státech známo asi od roku 1987 a v Evropě od roku 1990. Nemoc byla zpočátku označována různými jmény jako jsou „mystery swine disease“, „swine infertility and respirátory syndrome“ a mnohá další. Také samotný virus byl známý pod mnoha jmény, například „Lelystad virus“ (LV) nebo SIRS virus, ale nyní je popisován převážně jako virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV). Virus u prasat způsobuje potraty a respirační obtíže. Poprvé byl izolován v Evropě v roce 1991 (EP patent 587780 a patent US 5 620 691) a vzápětí nato také ve Spojených státech a v mnoha dalších zemích světa. PRRSV je malý obalený virus jehož genom je tvořený pozitivním řetězcem RNA. Preferovaným hostitelem PRRSV jsou makrofágy. Kromě makrofágů může PRRSV růst také v buňkách linie CL261 a v dalších buněčných liniích klonovaných z opičích ledvinných buněk linie MA-104 (Benfíeld et al., J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133, 1992). Genom PRRSV, polyadenylovaná RNA o velikosti asi 15 kb, byl sekvenován v roce 1993 (Meulenberg et al., Virology 192; 62-74, 1993). Nukleotidová sekvence, organizace genomu a replikační strategie ukazují, že PRRSV je příbuzný skupině malých obalených virů s genomem tvořeným pozitivním řetězcem RNA, souborně nazývané Arteriviry. Do této skupiny patří LDV („lactate dehydrogenase-elevating virus“), EAV (virus koňské arthritidy) a SHFV (virus opičí hemorhagické horečky). Všechny tyto viry mají podobnou organizaci genomu, replikační strategii, morfologii i aminokyselinovou sekvenci virových proteinů. Velikost genomu arterivirů se pohybuje v rozmezí od 12,5 do 15 kb a během replikace syntetizují arteriviry soubor šesti 3'překrývajících se subgenomických RNA. Tyto subgenomické RNA obsahují vedoucí sekvence odvozené od 5'konce virového genomu. ORF la a lb obsahují přibližně dvě třetiny virového genomu a kódují RNA dependentní RNA polymerázu. Šest menších ORF, ORF 2 až 7, je lokalizováno na 3'konci virového genomu. ORF 2 až 6 kódují pravděpodobně obalové proteiny zatímco ORF 7 kóduje nukleokapsidový protein (Meulenberg et al., Virology 206, 155-163, 1995).
PRRSV je prvním adenovirem, u kterého byla prokázána asociace všech šesti proteinů kódovaných ORF 2 až ORF 7 s virionem. 15 kDa protein N (kódovaný ORF 7) a 18 kDa integrální membránový protein M (ORF 6) nejsou N-glykosylované, zatímco 29-30 kDa protein GP2 (ORF 2), 45-50 kDa protein GP3 (ORF 3), 31-35 kDa protein GP4 (ORF 4) a 25 kDa protein GP5 (ORF 5) N-glykosylované jsou. Tyto proteiny byly detekovány také u extracelulámích virů a v lyzátech buněk infikovaných severoamerickým izolátem PRRSV, ATCC-VR2332, stejně jako dalšími izoláty PRRSV (jako jsou například CNCM 1-1140, ECACC V93070108, CNCM 1-1387, CNCM 1-1388, ATCC-VR2402, ATCC-VR2429, ATCC-VR2430, ATCC-VR2431, ATCC-VR2475, ATCC-VR2385 a mnohé další).
Již dříve jsme popsali izolaci a charakterizaci souboru PRRSV-specifických monoklonálních protilátek (MAb), které specificky reagují s GP3, GP4, M a N proteiny (van Nieuwstadt et al., J. Virol. 70, 4767-4772, 1996). Překvapivě bylo zjištěno, že protilátky namířené proti GP4 jsou neutralizující což předpokládá, že alespoň část proteinu je vystavena na povrchu virionu. Dále také většina MAb namířených proti proteinu N reagovala se všemi testovanými izoláty PRRSV.
- 1 CZ 297371 B6
PRRS sám o sobě je pro průmysl zpracování vepřového masa významným problémem téměř na celém světě. Zavlečení PRRSV do prasečího stáda působí těžké ekonomické ztráty. Diagnostické testování zaměřené proti PRRS je rozšířenou praktikou mnoha veterinárních pracovišť i laboratoří. Existuje celá řada diagnostických testů jako jsou například IPMA, IPT, IFA nebo ELISA, z nichž každý zahrnuje některý z detekčních systémů jako jsou konjugované enzymy nebo fluorochromy a další substráty využívající interakce mezi antigenem odvozeným od PRRSV a protilátkou namířenou proti PRRSV ke stanovení přítomnosti buď PRRSV antigenů, nebo protilátek proti PRRSV v biologickém vzorku odebraném testovanému zvířeti (například praseti). Biologickým vzorkem může být například krev, sérum, tkáň, tkáňové tekutiny, tekutiny získané výplachem, moč či výkaly. Antigeny a/nebo protilátky používané ve zmíněných diagnostických testech nebo soupravách pro diagnostiku PRRS jsou definovány pouze na základě svého původu nebo reaktivity s PRRSV. V zásadě je toto dostačující pro testovací metody, kde není explicitně vyžadována vysoká specifičnost nebo citlivost. Ovšem stále pokračující šíření PRRS zapříčinilo značný zájem ze strany průmyslu zpracování vepřového masa, a to nejen o diagnostiku, ale o eradikaci PRRS z celých stád nebo dokonce z celých oblastí, regionů či zemí, kde se prasata chovají. Jasným příkladem zmiňovaných potřeb průmyslu je navržený eradikační program týkající se PRRS v Dánsku. V případě potřeby kompletního vyhubení PRRS jsou nezbytné diagnostické testy vykazující vyšší specifičnost nebo citlivost, než jakou mají dosud používané testy.
Očkování proti PRRS je další rozšířenou praktikou. Dosud se používá několik typů modifikovaných živých vakcín, ovšem jsou známé i neživé vakcíny. Ovšem obecným problémem živých vakcín, a tedy i živých PRRS vakcín, je tendence těchto vakcín rozšířit se i na neočkovaná zvířata, čímž namísto redukce detekovatelné infekce způsobí její rozšíření ve stádu a tak působí vzhledem k úplné eradikaci infekce kontraproduktivně. V případě použití „line markér“ vakcín, které jsou sérologicky odlišitelné od vakcín divokého typu, může být zmíněný problém z velké části redukován. Další nevýhodou je, že živé vakcíny mohou někdy u očkovaných prasat způsobit anafytaktickou reakci, neboť obsahují některé nedefinované antigenní složky. Je známo, že neživé vakcíny obecně indukují ochrannou odpověď u očkovaných prasat a mají i některé další výhody ke kterým patří například fakt, že nedochází k jejich šíření mezi zvířaty ve stádě. Nevýhodou neživých vakcín je že může být obtížné podat v jediné dávce dostatečné množství antigenů pro vyvolání měřitelné a ochranné imunitní odpovědi. Bylo by vhodné mít především neživé vakcíny schopné vyvolat měřitelnou neutralizující protilátkovou odpověď u prasat, neboť právě stanovení neutralizujících protilátek u očkovaných populací prasat může významně přispět k rozvoji poznání rozsahu ochrany prasečího stáda pomocí vakcinace. Navíc pokud se podaří připravit vakcínu s dostatečným množstvím odpovídajícího antigenů, znamená to, že vakcína obsahuje i další nedefinované antigeny v nedefinovaném množství, což může způsobit anafylaktickou reakci tak, jak byla popsána výše. S ohledem na výše uvedené skutečnosti by bylo výhodné vědět, které specifické místo na PRRSV je zahrnuto v procesu neutralizace. S pomocí takových znalostí by bylo možné navrhnout vhodnější vakcíny, zahrnující peptidové sekvence nezbytné pro vyvolání neutralizující reakce a tvorbu neutralizujících protilátek. Výhodou v současnosti používaných vakcín pocházejících z PRRSV izolátů ze Spojených států je, že takové vakcíny, ačkoliv vyvolávají úplnou ochrannou reakci proti Evropským izolátům PRRSV, se kterými také zkříženě reagují, obsahují dosud neidentifikované epitopy nebo antigenní místa pomocí kterých mohou být odlišeny od evropských izolátů PRRSV. Naopak živé vakcíny pocházející z PRRSV izolátů z Evropy, přestože jsou plně účinné proti imunologicky zkříženě reagujícím US izolátům PRRSV, obsahují podobné dosud neidentifikované epitopy nebo antigenní místa, pomocí kterých mohou být odlišeny od US izolátů PRRSV.
