DE69214657T2 - Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas) - Google Patents

Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas)

Info

Publication number
DE69214657T2
DE69214657T2 DE69214657A DE69214657A DE69214657T2 DE 69214657 T2 DE69214657 T2 DE 69214657T2 DE 69214657 A DE69214657 A DE 69214657A DE 69214657 A DE69214657 A DE 69214657A DE 69214657 T2 DE69214657 T2 DE 69214657T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
virus
msd
pig
cell
homogenate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69214657A
Other languages
English (en)
Other versions
DE69214657T4 (de
DE69214657T3 (de
DE69214657D1 (de
Inventor
David Allen Benfield
Danny W Chladek
James Edward Collins
David E Gorcyca
Louis L Harris
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27419388&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69214657(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Individual filed Critical Individual
Application granted granted Critical
Publication of DE69214657D1 publication Critical patent/DE69214657D1/de
Publication of DE69214657T2 publication Critical patent/DE69214657T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Seit 1987 leidet die Schweine erzeugende Industrie unter einer verheerenden als Epidemie auftretenden unbekannten Krankheit, die oft als "Mistery Swine Desease" [MSD, seit kürzerer Zeit bezeichnet als "Swine Infertility and Respiratory Syndrome (SIRS) (Schweine-Infertilitäts- und Respirationssyndrom)] bezeichnet wird, da Forscher nicht in der Lage waren, das kausale Agens zu identifizieren. MSD hat Hunderttausende von Schweinen in ganz Nord-Amerika und Europa befallen. Wenn ein Schwein einmal mit MSD infiziert ist, kann dieses eine Schwein MSD innerhalb von 3 bis 7 Tagen auf eine ganze Herde ausbreiten. Von 1987 bis 1991 hat die Schweineindustrie Einnahmeverluste in Höhe von Millionen von Dollarn infolge von MSD erlitten. Eine kürzlich erstellte Studie schätzt, daß MSD finanzielle Verluste zwischen $ 250 und $ 500 pro erfaßtem Mutterschwein verursacht.
  • MSD verursacht bei Schweinen mannigfaltige Symptome. Das erste Symptom von MSD in einer Zuchtherde von Schweinen ist gewöhnlicherweise Anorexie und leichte Pyrexie. Zusätzlich können die Tiere der Herde bläuliche Verfärbungen der Haut, besonders der Ohren, der Zitzen, der Schnauze und der stirnseitigen Teile ihrer Nacken und Schultern aufweisen. Die betroffene Haut kann irreparabel beschädigt werden. Das verheerendste Symptom von MSD ist jedoch die Fortpflanzungsstörung, die in einer Zuchtherde von Schweinen auftritt. MSD bedingt, daß Mutterschweine totgeborene Ferkel tragen; zu kleine, schwache Ferkel mit Atemnot; oder Schweine, die sterben, bevor sie entwöhnt sind. Andere durch MSD bedingte Fortpflanzungssymptome schließen frühes Ferkeln, verringerte Konzeptionsraten, Zyklusstörungen bei manchen Mutterschweinen und eine Verringerung der in einem Wurf gefundenen Gesamtanzahl von Ferkeln ein. Man hat geschätzt, daß die Zahl von durch Fortpflanzungsstörungen verlorenen Ferkeln etwa 10 bis 15 % der jährlichen Schweineproduktion beträgt.
  • Die Forschung konzentrierte sich auf das Isolieren des kausalen Agens von MSD. Eine Anzahl potentieller bakterieller Erreger ist isoliert worden. Die Typen potentieller bakterieller Erreger haben jedoch zwischen den Schweine produzierenden Betrieben variiert. Untersuchungen auf Viren haben solche mit Fluoreszenzantikörpern, elektronenmikroskopische Nachforschungen und die Serologie eingeschlossen. Diese Verfahren sind bei der Bestimmung des kausalen Agens von MSD gescheitert.
  • Forscher haben in den Niederlanden einen als Lelystad-Virus bezeichneten Virus aus Schweinen isoliert, der klinische Zeichen einer Mistery Swine Disease zeigt. Wensvoort et al., Vet. Ouarterly 13:121-129 (1991) und Terpstra et al., Vet. Quarterly 13:131-136 (1991). Der Lelystad-Virus wurde als ein Aerosol verabreicht, um MSD bei den Schweinen wieder hervorzurufen, und wurde von den von den Mutterschweinen ausgetragenen Ferkeln re-isoliert. Jedoch hat noch niemand einen Impfstoff entwickelt, der verwendet werden kann, um MSD in der Schweinepopulation zu behandeln.
  • Deshalb ist es ein Ziel der Erfindung, einen Impfstoff und Sera bereitzustellen, die, wenn einer Zuchtherde von Schweinen verabreicht, die Anwesenheit von MSD in ihrer Population verringert. Ein anderes Ziel ist es, ein Verfahren zur Behandlung einer Schweinepopulation mit dem Impfstoff bereitzustellen, um MSD aus der Schweinepopulation auszurotten. Noch ein weiteres Ziel ist es, ein Verfahren zur Diagnose von MSD bereitzustellen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, die auf einen Impfstoff und Sera zur Prävention und Behandlung von Mistery Swine Disease und auf ein Verfahren zu deren Diagnose bei Schweinen gerichtet ist.
  • Der Impfstoff ist abgeleitet von einem infektiösen Agens, das Schweine mit Mistery Swine Disease (MSD) infizieren wird. Das infektiöse Agens wird erhalten aus einem Inokulum aus prozessiertem Gewebe von Schweinen, bevorzugt Lungengewebe, die mit der Krankheit infiziert sind. Bevorzugterweise ist das infektiöse Agens das Produkt einer in vitro-Säugerzellkultur, wie beispielsweise einer mit dem Inokulum des infizierten Schweinegewebes infizierten Affenzellinie. Bevorzugterweise enthält das Inokulum biologische Partikel, die nicht größer sind als etwa 1,0 µm (Mikron), bevorzugtererweise 0,5 µm (Mikron), bevorzugtesterweise nicht größer als 0,2 µm (Mikron). Es ist auch bevorzugt, daß das Inokulum mit Antikörpern gegen gewöhnliche Schweinekrankheiten neutralisiert worden ist.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung reproduzierte ein Gewebehomogenat, das von Ferkeln aus mit SIRS befallenen Herden erhalten wurde, in konsistenter Weise die respiratorischen und reproduktiven Formen von SIRS, wenn dieses intranasal in gnotobiotische Ferkel und trächtige Mutterschweine inokuliert wurde. Solchermaßen mit entweder unfiltriertem oder filtriertem (0,45, 0,22 oder 0,1 µm) Inokulum inokulierten gnotobiotischen Ferkel wurden appetitlos und entwickelten mikroskopische Lungenläsionen ähnlich den Läsionen, die in von SIRS betroffenen Herden beobachtet werden. Dasselbe Inokulum verursachte auch reproduktive Wirkungen, die identisch sind mit den in von SIRS betroffenen Herden gesehenen. Ein virales Agens ist aus dem Gewebehomogenat wiedergewonnen worden. Das virale Agens verursacht eine Krankheit, die bei Ferkeln und trächtigen Mutterschweinen SIRS nachahmt. Das virale Agens ist noch nicht klassifiziert worden. Jedoch ist das virale Agens ein anspruchsvolles nicht-hämagglutinierendes RNA-Virus mit Hülle und ist am 18. Juli 1991 bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, unter der Eingangsnummer ATCC VR- 2332 hinterlegt worden.
  • Das Serum zur Behandlung infizierter Schweine trägt Säugerantikörper gegen MSD. Es wird aus dem Blutplasma eines Säugetieres (Nicht-Schwein oder Schwein) erhalten, das mit dem oben beschriebenen infektiösen Agens vorbehandelt wurde.
  • Alternativ ist das Serum aus monoklonalen durch Hybridomaverfahren produzierten Antikörpern gegen MSD formuliert.
  • Das Verfahren zur Diagnose von MSD basiert auf der Verwendung von immunspezifischen Antikörpern gegen MSD. Das Verfahren bedarf der Kombination eines filtrierten Homogenates einer Lungenbiopsieprobe oder einer Biopsieprobe oder ähnlichen Proben (Homogenat oder Biopsie) von einem anderen Gewebe und den immunspezifischen Antikörpern, gefolgt von der Anwendung einer bekannten Nachweistechnik für das durch diese Kombination gebildete Konjugat. Immobilisierung oder Präzipitierung des Konjugates und Anwendung solcher Nachweistechniken wie ELISA; RIA; Southern, Northern, Western Blots und dergleichen wird MSD diagnostizieren.
  • Nach der vorliegenden Erfindung involvieren therapeutische und diagnostische Verfahren, die Antikörper gegen MSD verwenden, monoklonale Antikörper (beispielsweise IgG oder IgM) gegen das oben beschriebene anspruchsvolle, nicht-hämagglutinierende RNA-Virus mit Hülle. Diese Antikörper werden von den SDOW 12 und SDOW 17 bezeichneten Hybridomen erhalten, die bei der American Type Culture Collection am 27. März 1992 mit den Zugangsnummern HB 10996 bzw. HB 10997 hinterlegt wurden.
    • Kurze Beschreibung
  • Fig. 1 zeigt die mit SIRS-Virus VR-2332 beobachteten cytopathischen Wirkungen. Fig. 1A: Nicht infizierter, ungefärbter Zellmonolayer. Fig. 1B: Infizierter Monolayer mit kleinen granulären abgerundeten und degenerierenden Zellen, die drei Tage nach Inokulation mit der sechsten Passage des SIRS-Virus beobachtet wurden.
  • Fig. 2 zeigt die direkte Immunfluoreszenzfärbung von SIRS-Virus-infizierten MA-104-Zellen. Fig. 2A: Nicht infizierter Zellmonolayer. Fig. 2B: Infizierte Zellen mit starker, oft granulierter cytoplasmatischer Fluoreszenz, die drei Tage nach Inokulation beobachtet wurde.
  • Fig. 3 zeigt das Dichtegradientenprofil von auf CsCl-Dichtegradienten gereinigtem SIRS-Virus. Der Maximalwert der Virusinfektiosität, liegt bei 1,18-1,19 g/ml.
  • Fig. 4 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme von in CsCl-Gradientenfraktionen mit einer Dichte von 1,18-1,19 g/ml beobachteten Viruspartikeln. Fig. 4A: Diese vier Partikel sind sphärisch und weisen einen Durchmesser von 60-65 nm auf. Zwei Partikel sind "leer" und zeigen einen elektronendichten Kern (Pfeile) und die anderen zwei Partikel sind vollständig. Balken 100 nm. Fig. 4B: Immungoldelektronenmikroskopische Aufnahme von SIRS-Virus mit hyperimmunem Kaninchenserum und anti- Kaninchen-IgG, das mit Goldpartikeln markiert ist. Beachtlich ist die Anwesenheit eines Kernpartikels mit einem Durchmesser von etwa 25-30 nm im Virion. Balken = 50 nm.
  • Fig. 5 zeigt die Temperaturstabilität des SIRS-Virus bei 4ºC (offene Dreiecke), 37ºC (offene Kreise) und 56ºC (geschlossene Kreise).
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Bestimmung der Ursache der Mistery Swine Disease (MSD) gestaltet sich schwierig. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde jedoch die Isolierung und Wachstum des MSD verursachenden infektiösen Agens erreicht. Wie hierin verwendet, bezeichnet "infektiöses Agens" ein Virus, das in der Lage ist, Infertilität und respiratorisches Syndrom bei Schweinen zu verursachen. Genauer gesagt ist das infektiöse Agens ein anspruchsvolles, nicht-hämagglutinierendes RNA-Virus mit Hülle und tierpathogene Mutanten davon sind in der Lage, bei Schweinen Infertilität und respiratorische Erkrankung zu verursachen. Die Isolierung des infektiösen Agens ist ein wesentlicher Durchbruch und eine wesentliche Entdeckung. Sie erlaubt die Herstellung von Impfstoffen, Antikörperseren zur Behandlung infizierter Schweine und diagnostische Verfahren.
  • Der Impfstoff ist aus einem inaktivierten oder attenuierten infektiösen MSD-Agens zusammengesetzt, das aus einem Inokulum gewonnen wird, das aus infiziertem Schweinelungengewebe oder anderem Schweinegewebe hergestellt wird, das die charakteristischen Läsionen von MSD aufweist. Funktionelle Derivate des infektiösen Agens, einschließlich Untereinheit, Vektor, rekombinante und synthetische Peptidimpfstoffe oder dergleichen, kann man sich auch vorstellen. Bei der Herstellung des MSD- Impfstoffes wird ein Mehrstufenverfahren verwendet. Das infektiöse MSD-Agens wird zuerst als ein Inokulum durch Separieren und Isolieren aus infiziertem Schweinegewebe, bevorzugterweise dem Lungengewebe, erhalten. Das infektiöse NSD-Agens wird dann unter Verwendung bekannter Techniken der Impfstoffherstellung behandelt, um einen Impfstoff gegen MSD zu bilden.
  • Das infektiöse MSD-Agens wird bevorzugt als ein Inokulum aus dem Lungengewebe von Schweinen isoliert, die infolge MSD ein schnelles Atmen zeigen (andere Gewebe wie beispielsweise fötales Gewebe kann auch verwendet werden, um das Virus wiederzugewinnen). Solche Schweine werden getötet und ihr Lungengewebe entfernt. Das Lungengewebe wird dann mikroskopisch auf verdickte Alveolarsepten untersucht, die durch die Anwesenheit von Makrophagen, degenerierenden Zellen und Debris in Alveolarräumen verursacht sind. Diese Merkmale zeigen die Anwesenheit des infektiösen MSD-Agens an. Anderes Schweinegewebe, das Läsionen dieser Art aufweist, kann ebenfalls verwendet werden, um das infektiöse MSD-Agens zu isolieren.
  • Die Lunge oder anderes Gewebe vom Schwein wird dann mit einer pharmazeutisch akzeptablen wässrigen Lösung (wie beispielsweise physiologische Salzlösung, Ringer-Lösung, Hank's Balanced Salt Solution, Minimum Essential Medium, und dergleichen) homogenisiert, so daß das Gewebe 10 % w/v der Menge des Homogenates umfaßt. Das Homogenat wird dann durch Filter mit Porendurchmessern im Bereich von 0,05 bis 10 µm (Mikron), bevorzugterweise durch eine Serie von 0,45, 0,2, und 0,1 µm (Mikron)- Filter, gegeben, um ein filtriertes Homogenat herzustellen, das das infektiöse MSD-Agens enthält. Als ein Ergebnis enthält das filtrierte Homogenat biologische Partikel mit einer Größe nicht größer als etwa 1,0 µm (Mikron), bevorzugterweise nicht größer als 0,2 bis 0,1 µm (Mikron). Das filtrierte Homogenat kann dann mit unvollständigem Freunds-Adjuvans gemischt werden, so daß die Herstellung von Antikörpern nach Injektion in ein Säugetier angeregt werden kann. Diese Mischung kann als ein Inokulum für die Entwicklung von MSD in Schweinen oder weitere Studien des infektiösen MSD-Agens verwendet werden.
  • Nachdem man ein filtriertes Homogenat erhalten hat, das das infektiöse Agens enthält, kann das infektiöse Agens inaktiviert oder abgetötet werden durch Behandlung des filtrierten Homogenats mit einem standardmäßigen chemischen Inaktivierungsmittel, wie beispielsweise einem Aldehydreagens, das Formalin, Acetaldehyd und dergleichen enthält; reaktive saure Alkohole einschließlich Cresol, Phenol und dergleichen; Säuren wie beispielsweise Benzoesäure, Benzensulfonsäure und dergleichen; Lactone wie beispielsweise Beta-Propiolacton und Caprolacton; und aktivierte Lactame, Carbodiimide und carbonyldiheteroaromatische Verbindungen wie beispielsweise Carbonlydiimi -dazol. Bestrahlung wie beispielsweise Ultraviolett- und Gammabestrahlung kann ebenfalls verwendet werden, um das infektiöse Agens zu inaktivieren oder abzutöten. Alternativ kann das infektiöse Agens durch sein wiederholtes Wachstum in Zellkulturen von anderen Säugetieren als Schweinen oder von Vögeln attenuiert werden, so daß die Fähigkeit des infektiösen Agens, sich virulent zu reproduzieren, verloren geht. Die Details der Zellkulturattenuationstechnik werden unten angegeben.
  • Das abgetötete oder attenuierte infektiöse Agens wird dann auf einen geeigneten Titer durch Zugabe einer Verdünnungsadjuvanslösung zur Stimulierung der Immunantwort verdünnt. Die Titration wird vervollständigt durch Messung gegen MSD-Antikörper in einem immunologischen Test wie beispielsweise einem ELISA-, RIA-, IFA- oder Enzymsubstratnachweistest, wie unten beschrieben.
