CN101848995A - 重组的北美1型猪繁殖与呼吸综合征病毒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是全世界猪肉工业的一个主要问题。在疫苗中包含标记将允许诊断区分接种疫苗的动物和自然感染野生型病毒的那些动物。使用北美1型PRRSV的cDNA感染性克隆，制备了重组绿色荧光蛋白(GFP)标签化的PRRSV，其包含免疫原性表位ES4在nsp2区域的缺失。基于GFP和ES4表位的ELISA肯定了标记鉴定。

Description

重组的北美1型猪繁殖与呼吸综合征病毒及使用方法
本申请要求2007年6月25日提交的美国临时申请序列第60/946,080号的权益。
技术领域
本申请涉及分子病毒学领域，更具体地，涉及编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组核酸的构建。
背景
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范围内最具经济意义的猪的疾病。其通过母猪的晚期生殖失败以及仔猪的严重肺炎来表征。PRRS病毒(PRRSV)由两种主要的基因型欧洲基因型(1型)和北美基因型(2型)组成，每种基因型以前分布在不同的大陆上。近期，1型PRRSV分离株(北美1型)已经在美国猪群中被鉴定。这组病毒具有和典型的北美型和欧洲型PRRSV明显不同的独特的抗原特性和遗传特性。在Nsp2的免疫显性区中鉴定了特有的51bp的缺失。PRRS的病原体是含有单股正链RNA基因组的小的有包膜病毒。PRRSV属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)，该科包括马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)以及猴出血热病毒(SHFV)(Snijder&Meulenberg，1998)。核苷酸序列比较显示PRRSV可分为不同的欧洲(1型)基因型和北美(2型)基因型(Allende等，1999；Nelson等，1999)。
PRRSV基因组长度为约15kb，并包含九个开放读码框。基因组的3’端编码四个膜缔合性糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5；由sg mRNA 2-5编码)，两个非糖基化的膜蛋白(E和M；由sg mRNA 2和6编码)，以及一个核壳蛋白(N；由sg mRNA7编码)(Bautista等，1996；Mardassi等，1996；Meng等，1996；Meulenberg&den Besten，1996；Meulenberg等；1995；Mounir等，1995；Wu等，2001，2005)。复制酶相关的基因，即ORF1a和ORF1b，位于基因组的5’端，其代表病毒基因组的近75％。预测ORF 1ab编码的多蛋白pp1ab在12个位点切割形成13个产物：nsp1α、nsp1β，以及nsp2到nsp12(Allende等，1999；den Boon等，1995；Nelsen等，1999；Snijder&Meulenberg，1998)。
针对PRRSV的改造的减毒疫苗目前可用于减少PRRSV相关的临床疾病(Boehringer-Ingelheim Animal Health，Inc.)。然而，它们无法在血清学上区分自然感染痊愈的猪和已经接种疫苗的猪。遗传标记的疫苗将允许区分接种疫苗的猪和自然感染的猪，这是控制和消除PRRSV项目所需要的。
概述
重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在开放读码框(ORF)1a中包括一个或多个突变，所述突变使得重组的PRRSV不能产生对应于ORF1a的至少一种功能性多肽。所述突变可能是缺失。缺失可发生在nsp2区域中，并可包括表位ES4。在一实施方案中，缺失包括ORF1a的736-790位氨基酸。所述突变可包括异源DNA序列的插入。插入可在ORF1a的733位氨基酸和734位氨基酸之间。所述插入可包括绿色荧光蛋白(GFP)。