Pokud by byly dostupné sérologické testy, které by dokázaly rozlišit (na základě malých rozdílů v epitopech jednotlivých izolátů PRRSV) mezi prasaty buď očkovanými US vakcínou, nebo nakaženými evropským divokým typem PRRSV (očkovanými či nikoliv), nebo které by dokázaly rozlišit prasata, která jsou buď očkována evropskou vakcínou, nebo infikovaná US divokým typem PRRSV (ať již byla očkována či nikoliv), potom by mohly být vyvinuty značkovací vakcína a odpovídající diagnostické testy (zahrnující zmíněné diskriminující epitopy nebo antigenní místa), vykazující vyšší spolehlivost při použití v programech pro eradikaci PRRS. Například
- 2 CZ 297371 B6 v Dánsku by potom bylo možné očkovat vakcínou amerického původu a měřit soubor protilátek produkovaných dánskými vepři, namířených výhradně proti jedinečným epitopům evropského divokého typu PRRSV, které nevykazují žádnou zkříženou reaktivitu s US kmeny. To by umožnilo zcela jednoznačnou detekci a následné oddělení vepřů infikovaných divokým typem viru z dánských stád. V současnosti takový postup není možný v důsledku obecně široké imunologické zkřížené reaktivity mezi jednotlivými izoláty PRRSV. Je nesporné, že takové kombinované vakcinační a testovací programy budou základem pro celkovou eradikaci PRRS a že tyto programy mohou být použity i v dalších zemích, v případě potřeby s použitím vakcíny a/nebo diagnostického testu s odlišnými PRRSV antigenními místy.
Podstata vynálezu
Navrhovaný vynález se zabývá peptidovými sekvencemi PRRSV nesoucími antigenní místa umožňující zdokonalení vakcín, ať už jsou to oslabené živé vakcíny nebo neživé vakcíny nebo vakcíny připravené technikami rekombinantní DNA, a antigenní místa umožňující zdokonalení diagnostických metod a testů a přípravu nových diagnostických souprav. Sekvence, o kterých je známo že tvoří antigenní místo konkrétního izolátu, mohou být snadno osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů pozměněny například ve smyslu substituce jedné nebo více aminokyselin, a to při zachování antigenicity (která je definována například reaktivitou s polyklonálním sérem nebo monoklonálními protilátkami) a tudíž i funkčnosti antigenního místa. Například určitý aminokyselinový zbytek může být standardně nahrazen jiným zbytkem srovnatelné povahy, tj. například bazický zbytek jiným bazickým zbytkem, kyselý kyselým, objemná objemnou, hydrofobní jinou hydrofobní a hydrofilní jinou hydrofilní atd. I jiné záměny, méně konvenční ale více specifické, jsou možné v případě kdy zachovávají nebo dokonce zvyšují antigenicitu vybrané sekvence. Takové záměny mohou být uskutečněny například s pomocí PEPSCAN aminokyselinových substitucí nebo techniky mapování na základě aminokyselinových záměn (van Amerongen et al., Peptide Research (1992) 5, 269-274). Krátce, aminokyselinové zbytky, které jsou součástí antigenních míst podle vynálezu, mohou být zaměňovány konvenčním způsobem nebo na základě mapování pomocí aminokyselinových záměn. Výsledná peptidová sekvence zůstává funkčně ekvivalentní původnímu antigennímu místu. Nově vložená aminokyselina může být buď D-, nebo L- aminokyselina. Imunogenicita peptidových sekvencí podle vynálezu je navíc ještě zvýšena jejich spojením s adjuvans (například KLH), jaká jsou v oboru běžně používána. Dále může být imunogenicita zmíněných peptidů zvýšena jejich spojováním (tandemové peptidy) nebo přípravou opakujících se sekvencí, polymerizací nebo cirkularizací. Ačkoliv bylo již dříve popsáno, že N-protein je imunogenní (Meulenberg (1995), J. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2, 652-656, GB 2 289 279 A) a že mezi N-proteiny evropských izolátů (LV) a US kmenů (VR2332) existují konzervované a nekonzervované oblasti (WO 96/04010), teprve nyní bylo poprvé popsáno které konzervované a nekonzervované oblasti jsou antigenní a které mohou být použity individuálně nebo v různých kombinacích jako antigeny pro imunizaci nebo pro diagnostické účely .Navíc zde bylo prokázáno, že se antigenní oblasti N-proteinu sestávají jak z lineárních, tak i z konformačně závislých epitopů.
Protein GP4 je prvním strukturním proteinem PRRSV u kterého bylo prokázáno, že vyvolává tvorbu protilátek schopných neutralizovat virus. Byla identifikována specifická oblast dlouhá přibližně 40 aminokyselin a bylo zjištěno, že je-li vystavena na povrchu virionu, stává se cílem neutralizujících protilátek, které tak zabrání infekci buněk zmíněným virem. Je to překvapující nové zjištění, neboť dosud byl za nej důležitější pro navázání viru na hostitelskou buňku považován protein GP5, hlavní strukturní protein PRRSV.
Vynález se zabývá hlavním antigenním místem, neutralizačním místem proteinu GP4 PRRSV. Vynález se zabývá lokalizací hlavního neutralizačního místa, která je nezbytná pro navržení účinných značkovacích vakcín, které obsahují hlavní aminokyselinové sekvence a aminokyselinové sekvence sousedící s hlavní aminokyselinovou sekvencí PRRSV izolátů, které obsahují sekvenci neutralizačního místa na ORF4 proteinu PRRSV. Vnesení sekvencí pro určitá neutrali
- 3 CZ 297371 B6 začni místa do různých typů vakcín umožňuje specificky indukovat tvorbu neutralizačních protilátek u očkovaných prasat. Jsou připravovány neživé vakcíny obsahující neutralizační místo podle vynálezu, indukující měřitelnou produkci neutralizačních protilátek. Neutralizační místo obsahují především sekvence PRRSV proteinu kódovaného ORF4 odpovídající aminokyselinovým sekvencím v pozicích 40 až 79 v PRRSV izolátu 1-1102. Imunogenicita vybraných peptidových sekvencí je dále zvýšena smísením peptidů s vhodným adjuvans nebo s dalšími v oboru známými nosiči. Takto získaná peptidová směs je použita jako očkovací látka. Ovšem vybrané peptidové sekvence obsahující neutralizační místo jsou také součástí vektorových vakcinačních systémů ve formě rekombinantních vektorů odvozených od heterologních virů nebo bakterií, nebo mohou být vybrané peptidové sekvence selektivně inkorporovány do virů nebo vakcín odvozených od PRRSV.
Předmětem navrhovaného vynálezu jsou dále aminokyselinové sekvence lokalizované v pozicích odpovídajících aminokyselinám 52 až 75 tvořící neutralizační místo se širokým spektrem reaktivity. Další neutralizační místa podle vynálezu mohou být nalezena mezi dalšími PRRSV izoláty ať již objevenými nebo těmi, které teprve budou popsány (viz například experimentální část popisu vynálezu). Pro člověka pracujícího v oblasti molekulární biologie je snadné porovnat sekvence obsahující neutralizační místo podle vynálezu s aminokyselinovou sekvencí proteinu kódovaného ORF4 z některého dalšího PRRSV izolátu.
Vynález se dále zabývá peptidovými sekvencemi PRRSV zlepšujícími diagnostické testy, ať již se jedná o testy přítomnosti antigenu, nebo o testy přítomnosti protilátek. Vynález se zabývá nejrůznějšími skupinami antigenních míst, které jsou použity buď samostatně, nebo v kombinaci s diagnostickými testy. Předmětem vynálezu jsou tedy diagnostické testy sloužící nejrůznějším potřebám v oblasti diagnostiky a diferenciální diagnostiky. Reakce antigen-protilátka je vždy doprovázena i zkříženou reakcí epitop-paratop aminokyselinových sekvencí, které jsou dlouhé 5 až 15 aminokyselin. Aminokyselinové sekvence dlouhé 5 až 15 aminokyselin, které se částečně nebo úplně překrývají s hlavní sekvencí antigenního místa podle vynálezu jsou předmětem vynálezu jako sekvence vhodné pro diagnostické testy. Tyto peptidové sekvence se používají pro výběr nebo navržení antigenu nebo antigenní substance obsahující testovanou sekvenci. Dále jsou předmětem vynálezu také syntetické protilátky reagující s antigenními místy podle vynálezu. Zmíněná antigenní místa nebo příbuzné sekvence reagují se syntetickými protilátkami připravenými pomocí systémů jako jsou fágové knihovny nebo klonální selekce (těžkých řetězců) protilátek, které tvoří protilátkám podobné molekuly, které mohou být snadno exprimovány v heterologních expresních systémech.
Jedna skupina látek, která je předmětem vynálezu, zahrnuje peptidovou sekvenci odpovídající zmíněnému neutralizačnímu místu tak, jak bylo popsáno výše. Diagnostické testy zahrnující toto místo a/nebo protilátky specificky reagující s tímto místem detekují u prasat přítomnost neutralizujících protilátek.
Další skupina látek podle vynálezu zahrnuje konzervované antigenní místo proteinu N. V rámci konzervovaného antigenního místa je předmětem vynálezu hlavní aminokyselinová sekvence VNQLCQLLGA nebo VNQLCQMLGK. Diagnostické testy zahrnující toto místo a/nebo protilátky specificky reagující s tímto místem detekují u prasat přítomnost protilátek které specificky reagují s většinou PRRSV izolátů. Předmětem vynálezu jsou dále diagnostické testy které využívají protilátky namířené proti konzervovanému místu, detekující PRRSV antigen. Takové testy umožňují diagnostikovat přítomnost PRRSV izolátů nezávisle na jejich původu.