  • Um eine gereinigte Form des infektiösen Agens herzustellen, kann das oben beschriebene filtrierte Homogenat in eine Serie von in vitro-Zellpräparaten inokuliert werden. Zellpräparate mit Zellen aus Säugerorganen, wie beispielsweise Niere, Leber, Herz und Gehirn, Lunge, Milz, Hoden, Nasenmuschel, weiße und rote Blutzellen und Lymphknoten, ebenso wie Insekten- und Vogelembryopräparate können verwendet werden. Kulturmedien, die für diese Zellpräparate geeignet sind, schließen jene ein, die das Wachstum von Säugerzellen unterstützen, wie beispielsweise fötales Kälberserum und Agar, Blutinfusionsagar, Gehirn-Herz- Infusionsglucosebrühe und Agar und dergleichen. Bevorzugterweise sind die Säugerzellen Nierenzellen, bevorzugtesterweise embryonale Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze - Affennierenzellinie (MA-104).
  • Nach dem Inokulieren der Zellpräparate mit dem filtrierten Homogenat und Anziehen der Kultur werden einzelne Klumpen kultivierter Zellen geerntet und in steriles Kulturmedium mit Zellen wieder eingeführt. Die Kulturflüssigkeit der letzten Kultur der Serie liefert die gereinigte Form des virulenten infektiösen Agens. Auch nachdem eine Reihe von wiederholten Ernten vorgenommen worden ist, kann die Kultur angezogen, die Kulturflüssigkeit gesammelt und die Flüssigkeit als ein Inokulum für eine Kultur einer anderen Zellspecies verwendet werden. Auf diese Weise kann das infektiöse Agens attenuiert werden, so daß die Kulturflüssigkeit von der Kultur der anderen Species die gereinigte Form des attenuierten infektiösen Agens liefert.
  • Polyklonale Antiköperseren können durch Verwendung des infektiösen Agens als eine antigene Substanz hergestellt werden, um eine Immunantwort in Säugetieren hervorzurufen. Die Kulturflüssigkeit oder das Inokulum, hergestellt wie oben beschrieben, kann mit einem stimulierenden Adjuvans einem anderen Säugetier als einem Schwein, wie beispielsweise einem Pferd, einer Ziege, einer Maus oder einem Kaninchen, verabreicht werden. Nach wiederholter Reizaussetzung können Teile des Blutserums entnommen und unter Verwendung von immobilisierten Antikörpern gegen jene krankheitsspezifischen Antikörper, die typischerweise im Serum des zur Ader gelassenen Tieres gefunden werden, antigenisch gereinigt werden. Eine weitere Behandlung des halbgereinigten Serums durch Chromatographie auf, beispielsweise, einer Saccharidgelsäule mit physiologischer Kochsalzlösung und Sammeln von Proteinkomponenten mit einem Molekulargewicht von mindestens 10.000, liefert ein gereinigtes polyklonales Serum zur Verwendung bei der Behandlung.
  • Monoklonale Antikörperseren können durch die Hybridomatechnik hergestellt werden. Nach Immunisierung einer Maus, eines Schweins, einer Ratte, eines Kaninchen oder einer anderen geeigneten Spezies mit MSD-enthaltendem Zellkulturlysat oder Gradienten-gereinigtem MSD, wie oben beschrieben, kann die Milz des Tieres entfernt und in ein Ganzzellpräparat umgewandelt werden. Gemäß der Methode von Kohler und Milstein (Kohler et al., Nature, 256, 495-97 (1975)), können die Immunzellen aus dem Milzzellpräparat mit Myelomazellen fusioniert werden, um Hybridomas herzustellen. Kultivierung der Hybridomas und Testen der Kulturflüssigkeit gegen die Flüssigkeit oder das Inokulum, die/das das infektiöse Agens trägt, erlaubt die Isolierung der Hybridomkultur, die monoklonale Antikörper gegen das infektiöse MSD-Agens herstellt. Einführen der Hybridoma in das Peritoneum der Wirtsspezies wird zu einem peritonealen Wachstum der Hybridomas führen. Sammeln der Ascitesflüssigkeit liefert Körperflüssigkeit, die den monoklonalen Antikörper gegen das infektiöse Agens enthält. Zellkulturüberstand aus der Hybridomzellkultur kann ebenfalls verwendet werden. Bevorzugterweise wird der monoklonale Antikörper durch eine von der Maus abgeleiteten Hybridomzellinie hergestellt, wobei der Antikörper ein Immunglobulin vom Typ IgG oder IgM ist. Beispiele monoklonaler Antikörper gegen das infektiöse Agens für SIRS sind der monoklonale Antikörper SDOW 12 und SDOW 17. Zusätzlich zu den in dieser Anmeldung an anderen Stellen diskutierten Verwendungen können monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden, einschließlich passiver Immunisierung und Herstellung von anti-Idiotyp-Impfstoffen.
  • Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, MSD- Infektionen, die in der Schweinepopulation gefunden werden, zu verhindern und zu heilen. Für eine effektive prophylaktische und anti-infektiöse Verwendung in vivo enthält der MSD-Impfstoff abgetötetes oder attenuiertes infektiöses MSD-Agens und kann alleine oder in Kombination mit einer pharmazeutischen Trägersubstanz verabreicht werden, die für Schweine kompatibel ist. Der Impfstoff kann oral, parenteral, intranasal oder intravenös verabreicht werden. Faktoren, die auf die Impfstoffdosis Einfluß nehmen schließen, beispielsweise, das Alter, Gewicht und Umfang mütterlicher Antikörper des infizierten Schweines ein. Der Bereich einer verabreichten Dosis beträgt 10³ bis 10&sup7; infektiöse Gewebekulturdosis 50 pro ml, bevorzugterweise in 1 ml bis 5 ml Dosen verabreicht. Die Impfstoffdosen sollten über etwa 14 bis 28 Tage verabreicht werden, um zu gewährleisten, daß das Schwein eine Immunität gegen die MSD- Infektion entwickelt hat.
  • Der MSD-Impfstoff kann in einer Vielzahl verschiedener Dosierungsformen verabreicht werden. Ein wässriges Medium, das das abgetötete oder attenuierte infektiöse MSD-Agens enthält, kann getrocknet und mit pharmazeutisch akzeptablen inerten Bindemitteln und Puffersubstanzen wie beispielsweise Lactose, Stärke, Calciumcarbonat, Natriumcitrat kombiniert und zu Tabletten, Kapseln und dergleichen geformt werden. Diese Kombinationen können auch als ein Pulver ausgebildet werden oder in einer wässrigen Lösung suspendiert werden, so daß diese Pulver und/oder Lösungen dem Tierfutter oder dem Trinkwasser der Tiere zugesetzt werden können. Diese MSD-Impfstoffpulver oder Lösungen können in geeigneter Weise durch verschiedene bekannte Agenzien gesüßt oder mit Aromastoffen versetzt werden, um die orale Aufnahme des Impfstoffes durch das Schwein zu fördern.
  • Zu Zwecken der parenteralen Verabreichung kann das abgetötete oder attenuierte infektiöse MSD-Agens mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen, in der Technik gut bekannten Trägern, wie beispielsweise Kochsalzlösungen, Wasser, Propylenglycol, etc., kombiniert werden. In dieser Form kann der Impfs.o. stoff parenteral, intranasal und oral mittels in der Veterinärmedizin gut bekannter Verfahren verabreicht werden. Der MSD-Impfstoff kann auch intravenös mittels einer Spritze verabreicht werden. In dieser Form ist der MSD-Impfstoff mit (einem) pharmazeutisch akzeptablen wässrigen Träger(n), wie beispielsweise einer physiologischen Kochsalzlösung, kombiniert. Die parenteralen und intravenösen Formulierungen von MSD-Impfstoff können auch Emulgatoren und/oder Suspensionsmittel, zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln einschließen, um die Freisetzung und die Dosismenge des MSD-Impfstoffes zu kontrollieren.
  • Das Verfahren zur Diagnose von MSD wird mit polyklonalem oder monoklonalem Antikörperserum, wie oben beschrieben, ausgeführt. Entweder das Antikörperserum oder das mittels Biopsie gewonnene Gewebehomogenat kann durch Kontakt mit einer Polystyrolberfläche oder mit einer Oberfläche eines anderen Polymers zur Immobilisierung von Proteinen immobilisiert werden. Das übrige Antikörperserum und Homogenat wird dann zugesetzt, inkubiert und das nicht-immobilisierte Material entfernt, z.B. durch Waschen. Ein markierter Spezies-spezifischer Antikörper für das Antikörperserum wird dann zugesetzt und die Anwesen heit und Menge der Markierung bestimmt. Die Bestimmung der Markierung zeigt die Anwesenheit von MSD in dem getesteten Gewebe an. Typische Ausführungsformen dieses Verfahrens schließen den Enzymimmuntest (ELISA); Radioimmunotest (RIA); Immunfluoreszenztest (IFA); Northern, Southern und Western Blot-Immuntest ein.
  • Die folgenden Beispiele illustrieren weiter spezifische Ausführungsformen der Erfindung. Die Beispiele sollen jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung beschränken, der gänzlich in der vorhergehenden Offenbarung charakterisiert worden ist.
    • Beispiel 1
  • Das infektiöse MSD-Agens kann gekennzeichnet werden durch Bestimmung physikochemischer Eigenschaften (Größe, Empfindlichkeit gegen Lipidlösungsmittel und Empfindlichkeit gegen Protease), durch Behandlung des Inokulums, gefolgt von der Inokulierung gnotobiotischer Schweine, um zu bestimmen, ob das infektiöse MSD-Agens pathogen bleibt.
    • A. Materialien Gnotobiotische Schweine.
  • Herkunft und Verfahren zur Pflege gnotobiotischer Schweine sind bei Benfield et al., Am. J. Vet. Res., 49, 330-36 (1988) und Collins et al., Am. J. Vet. Res., 50, 824-35 (1989) beschrieben. Mutterschweine können aus einer Herde erhalten werden, die frei von Fortpflanzungsproblemen, einschließlich MSD, ist. Würfe mit totgeborenen und/oder mumifizierten Föten sollten nicht verwendet werden.
    • MSD-Inokulum (MN90-SD76-GP2, hierin als MNSD90x76-L oder MNSD90x76-P bezeichnet).
  • Trachea, Lunge, Nasenmuscheln, Mandel, Leber, Hirn und Milz können von säugenden Schweinen aus einer Schweineherde in Minnesota, die spontan mit MSD infiziert wurde, gesammelt werden (Collins et al., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, Abstract, 254-55 (1990). Ein Homogenat dieser Gewebe (bezeichnet als MN 89-35477) ist in Hank's Balanced Salt Solution ohne Antibiotika hergestellt worden und 0,5 ml können intranasal in drei Tage alte gnotobiotische Ferkel inokuliert werden unter Verwendung eines Zerstäubers aus Glas (Ted Pella Co., Redding, CA). Inokulierte Ferkel können klinische Anzeichen und mikroskopische Läsionen ähnlich jenen entwickeln, die in den spontan infizierten Schweinen beobachtet werden. Lungen, Leber, Niere, Milz, Herz und Gehirn von diesen gnotobiotischen Schweinen können 8 Tage nach der ursprünglichen Inokulation gesammelt und vereinigt werden, um ein weiteres Homogenat herzustellen. Dieses zweite Homogenat kann dann ein zusätzliches Mal in gnotobiotische Schweine inokuliert werden. Wieder können dieselben Gewebe gesammelt und homogenisiert werden, mit der Ausnahme, daß Lungengewebe als ein eigenes Homogenat hergestellt werden kann, da sich MSD idealerweise vom Lungenhomogenat reproduzieren läßt. Dieses Lungenhomogenat stellt die zweite serielle Passage des ursprünglichen Inokulums (MN 89-35477) in gnotobiotischen Schweinen dar (Collins et al., 71st Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Disease, Abstract No. 2 (1990)). Zwei Filtrate können dann unter Verwendung von 0,20 um Filter (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) und 0,10 µm Filter (Millipore Corp., Bedford, MA) hergestellt werden. Diese Filtrate können aliquotiert und bei -70ºC gelagert werden. Alle Filtrate sind frei von Bakterien und es sollten keine Viren bei direkter Elektronenmikroskopie unter Verwendung negativ gefärbter Präparate beobachtet werden.
    • Kontrollinokulum.
  • Homogenate von Lungengeweben, die von zwei scheininfizierten gnotobiotischen Schweinen gewonnenen wurden, können als Inokulum in Kontrollschweinen verwendet werden. Dieses Kontrollinokulum kann als 0,20 und 0,10 µm-Filtrat, wie für das MSD-Inokulum beschrieben, hergestellt werden.
    • Nekropsieverfahren und Histopathologie.
  • Die Schweine können sieben Tage nach der ursprünglichen Inokulation getötet werden, wie kürzlich beschrieben in Collins et al., 71st Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Disease, Abstract No. 2 (1990)). Gewebe können gesammelt, in neutralem gepuffertem Formalin fixiert und für die lichtmikroskopische Untersuchung bearbeitet werden, wie beschrieben in Collins et al., Am. J. Vet. Res., 50, 827-35 (1989). Proben können gesammelt werden von den Nasenmuscheln, Mandeln, Trachea, Gehirn, Thymus, Lunge (apicale, cardiale, diaphragmatische Lappen), Herz, Nieren, Milz, Leber, Magen, Duodenum, Jejunum, Ileum, aufsteigender und absteigender Colon, Blut und mesenterischen Lymphknoten. Diese Gewebe können bearbeitet und dann unter Verwendung eines Lichtmikroskopes untersucht werden, um zu bestimmen, ob lymphomononukleäre Encephalits, interstitielle Pneumonie, lymphoplasmacytische Rhinitis, lymphomononucleäre Myocarditis oder portale Hepatitis vorliegt. Läsionen können durchweg bei spontan infizierten Schweinen aus Herden mit MSD- Inokulum beobachtet werden (Collins et al., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, Abstract&sub1; 254-55 (1990)). Fäkalinhalte können auch gesammelt und auf Viruspartikel untersucht werden, wie vor kurzem beschrieben in Ritschie et al., Arch. Gesante. Virus-forsche, 23, 292-98 (1968). Blut und Gewebe können für immunologische Tests gesammelt und auf Bakterien kultiviert werden, wie beschrieben in Beispiel 3.
    • B. Isolierung des infektiösen Agens
  • Lungengewebe und kombinierte Gehirn-Milz-Leber-Nierengewebe, die von einem infizierten Ferkel aus einer SIRS-infizierten Herde gewonnen wurden, wurden getrennt homogenisiert. 10 % Gewebehomogenate wurden verwendet. Die einzelnen Homogenate wurden mit Minimum Essential Medium (MEM), das Gentamycin zu etwa 100 ug pro ml enthielt, gemischt. Beide Proben wurden bei etwa 4000 x g für etwa 25 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dann entfernt und durch einen 0,45 Mikron-Filter filtriert. Die Gewebe- und Lungenhomogenate wurden dann vereinigt und das vereinigte Material wurde verwendet, um verschiedene Gewebekulturzellinien zu infizieren.
    • 1. In vitro-Testen.
  • Zwei Tests wurden unter Verwendung von 75 cm² Plastikflaschen durchgeführt. In Test Nr. 1 wurde das kombinierte Material in zwei Flaschen mit vollständiger Zellschicht einer jeden der unten aufgeführten Zellinien inokuliert. Zusätzlich wurden zu einer Flasche einer jeden Zellinie etwa 2,5 mg Trypsin zugegeben. Alle anderen restlichen Bedingungen waren für jede Flasche der Zellinie dieselben. Serum war im Kulturmedium nicht vorhanden. Das Inokulum betrug 1 ml.
  • Alle Flaschen wurden für sieben Tage bei 34ºC gehalten. Die Ergebnisse wurden am Ende von sieben Tagen aufgezeichnet. Nach Einfrieren und Auftauen wurde eine Probe genommen für eine zweite Passage in derselben Zellinie. Das restliche Material wurde eingefroren und bei etwa -60ºC gelagert.
  • In Test Nr. 2 wurde das kombinierte Material in eine Flasche derselben Zellen inokuliert, wie sie in Test Nr. 1 verwendet wurden. Die Zellschichten waren jedoch zum Zeitpunkt der Inokulierung nur zu 20-40 % konfluent. Die Medien enthielten etwa 10 % fötales Kälberserum. Wiederum betrug das Inokulum 1 ml und die Kulturen wurden bei etwa 34ºC für etwa sieben Tage inkubiert. Die Ergebnisse von sowohl Test Nr. 1 als auch Test Nr. 2 sind unten zusammengefaßt:
  • + = CPE-Wirkung
  • - = keine CPE-Wirkung
  • NT = nicht getestet
  • Es wurde keine cytopathische Wirkung in irgendeiner der evaluierten Zellinien in Test Nr. 1 beobachtet. In Test Nr. 2 hingegen begannen kleine Klumpen von MA-104-Zellen zu schwellen und "schwache Löcher" im Monolayer im Bereich der Ecken der Flaschen zu bilden. Flüssigkeit wurde von der Flasche abgetrennt, in eine neue Flasche mit MA-104-Zellen überführt (wieder Zellschicht zu 20-40 %) und dann nachfolgend ein drittes Mal überführt. Die cytopathische Wirkung (CPE) wurde mit jeder Passage stärker. Die oben beschriebenen Verfahren wurden für die MA-104-Zellinie unter Verwendung einer vollständigen Zellschicht wiederholt. CPE wurde ebenfalls beobachtet. Weiteres Testen zeigte, daß das virale Agens auch bei 37ºC wachsen wird. Die Anwesenheit von Serum kann für die anfängliche Isolierung des viralen Agens hilfreich sein. Nachfolgende Passagen des viralen Agens in der MA-104-Zellinie wird die CPE ohne die Anwesenheit von Serum liefern. Jedoch wird eine stärker ausgebildete CPE für die MA-104 Zellinie bei Verwendung des Serums im Wachstumsmedium beobachtet.
  • Das virale Agens wurde acht Mal in der MA-104-Zellinie passagiert, wobei sich gute CPE in drei Tagen bei Passage 5 und größer entwickelte. Der erhaltene Titer beträgt etwa 5-1/2 logs (105,5). Das virale Agens wird auch in weiteren Affenzellinien wachsen.
    • 2. In vivo-Testen.
  • Die Ernte einer dritten Passage wurde verwendet, um zwei drei Tage alte gnotobiotische Ferkel zu inokulieren. Beide Ferkel wurden intranasal exponiert, eines mit 1 ml und das andere mit 2 ml. Die Ferkel wurden für sieben Tage beobachtet und dann getötet.
  • Gewebeproben wurden für histopathologische Untersuchungen und zur Wiedergewinnung des viralen Agens gesammelt. Der histopathologische Bericht bestätigte, daß Lungenläsionen in den infizierten Ferkeln identisch mit Lungenläsionen von Ferkeln waren, die bekanntermaßen SIRS aufwiesen. Die Gewebeproben wurden wie zuvor bearbeitet und dann auf 20-40 %- und 100 %- Monolayern der MA-104-Zellinie mit fötalem Rinderserum kultiviert. Das virale Agens wurde wiederum wiedergewonnen.
  • Eine Ernte der dritten Passage wurde auch verwendet um Mutterschweine zu inokulieren, um zu verifizieren, daß die reproduktiven Wirkungen der Krankheit dupliziert und bestätigt werden können. Zwei multipare Mutterschweine wurden intranasal nach 93-tägiger Trächtigkeit inokuliert. Die Mutterschweine hatten Würfe mit 50 % totgeborenen Ferkeln (8/13 und 6/14 totgeboren zu lebend) am Tag 112 bzw. 114 der Trächtigkeit. Sieben der totgeborenen Ferkel waren partiell mumifiziert und die lebend geborenen Ferkel waren schwach und schafften es nicht, kräftig zu saugen. Das virale Agens wurde aus Geweben der totgeborenen Ferkel wiedergewonnen.
  • Das virale Agens ist aus drei Herden wiedergewonnen worden, von denen bekannt ist, daß sie SIRS haben. Antikörpertiter gegen das ATCC VR-2332-Agens sind in diesen Herden identifiziert worden.
  • Obwohl es einige Unterschiede in den klinischen Symptomen gibt, d.h. kutane Zyanose der Ohren, des Schwanzes und des Euters bei europäischen Schweinen, ist die vorherrschende Meinung die, daß die nordamerikanischen und europäischen Krankheiten durch dasselbe Virus verursacht werden, einem anspruchsvollen, nicht-hämagglutinierenden RNA-Virus mit Hülle, wie durch die Hinterlegung ATCC VR-2332 veranschaulicht.
    • Beispiel 1A - Weitere Charakterisierung des infektiösen Agens A. Materialien und Methoden 1. Zellen.
  • Crandell-Katzennieren (CRFK)-, Affennieren (MA- 104)-Zellen wurden bei 37ºC in geeigneten Zellkulturflaschen angezogen. Die CRFK- und MA-104-Zellen wurden vermehrt in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (erhältlich von Gibco Laboratories, Grand Island, NY), supplementiert mit 10 % gamma-bestrahltem fötalem Rinderserum (FBS) (erhältlich von JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 2,5 µg/ml Amphotericin B. MA-104-Zellen wurde in demselben mit 10 % FBS und 50 µg/ml Gentamicin supplementierten Medium vermehrt. Es wurde bestätigt, daß das FBS und die Zellen frei sind von Rindervirus-Diarrhoe-Virus (BVDV), wobei die kürzlich beschriebenen Verfahren von Mayer et al., Vet. Microbiol., 16, 303-314 (1988); Smithies et al., Proc. Annu. Meet. US. Animal Health Assoc., 73, 539-550 (1969); und Vickers et al., J.Vet. Diagn. Invest., 2, 300-302 (1990) verwendet wurden.
    • 2. Die Quelle der VR-2332-Isolate (SIRS-Virus).
  • Die Quelle und das Isolieren des SIRS-Virus für dieses Beispiel wird unten beschrieben. Das in dieser Studie verwendete Virus war in der fünften bis siebten Passage in MA-104-Zellen mit Titern von 10&sup5; bis 10&sup6; TCID&sub5;&sub0;/ml präsent.
    • Gnotobiotische Schweine.
  • Gnotobiotische Ferkel, die durch geschlossene Hysterotomie erhalten wurden, wurden in Wannen aus rostfreiem Stahl, die mit Isolatoren aus flexibler Folie beschichtet waren, wie kürzlich beschrieben von Miniatas O.P. et al., Can. J. Comp. Med., 42, 428-437 (1978), gehalten. Die Isolatoren wurden auf einer Umgebungstemperatur von 30ºC gehalten und den Schweinen wurden dreimal täglich empfohlene Mengen kommerziellen Milchersatzes gefüttert. Fäkalausstriche wurden vor der experimentellen Inokulierung und bei Nekropsie gesammelt und auf Schafsblutagar, Tergitol-sieben-Agar und Brilliantgrün-Agar unter aeroben und anaeroben Atmosphären inokuliert. Bei der Nekropsie gesammelte Fäkalien wurden auch auf Viren durch Negativkontrastelektronenmikroskopie untersucht, wie beschrieben von Richie et al., Arch. Gesante. Virus-forsche, oben.
    • Quelle des Inokulums.
  • Eine 160-Mutterschweine umfassende Herde aus Ferkeln bis hin zu adulten Tieren im westlichen Zentralminnesota erfuhr einen Ausbruch von MSD mit typischen MSD-Symptomen. Ein lebendes Mutterschwein, fünf neugeborene Ferkel und totgeborene Föten wurden dem Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory zur Untersuchung, einschließlich Gesamtsektion, Histopathologie und routinemäßiger mikrobiologischer Untersuchung, überstellt. Ein Inokulum wurde hergestellt zur experimentellen Verwendung mit verschiedenen Geweben von klinisch kranken neonatalen Schweinen. Genauer gesagt wurden zwei lebende und zwei tote sieben bis zehn Tage alte Ferkel, die während der Epizootie von der betroffenen Herde erhalten wurden, seziert und Proben für diagnostische Untersuchungen gesammelt. Die lebenden Ferkel wurden durch intravenöse Injektion einer Euthanasielösung vor der Sektion getötet. Ein 10 % Homogenat (MN89-35477) von Hirn, Lunge und Mandel, vereinigt von jedem Schwein, wurde unter Verwendung von Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), enthaltend 100 IU Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 5µg/ml Amphotericin B, hergestellt.
    • Experimentelle Übertragung.
  • Eine Serie aus 14 gnotobiotischen Ferkeln wurde im Alter von drei Tagen mit vereinigten Gewebehomogenaten gereizt. Jedes Ferkel wurde intranasal durch Verwendung eines an einem Glaszerstäuber befestigten Gummiballons infiziert, der vor den Nasenlöchern des Schweins plaziert war. Anfänglich wurden zwei gnotobiotische Ferkel mit je 0,5 ml des nicht-filtrierten Inokulums (MN89-35477) inokuliert, auf klinische Symptome der Krankheit hin überwacht und sieben Tage nach Exposition (PE) durch Stromschlag getötet.
  • Ein 10 % Homogenat (bezeichnet als MNSD-1) aus Lungengeweben, die aus den zuvor erwähnten gnotobiotischen Ferkeln vereinigt wurde, wurde blind passagiert indem jedes der drei gnotobiotischen Ferkel 0,5 ml des Homogenates ausgesetzt wurde, wobei ein Ferkel 0,5 ml ungefiltertes Homogenat, das zweite 0,45 µm- Filtrat und das letzte ein 0,22 µm-Filtrat erhielt. Die Ferkel wurden acht Tage nach Exposition getötet und Gewebe für die histologische Untersuchung, für die weitere Passage in gnotobiotische Ferkel und für die Virusisolierung gesammelt.
  • Eine 25 % Lungensuspension (MNSD90x76-L) und eine Zusammensetzung aus Hirn, Leber und Niere (MSD90x76-P) des mit 0,45 µm- Filtrat von MNSD-1 inokulierten Ferkels wurde unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthaltend je 0,5 mg/ml Kanamycin, Streptomycin und Vancomycin hergestellt. Sechs gnotobiotische Ferkel wurden mit Lungenhomogenat MNSD90x76-L inokuliert; vier Ferkel erhielten ein 0,45 µm-Filtrat und zwei wurde ein 0,1 um-Filtrat gegeben. Drei nicht-infizierte, gnotobiotische Kontrollferkel wurden inokuliert, ein Ferkel mit einem 0,45 µm-Filtrat von nicht-infiziertem Gewebehomogenat von gnotobiotischen Ferkeln in HBSS und zwei Ferkel mit HBSS alleine.
    • Virusisolierung.
  • Gewebehomogenate (MNSD90x76-L und MNSD90x76- P) wurden bei 1500 x g bei 4ºC für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde 1:1 mit minimalem essentiellem Medium (MEM), das 10 µg/ml Gentamicin enthält, verdünnt, mit einem Vortex-Mixer gründlich gemischt und erneut bei 4500 x g bei 4ºC für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und durch ein 0,45 µm Filter filtriert. Die Filtrate von Lunge und Gewebepoolhomogenaten wurden kombiniert und auf kontinuierliche MA-104-Zellinie inokuliert. Virusisolierung erfolgte in 75 cm² Flaschen mit zu 20 bis 40 % konfluenten Monolayern von MA-104-Zellen, die 50 ml MEM (pH 7,5) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) enthielten. Zellkulturen wurden bei 4ºC für sieben Tage gehalten. Wenn innerhalb von sieben Tagen keine cytopathische Wirkung (CPE) beobachtet wurde, wurden die Kulturen eingefroren, aufgetaut und auf MA-104-Zellen inokuliert und wie oben inkubiert.
    • Virustitration.
  • Virustitration wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen und flachem Boden vorgenommen. Serielle 10-fache Verdünnungen des Virus wurden in MEM mit 2 % FBS hergestellt. Nach drei Tagen wurde das Zellwachstumsmedium von den Mikrotiterplatten abgesaugt, 200 µml der Virusverdünnung in jeden von fünf Näpfen gegeben und die Platten bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; inkubiert. Nach drei Tagen wurde das Medium in Näpfen ohne CPE durch mit 2 % FBS (pH 7,5) supplementiertes MEM ersetzt und ein letztes Ablesen erfolgte am fünften Tag der Inkubation. Titer wurden nach der Methode von Reed et al., Am. J. Hyg., 27, 493-497 (1938) berechnet.
    • 3. Andere Viren.
  • Attenuierte Polioviren, erhältlich von Dr. Roger Koment, Department of Microbiology, University of South Dakota School of Medicine, Vermillion, SD, wurden auf MA-104- Zelllen bis zu einem Titer von 10&sup8; TCID&sub5;&sub0;/ml vermehrt und der Shope-Stamm des Pseudotollwut-Virus, erhältlich vom National Veterinary Services Laboratoy, Ames, IA, wurde auf CRFK-Zellen bis zu einem Titer von 10&sup5;&supmin;&sup7; TCID&sub5;&sub0;/ml angezogen. Diese Viren wurden als RNA- und DNA-Viruskontrollen in Studien verwendet, um den Nukleinsäuretyp des VR2322-Isolates des SIRS-Virus zu bestimmen.
    • 4. Herstellung von Antiserum gegen das VR-2332-Isolat.
  • Passage fünf des VR2322-Isolates des SIRS-Virus (Titer 10&sup6; TCID&sub5;&sub0;/ml) wurde mit 0,25 % Formalin inaktiviert, 1:1 mit unvollständigem Freunds-Adjuvans gemischt und 2 ml dieser Suspension wurden einem Kaninchen subcutan in zweiwöchigem Abstand für sechs Wochen injiziert. Das zwei Wochen nach der letzten Injektion hergestellte Antiserum wies einen Neutralisierungstiter von 1:512 auf.
    • 5. Virus-Neutralisationstest (VNT).
  • MA-104-Zellen wurden für den VNT in Mikrotiterplatten mit flachem Boden und 96 Näpfen eingesät. Serielle Zweifachverdünnungen eines jeden Serums (100 µl) wurden in MEM-Verdünnungsmittel hergestellt und mit einem gleichen Volumen (100 µl) von Isolat VR-2332 gemischt, das 100-300 TCID&sub5;&sub0;/100 µl enthielt. Jede Mischung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert und 200 µl einer jeden Serum- Virus-Mischung wurden zu drei Näpfen zugegeben. Mikrotiterplatten wurden für weitere drei Tage bei 37ºC inkubiert, mittels Lichtmikroskopie auf cytopathische Wirkungen (CPE) untersucht und der Endpunkttiter ausgedrückt als die höchsten Serumverdünnung, die CPE neutralisierte.
  • Die folgenden polyklonalen Antiseren wurden, sofern nicht anders vermerkt, hergestellt, wie für das VR-2332-Isolat beschrieben (mit der Ausnahme, daß die Viren nicht inaktiviert wurden) und im VNT verwendet: Der Stamm Miller von übertragbarer Gastroenteritis, Schweine-Rotavirus Serotyp 4 (Gottfried); Schweine-Rotavirus Serotyp 5 (OSU); Schweine-Reovirus Serotyp 1; Schweine-Enterovirus Serotypen 1 bis 8, erhältlich von National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA; monoklonaler Antikörper gegen Schweine-Parvovirus, erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, MD; Encephalomyelocarditis-Virus, erhältlich von Dr. W. Christianson, Department of Clinical and Population Sciences, University of Minnesota, St. Paul, MN; Pseudotollwut-Virus, erhältlich von National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA; Ost-, West- und venezuelanisches Pferde-Encephalitis-Virus; monoklonaler Antikörper D89 gegen BVDV, beschrieben von Mayer et al., Vet. Microbiol., 16, 303-314 (1988); Pferde-Arteritis-Virus, erhältlich von National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA; Rubella; und Lactatdehydrogenase-Virus, erhältlich von Dr. W. Cafruny, Department of Microbiology, University of South Dakota School of Medicine, Vermillion, SD.
    • 6. Direkte Elektronenmikroskodie (DEM).
  • Cäsiumchlorid-Gradientenfraktionen wurden mittels DEM auf Viruspartikel untersucht, wie vor kurzem beschrieben durch Benfield et al., J.Clin. Microbiol., 16, 186-190 (1982); Horzinek, "Non-arthropod-borne Togaviruses" (Acad. Press, London, 1981); und Richie et al., Arch. Gesante. Virus-forsche, s.o., und auf einem Elektronenmikroskop (Hitachi HU12A, Hitachi, Tokoy, Japan) bei einem Potential von 75 kV untersucht.
    • 7. Immunelektronenmikroskodie (IEM).
  • Immun-Gold-Markierung wurde vorgenommen unter Verwendung von kolbidalen Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Goldpartikeln (5 nm). Kurz gesagt wurde das Virus bei 40.000 x g für 30 Minuten bei 4ºC konzentriert, das Pellet in 50 µl destilliertem Wasser resuspendiert und 25 µl wurden auf ein Stück Parafilm gegeben. Man ließ ein Collodium- Kohlenstoff-beschichtetes Netz auf dem Virustropfen für 15 Minuten flotieren, trocknete dies mit Filterpapier und plazierte darauf einen 25 µl Tropfen Kaninchen-anti-SIRS-Serum für zwei Minuten. Die Netze wurden mit zweimaligem Wechsel von 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Tris-Puffer für jeweils fünf Minuten gewaschen und für 15 Minuten auf einem Tropfen Goldmarkierten anti-Kaninchen-IgG flotiert. Nach sechsmaligem Waschen in BSA-Tris-Puffer für jeweils zwei Minuten und zweimaligem Waschen in destilliertem Wasser wurden die Netze negativ gefärbt und, wie für DEM beschrieben, untersucht.