重组的北美PRRS病毒由分离的多聚核苷酸分子编码，此分子包括编码感染性RNA分子的DNA序列，该感染性RNA分子编码北美PRRS病毒，并且所述DNA序列是SEQ ID NO：43或其同源序列。
疫苗包括在ORF1a中具有突变的PRRSV突变体，该突变使得所述PRRSV突变体不能产生功能性ORF1a多肽，并且所述疫苗包括药学可接受的运载体。所述突变可包括nsp2区域中的缺失，如nsp2区域中736-790位氨基酸的缺失。所述突变可包括异源DNA序列的插入。所述插入可以在nsp2区域中的733位氨基酸和734位氨基酸之间。
试剂盒包括疫苗，该疫苗包括在ORF1a中具有突变的PRRSV突变体和药学可接受的运载体，该突变使得所述PRRSV突变体不能产生功能性ORF1a多肽，所述突变包括异源DNA序列的插入。所述试剂盒还包括一种或多种第一多肽，该第一多肽由所述异源DNA序列编码，以及一种或多种第二多肽，该第二多肽由所述功能性ORF1a编码。PRRSV疫苗中的突变可以是在nsp2区域中比如在ES4表位中的缺失，并且所述一种或多种第一多肽包括GFP，且所述一种或多种第二多肽包括ES4表位。
提供区分接种PRRSV标记疫苗的动物和自然感染PRRSV的动物的方法，其中所述PRRSV标记疫苗包括插入突变和缺失突变。此方法包括以下步骤：提供包括插入突变的第一重组PRRSV蛋白，提供包括缺失突变的第二重组PRRSV蛋白，用第一重组PRRSV蛋白和第二重组PRRSV蛋白孵育来自动物的血清样品，并检测样品中的抗体与第一重组PRRSV蛋白和第二重组PRRSV蛋白的结合。样品中的抗体与第一重组PRRSV蛋白的结合指示接种疫苗的动物，而样品中的抗体与第二重组PRRSV蛋白的结合指示自然感染的动物。第一重组PRRSV蛋白可包括GFP插入，而第二重组PRRSV蛋白可包括ES4缺失。
附图简述
图1是PRRSV基因组和克隆策略的示意图。
图2A-2F显示旨在检查感染性克隆pSD01-08感染力的免疫荧光分析的结果。
图3是显示克隆病毒、亲本病毒和表达GFP的病毒的生长动力学的图。
图4显示克隆病毒和亲本病毒SD01-08的RT-PCR产物的限制性内切核酸酶片段模式。
图5A和5B是显示克隆病毒的体内表征的图。
图6A-6C显示旨在检查表达GFP的PRRSV的免疫荧光分析的结果。
图7是pSD01-08-GFP构建体的示意图。
图8是pSD01-08-GFP/ΔES4构建体的示意图。
图9是显示GFP/ΔES4标记病毒生长动力学的图。
图10显示GFP/ΔES4标记病毒和亲本病毒的噬斑形态。
图11显示GFP表达的稳定性。
图12显示野生型GFP基因和Arg-97突变的GFP基因的比较。
图13是显示GFP/ΔES4标记病毒的体内特性的图。
图14A-14C是显示GFP/ΔES4标记病毒的病毒学和免疫学性质的图。
图15A-15C显示基于GFP和ES4表位的ELISA结果。
详述
开发了北美1型PRRSV分离株的全长cDNA克隆SD01-08。SD01-08与Lelystad病毒相比时在核苷酸水平上拥有94.1％同一性(GenBank登录号DQ489311)。SD01-08和LV之间的重要区别是在PAM和猴肾脏细胞中的生长性质。Meulenberg等人(15)报告的结果显示野生型和克隆的LV病毒在PAM中生长良好，但在MA-104来源的细胞系CL2621中低水平生长。亲本和克隆的SD01-08在PAM和MARC-145细胞中生长一致良好，MARC-145细胞是另外一种MA-104来源的细胞系。SD01-08克隆病毒的效价在48hpi时达到峰值，而此时LV克隆病毒生长至较低效价甚至在96hpi时仍未达到峰值。因此，SD01-08感染性克隆在连续的细胞系中良好复制。