Další skupina látek podle vynálezu zahrnuje nekonzervované diferencující antigenní místo proteinu N. Diagnostické testy zahrnující toto místo a/nebo protilátky specificky reagující s tímto místem detekují u prasat přítomnost protilátek které specificky reagují s konkrétními PRRSV izoláty a tudíž například umožňují rozlišení očkovaných prasat od prasat infikovaných divokým typem PRRSV. Předmětem vynálezu jsou dále diagnostické testy které využívají protilátky namířené proti nekonzervovanému místu, detekující PRRSV antigen. Takové testy umožňují
- 4 CZ 297371 B6 diagnostikovat přítomnost konkrétních PRRSV izolátů. V rámci jednoho nekonzervovaného místa je předmětem vynálezu hlavní sekvence PRGGQAKKKK nebo PRGGQAKRKK nebo PRGGQAKKRK nebo GPGKKNKKKN nebo GPGKKNKKKT nebo GPGKKNRKKN nebo GPGKKFKKKN nebo GPGKKIKKKN nebo GPGQINKKIN. V rámci jiného nekonzervovaného místa je předmětem vynálezu hlavní sekvence MAGKNQSQKK nebo MPNNNGKQTE nebo MPNNNGKQPK nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGKQQN nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGRQQK. Jak již bylo popsáno výše, není pro člověka zabývajícího se navrhováním a syntézou peptidů obtížné pozměnit uměle zmíněné sekvence GP4 nebo N proteinu tak, aby byla zachována jejich antigenicita a tudíž i funkčnost.
Další skupina látek podle vynálezu zahrnuje konformační epitopy (které se navzájem mezi jednotlivými izoláty velmi liší), které se nacházejí v pozicích odpovídajících aminokyselinám 51 až 68 proteinu N u izolátu 1-1102 (u tohoto izolátu se jedná o hlavní sekvenci PKPHFPLAAEDDIRHHL) nebo aminokyselinám 79 až asi 90 proteinu N (u izolátu 1-1102 se jedná o hlavní sekvenci SIQTAFNQGAGT) nebo aminokyselinám 111 až 124 proteinu N (u izolátu 1-1102 se jedná o hlavní sekvenci HTVRLIRVTSTSAS).
Konzervovaná, nekonzervovaná, diferencující i konformační místa proteinu N, která jsou předmětem navrhovaného vynálezu, umožňují při použití v diagnostických testech zcela jednoznačnou diagnostiku PRRSV infekcí. Byly připraveny testy které nevyužívají nekonzervované sekvence a tudíž zabraňují vzniku falešně negativních výsledků. Ovšem různá nekonzervovaná místa byla použita při přípravě diferenciačních testů, které mohou například rozlišovat mezi očkovanými prasaty a prasaty infikovanými divokým typem PRRSV. Jak již bylo řečeno, není pro molekulárního biologa obtížné porovnat sekvence obsahuj ící konzervované, nekonzervované, diferencující či konformační epitopy s aminokyselinovými sekvencemi proteinů kódovaných ORF7 některého dalšího PRRSV izolátu. Antigenní místa, která jsou předmětem navrhovaného vynálezu, jsou použita v nových souborech očkovací látka-diskriminační diagnostický test, určených pro použití v programech pro eradikaci PRRS.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
MATERIÁL A METODY
Buňky a viry
Ter Huurne kmen PRRSV (CNCM 1-1102) byl izolován v roce 1991 (Wenswoort et al., 1991). Americký kmen PRRSV ATCC-VR2332 byl izolován o rok později Benfíeld et al. (1992). Kmen NL1 (Nizozemí, 1991) byl izolován v naší laboratoři, kmen NY2 (Velká Británie, 1991) laskavě poskytnul T. Drew, kmen DEN (Dánsko, 1992) laskavě poskytnul A. Botner, kmen LUX (Lucembursko, 1992) laskavě poskytnul Losch, kmeny SPA1 a SPA2 (Španělsko, 1992) laskavě poskytli Shokouhi a Espuna resp. a kmen FRA (Francie, 1992) laskavě poskytnul Y. Leforban.
PRRSV a VR2332 byly pěstovány na CL2621 buňkách tak jak to bylo popsáno dříve (van Nieuwstadt et al., 1996). Sedm odlišných evropských izolátů bylo pěstováno na prasečích alveolámích makrofázích. Makrofágy byly pěstovány tak, jak to bylo popsáno dříve (Wensvoort et al., 1991). BHK-21 buňky byly pěstovány na Dulbeccově základním minimálním médiu doplněném 5% fetálním hovězím sérem a antibiotiky. Pro účely transfekce byly BHK-21 buňky pěstovány na Glasgow základním minimálním médiu (GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd.).
Antiséra
Prasečí anti-PRRSV sérum 21 a králičí anti-peptidové sérum 698 a 700 byly použity již v dřívějších experimentech. Sérum 700 je namířeno proti aminokyselinám 106 až 122 (CLFYASEMSEKGFKVIF) kódovaným ORF4 PRRSV a bylo získáno imunizací králíků. PřípraCZ 297371 B6 va a charakterizace monoklonálních protilátek byla popsána již dříve (van Nieuwstadt et al., 1996). Hybridomy byly připraveny v pěti po sobě následujících fúzních experimentech a byly připraveny proti proteinu kódovanému ORF4 (MAb, 121.4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130.7, 138.28) nebo proti proteinu kódovanému ORF7 (MAb 122.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2, 130.4, 131.7, 138.22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17). Monoklonální protilátky WBE nám laskavě poskytnul Dr. Drew, Weybridge, UK; MAb SDOW17 laskavě poskytnul Dr. Benfíeld, South Dakota, US.
Plazmidové konstrukty
Dva oligonukleotidy lokalizované po směru transkripce (PRRSV13) a proti směru transkripce (PRRSV14) ORF4 byly již dříve použity pro amplifikaci a klonování ORF4 izolátu 1-1102 do plazmidu pGEM—4Z. Pro klonování byla použita BamHl a HindlII restrikční místa zabudovaná do oligonukleotidových primerů (Meulenberg et al., 1995). Takto vzniklý konstrukt byl nazván pABV209. Dva oligonukleotidové primery lokalizované v podobných pozicích vzhledem k iniciačnímu kodonu (PRRSV4) a terminačnímu kodonu (PRRSV5) ORF4 VR2332 izolátu byly použity pro amplifikaci ORF4 z VR2332 metodou RT-PCR tak, jak to bylo popsáno v dřívějších studiích. PCR produkty byly opracovány BamHl restrikčním enzymem a částečně také HindlII enzymem (částečně z toho důvodu, že ORF4 z VR2332 obsahuje interní HindlII místo) a klonovány do pGEM-4Z plazmidu za vzniku konstruktu pABV270. Rekombinantní DNA techniky byly použity v podstatě tak jak byly popsány v Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Eaboratory Manual, Cold Spring Harbor Eab., Cold Spring Harbor, Ny, 1989). Nukleotidová sekvence ORF4 z VR2332 v pABV270, stanovená pomocí automatického DNA sekvenátoru (Applied Biosystems) byla shodná s publikovanou sekvencí (Murtaughet al., Arch. Virol. 140; 1451-1460,1995).
Následně byly ORF4 z 1-1102 a VR2332 přeneseny do Semliki Forest virus expresního vektoru pSFVl. pABV209 a pABV270 byly štěpeny restrikčními enzymy BamHl a HindlII (jen částečně v případě pABV270), ORF fragmenty byly opracovány Klenowovým fragmentem DNA polymerázy (Pharmacia) za vzniku tupých konců a takto opracovaná DNA byla ligována do Smál místa pSFVl, defosforylovaného telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Pharmacia). Plazmidy nesoucí ORF4 1-1102 (pABV265) a VR2332 (pABV271) ve správné orientaci byly dále testovány na expresi GP4 proteinu. Dále byly z 1-1102 a VR2332 připraveny čtyři různé chimémí ORF4 geny. Nukleotidová sekvence ORF4 genu kódující aminokyseliny 1 až 39 GP4 VR2332 byla amplifikována pomocí oligonukleotidů PRRSV4 a PRRSV6 z plazmidu pABV270. Takto získaný fragment byl opracován enzymy BamHl a SacII. Takto upravený fragment byl zaligován do pABV209 vektoru rozštěpeného BamHl a SacII restrikčními enzymy a za vzniku „in frame“ fúze (tj. fúze bez porušení čtecího rámce) mezi aminokyselinami 1 až 39 proteinu GP4 VR2332 a aminokyselinami 40 až 183 proteinu GP41-1102 v plazmidu pABV306. Nukleotidová sekvence ORF4 genu kódující aminokyseliny 1 až 75 GP4 VR2332 byla amplifikována pomocí oligonukleotidů PRRSV4 a PRRSV9 (viz. tabulka 2). tento fragment byl opracován restrikčními enzymy KpnI a BamHl. Nukleotidová sekvence ORF4 genu kódující aminokyseliny 80 až 183 proteinu GP4 z 1-1102 izolátu byla amplifikována pomocí oligonukleotidových primerů PRRSV46 a PRRSV14 a vzniklý fragment byl opracován restrikčními enzymy KpnI a BamHl. Oba fragmenty byly společně zaligovány do vektoru pGEM^lZ opracovaného enzymy BamHl a HindlII za vzniku plazmidu pABV308. Stejným způsobem byl připraven komplementární konstrukt pABV314 obsahující nukleotidovou sekvenci kódující aminokyseliny 1 až 79 GP4 proteinu z 1-1102 amplifikovanou z primerů PRRSV13 a PRRSV57 spojenou ligací s fragmentem kódujícím aminokyseliny 76 až 178 VR2332, připraveným amplifikaci z primerů PRRSV10 a PRRSV5 ve vektoru pGEM-4Z. Čtvrtý chimémí konstrukt byl tvořen fragmentem kódujícím aminokyseliny 40 až 79 PRRSV GP4 proteinu fúzovaným s fragmenty kódujícími aminokyseliny 1 až 39 a aminokyseliny 76 až 178 VR2332 GP4 proteinu. Toho bylo dosaženo ligací BamHI/SacII ORF4 fragmentu pABV270 a SacII/HindlII ORF4 fragmentu pABV314 s pGEM4Z opracovaným BamHl a HindlII. Výsledný plazmid byl nazván pABV325. Správnost sekvence plazmidů pABV306, pABV308, pABV314 a pABV325 byla ověřena sekvenací oligonukleotidů. Chimémí ORF4 geny byly přeneseny z pABV306, pABV308, pABV314 a pABV325 do PSFVl,
- 6 CZ 297371 B6 tak, jak to bylo popsáno výše v případě ORF4 genů zVR2332 a PRRSV. Výsledkem byly plazmidy pABV296, pABV305, pABV321 a pABV326 resp. (obr. 3).