    • 8. Hämagglutinationstest (HAT).
  • Die Fähigkeit des VR-2332-Isolats, Schaf-, Ziegen-, Schweine-, Rinder-, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen-, menschliche Gruppe "0"-, Enten- und Kücken-Erythrocyten zu hämagglutinieren, wurde unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Zweifachverdünnungen der fünften bis siebten Passage des VR-2332-Isolates des SIRS- Virus wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2- 7,4) in Mikrotiterplatten mit U-Boden hergestellt. Gleiche Volumina einer 1 % Suspension gewaschener Erythrocyten von jeder der obigen Spezies wurde zu jeder Virusverdünnung zugegeben, bei 4º, 22ºC oder 37ºC inkubiert und nach ein bis zwei Stunden abgelesen, wenn die Erythrocytenkontrollen (kein Virus enthaltend) sich zu einem Haufen auf dem Boden des Napfes abgesetzt hatten.
    • 9. Immunfluoreszenz (ImF).
  • Indirektes oder direktes ImF-Färben von Isolat VR-2332-infizierten und nicht infizierten MA-104- Zellen erfolgte unter Verwendung der durch VNT getesteten polyklonalen oder monoklonalen Antikörper. Schweineinfluenza, erhältlich von National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA (Typ A, H1N1) und polyklonales Schweinepestvirus-Antiserum, erhältlich von National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA, wurden auch verwendet. Abgeschabtes von dem Zellmonolayer wurde 72 Stunden PI mit einer sterilen Inokulierungsschleife entfernt, ImF-Färbung, wie kürzlich beschrieben von Benfield et al., J. Clin. Microbiol., s.o.. Positive Kontrollobjektträger wurden entweder mit konvaleszentem Antiserum von einem Mutterschwein (VNT-Titer 1:256) oder einem monoklonalen Antikörper (SDOW 12 oder SDOW 17, hierin beschrieben) gegen das VR-2332-Isolat des SIRS-Virus gefärbt.
    • 10. Filtrationsstudien, um die Größe des Isolates VR-2332 zu schätzen.
  • Geklärte Überstände infizierter Zellkulturen wurden durch 0,45 µm- (Schleicher und Schnell, Keene, NH), 0,20 µm- (Schleicher und Schnell, Keene, NH), 0,10 um- (Millipore Products Div., Bedford, MA) und 0,05 µm- (Millipore Products Div., Bedford, MA) Filter filtriert. Der Infektiositätstiter vor und nach Filtration wurde bestimmt unter Verwendung eines Mikrotitertests und einem kürzlich beschriebenen Verfahren von Cottral, Manual of Standardized Methods for Veterinary Microbiology, pp. 81-82 (Cornell Univ. Press, Ithaca, NY, 1978). Eine 100-fache Verringerung des Infektiositätstiters wurde als signifikant erachtet.
    • 11. Gradientenreinigung von Isolat VR-2332.
  • Das VR-2332-Isolat des SIRS-Virus von geklärtem Kulturüberstand wurde durch Zentrifugation (Beckman SW 41 Ti-Rotor) bei 200.000 x g bei 4ºC für 16 Stunden durch einen diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten, der aus 2 mm 20, 30, 40, 50 und 65 % Saccharose (Gew./Vol.) bestand, in TNC-Puffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl und 2 mM CaCl, pH 7,8) konzentriert. Kulturüberstände wurden auch mit 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) extrahiert, durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g bei 4ºC für eine Stunde konzentriert und auf Cäsiumchlorid- Dichtegradienten (1,20 g/ml) gereinigt, wie für die Saccharose-Gradienten beschrieben. Fraktionen von jedem Gradienten wurden von der Spitze geerntet, der Brechungsindex unter Verwendung eines Refraktometers bestimmt und ausgewählte Fraktionen in Hank's Balanced Salt Solution für die Virustitration, wie oben beschrieben, verdünnt.
    • 12. Chloroform- und Fluorkohlenwasserstoff-Inaktivierung.
  • Gleiche Volumina von SIRS-Virus (VR-2332) und Chloroform wurden periodisch für 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und dann bei 500 x g bei 4ºC für 15 Minuten zentrifugiert. In ähnlicher Weise wurden gleich Volumina von 1,1,2-Trichlortrifluorethan und SIRS-Virus auf einem Vortex für fünf Minuten gemischt und wie für das Chloroform-behandelte Virus beschrieben zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde die wässrige Phase jeder behandelten Probe geerntet, verdünnt und ein Mikrotitertest verwendet, um die verbleibende Virusinfektiosität zu bestimmen. Eine 100-fache Verringerung des Titers von behandeltem verglichen mit unbehandeltem Virus wurde als signifikant erachtet.
    • 13. Wirkungen von DNA-Virus-Inhibitoren auf Isolat VR-2332.
  • Die Verbindungen 5-Brom-2-deoxyuridin (BUDR) und Mitomycin C sind bekannte Inhibitoren für die Replikation von DNA-Viren, inhibieren aber nicht RNA-Viren mit Ausnahme der Retroviridae (Easternbrook, Virology, 19, 509-520 (1962); und Reich et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 47, 1212-1217 (1961).
  • Pseudotollwut- und Polioviren wurden als die bekannten DNA- und RNA-Viruskontrollen in diesem Experiment verwendet. Zellen (CRFK oder MA-104) wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen eingesät und je zwei Näpfe wurden mit 100 µl 10-facher Verdünnungen von Pseudotollwut-Virus, Poliovirus bzw. SIRS- Virus inokuliert. Nach einer einstündigen Absorptionsphase bei 37ºC wurde unabsorbiertes Virus enthaltendes Medium entfernt und durch entweder MEM (unbehandelte Viruskontrollen); MEM, supplementiert mit 40 oder 150 µg/ml BUDR; oder MEM, enthaltend 2, 10 oder 20 µg/ml Mitomycin C, ersetzt. Mikrotiterplatten wurden bei 37ºC für weitere vier Tage bei 37ºC inkubiert, mittels Lichtmikroskopie auf CPE untersucht und der Virustiter wie kürzlich von Cottral, s.o. (1978), beschrieben, berechnet. Eine 1000-fache Verringerung des Virusinfektiositätstiters verglichen mit der unbehandelten Kontrolle wurde als signifikant betrachtet.
    • 14. Temperaturstabilität von SIRS-Virus.
  • Ein 2 ml-Aliquot Virus in MEM wurde entweder bei 4ºC oder in Wasserbädern bei 37ºC und 56ºC für mindestens fünf Tage inkubiert. Aliquots aus jedem Reagenzglas bei den drei verschiedenen Temperaturen wurden nach 15, 30, 60 und 120 Minuten und dann in 12 Stunden- Intervallen von 12 bis 120 Stunden gesammelt. Virusproben wurden 10-fach in MEM verdünnt und Virustiter berechnet, wie oben beschrieben.
    • B. Ergebnisse 1. Cytopathische Wirkung von Isolat VR-2332 auf MA-104-Zellen.
  • Die CPE begann als kleine, abgerundete Zellklumpen, die über den Rest des nicht infizierten Monolayers erhoben zu sein schienen (Fig. 1B). Die Anzahl abgerundeter Zellen erhöhte sich und viele Zellen wurden pyknotisch und lösten sich vom Monolayer innerhalb von zwei bis vier Tagen PI. Fünf bis sechs Tage PI war CPE in 100 % des Monolayers offensichtlich. Infek tiositätstiter schwankten von 10&sup5; bis 10&sup7; TCID&sub5;&sub0;/1 ml bei der fünften bzw. siebten seriellen Viruspassage. Keine CPE wurde in nicht inokulierten MA-104-Zellen beobachtet (Fig. 1A).
  • Fluoreszenz wurde nicht in nicht inokulierten MA-104-Zellen beobachtet (Fig. 2A). Fig. 28 zeigt die intensive, diffuse Fluoreszenz, die im Cytoplasma von inokulierten MA-104-Zellen beobachtet wurde, die entweder mit Serum eines konvaleszierenden Mutterschweines, Kaninchen-Antiserum oder monoklonalem Antikörper (hergestellt gegen VR-2332-Isolat von SIRS) gefärbt waren.
    • 2. Wirkungen von Fettlösungsmitteln auf die Infektiosität von SIRS-Virus (Isolat VR-2332).
  • Vorbehandlung des Virus mit Chloroform eliminierte die Infektiosität (Titer verringerte sich von 10&sup5; auf < 10¹ TCID&sub5;&sub0;/1 ml), wohingegen Fluorkohlenwasserstoff-Behandlung keine signifikante Wirkung hatte.
    • 3. Hämagglutination.
  • Das Virus hämagglutinierte Erythrocyten von 11 verschiedenen Spezies nicht, unabhängig von der Inkubationstemperatur.
    • 4. Abschätzung der Größe des SIRS-Virus durch Filtration.
  • Virustiter blieben unverändert nach Filtration durch 0,45, 0,20 und 010 µm-Filter. Jedoch wurden Infektiositätstiter 1000-fach reduziert (10&sup5; zu 10² TCID&sub5;&sub0;/1 ml) nach Passage durch ein 0,05 µm (50 nm)-Filter.
    • 5. Wirkungen von DNA-Inhibitoren auf die Redlikation des SIRS- Virus.
  • Nur die Infektiosität des DNA-Virus, Pseudotollwut, wurde entweder durch BUDR oder Mitomycin C verringert. Die Replikation von Poliovirus (RNA-Kontrolle) und Isolat VR-2332 war nicht betroffen, was anzeigt, daß das Genom des SIRS-Virus wahrscheinlich RNA war (Tabellen 1 und 2).
    • 6. Virusreinigung.
  • Virusbanden wurden auf Saccharose-Gradienten nicht nachgewiesen und Spitzenvirustiter (10&sup4; TCID&sub5;&sub0;/1 ml) wurden von Fraktionen mit einer Auftriebsdichte von 1,18 bis 1,23 g/ml wiedergewonnen. Dieser Spitzenvirustiter war 1000- fach geringer als der Infektiositätstiter (10&sup7; TCID&sub5;&sub0;/ml) der Virussuspension vor der Reinigung. Cäsiumchlorid-Gradienten ergaben eine einzelne, schwache, opaleszierende Bande bei einer Auftriebsdichte von 1,18 bis 1,19 g/ml. Spitzenvirusinfektiosität von 1,3 x 10&sup6; TCID&sub5;&sub0;/1 ml, die 130-fach höher als die Spitzeninfektiosität von dem Saccharose-Gradienten war, entsprach dieser sichtbaren Bande (Fig. 3).
    • 7. DEM von gereinigten SIRS-Virusnartikeln.
  • Pleomorphe, aber vorherrschend sphärische Virionen wurden durch DEM in den CsCl-Fraktionen (1,18 bis 1,19 g/ml) beobachtet. Die Virionen wiesen einen Durchmesser von 48 bis 80 nm (Mittel aus 25 Partikeln = 62 nm) auf und bestanden aus vollständigen, elektronendurchlässigen oder leeren (elektronendichtes Zentrum) Partikeln, die von einer dünnen Membran oder Hülle umgeben waren (Fig. 4A). [Ein isosahedrisches Nucleocapsid mit kurzen Oberflächenfortsätzen von etwa 5 nm Länge und einem Durchmesser von 40 bis 45 nm wurde beobachtet.] Diese Partikel enthielten Kerne, die einen Durchmesser von 25 bis 35 nm aufwiesen (Fig. 4B). Virionen wurden Immuno-Gold-markiert, wenn das Kaninchen- Hyperimmun-Antiserum und Gold-markiertes anti-Kaninchen-IgG als primäre und sekundäre Antikörper verwendet wurden (Fig. 4B). Virionen wurden nicht mit Gold markiert bei Abwesenheit des Kaninchen-Hyperimmun-Antiserums gegen Isolat VR-2332.
    • 8. Antigenische Beziehung von SIRS-Virus zu Antiseren von anderen Viren.
  • Antiseren gegen bekannte Schweine-Viren und verschiedene Togaviren neutralisierten nicht oder reagierten nicht mit SIRS-Virus-Antigen in infizierten MA-104-Zellen. Konvaleszierende Mutterschweine und Hyperimmun-Kaninchen-Antiseren wiesen neutralisierende Antikörpertiter von 1:256 bzw. 1:512 auf.
    • 9. Wirkungen von Temperatur auf die Infektiosität des SIRS- Virus.
  • Die Virusinfektiosität für MA-104-Zellen wurde nach Inkubation für 12 Stunden bei 37ºC um 50 % verringert und nach 48-stündiger Inkubation bei 37ºC und 45-minütiger Inkubation bei 56ºC Inkubation vollständig inaktiviert (Fig. 5). Die Infektiosität blieb unverändert nach einmonatiger Inkubation bei 4ºC oder vier Monaten bei -70ºC (Daten nicht gezeigt). Lungengewebe, das von gnotobiotischen mit SIRS-Virus infizierten Schweinen gesammelt und in Hank's Balanced Salt Solution homogenisiert wurde, behält Infektiosität für Schweine für mindestens 18 Monate bei.
  • Die Ergebnisse zeigen an, daß Isolat VR-2332 ein anspruchsvolles, nicht-hämagglutinierendes RNA-Virus mit Hülle ist, das vorläufig als ein nicht-Arthropoden-getragenes Togavirus klassifiziert werden kann, das zu einer unbekannten Gattung gehört.
  • Das Vorhandensein eines RNA-Genoms des SIRS-Virus wurde bestätigt durch die Fähigkeit dieses Virus, in Gegenwart von 5- Brom-2-deoxyuridin und Mitomoycin C weiterhin zu replizieren, die bekannt dafür sind, die Replikation von DNA und einer Familie von RNA-Viren (Retroviridae) zu inhibieren (Easterbrook, 5.0. (1962); und Reich et al., 5.0. (1961)), aber keine anderen RNA-Viren. Unsere vorläufige Klassifikation des SIRS-Virus als ein RNA-Virus stimmt mit der Beobachtung überein, daß dieses Virus im Cytoplasma der Zelle repliziert, wie durch die durch ImF nachgewiesene Anwesenheit von Virusantigenen, angezeigt wurde.
  • Das VR-2332-Isolat des SIRS-Virus ist hitzelabil, aber vergleichsweise stabil für längere Zeiträume bei 40 und -70ºC. Die Thermolabilität dieses Virus bei 37ºC hat praktische Anwendungen für die Vermehrung des Virus und legt nahe, daß Wachstum bei Temperaturen von weniger als 37ºC höhere Virusausbeuten ergeben wird. Kühlung ist ausreichend für die Konservierung von Diagnoseproben für die Virusisolierung für kurze Zeiträume, ansonsten kann die Probe für mehrere Monate oder länger eingefroren werden.
    • BEISPIEL2
  • Die reinste Form eines Inokulums mit dem infektiösen MSD- Agens, wie aus den Experimenten in Beispiel 1 bestimmt, kann verwendet werden, um das MSD-Agens auf trächtige Mutterschweine zu übertragen, um die reproduktive Form des Krankheitssyndroms zu reproduzieren.
    • Diskussion.
  • Vor kurzem wurde vorübergehende Anorexie und vorzeitiges Ferkeln (beides hervorstechende klinische Symptome von MSD auf diesem Gebiet) in 2/2 Mutterschweinen induziert, die mit demselben MSD-Inokulum inokuliert waren, das respiratorische Läsionen in gnotobiotischen Schweinen erzeugte. Zusätzlich waren 15/29 (52 %) der Schweine totgeboren und die restlichen 14 Schweine waren schwach und saugten nicht gut. Keine großen oder mikroskopischen Läsionen wurden in den totgeborenen Schweinen oder der Plazenta beobachtet und Isolierungsverfahren, um mikrobielle Agenzien nachzuweisen, werden derzeit vorgenommen. Folglich testet das unten beschriebene Experiment, ob die reproduktive Form von MSD mittels intranasaler Inokulation auf Schweine übertragen werden kann, und ob eine Störung der fötalen Lebensfähigkeit aus Replikation in Geweben der Mutter, aber nicht in den Föten, resultiert.
  • Die Experimente in Beispiel 1 liefern Informationen darüber, wie das Inokulum behandelt werden kann (Filtergröße, organische Lösungsmittelextraktion und/oder Proteaseverdauung), um die reinste Form des MSD-Agens für ein Inokulum (d.h. virales Agens) zu liefern. Da das MSD-Agens sowohl eine respiratorische Form in jungen Schweinen als auch eine reproduktive Form in erwachsenen Schweinen aufweist, ist es notwendig, die letztgenannte Form des Syndroms zu reproduzieren, um weiter zu verifizieren, daß das infektiöse Agens die mutmaßliche Ursache von MSD ist.