LV和SD01-08之间的另外一个不同是在毒性水平上。在PAM中，LV克隆病毒达到107.1至107.9TCID50/ml的高效价并在大约32hpi时达到峰值。SD01-08克隆病毒在PAM中达到了和其亲本病毒相同的效价，但是它们二者的效价都低于LV的效价，仅达到了约104TCID50/ml，并且在稍后约72hpi时达到峰值。这一结果显示SD01-08克隆病毒的毒性弱于LV克隆病毒。实地(field)观测和实验动物攻击研究支持此结论。SD01-08不引发显著的临床病征，并且在实验感染的猪中仅观察到轻微的病理损伤。相反，据报道LV引发猪的显著呼吸道问题和母猪的流产(34)。
感染性克隆的主要应用之一是用其作为构建遗传工程疫苗的病毒骨架。美国目前的PRRSV疫苗主要针对北美2型分离株。北美1型PRRSV的出现要求疫苗对PRRSV的两种基因型都有效。任何活病毒疫苗的基本要求是低毒性，不引发或者至多引发极轻微的疾病表现症状。亲本病毒SD01-08是从没有显示临床病征的猪群中分离得到的。发病机理研究证实了SD01-08在疾病急性期拥有低毒特性，这就表明pSD01-08感染性克隆是可能的低毒性株系并且适合疫苗构建。
开发疫苗的关键步骤之一是包括用于诊断区分接种疫苗的动物和自然感染野生型病毒动物的标记。标记疫苗对于致力于控制或者消除食用动物和伴侣动物的病毒感染的项目是重要的(Babiuk，1999；Babiuk等，1999，2002；van Oirschot，2001)。疱疹病毒标记疫苗是首批被证实在实地有效的疫苗之一(Bosch等，1996；van Oirschot等，1996)，随后有各种遗传修饰的RNA病毒，如典型性猪瘟病毒(Widjojoatmodjo等，2000；van Gennip等，2002)和牛瘟病毒(Walsh等，2000)。在根除EAV项目中，因为马被广泛用于国际贸易和交通，标记疫苗是一些立法机构所需要的。区分疫苗接种和感染正成为主流论点(Castillo-Olivares等，2003)。同样的，在根除PRRSV项目中，生猪和猪肉的国际贸易未来也将可能需要标记疫苗。此外，随着世界日益走向PRRSV的消除，血清监测是核实疾病状况的基本工具。目前有效的常规疫苗无法区分野生型感染和疫苗接种。因此，血清监测在面临疫苗接种时或者疫苗接种结束几个月后是无法进行的。明显地，标记疫苗将会有很大优势。
北美1型PRRSV的感染性克隆pSD01-08被用于产生重组的PRRSV。和欧洲Lelystad病毒(LV)感染性克隆相比，pSD01-08具有几个明显的生物学特性：(1)pSD01-08感染性克隆来源于2001年美国分离的亲本株系，该亲本株系代表北美1型PRRSV；(2)亲本株系SD01-08是从8周大的显示无临床病征的猪群中分离得到的；并且(3)SD01-08在Nsp2的免疫显性区域中具有特有的51bp的缺失(Fang等，2004)。
nsp2在病毒复制中发挥作用。nsp2含有位于N末端的半胱氨酸蛋白酶结构域。这一结构域诱导nsp2/3切割，并且还作为辅因子和nsp4丝氨酸蛋白酶一起加工其他切割产物(Snijder等，1994，1995；Wassenaar等，1997)。除了在病毒复制中的作用外，EAV和PRRSV nsp2的半胱氨酸蛋白酶显示属于卵巢瘤(OTU)蛋白酶超家族。OTU蛋白酶能够把泛素和ISG 15从细胞蛋白上解离下来，从而抑制Ub-和ISG15-依赖的先天免疫应答(Frias-Staheli等，2007)。
标记疫苗的开发是基于操作cDNA感染性克隆，其中可插入外源抗原(正标记)或者可缺失产生免疫原性表位(负标记)。针对外源抗原或者病毒表位的抗体应答可被用于区分接种疫苗的动物和自然感染的动物。PRRSV nsp2是用于标记改造的优秀的候选位点。和标记工程相关的最重要的nsp2性质是nsp2耐受大的缺失和插入的能力。已报道了蛋白质中心区内的核苷酸序列插入/缺失(Gao等，2004；Shen等，2000；Tian等，2007；Han等，2007)。与标记工程相关的另一性质是在这个区域中几个免疫显性表位的存在。丹麦1型病毒的nsp2区域中有六个线性B-细胞表位位点(ES)(ES2到ES7)已被鉴定出来(Oleksiewicz等，2001)。在2型病毒中，发现nsp2与结构蛋白相比时含有免疫显性表位的频率最高(de Lima等，2006)。