Dva oligonukleotidy lokalizované proti směru transkripce (LVI08; 5'-GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC-3') a po směru transkripce (LVI 12; 5'CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCT GA-3') ORF7 byly použity pro amplifikaci a klonování ORF7 genu do plazmidu pGEM-T za vzniku pABV341. Sekvence a pozice těchto a i dalších oligonukleotidů, použitých pro amplifikaci fragmentů ORF7, jsou uvedeny v tabulce 1. Další čtyři chimémí konstrukty byly připraveny mutagenezí pomocí PCR. Sekvence kódující aminokyseliny 25 až 26 a 28 až 30 (místo B; obrázek 3) byly nahrazeny odpovídajícími sekvencemi EAV N proteinu. Této záměny bylo dosaženo PCR amplifikaci ORF7 z primerů LV108 a LV134 (5-TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGATAAAGTCC-3'). Mutantní DNA fragmenty byly s pomocí MscI a PacI restrikčních míst vneseny do pABV431 za vzniku pABV455. Oblast ORF7 kódující aminokyseliny 51 až 67 byla nahrazena odpovídající oblastí LDV ORF7. Plazmid pABV431 byl štěpen enzymy EcoNI a Clal a byl ligován s PCR fragmentem vzniklým amplifikaci zprimerů LV98 (5CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTTC CCATGGCTGGTCCATCTGAC-3') a LV99 (5'-CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGGAGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCAGATGGACCAGCC-3') a opracovaným stejnými restrikčními enzymy. Vzniklý plazmid byl nazván pABV463. Oblast ORF7 kódující aminokyseliny 80 až 90 byla nahrazena odpovídajícím úsekem LDV ORF7 genu. ORF7 gen LV byl mutován pomocí PCR s použitím primerů LVI01 (5-GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCTTTCATCCA-3') a LVI 12. Získaný fragment byl opracován enzymy Narl a PacI a byl ligován do vektoru pABV431 štěpeného Clal a Pacl. Vzniklý plazmid byl nazván pABV453. Konečně oblast kódující C-terminální část proteinu N (aminokyseliny 111 až 128) byla nahrazena sekvencí kódující odpovídající aminokyseliny v N proteinu LDV. Gen ORF7 byl amplifikován z primerů LVI08 a LV102 (5-ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAGGAATTAGCAGAAGCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCAGCAACCGGCAG-3') a klonován do vektoru pGEM-T. Vzniklý konstrukt byl nazván pABV456. Divoký typ ORF7 genu i mutované ORF7 geny byly z vektorů pABV431, pABV453, pABV455 a pABV463 vystřiženy pomocí enzymu PacI (tupé konce) a Hpal z vektoru pABV456 pomocí enzymů Hpal a Swal. Získané geny byly následně vloženy do defosforylovaného Smál místa expresního vektoru pSFVI (Semliki forest virus). Plazmidy pABV470, pABV460, pABV462, pABV518 a pABV471 nesoucí odpovídající ORF7 geny ve správné orientaci byly dále testovány na expresi N proteinu. In vitro transkripce a transfekce SFV ORF7 RNA byla provedena stejně jako to bylo popsáno výše pro SFV-ORF4 konstrukty.
ORF4 geny sedmi různých evropských izolátů byly klonovány následujícím způsobem: makrofágy byly infikovány NL1, NY2, DEN, FRA, SPA1, SPA2 a LUX a RNA byla izolována tak jak to popsal Meulenberg et al., (1993). ORF4 geny byly amplifíkovány pomocí RT-PCR zoligonukleotidových primerů PRRSV13 a PRRSV14 a klonovány pomocí BamHI a HindlII do pGEM-4Z. Pro každý kmen byla stanovena sekvence ORF4 genu dvou nezávislých klonů pocházejících z nezávislých PCR reakcí. Proteinové sekvence odvozené z nukleotidových sekvencí byly zpracovány programem pro mnohonásobné porovnání sekvencí CLUSTAL PCGene (Intelligenetics Tm).
In vitro transkripce a transfekce SFV-ORF4 RNA.
Plazmidy pSFV obsahující různé ORF4 konstrukty byly linearizovány štěpením Spěl a transkribovány in vitro. Syntetizovaná RNA byla transfekcí vnesena do BHK-21 buněk. Transfekce byla provedena v 15 mm jamkách na destičce s dvacetičtyřmi jamkami s použitím lipofectinu. Buňky byly fixovány ledovým 50% (v/v) methanolem v acetonu a GP4 protein exprimovaný různými ORF4 konstrukty byl značen monoklonálními protilátkami metodou IPMA (immunoperoxidase monolayer assay). ORF4 expresní produkty byly analyzovány imunoprecipitací. 107 BHK-21 buněk bylo transfekováno 10 pg in vitro transkribované SFV-ORF4 RNA. Transfekce byla
- 7 CZ 297371 B6 provedena elektroporací. Poté byly buňky vysety do tří 35 mm jamek šesti jamkové kultivační destičky a 18 hodin po transfekci byly buňky značeny.
Metoda pepscan
Kompletní soubor překrývajících se nonapeptidů nebo dodekapeptidů byl syntetizován z aminokyselin odvozených od sekvence ORF4 nebo ORF7 PRRSV (popis viz Meulenberg et al. 1993). Syntézu peptidů na pevné fázi na polyethylénových tyčinkách a imunologické testování metodou ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) jsme prováděli přesně podle zavedené metody PEPSCAN (Geysen et al., PNAS 81, 3998-4002, 1984).
Výsledky
Již dříve jsme popsali soubor neutralizujících monoklonálních protilátek reagujících s 31 až 35 kDa proteinem PRRSV nazvaným GP4 a soubor monoklonálních protilátek reagujících při testování metodou Western imunoblot s proteinem N. Bylo prokázáno že GP4 je strukturální glykoprotein kódovaný ORF4 a N je protein nukleokapsidy kódovaný ORF7. V imunoprecipitačních pokusech s GP4 specifickými monoklonálními protilátkami putoval GP4 protein z lyzátů buněk infikovaných PRRSV jako oddělený pruh o velikosti 28 kDa spolu s nepatrnou skvrnou o něco větší zdánlivé molekulové hmotnosti. Monoklonální protilátky imunoprecipitovaly difúzní (glykosylovaný) GP4 protein veliký asi 31 kDa z extracelulámího média PRRSV infikovaných buněk ale nikoliv z extracelulámího média falešně infikovaných buněk.