  • Ein 93 Tage trächtiges Mutterschwein wird als das Versuchstier verwendet, da es möglich ist, experimentell einen Abort bei diesen mit dem infektiösen MSD-Agens inokulierten Tieren zu induzieren. Mutterschweine können von einer kommerziellen Herde gekauft werden, die frei von laufenden reproduktiven Problemen und MSD ist. Vollständige epidemiologische Aufzeichnungen von dieser Herde können computerisiert werden und Informationen betreffend Trächtigkeitszeiten, Wurfgröße und durchschnittliche Anzahl von Totgeburten können für Vergleichsstudien verfügbar gemacht werden. Gruppen von jeweils drei Mutterschweinen können intranasal nach 93-tägiger Trächtigkeit mit entweder dem 0,20 µm-Filtrat (Positivkontrollen), einem pathogenen, aber modifizierten Inokulum, wie vorgeschrieben durch die Ergebnisse aus Beispiel 1, einem 0,20 µm-Filtrat des Kontrollinokulums (Negativkontrolle) und einem Kontrollinokulum, das modifiziert ist, wie angezeigt durch die Ergebnisse der Experimente in Beispiel 1, inokuliert werden. Jede Gruppe von Mutterschweinen kann in getrennen Isolationsräumen untergebracht werden und täglich bis zum Ende der Trächtigkeit untersucht werden. Temperaturen und klinische Symptome (Anorexie, Atemprobleme wie beispielsweise Husten, Niesen, Schnauben und verstärkte Respiration) können täglich notiert werden. Das Beproben der Mutterschweine kann beschränkt sein auf Blutproben für die Serologie vor und nach dem Ferkeln. Das tatsächliche Datum des Ferkelns kann notiert und die Anzahl totgeborener, mumifizierter Föten, lebender "schwacher" Schweine und lebender "normaler" Schweine bestimmt werden. Föten können auf große und mikroskopische Läsionen, wie in Beispiel 1 beschrieben, untersucht werden und fötale Gewebe für mikrobiologische Tests, wie beschrieben in Beispiel 3, verarbeitet werden. Die fötalen Seren können auch auf die Anwesenheit von Gamma-Globulinen oder Antikörpern gegen PPV und EMCV (Joo et al., In Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting. 62- 66, (1990); und Kim et al., J. Vet. Diagn. Invest 1, 101-4 (1990)) getestet werden. Lebendgeborene Schweine können für eine Woche beobachtet und Morbidität und Mortalität aufgezeichnet werden, wonach diese Schweine getötet und die Gewebe gesammelt werden können für lichtmikroskopische und mikrobiologische Untersuchungen, wie für die Föten beschreiben.
  • Das 0,2 µm-und die modifizierten Filtrate des MSD-Inokulums sind pathogen für Mutterschweine und induzieren Anorexie, möglicherweise ein mildes Fieber und vorzeitiges Ferkeln mit einer großen Anzahl totgeborener und schwacher Schweine in jedem Wurf. Dies veranschaulicht den Beweis, daß das Inokulum das MSD-Agens enthält. Mutterschweine, die mit dem Kontrollinokulum inokuliert wurden, ferkeln nahe der Zeit und haben Wurfgrößen innerhalb des für die Ursprungsherde normalen Bereiches, wie aus der verfügbaren epidemiologischen Datenbank dieser Herde bestimmt. Es werden keine Läsionen in den totgeborenen Schweinen gefunden und man beobachtet eine hohe Mortahtätsrate unter den überlebenden schwachen Schweinen innerhalb einer Woche nach der Geburt.
    • BEISPIEL 3
  • Gewebeproben, die von gnotobiotischen Ferkeln gesammelt wurden, die mit dem MSD-Inokulum inokuliert und zu verschiedenen Zeiten nach Inokulation getötet wurden, können verwendet werden, um das infektiöse MSD-Agens zu isolieren und zu identifizieren und die sequenzielle Entwicklung von Läsionen zu bestimmen und zu ermitteln, ob das MSD-Agens immunsuppressiv ist.
    • Immunfluoreszenztests an gefrorenen Geweben und inokulierten Zellkulturen.
  • Immunfluoreszenztests an gefrorenen Geweben und Zellabschabungen können vorgenommen werden, wie kürzlich beschrieben in Benfield et al., J. Clin. Microbiol., 16, 186-190 (1982) und Benfield et al., Am. J. Vet. Res., 49, 330-36 (1988). Die gefrorenen Gewebe und Zellabschabungen können auf PPV, EMCV (siehe Beispiel 4 für Definition von Akronymen) und MSD-Agens/MSD-Agenzien gescreent werden. Konjugate für PPV und EMCV sind erhältlich am South Dakota Animal Disease Research and Diagnotic Laboratory. Ein Hyperimmun-Serum in gnotobiotischen Schweinen kann von der reinsten Form des MSD-Inokulums hergestellt werden. Zwei Schweine können intranasal inokuliert und diesen dann eine subkutane Auffrischung des MSD-Inokulums in unvollständigem Freunds-Adjuvans zwei und vier Wochen nach der anfänglichen Inokulierung gegeben werden. Serum kann von diesem Schwein zwei Wochen nach der letzten Auffrischung geerntet werden. Ein Kontrollserum wird ebenfalls in zwei gnotobiotischen Schweinen unter Verwendung des Kontrollinokulums und desselben Immunisierungsprotokolls, wie für das MSD-Inokulum beschrieben, hergestellt werden. Diese Seren können als Primärantikörper und Ziegen- oder Kaninchen-anti-Schwein-Immunglobulin, konjugiert mit Fluoreszein-Isothiocyanat als Sekundärantikörper, verwendet werden, um MSD-Antigene in gefrorenen Gewebeschnitten und Zellkulturen nachzuweisen.
    • Serologische Tests.
  • Seren, die von Kontroll- und inokulierten Schweinen gesammelt wurden, können auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Antikörpern gegen PPV und SIV (Hämagglutination-Inhibition), Ledtosdira (Mikro-Agglutination) und EMCV (virale Neutralisation) (siehe Beispiel 4 bezüglich der Definition von Akronymen) getestet werden. Frühere Ergebnisse zeigten an, daß Serologie zu anderen herkömmlichen mikrobiellen Agenzien negativ war (Collins et al., 71st Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Disease, Abstract No. 2 (1990)).
    • Immunologische Tests.
  • Gewebe und Blut können von mit MSD inokulierten und Kontrollschweinen gesammelt werden, so daß deren immunologischer Status bestimmt werden kann. Schweineleukozyten können aus peripherem Blut durch Einschritt-Gradientenflotation mit diskontinuierlichem Gradienten auf Histopaque 1077 isoliert werden, wie von Pescovitz et al., J. Immunol., 134, 37-44 (1985) gelehrt. Zellen aus Lymphknoten, Milz und Thymus können in Einzelzellen durch mäßiges Zerkleinern der Gewebe aufgetrennt und Sammeln der resultierenden Zellsuspensionen aufgespalten werden. (Hurley et al., Cancer Res., 47, 3729-35 (1987)).
  • Die Phänotypen von Schweineleukozyten können bestimmt werden durch Verwendung einer Tafel mit monoklonalen Antikörpern, die von der American Type Culture Collection und Joan Lunney (USDA Beltsville, MD) erhältlich sind. Diese schließen ein Antikörper für die Bestimmung der gesamten T-Zellen, pCD2 (MSA4; Hammersberg et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 11, 107-21 (1986), Helfer-/Klasse II MHC-abhängige T-Zellen, pCD4 (74-12- 4; Lunney et al., Vet. Immunol. Immunodathol., 17, 135-144 (1987), cytotoxische Suppressor-/Klasse I MHC-abhängige T-Zellen, pCD8 (74-2-1; aaO), Macrophagen und Granulocyten (74-22- 15A; aaO), Thymocyten und periphere B-Zellen, pCD1 (76-7-4; aaO), und MHC Klasse II-Antigene vom Schwein, äquivalent dem menschlichen DRw (MSA3; Hammerberg et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 11, 107-21 (1986)) und DQw (TH21A und andere (VRMD, Pullman, WA; Davis et al., Hybridoma Technology in Agriculture and Veterinary Research, Rowman and Allanheld, 121-50 (1984)). Isotyp-spezifische monoklonale Antikörper gegen Schweine-Immunglobuline sind ebenfalls erhältlich (Paul et al., J. Vet. Res., 50, 471-79 (1989)) und können verwendet werden bei zweifacher minimaler Sättigungskonzentration für indirektes Fluoreszenzfärben von Leukozyten aus peripheren Blut, Lymphknoten und Peyersche Platten (Hurley et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 25, 177-93 (1990)). Um eine Zweifarbenanalyse zu erhalten, können Zellen auch mit RPE-markiertem Avidin gefärbt werden, nachdem sie mit Biotin-gebundenen (Pierce Kit #21333) Antikörpern markiert worden sind. Die Zellen können mittels Flußzytometrie oder einem analytischen Zweifarben-Fluoreszenzmikroskop (PTI FSCAN-System) analysiert werden. Ein Ko-Nachweis in der 488 nm Laserlinie auf dem Flußzytometer oder Verwendung des dualen analytischen Fluoreszenzmikroskops kann leicht erreicht werden. Die Intensität der zellulären Fluoreszenz und der Prozentsatz positiver Zellen kann auch bestimmt werden.
  • Funktionelle in vitro-Tests wie beispielsweise Lectin-Mitogenese mit Concanavalin A, Pokeweed-Mitogen (PWM), und Phytohämagglutinin (PHA) können vorgenommen werden, wie beschrieben in Hammerberg et al., Am. J. Vet. Res., 50, 868-74 (1989). Antigen-spezifische in vitro-T-Zell-Antworten auf Lysozym können auch nach ihrer Technik modelliert werden. Proliferative B- Zell-Tests können mit E. coli- und S. typhimurium-LPS oder anti-Immunglobulin vorgenommen werden, wie berichtet in Symons et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 54, 67-77 (1977). In vitro-Antikörperproduktion, induziert mit PWM, kann erreicht und quantifiziert werden, wie beschrieben in Hammerberg et al., Am. J. Vet. Res., 50, 868-74 (1989). Macrophagenproduktion von IL-1 nach 48-stündiger Exposition gegen E. coli-LPS kann im Maus-Thymocyten-Test gemessen werden (Mizel, Immunological Rev., 63, 51-72 (1982)). IL-2-Produktion durch PHA-stimulierte Lymphozyten kann gemessen werden, wie beschrieben von Stott et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 13, 31-38 (1986). Ein isotypenspezifischer anti-Lysozym-ELISA kann unter Verwendung der monoklonalen Antikörper gegen Schweine-Immunglobulin- Isotypen vorgenommen werden (Paul et al., Am. J. Vet. Res., 50, 471-79 (1989)).
  • Um die in vivo-Antikörperproduktion zu bewerten, kann drei mit MSD inokulierten Ferkeln und drei mit Kontrollinokulum inokulierten Ferkeln eine 2 % Suspension von Schaferythrozyten und eine 10 µg/ml Rinderserumalbuminlösung an verschiedenen Stellen 5, 7, 10, 14 und 24 Tage nach ihrer anfänglichen Inokulation injiziert werden. Die Schweine werden 24 Tage nach der anfänglichen Inokulation getötet, Gewebe für die Histopathologie gesammelt, wie in Beipiel 1 beschrieben, und Blut gesammelt, um auf Antikörper zu testen. Der gesamte Antikörpertiter und die spezifischen IgG- und IgM-Antworten auf jedes Antigen können durch Antigen-spezifische Radialimmundiffusion oder ELISA bestimmt werden. Antigenspezifische Plaque-Tests können an Milzzellen vorgenommen werden, um die Frequenz von B-Zellclonen in den infizierten Tieren und den Kontrolltieren zu bewerten (Kappler, J. Immunol., 112, 1271-85 (1974)).
    • BEISPIEL 4 Ziel.
  • Das Ziel dieses Experimentes besteht darin, Hyperimmun- Antiserum in einem gnotobiotischen Schwein gegen ein Isolat von MSD herzustellen zur Verwendung als ein diagnostisches Reagenz und zur weiteren Charakterisierung der antigenen Eigenschaften von MSD.
    • Hintergrund.
  • Früher durchgeführte Studien an gnotobiotischen Schweinen an der South Dakota State University in Zusammenarbeit mit der University of Minnesota zeigten an, daß vereinigte Gewebehomogenate vom Freilandfall MN 89-35477 Lungenläsionen in gnotobiotischen Schweinen induzierten. Vereinigte Gewebehomogenate von diesen Schweinen sind nachfolgend verwendet worden, um klinische Erkrankung und respiratorische Läsionen herzustellen, die charakteristisch für MSD in drei Tage alten gnotobiotischen Schweinen sind (Collins et al., 71st Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Disease, Abstract No. 2 (1990) und Collins et al., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, Abstract, 254-55 (1990)). Lungen- und Gewebehomogenate wurden von dieser zweiten Passage der ursprünglichen Inokula in gnotobiotischen Schweinen (90 X 75) hergestellt, um ein zweites Inokulum herzustellen. Die zweiten Inokula können als Inokula und Antigen verwendet werden, um das Hyperimmun-Serum in diesem Experiment herzustellen.
    • Vorgehensweise, um dieses Ziel zu erreichen. Gnotobiotische Schweine.
  • Gnotobiotische Schweine können gewonnen und gehalten werden, wie kürzlich beschrieben in Benfield et al., Am. J. Vet. Res., 49, 330-36 (1988) und Collins et al., Am. J. Vet. Res., 50. 827-835 (1989).
    • Inokulierung von Hyperimmun-Serum.
  • Hyperimmun-Serum kann durch anfängliches Inokulieren eines gnotobiotischen Schweines, wie oben beschrieben, hergestellt werden. Den Schweinen kann dann eine Auffrischung bestehend aus 1 ml der zweiten Inokula und 1 ml unvollständigem Freunds-Adjuvans 14 und 21 Tage nach der anfänglichen Inokulation gegeben werden (Harlow and Lane, 1988). Das Schwein soll dann 14 Tage oder später nach der letzten Inokulation getötet und ausgeblutet werden. Die Seren sollten geerntet und in geeignete Aliquots aufgeteilt und bei -20ºC eingefroren werden.
    • Serologie.
  • Das Hyperimmun-Serum kann auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen gewöhnliche Schweinepathogene getestet werden, wie dies gewöhnlich in den meisten diagnostischen Laboratorien gemacht wird. Diese Seren können auf Antikörper gegen Hemophilus, Bruzellose, Leptospira (6 Serovaritäten), Pseudotollwut (PRV), Parvovirus (PPV), Encephalomyocarditis-Virus (EMC) und Schweineinfluenza-Virus (SI) getestet werden.
    • Ergebnisse.
  • Das für die Herstellung des Antiserums verwendete Schwein war Schwein #4B (Experiment-Nr. 90 X 238). Das Schwein wurde am 1.11.90 inokuliert und täglich auf klinische Symptome hin beobachtet, bis es am 29.11.90 getötet wurde. Die klinischen Symptome sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Unglücklicherweise machte der fortwährend schlechte Zustand des Schweines es erforderlich, daß es nach nur einer am 13.11.90 erfolgten Auffrischung getötet wurde. Das Tier wurde 16 Tage nach der anfänglichen Auffrischung am 29.11.90 getötet.
  • Die serologischen Ergebnisse waren negativ für alle obigen Agenzien mit Ausnahme von PPV, welches einen Titer von 16.384 (siehe Tabelle 2) aufwies. Ein vortitriertes Serum von diesem Schwein wurde nicht betrieben.
  • Proben von Lunge, Herz, Hirn, Niere, Colon, Dünndarm, Nasenmuscheln, Milz, Magen und Trachea wurden gesammelt, als das Schwein seziert wurde. Diese Proben wurden evaluiert und es wurde festgestellt, daß die Lungen von diesem Schwein Lasionen von einer schweren Pneumonie, typisch den in Freilandfällen von MSD gesehenen, aufwies.
  • Die Ergebnisse dieses Experimentes bestätigen anfängliche Studien, daß ein infektiöses Agens im zweiten Inokulum vorhanden ist, da es eine klinische Erkrankung und Läsionen induzieren kann, die typisch denjenigen in natürlichen Fällen von MSD beobachteten sind. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 2 Antikörpertests inokulierter Ferkel
    • BEISPIEL 4A - HERSTELLEN VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN Immunisierung von Mäusen.
  • Acht Wochen vor dem Zeitpunkt der Hybridomfusion sind BALB/c AnN-Mäuse IP mit einer 1:1 Suspension von Antigen in vollständigem Freunds-Adjuvans (CFA) zu inokulieren. Die Menge des verwendeten Antigens hängt von der Immunogenizität und Toxizität des Antigens ab. Ein Maximum von 0,3 ml CFA pro Maus ist zu verwenden. Fünf Wochen nach der anfänglichen Immunisierung sind die Mäuse mit Antigen in CFA aufzufrischen. Eine Woche vor der Fusion sind die Mäuse I.P. mit Antigen in physiologischer Kochsalzlösung zu immunisieren. Zwei Tage vor der Fusion sind die Mäuse IV mit Antigen in physiologischer Kochsalzlösung zu inokulieren.
    • Myelomzellen.