制备了在美国1型PRRSV感染性克隆的nsp2区域中的标记修饰。正标记GFP被插入到nsp2区域，但是GFP基因不稳定。随后，位于nsp2区域中的高度免疫原性表位ES4(ORF1a的736到790位氨基酸)被缺失然后用反向遗传学置换入GFP基因(位于ORF1a的733/734位氨基酸)来构建负标记。表征得到的重组病毒的体外复制特征和体内生物学特性，以确定其作为标记疫苗抗PRRSV感染的潜在用途。测试基于GFP抗原和基于ES4肽抗原的ELISA，以确定它们作为标记检测和区分的伴随诊断分析的灵敏性和特异性。
I.正标记GFP
细胞和病毒。北美1型PRRSV分离株SD01-08最早在2001年从美国的8周大的猪群中分离得到，这个猪群没有表现出PRRS的临床病征。为从体外转录的RNA中复原病毒，幼仓鼠肾细胞(BHK-21C 13：美国典型培养物保藏中心)被用于起始的转染。MARC-145细胞被用于病毒拯救和后续的实验(Fang等，2006)。猪肺泡巨噬细胞(PAM)通过对无特异病原体无PRRSV的仔猪进行肺灌洗获得。
RNA提取、RT-PCR和测序：用MOI接近0.1的噬斑纯化的病毒感染MARC-145细胞。三天后，将培养物上清液层放在0.5M蔗糖垫上，以100,000xg在SW41转头(Beckman)中离心14小时。使用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen)从沉淀中提取RNA。为获得亲本病毒SD01-08的全长基因组序列，使用一系列引物进行RT-PCR(Ropp等，2004)。每个RT-PCR产物直接从两个方向测序至少2次以获得共有序列。为构建感染性的克隆，通过RT-PCR扩增侧翼于独特限制性酶位点的覆盖全长病毒基因组的9个重叠片段(图1)。RT-PCR扩增所用正向和反向寡核苷酸最开始依据LV序列(GenBank登录号M96262；18)而设计，后来修改为和SD01-08序列(表1)相匹配。进行RT-PCR(Fang等，2004)。这些RT-PCR扩增的片段通过凝胶纯化，并克隆入PCR-Blunt II-Topo载体(Invitrogen)。每个片段的三个克隆被测序，并将含有共有序列的克隆用于感染性克隆的装配。
表1.用于RT-PCR扩增的引物
Figure GPA00001035001100071
Figure GPA00001035001100081
Figure GPA00001035001100091
*为产生Sca1限制性酶位点而突变的核苷酸为粗斜体。
按照生产商的说明书，使用GeneRACER试剂盒(Invitrogen)确定基因组序列的5’和3’端。通过使用引物E1GF和E2968R(表1)的RT-PCR制备代表病毒基因组5’末端的片段，所述片段在紧接真实的5’末端核苷酸前整合T7RNA聚合酶位点和Asc1限制性酶位点。包含3’端序列的片段通过使用引物018聚腺苷酸对RNA进行反转录而构建，该片段的侧翼为41个聚腺苷酸残基和Xba1位点。反转录反应之后用引物E14059F和0183’R(表1)进行PCR。
北美1型PRRSV全长cDNA克隆的构建及其感染力的确定。北美1型PRRSV的全长基因组cDNA克隆pSD01-08使用图1所示策略进行构建。通过用填充片段置换BamH1和Bgl1位点之间的片段改造低拷贝数质粒pACYC177(GenBank登录号X06402)，该填充片段制备为含有图1所示的限制性酶位点的合成基因。使用限制性酶将每个病毒片段从PCR-BluntII-Topo上切下并连入使用同样的限制性酶消化的pACYC177质粒。每一个连接步骤之后，将pACYC177构建体转化进大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，并于37℃在卡那霉素存在下培养过夜。对完整装配的全长cDNA克隆进行测序，并将全长基因组序列以登录号DQ489311保存于GenBank。