Identifikace neutralizující domény GP4
Již dříve bylo popsáno, že monoklonální protilátky specifické pro GP4 protein rozeznávaly 1-1102, ale nikoliv US izolát VR2332 (van Nieuwstadt et al., 1996). Abychom mohli identifikovat doménu GP4 proteinu vážící neutralizující monoklonální protilátky, připravili jsme fúzní proteiny sestávající se zčásti GP4 proteinu 1-1102 a VR2332. Tyto proteiny byly exprimovány s použitím SFV (Semliki forest virus) expresního systému vyvinutého Liljestrom et al. (Biotechnol, 9, 1356-1362, 1991). Nejprve byl do pSFVl klonován ORF4 z 1-1102 izolátu za vzniku plazmidu pABV265 (obr. 1). RNA získaná transkripcí zpABV265 byla transfekci vnesena do BHK-21 buněk a 24 hodin po transfekci byly buňky pozitivně značeny souborem 15 neutralizujících monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky nereagovaly s BHK-21 buňkami nesoucími pSFVl-RNA. Rekombinantní GP4 protein byl imunoprecipitován monoklonální protilátkou MAb 126.1 z BHK-21 buněk značených L-[35S]-methioninem, transfektovaných pABV265 RNA. Tento protein měl stejnou velikost jako původní GP4 protein syntetizovaný CL2621 buňkami infikovanými 1-1102 a také obsahoval PNGaseF a EndoH citlivé N-glykany. Také GP4 protein VR2332 byl klonován do pSFVl, ale tento protein nebyl po expresi v BHK-21 buňkách rozpoznán monoklonálními protilátkami (obr. 1). Aby bylo možné ještě blíže určit oblast GP4 proteinu rozpoznávanou monoklonálními protilátkami, byly připraveny čtyři chimémí ORF4 geny z —1102 a VR2332 a vneseny do SFV1 vektoru (obr. 1). RNA získaná transkripcí zplazmidů pABV296, pABV30S, pABV321 a pABV326 byla vnesena transfekci do BHK-21 buněk. Reaktivita exprimovaných proteinů s GP4 specifickými MAb byla testována metodou IPMA. Výsledek reakce se všemi 15 MAb byl identický, což dokazuje, že všechny tyto monoklonální protilátky byly namířeny proti oblasti GP4 proteinu velké 40 aminokyselin. Produkt exprese pABV326, který obsahoval aminokyseliny 40 až 79 odvozené od GP4 proteinu CNCM 1-1102 izolátu a celý zbytek sekvence GP4 proteinu odvozený od GP4 proteinu VR2332, byl stále ještě rozpoznáván celým souborem monoklonálních protilátek. Abychom se ujistili, že byly různé GP4 proteiny, především ty, které nebyly rozpoznány monoklonálními protilátkami, v BHK-21 buňkách správně exprimovány, byly tyto proteiny z lyzátu BHK-21 buněk transfektovaných RNA připravenou in vitro transkripci z plazmidů pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV321 a pABV326 imunoprecipitovány. Proteiny byly imunoprecipitovány prasečím anti-PRRSV sérem 21, MAb 126.1 a anti-peptidovými séry 698 a 700. Sérum 700 je namířeno proti aminokyselinám 106-122 PRRSV GP4 proteinu izolátu CNCN 1-1102, tj. proti sekvenci která je s výjimkou aminokyseliny 121 identická s odpovídající sekvencí GP4 proteinu izolátu ATCC-VR2332. Proto byly sérem 700 imunoprecipitovány všechny GP4
- 8 CZ 297371 B6 proteiny. Zmíněné GP4 proteiny byly při analýze na SDS-PAGE co do velikosti nerozeznatelné. Výjimku tvořily GP4 proteiny exprimované pABV305 a pABV271, které se pohybovaly nepatrně rychleji. To je pravděpodobně způsobeno delecí čtyř aminokyselin u izolátu VR2332 oproti sekvenci 1-1102. Ktéto deleci dochází mezi aminokyselinami 62 až 64 (obr. 3). Kompletní soubor GP4 specifických monoklonálních protilátek rozpoznával GP4 proteiny exprimované z plazmidů pABV265, pABV296, pABV321, pABV326, ale nikoliv proteiny exprimované z plazmidů pABV305 a pABV271, což jen potvrdilo výsledky získané metodou IPMA (obr. 3). Sérum 698 vykazovalo stejný reakční profil jako monoklonální protilátky. Sérum 698 je namířeno proti aminokyselinám 62 až 77 GP4 proteinu PRRSV, které jsou lokalizovány v nově popsané neutralizační doméně GP4 proteinu. Tato oblast je u VR2332 GP4 proteinu velice heterogenní, a proto nebyly produkty získané expresí genů nesoucích v této oblasti VR2332 sekvenci sérem 698 rozpoznány. Ovšem neutralizující polyklonální prasečí sérum rozpoznává 1-1102 GP4 protein stejně jako chimémí GP4 proteiny i VR2332 GP4 protein, což naznačuje, že toto sérum obsahuje celou řadu neutralizujících protilátek, které jsou namířeny proti neutralizačnímu místu GP4 proteinu, tvořenému aminokyselinami 40 až 79.
PEPSCAN ORF4 a ORF7 proteinů
Vzhledem ktomu že při testování metodou western blot reagovalo s GP4 proteinem všech 15 monoklonálních protilátek, předpokládali jsme, že tyto protilátky rozpoznávají lineární epitop v oblasti spojující aminokyselinami 40 až 79 proteinu GP4 z izolátu 1-1102. Pro další mapování oblasti vážící monoklonální protilátky byla použita metoda PEPSCAN s použitím překrývajících se nonapeptidů nebo dodekapeptídů z této oblasti. Peptidy byly považovány za představitele antigenního místa, pokud vrcholy v takovém souboru opakovaně dosahovaly více než dvojnásobných hodnot v porovnání s pozadím. MAb 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7 a 138-28 reagovaly pozitivně s jedním specifickým antigenním místem tvořeným aminokyseliny 59 až 67 (SAAQEKISF) (obr. 2). MAb 122-12 reagovala s tímto antigenním místem jen slabě, zatímco zbývajících 7 monoklonálních protilátek vykazovalo při PEPSCAN analýze negativní výsledky. Polyklonální prasečí sérum zmíněné místo při PEPSCAN analýze také identifikovalo. Neutralizující sérum 21, odebrané v šestém týdnu po infekci prasete 21 PRRSV, vykazovalo s tímto místem i přilehlými oblastmi silnou a širokou reaktivitu. Také neutralizující polyklonální prasečí séra (val2 a val4), odebraná 54. den po očkování PRV-ORF4 virovým vektorem a při porážce 30 dní po vyvolání reakce v 54. dnu s PRRSV, reagovala s neutralizačním místem identifikovaným metodou PEPSCAN silně a v nej širším spektru případů.
U izolátu 1-1102 obsahuje základní sekvence neutralizačního místa aminokyselinovou sekvenci SAAQEKISF lokalizovanou v oblasti aa 59 až 67. U dalších izolátů je tato základní sekvence lokalizována v místě a nebo v blízkosti místa odpovídajícího pozici zmíněných aminokyselin. Jedná se o aminokyselinovou sekvenci odpovídající neutralizačnímu místu GP4 proteinu, obsahující například sekvence jako SAAQEEISF, nebo STAQENISF, nebo STAQENIPF, nebo SEESQSVT, nebo SASEAIR, nebo SASEAFR, nebo PAPEAFR, nebo SAFETFR, nebo STSEAFR, ale předpokládáme, že další izoláty PRRSV nesou odpovídající, ale nepatrně odlišné základní sekvence neutralizačního místa, lokalizované v a nebo v blízkosti aminokyselinové sekvence odpovídající aminokyselinám 59-67 ORF4 PRRSV izolátu 1-1102. Zmíněná sekvence může být také snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti základní sekvence, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a tím i funkčnosti základní sekvence, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna. Také, jak bylo zcela zjevně demonstrováno mnohem širší reaktivitou neutralizujícího polyklonálního séra v PEPSCAN testech, aminokyselinové sekvence různých izolátů PRRSV obsahující základní aminokyselinovou sekvenci a sekvence přilehlé k této základní sekvenci navíc tvoří neutralizační místa na ORF4 proteinu. Neutralizační místo tvoří především sekvence lokalizované v pozicích odpovídajících aminokyselinám 40 až 79 (obr. 1). A znovu, zmíněná sekvence může být snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti základní sekvence, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna. Vezmeme-li v úvahu širokou reaktivitu polyklonálního neutralizujícího séra val2 nebo séra val4 (obr. 2), je zřejmé že aminokyselinové
- 9 CZ 297371 B6 sekvence lokalizované v pozicích odpovídajících aminokyselinám 52 až 75 ještě specifičtěji tvoří široce reaktivní neutralizační místo.
Monoklonální protilátky namířené proti ORF7 proteinu reagovaly v testu PEPSCAN ve čtyřech různých skupinách: skupina A (4), B (2), C (3) a D (1). Skupina 1 (D) (ve které byly mezi jinými MAb 122.17, 130.3, 130.4, 131.7, WBE1, WBE4, WBE6, SDOW17 obsahující konzervovaná i nekonzervovaná reaktivní místa) reagovala s konformačním epitopem, který nebyl metodou PEPSCAB detekován. Skupina 2 (B) (ve které byly mezi jinými MAb 125.1, 126.9, NS95 a NS99, reagující se všemi testovanými PRRSV izoláty a tudíž rozeznávající konzervované antigenní místo) rozeznává základní sekvenci VNQLCQLLGA (nacházející se u izolátu 1-1102 v pozici 22 až 32) nebo sekvenci VNQLCQMLGK. Skupina 3 (C) (ve které byla mezi jinými MAb 126.15 a reagující především s evropskými izoláty PRRSV a tudíž rozpoznávající diferenciační antigenní místo) rozpoznává základní sekvenci PRGGQAKKKK (nacházející se u izolátu 1-1102 v pozici 41 až 50) nebo PRGGQAKRKK nebo PRGGQAKKRK nebo GPGKKNKKKN nebo GPGKKNKKKT nebo GPGKKNRKKN nebo GPGKKFKKKN nebo GPGKKIKKKN nebo GPGQINKKIN. Skupina 4 (A) (ve které byla mezi jiným MAb 138.22 a reagující především s evropskými izoláty PRRSV a tudíž rozpoznávající diferenciační antigenní místo) rozpoznává základní sekvenci MAGKNQSQKK (nacházející se u izolátu 1-1102 v pozici 1 až 10) nebo MPNNNGKQTE nebo MPNNNGKQPK nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGKQQN nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGRQQK. Zmíněná antigenní místa mohou být snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti výše zmíněných antigenních míst proteinu N, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna. Přestože skupina 1 netvoří lineární epitopy, porovnání PRRSV aminokyselinových sekvencí s LDV aminokyselinovými sekvencemi ukazuje, že se v pozicích odpovídajících aminokyselinám 51 až 68 izolátu 1-1102 (u izolátu 1-1102 je to sekvence PKPHFPLAAEDDIRHHL) nebo aminokyselinám 79 až 90 (u izolátu 1-1102 je to sekvence SIQTAFNQGAGT) nebo aminokyselina 111 až 124 (u izolátu 1-1102 je to sekvence HTVRLIRVTSTSAS) nacházejí konformační epitopy. Zmíněná konformační antigenní místa mohou být snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti výše zmíněných antigenních míst proteinu N, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna, především s přihlédnutím k poznatkům získaným porovnáváním sekvencí PRRSV izolátů se sekvencemi N proteinů jiných zástupců Arteriviridae. To bylo potvrzeno expresí chimémích LDV/PRRSV ORF7 proteinů v SFV expresním systému (postup byl stejný jako v případě ORF4) a stanovením reaktivity výsledných produktů s monoklonálními protilátkami ze skupiny 1.