  • Mausmyelomzellen (P3/NS-1/1-Ag4-1 (ATCC TIB 18)) sind in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum zu halten. Etwa 10&sup7; bis 10&sup8; Zellen werden zur Fusion mit B-Zellen benötigt, die aus einer typischen Mausmilz erhalten sind. Unmittelbar vor der Hybridomfusion sind Myelomzellen aus einer Kultur in der log-Phase in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen zu ernten und die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für fünf Minuten zu pelletieren. Der Überstand ist zu entfernen und die Zellen zweifach mit serumfreiem DMEM zu waschen, gefolgt von Zentrifugation wie oben. Das Pellet (enthält 10&sup7; bis 10&sup8; Zellen) ist in 1 ml serumfreiem DMEM zu resuspendieren.
    • Isolieren von Milzlymphozyten.
  • Die Maus ist durch Genickbruch zu töten und in 70 % Ethanol für einige Minuten einzutauchen. Die Milz ist mittels aseptischer Verfahren zu entfernen und in eine sterile Petrischale zu überführen, die 5 ml kaltes serumfreies DMEM enthält. Eine Skalpellklinge ist zu verwenden, um die Milz entlang der Längsachse aufzuschneiden und um entlang der Länge der Milz vorsichtig zu schaben, um die Splenozyten in das Medium freizusetzen. Eine Pipette ist zu verwenden, um die freien Zellen und Medium in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen zu überführen, wobei die Hülle der Milz zurückbleibt. Dem Gewebedebris in dem Röhrchen soll erlaubt werden, sich fünf Minuten lang abzusetzen und die Einzelzellsuspension in ein frisches Röhrchen überführt werden. Die Zellen sollen für fünf Minuten bei 200 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet wieder mit kaltem serumfreiem DMEM gewaschen werden. Die Zellen sollen in 1 ml serumfreiem DMEM resuspendiert und bis zur Fusion auf Eis gelagert werden.
    • Fusion.
  • Die Milzzellen sind dem die Myelomzellen enthaltenden Zentrifugenröhrchen zuzugeben und für fünf Minuten bei 500 x g zu zentrifugieren. Der gesamte Überstand ist zu entfernen und das Zellpellet durch Klopfen auf die Seite des Röhrchens aufzulockern. Während alle Reagenzien und Zellen bei 37ºC gehalten werden, ist 1 ml 50 % Polyethylenglycollösung (PEG 4000, Gibco, Grand Island, NY) tropfenweise zu dem Röhrchen über eine Zeitspanne von einer Minute unter vorsichtigem Mischen zuzugeben. Der Mischung ist zu erlauben, bei 37ºC für eine Minute zu stehen. 1 ml warmes serumfreies DMEM ist tropfenweise über eine Minute unter vorsichtigem Mischen zuzugeben. Schließlich sind 20 ml serumfreies DMEM tropfenweise über vier Minuten zuzugeben und dann die Zellen bei 200 x g für fünf Minuten sofort zu zentrifugieren. Der Überstand ist zu verwerfen und die Zellen in 47 ml DMEM, das 20 % fötales Rinderserum, 0,2 Einheiten/ml Insulin, 0,5 mM Natriumpyruvat, 1 mM Oxalessigsäure, 2 mM L-Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren und 10 % NCTC-109-Lymphozytenmedium enthält, zu resuspendieren. Ein Volumen von 1 ml Zellsuspension ist den Näpfen zweier Gewebekulturplatten mit 24 Näpfen und flachen Böden zuzusetzen. Ein Napf mit einer Myelomzellkontrolle ist einzuschließen und die Platten bei 37ºC und 10 % CO&sub2; (SDMEM) zu inkubieren.
  • Nach Inkubation über Nacht sind 0,5 ml Medium von jedem Napf ohne Störung der Zellschicht zu entfernen. 1 ml SDMEM, das 1 x 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 x 10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1,6 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin (HAT) enthält, ist jedem Napf zuzusetzen und die Inkubation bei 37ºC und 10 % CO&sub2; fortzusetzen. 1 ml verbrauchtes Medium ist fortgesetzt durch 1 ml frisches DMEM + HAT für zwei bis drei Wochen dreimal pro Woche zu ersetzen. Wenn signifikantes Clonwachstum zu erkennen ist, sind die Näpfe auf Anwesenheit spezifischer Antikörper durch ELISA, indirekten FA oder andere geeignete Testsysteme zu testen.
    • Clonieren.
  • Primärnäpfe, die als auf spezifische Antikörper positiv getestet wurden, sollten unmittelbar subcloniert werden, um eine stabile Zellinie zu erhalten und ein Überwachsen durch andere Clone zu vermeiden. Die Zellen sind aus ausgewählten Primärnäpfen zu resuspendieren und Zellzahlbestimmungen unter Verwendung von Trypanblaufarbstoff und einem Hämocytometer vorzunehmen. Verdünnungen der Zellen sind vorzunehmen, um eine Endkonzentration von etwa 2 Zellen/ml SDMDM + HT zu erhalten. Normale Milzzellen, die aus nicht-inokulierten Mäusen erhalten wurden, sind als Futterschicht zu verwenden, indem 50 µl gepackter Zellen pro 100 ml Medium zugegeben werden.
  • 250 µl Zellsuspension sind jedem Napf einer Platte mit 96 Näpfen zuzusetzen und bei 37ºC und 10 % CO&sub2; zu inkubieren. Clone sollten nach zwei bis drei Wochen sichtbar sein und Überstände von einzelne Clone enthaltenden Näpfen werden getestet, wenn signifikantes Wachstum ersichtlich ist. Die Clonierungsprozedur ist mit Zellen, die als auf spezifische Antikörper positiv getestet wurden, zu wiederholen. Ausgewählte Clone sind langsam auf Gewebekulturflaschen für weitergehende Charakterisierung und Tieftemperaturkonservierung zu expandieren.
    • Ascitesdroduktion.
  • BALB/c AnN-Mäuse sind mit zwei Wochen vor Inokulieren mit Hybridomzellen IP gegebenen 0,5 ml Pristan vorzubereiten. Hybridomzellen sind zu ernten und einmal mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zu waschen. Zellen sind in HBSS zu resuspendieren und vorbereitete Mäuse IP mit 10&sup4; bis 10&sup6; lebenden Zellen zu inokulieren. Wenn Ascitesproduktion auftritt (gewöhnlich ein bis zwei Wochen nach Inokulation) ist durch Einführen einer 16 G 1-1/2" Nadel in die ventrale Leistenregion abzusaugen. Der Ansatz der Nadel ist über ein Zentrifugenröhrchen zu halten und Ascites in das Röhrchen abzuziehen. Die Ascitesflüssigkeit ist bei 200 x g zu zentrifugieren, durch ein 0,2 nm Filter zu filtrieren und gefroren zu lagern.
    • BEISPIEL 48 - MONOKLONALE SIRS-ANTIKÖRPER (SDOW 12 UND SDOW 17)
  • Die monoklonalen Antikörper SDOW 12 (ATCC Nr. HB 10996) und SDOW 17 (ATCC Nr. HB 10997) gegen das SIRS-Virus wurden unter Verwendung der obigen Standardprotokolle zur Herstellung monoklonaler Antikörper hergestellt. Das zur Mausimmunisierung verwendete Antigen war SIRS-Virus (VR-2332) aus der sechsten Passage, das in MA-104-Zellen, erhalten von Boehringer Ingelheim Animal Health (BIAH), angezogen wurde. Für jede Immunisierung wurden Mäuse mit 0,3 ml Gradienten-gereinigtem Virus mit einem Titer von 10&sup6; TCID&sub5;&sub0;/100 µl inokuliert.
  • Ein indirekter Fluoreszenzantikörper-Test (IFA) wurde verwendet, um spezifische Antikörper in primären Hybridomnäpfen und Clonnäpfen nachzuweisen. Aceton-fixierte Virus-infizierte und nicht-infizierte Zellmonolayer in Gewebekulturplatten mit 96 Näpfen wurden für den IFA verwendet. Zellkulturüberstände und Ascitesflüssigkeiten von diesen Hybridomen produzierten leuchtende, granuläre zytoplasmatische Fluoreszenz in SIRS-infizierten Zellen.
  • Die vorläufige Charakterisierung dieser monoklonalen Antikörper schloß Immunglobulin-Isotypisierung und Radioimmunpräzipitation von viralen SIRS-Proteinen ein. Die monoklonalen Antikörper SDOW 12 und SDOW 17 sind beide vom IgG&sub1;-Isotyp. Sie binden auch beide an ein virales 15 kD Protein bei Radioimmunpräzipitation.
    • BEISPIEL 5
  • Drei Pilotstudien werden beschrieben. Eine Studie an gnotobiotischen Schweinen wurde vorgenommen, um zu zeigen, daß Feldmaterial verwendet werden könnte, um zu infizieren und die respiratorische Komponente des Syndroms in keimfreien Schweinen zu verursachen. Eine zweite Studie, die herkömmlich gesäugte Schweine verwendete, wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die bei gnotobiotischen Schweinen beobachtete respiratorische Erkrankung in gewöhnlichen Schweinen reproduziert werden könnte. Und schließlich wurde eine Studie an trächtigen Mutterschweinen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Fertilitätsstörungskomponente des Syndroms experimentell reproduziert werden könnte.
    • Material und Methoden Freilandfall:
  • Siehe hierzu Ursprung des Inokulums in Beispiel 1A.
    • Gnotobiotische Studie.
  • Sechs mittels Hysterektomie gewonnene gnotobiotische Ferkel wurden intranasal im Alter von drei Tagen mit dem Freilandfallinokulum (10 % Homogenate, verschiedene Gewebe) inokuliert. Filtriertes (0,22 µm) und nicht filtriertes Inokulum wurde verwendet. Zwei Kontrollferkel wurden nur mit Medium inokuliert. Klinische Symptome wurden täglich aufgezeichnet und die Schweine wurden acht Tage nach Inokulation getötet, ausgenommen ein Tier, das für die Herstellung von Hyperimmun-Serum gehalten wurde. Gewebe für die Virusisolierung und histologische Untersuchung wurden bei der Nekropsie zusammen mit Serum gesammelt, das auf Antikörper gegen Leptospira, Chlamydia, Eperythrozoon, Aujeszky's Disease-Virus, Schweine-Parvovinus, Encephalomyocarditis-Virus, hämagglutinierendes Encephalitis-Virus, Schweineinfluenza-Virus, respiratorisches synzytiales Rindervirus, Hundestaupe-Virus, virale Rinderdiarrhoe und Schweinepest gescreent wurde. Das ursprüngliche Inokulum und Gewebe von gnotobiotischen Ferkeln wurden für drei Passagen auf kontinuierliche und primäre Zellinien inokuliert. Zusätzlich wurde direkte Mikroskopie und Immunelektronenmikroskopie vorgenommen.
    • Studie an herkömmlichen Schweinen.
  • Drei herkömmliche 28 Tage alte gesäugte Schweine von einem Bauernhof ohne MSD-Anamnese wurden intranasal mit 10 % Lungenhomogenaten von erkrankten gnotobiotischen Ferkeln inokuliert. Ein Lungenhomogenat von einem negativen gnotobiotischen Schwein wurde als Inokulum für eine Kontrolle verwendet. Die Ferkel wurden täglich auf klinische Symptome überwacht und acht Tage nach Inokulation seziert. Serum bzw. Gewebe wurden wie oben beschrieben bearbeitet.
    • Studie an trächtigen Mutterschweinen.
  • Acht multipare Mutterschweine mit bekannten historisch belegten Fälligkeitsterminen von einem MSD-freien Bauernhof wurden in dieser Studie verwendet. Drei Wochen vor dem erwarteten Ferkeldatum wurden sechs Mutterschweine intranasal mit erkrankten gnotobiotischen Lungenhomogenaten und zwei Mutterschweine mit negativen Lungenhomogenaten inokuliert. Die klinischen Symptome wurden täglich überwacht. Man erlaubte den Mutterschweinen, auf natürliche Weise zu ferkeln, und, wenn möglich, war man beim Ferkeln zugegen, um Serum von noch nicht gestillten lebend geborenen Schweinen zu sammeln. Mutterschweine und lebende Ferkel wurden kurz nach dem Ferkeln getötet und Gewebe wurden für die Histopathologie und Virusisolierung gesammelt. Serum und fötale Thoraxflüssigkeiten wurden ebenfalls gesammelt.
    • Ergebnisse Freilandstudie.
  • Bei der Nekropsie wurden keine großen Läsionen beobachtet. Mikroskopische Untersuchungen gesäugter Ferkel zeigten nekrotisierende interstitielle Pneumonie und lymphomononudeäre Encephalitis. Die Föten wiesen keine Läsionen auf, die Mutterschweine dagegen eine milde Encephalitis. Die mikroskopische Untersuchung ergab keine schlüssigen Ergebnisse.
    • Gnotobiotische Studie.
  • Die Ferkel wurden appetitlos und entwickelten ein struppiges Haarkleid drei Tage nach Inokulation. Die Kontrollen blieben normal. Mikroskopische Läsionen wurden in den mit filtriertem oder nicht-filtriertem Material inokulierten Haupttieren gefunden. Die Läsionen waren ähnlich den Freilandfällen und schlossen ein: nekrotisierende interstitielle Pneumonie (6/6 [sechs von sechs Ferkeln]), lymphoplasmazytische Rhinitis (4/6), lymphomononucleäre Encephalitis (2/6) und Myocarditis (1/6). Ein ätiologisches Agens wurde weder durch Prä- und Post-Inokulationsserologie noch durch Inokulum-/Gewebe-Untersuchung identifiziert.
    • Studie an herkömmlichen gesäugten Schweinen.
  • Die Haupttiere wurden zwei Tage nach Inokulation träge und appetitlos. Die Tiere erschienen unterkühlt, obwohl adäquate Wärme vorgesehen war. Ein Schwein wies sechs Tage nach Inokulation eine erhöhte Temperatur (41,5ºC) auf. Interstitielle Pneumonie, Encephalitis und Myocarditis wurden bei den Haupttieren, nicht aber bei der Kontrolle gefunden.
    • Studie an trächtigen Mutterschweinen.
  • Nur zwei Haupttiere zeigten klinisch signifikante Temperaturerhöhungen (1,5ºC) am dritten oder fünften Tag nach Inokulation. Jedoch wurde Anorexie bei 4/6 Mutterschweinen am Tag vier oder fünf nach der Inokulation beobachtet. Die Mutterschweine ferkelten bis zu sieben Tage zu früh und drei Mutterschweine ferkelten zum richtigen Zeitpunkt. Über 50 % der Föten von infizierten Mutterschweinen wurden tot geboren, während die Kontrollen normale Würfe hatten. Bei infizierten Würfen wurden sowohl totgeborene als auch spät mumifizierte Ferkel gefunden. Die Laborergebnisse waren nicht schlüssig--kein spezifisches Agens ist identifiziert worden und keine Läsionen sind bisher in Föten beobachtet worden.
  • Obwohl kein verursachender Mikroorganismus identifiziert worden ist, legen die Ergebnisse nahe, daß MSD experimentell auf gnotobiotische und herkömmliche Schweine (unter Verwendung von Freilandgeweben von einer Farm) übertragen werden kann. Sowohl die respiratorische als auch reproduktive Form von MSD wurde reproduziert. Das involviert Agens scheint infektiös und filtrierbar bei 0,22 µm zu sein und ist anscheinend anspruchsvoll.
    • Diskussion
  • MSD ist eine nicht nur in den Vereinigten Staaten, sondern auch in der ganzen Welt wichtige zum Vorschein kommende Krankheit. Um die Krankheit vor einem kontrollierten Hintergrund zu studieren, wurden drei Tage alte gnotobiotische Schweine intranasal mit Gewebehomogenaten von einer Farm inokuliert, auf der klinische Symptome von MSD auftraten. Mikroskopische Läsionen ähnlich Freilandfällen, einschließlich nekrotisierender interstitieller Pneumonie und, zu einem geringeren Umfang, lymphoplasmazytische Rhinitis, lymphomononucleäre Encephalitis oder Myocarditis, wurden bei Haupttieren, nicht aber bei Kontrollen gesehen. Bei Verwendung von Lungenhomogenaten von den gnotobiotischen Schweinen lieferte intranasale Inokulation herkömmlicher vier Wochen alter gesäugter Schweine ähnliche Läsionen. Multipare trächtige Mutterschweine wurden auch mit gnotobiotischen Lungenhomogenaten drei Wochen vor ihren Fälligkeitsterminen inokuliert. Klinisch gingen diese Mutterschweine durch eine Phase der Anorexie und ferkelten bis zu sieben Tage zu früh. Über 50 % der Föten waren entweder totgeboren oder in den beginnenden Phasen der Mumifizierung. Die Ergebnisse zeigten an, daß die mit dem infektiösen Agens assozuerte Erkrankung isoliert und experimentell mit Freilandgeweben auf gnotobiotische Schweine und von gnotobiotischen Schweinen auf herkömmliche gesäugte Schweine oder trächtige Mutterschweine übertragen werden kann. Diese Studie liefert ein Modell sowohl für die respiratorische als auch reproduktive Formen der Krankheit, das zu weiteren Untersuchungen der Pathogenese und Diagnose von MDS führen wird.