为生成Sca1限制性酶位点，使用位点定向诱变在ORF7的42位核苷酸(SD01-08基因组的14588位核苷酸)生成沉默突变(G到T突变)。位点定向诱变通过重叠延伸PCR技术(Ho等，1989；Jespersen等，1997)实现，使用了引物对E14059F/Sca1R和Sca1F/YFp503R。通过DNA测序分析确认突变产物。
此构建体包含位于病毒基因组5’末端的噬菌体T7RNA聚合酶启动子、一个被引入到T7启动子和病毒基因组第一个核苷酸之间的额外的鸟嘌呤核苷残基、SD 01-08的15047个核苷酸的全长基因组和并入到基因组的3’端的41残基的聚腺苷酸尾。与亲本病毒的基因组序列相比，pSD01-08的DNA序列包含6个核苷酸差异(表2)。
表2.亲本SD 01-08分离株和全长cDNA克隆之间的核苷酸差异。
  SD01-08基因组中的核苷酸位置   亲本病毒中的核苷酸   cDNA克隆中的核苷酸   氨基酸变化   基因位置
  1331   T   C   沉默的   Nsp1β
  6158   T   C   沉默的   Nsp5
  8191   A   G   沉默的   Nsp9
  9492   C   T   P到L   Nsp10
  11261   T   C   Y到H   Nsp11
  14588   G   T   沉默的   ORF7
这些差异中的四个是沉默突变。引入14588位核苷酸的突变以在ORF7中生成用于区分克隆病毒和亲本病毒的独特的Sca1限制性酶位点。核苷酸突变中有两个导致氨基酸变化，包括位于Nsp10的9492位核苷酸的C到T的取代(氨基酸P到L)，以及位于Nsp11的11261位核苷酸的T到C的取代(氨基酸Y到H)。
pSD01-08质粒通过限制性酶Xba1线性化，并用于通过T7 RNA聚合酶的体外转录来合成加帽的RNA。将体外转录的加帽RNA转染入BHK-21细胞。转染后48小时，通过使用mAb SDOW17的荧光抗体染色来检查细胞的N蛋白的表达(图2A)。图2A的结果显示约5％的转染细胞表达N蛋白。将来自转染细胞的上清液在MARC-145细胞上传代。72小时后，使用SD01-08特异性抗-Nsp2mAb ES3-458-46(图2B)，和抗-N mAbSDOW17(图2C)对MARC-145细胞进行染色。包括北美2型PRRSV特异性抗-N mAb MR39(图2D)作为负对照。结果显示在使用来自pSD01-08转染的BHK-21细胞的上清液接种的MARC-145细胞中，Nsp2和N蛋白二者均被检测到。进一步将上清液在新鲜的MARC-145细胞上传代时(MARC-145细胞上的第2代)，感染后48到72小时(hpi)内观察到细胞病变效应(CPE)。对MARC-145细胞上的第2代病毒的滴定显示平均效价为3.6×107FFU/ml。这些结果表明从使用体外转录的RNA转染的细胞中拯救了有活力且具感染力的北美1型PRRSV。
GFP插入：通过将GFP基因序列(Clontech)插入质粒pSD01-08中病毒基因组的Nsp2区域(核苷酸2420/2421)构建pSD01-08-GFP克隆。用正向引物gfpF和反向引物gfpR从pEGFP-N1质粒(Clontech)中扩增GFP基因。使用引物对Nsp2F1/Nsp2R1和Nsp2F2/Nsp2R2通过重叠延伸PCR技术(Ho等，1989，Jesperson等，1997)插入GFP。PCR产物使用Rsrl1和Acl1限制性酶消化，并连入用相同限制性酶消化的pSD01-08质粒中。