Chimémí proteiny N
Doména D byla dále mapována pomocí konstruktů ORF7 exprimujících chimémí proteiny N. Vzhledem ktomu, že 6 z 10 monoklonálních protilátek namířených proti doméně D rozeznávalo jak evropské, tak i severoamerické izoláty PRRSV, byly oblasti N proteinu, nejvíce konzervované mezi LV a severoamerickým izolátem VR2332 (obr. 4) mutovány. Nukleotidová sekvence kódující aminokyseliny 51 až 67, 80 až 90 a 111 až 128 byla nahrazena sekvencí kódující odpovídající aminokyseliny LDV (obr. 4). Pro úplnost bylo místo B (aminokyseliny 25 až 30), které je u evropských i severoamerických izolátů také konzervováno, mutováno. Vzhledem k tomu, že se aminokyselinová sekvence LV proteinu N v místě B velmi podobná aminokyselinové sekvenci LDV proteinu N, byla tato oblast LV proteinu N nahrazena oblastí kódující odpovídající aminokyseliny vN proteinu EAV (obr. 4). Mutované i divoké proteiny N byly exprimovány vBHK-21 buňkách (Semliki forest virus expresní systém) a byly testovány metodou IPMA s použitím N-specifických monoklonálních protilátek. D-specifické monoklonální protilátky reagovaly shodně (tabulka 1). Jejich vazba byla narušena mutacemi mezi aminokyselinami 51 až 67 a 80 až 90, ale nikoliv mutacemi mezi aminokyselinami 111 až 128 nebo 25 až 30 (místo B). Jak jsme očekávali, proteiny N nesoucí mezi aminokyselinami 51-67 a 80-90 LDV sekvenci byly stále ještě značeny protilátkami proti místům A, B a C. Ovšem množství barvených buněk a intenzita zbarvení byla nižší, než jaká byla pozorována u divokého typu proteinu N a u proteinu N mutovaného v oblasti mezi aminokyselinami 25 až 30 (místo B) nebo v oblasti mezi aminokyselinami 111-128 (tabulka 1). To bylo pravděpodobně způsobeno
-10CZ 297371 B6 nižší úrovní exprese proteinu N mutovaného mezi aminokyselinami 51-67 a 80-90, neboť i v případě kdy byla stejná množství transkriptů translatována in vitro, byly získané výtěžky zmíněných proteinů v porovnání s ostatními N proteiny nižší (data nejsou zobrazena). Jak jsme očekávali, proteiny N nesoucí v místě B EAV sekvence nebyly monoklonálními protilátkami proti místu B rozpoznány (pepscan analýza), ale byly rozpoznány monoklonálními protilátkami proti místům A, C a proti doméně D. Z těchto dat vyplývá, že epitopy patřící do domény D jsou závislé na konformaci a jsou tvořeny (zčásti) aminokyselinami 51-67 a 80-90.
Sekvenční analýza GP4 proteinu z různých PRRSV kmenů
Aby bylo možné analyzovat, je-li hlavní neutralizační antigenní místo, rozpoznávané GP4-specifickými protilátkami, mezi jednotlivými izoláty PRRSV konzervované, byla testována reaktivita a neutralizující aktivita monoklonálních protilátek na sedmi různých evropských kmenech. Výsledky ukázaly, že zmíněné protilátky rozpoznávají a neutralizují nizozemský kmen NL1 a anglický kmen NY, ale nikoliv dánský izolát DEN, dva španělské kmeny SPA1 a SPA2, francouzský izolát FRA a kmen LUX izolovaný v Lucembursku. Z toho důvodu nás zajímala aminokyselinová sekvence zmíněných izolátů v oblasti GP4 proteinu, ve které se nachází neutralizační místo. ORF4 byly klonovány metodou RT-PCR s použitím primerů odvozených od PRRSV sekvence a klonované úseky DNA byly osekvencovány. Aminokyselinové sekvence GP4 proteinů zmíněných izolátů, odvozené od stanovené nukleotidové sekvence, byly identické se sekvencí GP4 kmene 1-1102 z 86 až 97 %. Porovnání zmíněných aminokyselinových sekvencí ukázalo, že neutralizační místo (aminokyseliny 40 až 79) je mnohem více divergentní než zbývající části proteinu. V této oblasti se lišily především aminokyselinové sekvence izolátů DAN, SPA1, SPA2 a FRA. Tento poznatek je ve shodě se zjištěním, že tyto kmeny nejsou neutralizovány 1-1102 specifickými monoklonálními protilátkami a dále potvrdil, že tato oblast není mezi evropskými izoláty příliš konzervovaná. Další vysoce heterogenní oblast byla nalezena na N-konci GP4 proteinu. Porovnáním aminokyselinové sekvence PRRSV GP4 proteinu a GP4 proteinu z VR2332 a z dalších severoamerických kmenů ukázalo, že také americké izoláty jsou v oblasti neutralizačního místa GP4 proteinu heterogenní. Porovnáním aminokyselinových sekvencí bylo zjištěno, že neutralizační místo severoamerických izolátů je v porovnání s evropskými kmeny kratší (výsledkem porovnání sekvencí je mezera v neutralizační oblasti sekvence amerických izolátů) (obr. 3), což je v dobré shodě se zjištěním, že žádný ze zmíněných izolátů není rozpoznáván použitými monoklonálními protilátkami. Celkově byla mezi americkými izoláty pozorována vyšší diverzita než mezi evropskými kmeny.
To je ve shodě s vlastnostmi, charakteristickými pro typický virový obal, reprezentovanými například aminokyselinovou sekvencí GP4 proteinu. Potenciál neutralizačního místa, využitelný pro přípravu vakcíny, má, vzhledem k heterogenicitě neutralizačních míst, velký význam. Porovnáním aminokyselinových sekvencí GP4 proteinů různých evropských kmenů bylo zjištěno, že neutralizační místa vykazují mnohem vyšší variabilitu než ostatní části proteinu, což předpokládá, že tato místa jsou citlivá k imunoselekci. Porovnání sekvencí neutralizačních míst evropských a severoamerických izolátů ukázalo, že severoamerické kmeny mají v porovnání s evropskými v sekvenci mezeru velkou 4 aminokyseliny, což znovu ilustruje obrovskou variabilitu v aminokyselinové sekvenci nově identifikovaného neutralizačního místa PRRSV.