Claims (31)

1. Impfstoff, der zur Prävention von Mystery Swine Disease (MSD) geeignet ist, mit:
einem inaktivitierten oder attenuierten infektiösen Agens, das aus mit Mystery Swine Disease infiziertem Schweinegewebe gewonnen ist, in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägerstoff; worin das infektiöse Agens ein Virus mit den immunobgischen Eigenschaften eines unter der ATCC-Eingangsnummer VR- 2332 hinterlegten Virus und tierpathogene Mutanten desselben ist.
2. Impfstoff nach Anspruch 1, worin das infektiöse Agens aus einem Inokulum eines gefilterten Homogenats von mit Mystery Swine Disease infiziertem Schweinelungengewebe erhalten ist.
3. Impfstoff nach Anspruch 2, worin das Homogenat durch Neutralisation mit Antikörper-Seren gegen Schweinekrankheiten gereinigt worden ist, die aus der aus Hemophilus, Bruzellose, Leptospire, Parvovirus, Pseudotollwut, Enzephalomyokarditis, Enterovirus, Schweineinfluenza und jeder Kombination derselben bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
4. Impfstoff nach Anspruch 1, worin das infektiöse Agens erhalten ist aus dem Zellkulturmedium von in vitro-kultivierten Vogel-, Insekten- oder Säugetier-Organzellen, primären oder kontinuierlichen, die mit einem infektiösen Agens behandelt wurden, das aus dem Schweinelungengewebe isoliert worden ist, von dem bekannt war, daß es von einer Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom-Erkrankung befallen ist.
5. Impfstoff nach Anspruch 2, worin das gefilterte Homogenat biologische Teilchen mit einer Größe von nicht mehr als 1,0 µm (Mikron) enthält.
6. Impfstoff nach Anspruch 5, worin die Größe nicht größer als 0,5 µm (Mikron) ist.
7. Impfstoff nach Anspruch 1, worin das Virus ein anspruchsvolles, nicht-hämagglutinierendes BNA-Virus mit Hülle ist.
8. Impfstoff nach Anspruch 1, worin das infektiöse Agens eine biologisch reine Kultur von dem Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom-Virus ATCC VR-2332 und tierpathogenen Mutanten desselben ist.
9. Impfstoff nach Anspruch 8, worin das Virus durch Gradienten- oder serielle Zellkultivierung gereinigt worden ist.
10. Verfahren zur Diagnose von Mistery Swine Disease in einem Schwein, das umfaßt:
Erhalten einer Lungengewebeprobe von dem Schwein,
Bilden eines flüssigen Homogenats der Probe,
Hinzufügen des flüssigen Homogenats zu einem Gefäß zum Immobilisieren eines Virusmaterials, um ein immobilisiertes Gemisch zu bilden,
Hinzufügen eines monoklonalen Antikörpers gegen Mystery Swine Disease, der aus der Hybridoma-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungseingangsnummer HB 10996 oder HB 10997 gewinnbar ist, zum immobilisierten Gemisch, um einen Komplex zu bilden,
Hinzufügen eines markierten anti-Spezies-Antikörpers, um den Komplex nachzuweisen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der markierte anti-Spezies-Antikörper eine radioaktive oder farberzeugende Enzymmarkierung trägt.
12. Verfahren zur Diagnose von Mystery Swine Disease in einem Schwein, das umfaßt:
Bilden eines flüssigen Homogenats aus einer Gewebeprobe eines Schweins, das im Verdacht steht, das infektiöse Agens der Mystery Swine Disease zu enthalten,
Hinzufügen eines aus der Hybridoma-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungseingangsnummer HB 10996 oder HB 10997 gewinnbaren immunreaktiven Antikörpers, der immunspezifisch für das Mystery Swine Disease-Virus ist, zum flüssigen Homogenat,
Nachweisen des Vorliegens eines Niederschlags eines Antikörper-Antigen-Komplexes.
13. Verfahren zur Herstellung eines MSD-Impfstoffes, der ein inaktiviertes oder attenuiertes infektiöses MSD-Agens enthält, wobei das Verfahren umfaßt:
Identifizieren von schweinelungengewebe mit verdickten Aveolarsepten, degenerierenden Zellen und Zelldebris in Aveolarräumen;
Homogenisieren des Schweinelungengewebes mit einer pharmazeutisch annehmbaren, wässrigen Lösung, um ein Gemisch zu bilden;
Filtern des Gemisches durch eine Reihe von Filtern, um ein gefiltertes, das infektiöse MSD-Agens enthaltendes Homogenat zu bilden; worin das infektiöse MSD-Agens ein Virus mit den immunologischen Eigenschaften eines unter der ATCC-Eingangsnummer VR-2332 hinterlegten Virus und tierpathogene Mutanten desselben ist; und
Inaktivieren oder Attenuieren des infektiösen MSD-Agens in dem gefilterten Homogenat, um den MSD-Impfstoff herzustellen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Homogenat gefiltert wird, um Teilchen mit einer Größe von nicht größer als ungefähr 1,0 µm (Mikron) zu enthalten.
15. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Größe nicht größer als ungefähr 0,5 µm (Mikron) ist.
16. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Größe nicht größer als ungefähr 0,1 µm (Mikron) ist.
17. Biologisch reine Kultur von einem Virus mit den immunobgischen Eigenschaften eines unter der ATCC-Eingangsnummer VR- 2332 hinterlegten Virus, wobei die Kultur in der Lage ist, die Schweine-Infertilitäts- und -Respirations-Erkrankung in einem Schwein zu bewirken, zusammen mit allen tierpathogenen Mutanten desselben.
18. Biologisch reine Kultur nach Anspruch 17, worin das Virus das Schweine-Infertilitäts- und Respirationssyndrom-Virus mit der Hinterlegungseingangsnummer ATCC VR-2332 ist.
19. Monoklonaler Antikörper, der durch eine von einer Maus abgeleiteten Hybridzellinie hergestellt ist, worin der Antikörper aus der Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungseingangsnummer HB 10996 oder HB 10997 gewinnbar ist, und in der Lage ist, sich spezifisch an wenigstens eine Antigendeterminante eines anspruchsvollen, nicht-hämagglutinierenden RNA-Virus mit Hülle zu binden, der in der Lage ist, eine Schweine- Infertilitäts- und -Respirations-Erkrankung in einem Schwein zu bewirken.
20. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 19, worin der Antikörper ein Immunglobulinmolekül vom Typ IgG oder IgM ist.
21. Impfstoffzusammensetzung, die ein modifiziertes, lebendes Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom-Virus mit der Hinterlegungseingangsnummer ATCC VR-2332, und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfaßt, wobei das Virus modifiziert worden ist, um das Virus für Schweine nicht-tierpathogen zu machen.
22. Impfstoffzusammensetzung, die ein abgetötetes oder inaktiviertes Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom-Virus mit der Hinterlegungseingangsnummer ATCC VR-2332 , und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfaßt.
23. Die Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 21 für die Herstellung eines Medikaments zum Immunisieren von Schweinen gegen Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom.
24. Die Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zum Immunisieren von Schweinen gegen Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom.
25. Verfahren zum Züchten einer biologisch reinen Kultur eines Virus nach Anspruch 17, und Isolieren eines Schweine-Infertilitäts- und -Respirationssyndrom-Virus mit den immunologischen Eigenschaften des unter der ATCC-Eingangsnummer VR-2332 hinterlegten Virus, welches Inokulieren des Virus auf eine Volloder Teilschicht aus Affenzellen in der Gegenwart von Serum in einem geeigneten Zuchtmedium und Inkubieren der inokulierten Zelischicht bei ungefähr 34ºC bis 37ºC umfaßt, bis CPE beobachtet wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Affenzellinie MA-104 ist.
27. Verwendung eines haibgereinigten Blutserums eines Säugetiers, das mit einem infektisen Agens inokuliert wurde, das aus mit Mystery Swine Disease infiziertem Schweinegewebe gewonnen ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit Mystery Swine Disease infizierten Schweins; worin das infektiöse Agens ein Virus mit den immunologischen Eigenschaften eines unter der ATCC-Eingangsnummer VR-2332 hinterlegten Virus und tierpathogene Mutanten desselben ist.
28. Verfahren zur Diagnose von Mystery Swine Disease in einem Schwein, das umfaßt:
Erhalten einer Lungengewebeprobe von dem Schwein;
Bilden eines flüssigen Homogenats der Probe;
Inkubieren des Homogenats mit einem Zellpräparat unter Bedingungen, die ein Kultivieren der Zellen bewirken;
Verarbeiten der Zellkultur, um eine Zellabschabung zu liefern;
Kontaktieren der Zellabschabung mit einem Träger zum Immobilisieren, um eine immobilisierte Zellabschabung zu liefern;
Hinzufügen eines monoklonalen Antikörpers für Mystery Swine Disease, der aus der Hybridoma-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungseingangsnummer HB 10996 oder HB 10997 gewinnbar ist, zur immobilisierten Zellabschabung, um einen Komplex zwischen dem viralen Agens in der immobilisierten Zellabschabung und dem Antikörper zu bilden, und
Nachweisen des Komplexes.
29. Verfahren nach Anspruch 28, worin bei dem Inkubationsschritt das Homogenat und das Zellpräparat inkubiert werden, bis eine cytopathische Wirkung beobachtet wird, und die die cytopathische Wirkung zeigende Zellkultur verarbeitet wird, um eine Zellabschabung zu liefern.
30. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Zellpräparat eine Affenzellinie ist, die MA-104 oder ein Derivat derselben ist.
31. Verfahren zur Diagnose von Mystery Swine Disease in einem Schwein, das umfaßt:
Erhalten einer Lungengewebeprobe von dem Schwein;
Kontaktieren des Lungengewebes mit einem Träger, um eine immobilisierte Gewebeprobe zu bilden;
Hinzufügen eines monoklonalen Antikörpers für Mystery Swine Disease, der aus der Hybridoma-Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungseingangsnummer HB 10996 oder HB 10997 gewinnbar ist, zu der immobilisierten Gewebeprobe, um einen Komplex zwischen dem viralen Agens und dem Antikörper zu bilden, und
Nachweisen des Komplexes.
DE69214657A 1991-08-26 1992-08-17 Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas) Expired - Lifetime DE69214657T2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74983991A 1991-08-26 1991-08-26
US76071391A 1991-09-16 1991-09-16
US86044492A 1992-03-30 1992-03-30
PCT/US1992/006873 WO1993003760A1 (en) 1991-08-26 1992-08-17 Sirs vaccine and diagnosis method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69214657D1 DE69214657D1 (de) 1996-11-21
DE69214657T2 true DE69214657T2 (de) 1997-04-17