Neutralizační místo GP4 proteinu popsané zde, je prvním takovým místem identifikovaným u Lelystad viru. V případě dalších dvou arterivirů, EAV a LDV, byly izolovány neutralizující monoklonální protilátky a, které byly všechny namířeny proti G|/VP3 proteinu, kódovanému ORF5 (Deregt et al., 1994; Glaser et al., 1995; Balasuriya et al., 1995; Harty and Plagemann, 1988). Mapováním pomocí mutantů necitlivých k neutralizaci byla určena poloha neutralizačního místa EAV. Toto místo je tvořeno specifickými aminokyselinami ve vnější doméně Gp
Podobně byla analyzována sekvence ORF7 proteinu PRRSV (obr. 4). Tato analýza opět potvrdila velkou variabilitu v aminokyselinové sekvenci nově identifikovaných antigenně konzervovaných i nekonzervovaných míst PRRSV. V této části projektu byla identifikována čtyři různá antigenní místa nacházející se na proteinu N PRRSV. Tři místa, nazvaná A, B a C, jsou tvořena lineárními
-11 CZ 297371 B6 epitopy a nachází se mezi aminokyselinami 2-12, 25-30 a 40-46 resp. Na rozdíl od nich čtvrté místo, nazvané doména D, obsahuje konformačně závislé epitopy, které jsou (alespoň z části) tvořeny aminokyselinami 51-67 a 80-90. Místa A a C nesou epitopy, které jsou konzervované mezi evropskými, ale nikoliv mezi americkými izoláty PRRSV, místo B obsahuje epitopy konzervované jak mezi evropskými, tak mezi americkými izoláty a místo D obsahuje konzervované i nekonzervované epitopy jak u evropských, tak i severoamerických izolátů PRRSV. Konzervovaná místa proteinu N popsaná výše jsou pro vývoj diagnostických testů určených pro jednoznačnou diagnózu PRRSV infekcí velmi důležitá. Tyto testy by se měly vyhnout využití nekonzervovaných míst a tudíž by měly zabránit vzniku falešně negativních výsledků. Kromě toho je znalost různých nekonzervovaných míst obrovskou výhodou při vývoji diferenciačních testů, které například dokáží rozlišit mezi očkovanými prasaty a prasaty infikovanými divokým typem PRRSV.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: Schematické znázornění proteinů G exprimovaných v pSFVl a jejich reaktivita s GP4 specifickými monoklonálními protilátkami. Vyznačeny jsou také názvy plazmidů nesoucích jednotlivé ORF4 geny. Prázdné obdélníky představují aminokyselinové sekvence odvozené od proteinu G kódovaného ORF4 PRRSV, černě jsou vyznačeny aminokyselinové sekvence odvozené od proteinu G kódovaného ORF4 VR2332. Pořadová čísla aminokyselin jsou vyznačena nad odpovídajícími obdélníky. Geny byly nejprve vneseny do plazmidu pGEM-4Z, a teprve poté byly přeneseny do pSFVl, jak bylo podrobněji popsáno v kapitole „materiál a metody“. Kompletní soubor 14 GP4-specifických monoklonálních protilátek reagoval s různými konstrukty v IPMA testu identicky a reaktivita jednotlivých konstruktů je na obrázku vyznačena symboly + (pozitivní) nebo - (negativní).
Obrázek 2: Pepscan analýza GP4-specifických monoklonálních protilátek a polyklonálního séra s překrývajícími se 12-memími peptidy reprezentujícími aminokyseliny 12 až 94 proteinu GP4. Výsledky získané s protilátkami 130.7 a 138.28, které rozeznávají po sobě jdoucí peptidy, jsou znázorněny na obr. 2A. Dalších 5 monoklonálních protilátek (122.29, 122.30, 122.66, 122.71 a 138.28) vykazovalo obdobnou specifitu. Výsledky pokusů s polyklonálním sérem, získaným ze dvou prasat před imunizací (val2-0 a val4-0), po imunizaci vektorem odvozeným od pseudoviru vztekliny, exprimujícím ORF4 (val2-54 a val4-54) a po následné expozici PRRSV (val2sl a val4-sl) jsou znázorněny na obrázcích 2A a 2B. Výsledky pokusu s polyvalentním prasečím anti-LV sérem 21 (va21) jsou na obrázku 2D. Na obrázcích jsou vyznačeny aminokyselinové sekvence reaktivních peptidů, nejčastěji se vyskytující aminokyselinové zbytky jsou uvedeny v rámečku.
Obrázek 3: Porovnání aminokyselinových sekvencí GP4 (A) a N (B) proteinů z různých PRRSV kmenů. Zobrazeny jsou pouze aminokyseliny, které se liší od sekvence 1-1102, která je znázorněna v prvním řádku. Základní aminokyselinová sekvence, která je při pepscan analýze rozpoznávána monoklonálními protilátkami a/nebo polyklonálním sérem je podtržena.
Obrázek 4: Lokalizace antigen-vazebných míst v sekvenci proteinu N a porovnání sekvence N proteinu LV se sekvencí N proteinu severoamerického izolátu VR2332 a LDV. Antigen-vazebná místa A, B, a C a doména D jsou znázorněny stínováním. Místa A, B a C byla identifikována pepscan analýzou, doména D byla identifikována na základě konstrukce a analýzy chimémích N proteinů. Aminokyselinové sekvence LV, které byly za účelem mapování domény D nahrazeny odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi LDV jsou podtrženy. Aminokyseliny proteinu N EAV, které byly vloženy mezi aminokyseliny 25-30 za účelem mutace místa B, jsou zobrazeny pod sekvencí LDV. Identické aminokyseliny jsou spojeny vertikálními úsečkami.
- 12CZ 297371 B6
Tabulka 1
Značení chimémích proteinů N, exprimovaných vektorem SFV (Semliki forest virus) v BHK-21 buňkách, metodou IPMA.
| Plazmid | Mutace | Značení MAb metodou IPMA | |||
| 138.22 | 125.1/126.9/NS95/NS99 | 126.15 | 122.15/130.2/130.4/131.7/131,9/WBE 1 /WBE4/WBE5/W BE6/SDOW17 | ||
| A | B | C | D | ||
| pABV470 | - | +++ | +++ | ++ | +++ |
| pABV462 | 25-30 | +++ | - | ++ | +++ |
| pABV518 | 51-67 | ++ | ++ | + | - |
| pABV460 | 80-90 | ++ | ++ | + | - |
| pABV471 | 111-124 | +++ | +++ | ++ | +++ |
Tabulka 2
Sekvence primerů použitých pro PCR za účelem klonování ORF4 genů LV a VR2332 a chimémích ORF4 genů do plazmidových vektorů pGEMUZa pSFVl.
| Název | Sekvence’ | Vložené restrikční místo |
| LVI 3 | 5' GGCAATTGGMBCCATTTGGA 3' | BamHI |
| LVU | 5' AGAAGC/MGC7TGCGGAGTC 3' | Hindltt |
| LV46 | 5' GCCGTCGGD4CCCCTCAGTACAT 3' | KpnI |
| LV57 | 5’ATGTACTGAGGGGA ÁCCGACGGC 3' | KpnI |
| PRRSV4 | 5' GGCAATTGGdTCCACCTAGAATGGC 3' | BamHI |
| PRRSV5 | 5' GCGAGCX4GCTTCCGCGGTCAAGCATTTCT 3' | Hindlll |
| PRRSV6 | 5' CTTGCCGCCCGGTGGTGTTG 3' | Bacil |
| PRRSV9 | 5' ACAGCTGG7L4CCTATCGCCGTACGGCACTGA 3' | KpnI |
| PRRSV10 | 5' GCGATAGG7XCCCCTGTGTATGTTACCAT 3' | KpnI |
* Podtržené nukleotidy v těchto primerech byly vzhledem k původním sekvencím mutovány tak, aby vznikla restrikční místa nebo přesahující sekvence a aby bylo zabráněno v primerech jsou vyznačena proloženě.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Peptid mající 5 až 15 aminokyselinových zbytků vyvolávající tvorbu protilátek, které reagují s alespoň dvěma různými PRRSV izoláty, obsahující aminokyselinovou sekvenci odvozenou od aminokyselinové sekvence odpovídající konzervovanému místu proteinu N PRRSV, přičemž aminosekvence odpovídající konzervovanému místu proteinu N PRRSV je vybraná ze skupiny skládající se z VNQLCQLLGA A VNQLCQMLGK.
- 2. Protilátka reaktivní s peptidem podle nároku 1.
- 3. Diagnostická testovací souprava pro detekci nebo identifikaci protilátek namířených proti PRRSV izolátům, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden peptid podle nároku 1 společně s vhodnými detekčními prostředky.