Family

ID=27419388

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69214657A Expired - Lifetime DE69214657T2 (de) 1991-08-26 1992-08-17 Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas)
DE1992614657 Expired - Lifetime DE69214657T4 (de) 1991-08-26 1992-08-17 Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas)
DE0601062T Pending DE601062T1 (de) 1991-08-26 1992-08-17 Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas).

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE1992614657 Expired - Lifetime DE69214657T4 (de) 1991-08-26 1992-08-17 Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas)
DE0601062T Pending DE601062T1 (de) 1991-08-26 1992-08-17 Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas).

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5683865A (de)
EP (1) EP0601062B2 (de)
JP (4) JP3473700B2 (de)
KR (1) KR100241221B1 (de)
AT (1) ATE144144T1 (de)
AU (1) AU2508492A (de)
CA (1) CA2116348C (de)
DE (3) DE69214657T2 (de)
DK (1) DK0601062T4 (de)
ES (1) ES2065303T5 (de)
GR (3) GR940300089T1 (de)
HK (1) HK1005014A1 (de)
HU (1) HU217105B (de)
SG (1) SG43852A1 (de)
WO (1) WO1993003760A1 (de)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU218431B (hu) * 1991-06-06 2000-08-28 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények
US6080570A (en) * 1991-08-26 2000-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome
US6042830A (en) * 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
DK0601062T4 (da) * 1991-08-26 2001-03-14 Univ Minnesota SIRS-vaccine og diagnosefremgangsmåde
US6982160B2 (en) * 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
US5846805A (en) * 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
ES2083764T5 (es) * 1991-10-14 2009-04-01 Intervet International Bv Vacuna para el sindrome respiratorio reproductivo porcino (srrp) y diagnostico.
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6773908B1 (en) 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6251397B1 (en) * 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
KR100374295B1 (ko) * 1993-02-08 2003-12-24 바이엘 코포레이션 돼지생식및호흡증후군바이러스의생육방법과백신에서그의용도
EP0676467B1 (de) * 1994-04-11 2001-10-04 Akzo Nobel N.V. Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
GB2289279B (en) * 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
CA2196555C (en) * 1994-08-05 2012-07-03 Michael P. Murtaugh Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use
ES2102971B1 (es) * 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US5866401A (en) * 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0839912A1 (de) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Ansteckende Klone von RNA-Viren und darauf basierende Impfstoffe und diagnostisches Verfahren
WO2000053787A1 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. Prrsv vaccines
UA73915C2 (uk) 1997-05-06 2005-10-17 Стіхтінг Дінст Ландбаувкюндіг Ондерзук Пептид, який індукує утворення нейтралізуючих антитіл (варіанти), антитіло, одержане за допомогою вказаного пептиду, імуногенна композиція для індукції нейтралізуючих антитіл, вакцина для профілактики зараження репродуктивно-респіраторним синдромом свиней (ррсс) та діагностичний набір для виявлення або ідентифікації антитіл, специфічних до ізоляту вррсс
NZ513289A (en) 1998-12-22 2003-04-29 Pfizer Prod Inc Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7691389B2 (en) 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7132106B2 (en) 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7618797B2 (en) 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
WO2000065032A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 United States Department Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142
EP1255815B1 (de) * 2000-02-08 2006-07-19 Regents Of The University Of Minnesota Virus des porzinen reproduktiven und respiratorischen syndroms und dessen verwendung
US6841364B2 (en) * 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
US20080268426A1 (en) * 2004-06-18 2008-10-30 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
US7611717B2 (en) * 2004-06-18 2009-11-03 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
DE602006013270D1 (en) 2005-01-13 2010-05-12 Boehringer Ingelheim Vetmed Prrs-impfstoffe
UA95778C2 (ru) 2005-06-24 2011-09-12 Риджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота Вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней, их инфекционные клоны и мутанты и способы применения
US7666585B2 (en) * 2007-06-15 2010-02-23 Protatek International, Inc. Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations
CN101848995A (zh) * 2007-06-25 2010-09-29 南达科他州立大学 重组的北美1型猪繁殖与呼吸综合征病毒及使用方法
RU2561595C2 (ru) * 2008-08-25 2015-08-27 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs)
AR078253A1 (es) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
UA108902C2 (uk) 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
EA031432B1 (ru) 2011-02-17 2019-01-31 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Способ получения вируса репродуктивно-респираторного сидрома свиней prrs
EA038012B1 (ru) 2011-02-17 2021-06-23 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Композиция на основе нового штамма prrsv или его белков, продукт, их применение, вирус prrsv, выделенная нк и рекомбинантный вектор экспрессии для получения этого вируса
EP2737059A1 (de) 2011-07-29 2014-06-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Neuartiges prrs-virus zur induktion von interferon des typs i in empfindlichen zellen
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
JP6386999B2 (ja) 2012-05-17 2018-09-05 ゾエティス・エルエルシー ブタ生殖および呼吸症候群（ｐｒｒｓ）ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種
CN105073130A (zh) 2013-03-15 2015-11-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
KR101502360B1 (ko) * 2013-03-20 2015-03-25 주식회사 옵티팜 신규한 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스
KR20180042167A (ko) 2015-08-31 2018-04-25 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 선천성 진전을 위한 페스티바이러스 백신
US10188725B2 (en) 2015-12-14 2019-01-29 Elanco Us Inc. Hybrid core feline vaccines
CN110072547B (zh) 2016-12-14 2024-04-30 硕腾服务有限责任公司 断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的有效疫苗接种
EP3953370A1 (de) 2019-04-04 2022-02-16 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Impfstoffe gegen das porcine circovirus typ 3 (pcv3), ihre herstellung und verwendung
RU2731474C1 (ru) * 2020-02-26 2020-09-03 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии" (ФГБНУ "ВНИВИПФиТ") Способ диагностики скрыто протекающего воспалительного процесса в репродуктивных органах свиноматок
EP4185321A2 (de) 2020-07-24 2023-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Kombinationsimpfstoff gegen schweine

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD145705A1 (de) * 1979-08-31 1981-01-07 Peter Solisch Herstellungsverfahren von organspezifischen retrovirusimmunpraeparaten fuer prophylaxe,therapie und diagnostik
EP0208672B1 (de) * 1985-07-08 1993-02-17 REGION WALLONNE représentée par le Ministre des Technologies pour la Région wallonne dans ses attributions Vakzine und Diagnostika, die vom Bovine-Diarrhea-Virus stammen
NZ222465A (en) * 1986-11-07 1992-11-25 Pasteur Institut Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen
DE3833925A1 (de) * 1988-03-11 1989-09-21 Inst Angewandte Biotechnologie Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu
HU218431B (hu) * 1991-06-06 2000-08-28 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények
US6042830A (en) † 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
DK0601062T4 (da) * 1991-08-26 2001-03-14 Univ Minnesota SIRS-vaccine og diagnosefremgangsmåde

Also Published As

Publication number Publication date
KR100241221B1 (ko) 2000-03-02
ES2065303T1 (es) 1995-02-16
ATE144144T1 (de) 1996-11-15
AU2508492A (en) 1993-03-16
EP0601062A1 (de) 1994-06-15
JP2003252791A (ja) 2003-09-10
SG43852A1 (en) 1997-11-14
EP0601062B1 (de) 1996-10-16
CA2116348C (en) 2001-07-03
HK1005014A1 (en) 1998-12-18
US5683865A (en) 1997-11-04
GR3022194T3 (en) 1997-03-31
CA2116348A1 (en) 1993-03-04
JP3566279B2 (ja) 2004-09-15
HUT69800A (en) 1995-09-28
JP3722794B2 (ja) 2005-11-30
GR3035442T3 (en) 2001-05-31
DK0601062T3 (da) 1997-03-24
HU217105B (hu) 1999-11-29
DE69214657T4 (de) 2003-07-17
GR940300089T1 (en) 1994-12-30
JP2005336203A (ja) 2005-12-08
DE69214657T3 (de) 2001-05-03
WO1993003760A1 (en) 1993-03-04
DK0601062T4 (da) 2001-03-14
JP2004097214A (ja) 2004-04-02
DE69214657D1 (de) 1996-11-21
US5677429A (en) 1997-10-14
EP0601062B2 (de) 2000-12-13
JPH06510288A (ja) 1994-11-17
JP3878647B2 (ja) 2007-02-07
JP3473700B2 (ja) 2003-12-08
HU9400560D0 (en) 1994-05-30
ES2065303T3 (es) 1997-02-16
ES2065303T5 (es) 2001-05-01
DE601062T1 (de) 1995-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69214657T2 (de) Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas)
US5846805A (en) Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
US7264804B2 (en) Kits for detecting anti-SIRS antibodies
US6080570A (en) Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome
DE69206631T2 (de) Impfstoff gegen das Fortpflanzungs- und Atmungssyndrom bei Schweinen (PRRS) und Diagnose.
Allan et al. Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material
DE69334141T2 (de) Schweinevirus, Erreger der sich vermehrenden Erkrankung der Atemwege, Impstoffe und seine virale DNA
WO1993006211A1 (en) Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
EP0529584A2 (de) Virales Agens assoziiert mit der Mystery Swine Disease
Studdert et al. 1. Isolation and Characterisation of Equine Rhinopneumontis Virus and Other Equine Herpesviruses from Horses
PT623167E (pt) Preparacao de antigenios e vacinas do virus da mistery disease e antigenios e vacinas produzidos para a prevencao desta doenca
DE3882599T2 (de) Hundecoronavirus-Impfstoff.
US5916570A (en) Multivalent bovine coronavirus vaccine and method of treating bovine coronavirus infection
Sibalin Confirmation of the presence of the Talfan disease in Swedish pigs
Duncan Biological and serological properties of Frater virus—a cytopathogenic agent associated with aseptic meningitis
Pensaert et al. A Porcine Enterovirus causing Fetal Death and Mummification: I. Characteristics and Identification
RU2268937C1 (ru) Штамм &#34;вниизж&#34; коронавируса крупного рогатого скота для изготовления диагностических, вакцинных и лечебных препаратов
Hirasawa et al. Characterization of Low‐virulent Mouse Coronavirus Isolated from Faeces in a Mouse Colony
El-Ghorr Investigations into the biology of bovine coronavirus and the infections it causes
Mattson Properties of six South Dakota bovine picornaviruses
Krishnan Nair Investigation on the aetiology of plague-like disease in ducks In Kerala

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA, INC. (N. D. GES. D

8381 Inventor (new situation)

Free format text: COLLINS, JAMES EDWARD, WHITE BEAR LAKE, MINN., US BENFIELD, DAVID ALLEN, BROOKINGS, S.D., US CHLADEK, DANNY W., ST. JOSEPH, MO., US HARRIS, LOUIS L., ST. JOSEPH, MO., US GORCYCA, DAVID E., ST. JOSEPH, MO., US

8366 Restricted maintained after opposition proceedings
R071 Expiry of right

Ref document number: 601062

Country of ref document: EP