- 4. Diagnostická testovací souprava pro detekci nebo identifikaci protilátek namířených proti antigenům odvozených od PRRSV izolátů, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 2 společně s vhodnými detekčními prostředky.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97201343 | 1997-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ9903932A3 CZ9903932A3 (cs) | 2000-10-11 |
| CZ297371B6 true CZ297371B6 (cs) | 2006-11-15 |
Family
ID=8228298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0393299A CZ297371B6 (cs) | 1997-05-06 | 1998-05-05 | Peptid mající 5 az 15 aminokyselinových zbytku vyvolávající tvorbu protilátek, protilátka reaktivnís tímto peptidem a diagnostická testovací souprava |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6495138B1 (cs) |
| EP (2) | EP0980387B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000512313A (cs) |
| KR (1) | KR100388257B1 (cs) |
| CN (1) | CN1259141B (cs) |
| AT (1) | ATE365746T1 (cs) |
| AU (1) | AU754938B2 (cs) |
| BR (1) | BR9809221A (cs) |
| CA (2) | CA2289980C (cs) |
| CZ (1) | CZ297371B6 (cs) |
| DE (1) | DE69837992T2 (cs) |
| DK (1) | DK0980387T3 (cs) |
| ES (1) | ES2289781T3 (cs) |
| HU (1) | HU228704B1 (cs) |
| ID (1) | ID23399A (cs) |
| PL (1) | PL197057B1 (cs) |
| PT (1) | PT980387E (cs) |
| RU (1) | RU2220978C2 (cs) |
| SK (1) | SK286063B6 (cs) |
| UA (1) | UA73915C2 (cs) |
| WO (1) | WO1998050426A1 (cs) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US6773908B1 (en) | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| DE19850718C1 (de) * | 1998-11-03 | 2000-05-18 | Hildt Eberhardt | Zellpermeabilität-vermittelndes Polypeptid |
| CA2366072C (en) * | 1999-03-08 | 2007-07-10 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
| PT2251419E (pt) | 1999-04-22 | 2012-09-03 | Us Agriculture | Vacina contra a síndrome reprodutiva e respiratória porcina com base no isolado ja-142 |
| CZ20032743A3 (cs) * | 2001-03-09 | 2004-02-18 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Atenuované kmeny viru PRRS |
| US7335361B2 (en) * | 2003-06-09 | 2008-02-26 | Animal Technology Institute Taiwan | Fusion antigen used as vaccine |
| MXPA06015105A (es) | 2004-06-18 | 2007-03-26 | Univ Minnesota | Identificacion de organismos viralmente infectados y vacunados. |
| US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| ES2581211T3 (es) * | 2005-02-25 | 2016-09-02 | Idexx Laboratories, Inc. | Péptidos para la detección de anticuerpos contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino |
| PL2369001T3 (pl) | 2005-06-24 | 2017-06-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Wirusy PRRS, ich klony zakaźne, mutanty i sposoby stosowania |
| US7622254B2 (en) | 2005-11-29 | 2009-11-24 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof |
| US20100227339A1 (en) | 2005-12-02 | 2010-09-09 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Differential immunoassay for prrs vaccine antibody |
| US20110117129A1 (en) * | 2008-08-25 | 2011-05-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Vaccine Against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (HP PRRS) |
| KR101101386B1 (ko) * | 2008-12-04 | 2012-01-02 | 주식회사 바이오리쏘스 | 북미형 ｐｒｒｓｖ에 특이적인 면역원성 펩티드 및 그의 용도 |
| AR078253A1 (es) | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| US9132185B2 (en) | 2010-06-02 | 2015-09-15 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Modified live-attenuated vaccines (MLV) created by DNA shuffling against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| CN101885759B (zh) * | 2010-06-25 | 2013-01-09 | 国家兽用生物制品工程技术研究中心 | 一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽及其筛选方法和应用 |
| PH12013501708B1 (en) | 2011-02-17 | 2018-08-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Commercial scale process for production of prrsv |
| MX355058B (es) | 2011-02-17 | 2018-04-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nueva cepa del prrsv europea. |
| WO2013017568A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF |
| US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
| CA2859944C (en) * | 2011-12-30 | 2023-01-24 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide-based marker vaccine and diagnostic system for effective control of porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) |
| KR101430223B1 (ko) * | 2012-10-09 | 2014-09-25 | 전북대학교산학협력단 | 면역유도능이 증가된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 |
| CN103421817B (zh) * | 2012-10-15 | 2016-01-13 | 华中农业大学 | 人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用 |
| EP2929018A4 (en) | 2012-12-07 | 2016-07-13 | Univ Illinois | COMPOSITIONS FROM THE REPRODUCTIVE SWINE VIRUS AND A VIRUS FOR THE RESPIRATORY SYNDROME AND USES THEREOF |
| CN103059142B (zh) * | 2012-12-17 | 2015-02-25 | 重庆市畜牧科学院 | 猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的重组蛋白及其制备方法与应用 |
| CN105073130A (zh) | 2013-03-15 | 2015-11-18 | 勃林格殷格翰动物保健公司 | 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法 |
| EP2804000A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | Prionics AG | Method for the detection and classification of PRRSV-infections in swine herds and diagnostic antigen compositions for such methods |
| US10010601B2 (en) | 2013-12-20 | 2018-07-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus variant, European PRRS virus cDNA clone, and uses thereof |
| US10072046B2 (en) * | 2014-03-21 | 2018-09-11 | Nutech Ventures | Non-naturally occurring porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and methods of using |
| NZ738957A (en) | 2015-06-23 | 2019-09-27 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Prrsv minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof |
| CN106442968B (zh) * | 2016-09-21 | 2018-03-06 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 猪繁殖与呼吸综合征血清学鉴别诊断试剂盒 |
| CN109022613A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-12-18 | 上海申亚动物保健品阜阳有限公司 | 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及检测方法 |
| KR102091279B1 (ko) * | 2018-08-07 | 2020-03-20 | 대한민국 | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 |
| KR102138287B1 (ko) * | 2018-08-07 | 2020-07-29 | 대한민국 | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 유전형별 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 |
| CN110894243B (zh) * | 2019-12-16 | 2021-07-13 | 中国农业大学 | 一种猪蓝耳病毒嵌合抗原以及检测猪蓝耳病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
| CN112458115B (zh) * | 2020-10-21 | 2022-06-07 | 天津农学院 | 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992021375A1 (en) * | 1991-06-06 | 1992-12-10 | Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| GB2289279A (en) * | 1994-05-13 | 1995-11-15 | Iberica Cyanamid | Prrsv recombinant proteins |
| WO1996004010A1 (en) * | 1994-08-05 | 1996-02-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use |
| WO1996006619A1 (en) * | 1994-09-01 | 1996-03-07 | Paul Prem S | Polynucleic acids and proteins from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE144144T1 (de) | 1991-08-26 | 1996-11-15 | James Edward Collins | Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas) |
| US5846805A (en) | 1991-08-26 | 1998-12-08 | Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. | Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells |
| CA2076744C (en) | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Danny W. Chladek | Viral agent associated with mystery swine disease |
| WO1993007898A1 (en) | 1991-10-14 | 1993-04-29 | Akzo Nobel N.V. | Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic |
| US5695766A (en) | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US6251397B1 (en) * | 1992-10-30 | 2001-06-26 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same |
| PT683816E (pt) | 1993-02-08 | 2001-03-30 | Univ Iowa State Res Found Inc | Processo de cultura do virus do sidroma das funcoes respiratorias e reprodutoras de suinos e seu uso em vacinas |
| ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
| US5690940A (en) | 1995-06-21 | 1997-11-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof |
| ES2122921B1 (es) * | 1996-12-30 | 1999-09-16 | Inmunologia & Genetica Aplic | Proteinas recombinantes de fusion del virus reproductivo y respiratorio porcino (prrsv) y su empleo en diagnostico. |
-
1998
- 1998-05-05 EP EP98921916A patent/EP0980387B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 PT PT98921916T patent/PT980387E/pt unknown
- 1998-05-05 KR KR10-1999-7010289A patent/KR100388257B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 SK SK1526-99A patent/SK286063B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-05 DE DE69837992T patent/DE69837992T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 RU RU99125615/13A patent/RU2220978C2/ru active
- 1998-05-05 JP JP10547938A patent/JP2000512313A/ja active Pending
- 1998-05-05 ID IDW991527A patent/ID23399A/id unknown
- 1998-05-05 PL PL336714A patent/PL197057B1/pl unknown
- 1998-05-05 EP EP07107362A patent/EP1882696A3/en not_active Ceased
- 1998-05-05 CN CN988058219A patent/CN1259141B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-05 UA UA99126600A patent/UA73915C2/uk unknown
- 1998-05-05 CA CA2289980A patent/CA2289980C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 CZ CZ0393299A patent/CZ297371B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-05 ES ES98921916T patent/ES2289781T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 AU AU74571/98A patent/AU754938B2/en not_active Expired
- 1998-05-05 DK DK98921916T patent/DK0980387T3/da active
- 1998-05-05 CA CA2703181A patent/CA2703181C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 HU HU0002176A patent/HU228704B1/hu unknown
- 1998-05-05 AT AT98921916T patent/ATE365746T1/de active
- 1998-05-05 BR BR9809221-9A patent/BR9809221A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-05-05 WO PCT/NL1998/000251 patent/WO1998050426A1/en active IP Right Grant
-
1999
- 1999-11-05 US US09/434,476 patent/US6495138B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992021375A1 (en) * | 1991-06-06 | 1992-12-10 | Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| GB2289279A (en) * | 1994-05-13 | 1995-11-15 | Iberica Cyanamid | Prrsv recombinant proteins |
| WO1996004010A1 (en) * | 1994-08-05 | 1996-02-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use |
| WO1996006619A1 (en) * | 1994-09-01 | 1996-03-07 | Paul Prem S | Polynucleic acids and proteins from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.J.M. Meulenberg et al.: "Posttranslational Processing and Identification of a Neutralization Domain of the GP4 Protein Encoded by ORF4 of Lelystad Virus * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1259141B (zh) | 用于疫苗或诊断测试中的鉴定prrs病毒的肽序列的prrsv抗原位点 | |
| US7264802B2 (en) | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) | |
| Meulenberg et al. | Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus | |
| US6251397B1 (en) | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same | |
| US6977078B2 (en) | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) | |
| Meulenberg et al. | Localization and fine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies | |
| KR20140110013A (ko) | 돼지 생식기 호흡기 증후군 (prrs)의 효과적인 제어를 위한 합성 펩티드-기반 마커 백신 및 진단 시스템 | |
| De Lima et al. | GP3 is a structural component of the PRRSV type II (US) virion | |
| Zhou et al. | Monoclonal antibodies and conserved antigenic epitopes in the C terminus of GP5 protein of the North American type porcine reproductive and respiratory syndrome virus | |
| US6410031B1 (en) | Attentuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain and method of use | |
| Faaberg | Arterivirus structural proteins and assembly | |
| MXPA99010185A (en) | Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180505 |