PRRSV的体外转录和拯救：质粒pSD 01-08或者pSD01-08-GFP用限制性酶Xba1线性化。使用mMessage Machine试剂盒(Ambion)用T7 RNA聚合酶转录加帽的RNA，并按照生产商说明书使用DMRIE-C试剂(Invitrogen)将所述加帽的RNA转染至BHK-21细胞。为了拯救病毒，将转染后48小时获得的细胞培养物上清液在MARC-145细胞上连续传代。感染性病毒的拯救通过间接的免疫荧光分析(IFA)(Ropp等，2004)来确认。开发单克隆抗体(MAb)用于IFA检测，包括特异识别SD01-08的Nsp2的MAb ES3-458-46(Fang等，Conf.Res.Work.Anim，Dis.，abstr.78，2004)。MAb MR39特异性识别北美2型PRRSV的N蛋白，而MAbSDOW17识别两个基因型的PRRSV的N蛋白(Nelson等，1993；Ropp等，2004)。针对GFP病毒的拯救，GFP的表达也使用荧光显微镜直接目测。
通过使用MOI为0.1的克隆病毒和亲本病毒感染MARC-145细胞来检查生长动力学。在感染后0、6、12、24、36、48、60和72小时收集被感染细胞，通过对MARC-145细胞的IFA确定病毒的效价并按每毫升的荧光灶单位(fluorescent focus unit per ml，FFU/ml)定量。通过对MARC-145细胞进行噬斑分析来比较克隆病毒和亲本病毒的噬斑形态。以0.1MOI的病毒感染汇合的细胞单层。两小时后，除去细胞培养物上清液，并加上琼脂覆盖层。37℃下5天后，检测噬斑，并用0.1％结晶紫染色。
克隆病毒的体外表征。亲本病毒和克隆病毒(MARC-145细胞上的第2代)在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中进行滴定。使用抗-N mAb进行的免疫荧光染色显示两种病毒均在PAM中复制(图2E和2F)，并在72hpi产生相似的病毒产量(2.1-2.8×104FFU/ml)。
为进一步比较克隆病毒和亲本病毒的生长特性，MARC-145细胞被MOI为0.1的每种病毒感染，并在6、12、24、36、48、60和72hpi收获。生长曲线结果显示克隆病毒拥有和亲本病毒相似的生长动力学(图3)。两种病毒的效价均在48hpi达到峰值。克隆病毒效价的峰值是1.39×107FFU/ml，相比于亲本病毒效价的峰值为2.34×107FFU/ml。这些病毒的噬斑形态也被检查，克隆病毒产生的噬斑的大小与亲本病毒的噬斑的大小相似(数据未显示)。这些结果表明克隆病毒具有与亲本野生型病毒相似的体外特性。
为区分克隆病毒和亲本病毒，我们在ORF7的42位核苷酸工程改造了Sca1限制性酶位点。如图4所示，克隆病毒中13875到14928位核苷酸扩增产生的1054bp的RT-PCR片段被Sca1切割。相反，亲本病毒产生的RT-PCR片段不被Sca1切割。
pSD 01-08衍生的克隆病毒在猪模型中的病原和免疫学特性。利用看护猪模型(nursery pig model)进行了感染性克隆衍生病毒复制特性的体内研究。21头4周大的PRRSV幼稚的猪从被证明为PRRSV阴性的猪群中获得，并被随机分成4组，分别圈养在隔离的设施中。在4天的驯化期之后，每组的猪(对于克隆病毒感染组，n＝6；对于剩余组，n＝5)鼻内接种1毫升105TCID50的克隆病毒(组1)或者亲本病毒(组2)。第三组动物接种目前的改造的活病毒(MLV)
Figure GPA00001035001100131
PRRSV疫苗。负对照组(组4)动物使用MARC-145细胞培养物的上清液进行模拟攻击。
在感染后前7天，每天观察猪的临床病征并量取其体温。在0、7、14、21、28、35和42天从所有猪获取血液样品。血清样品保存在-80℃以备进一步的检测。在接种后21天(dpi)，从每组取两头猪，对其实施安乐死，以便进行急性感染的事后分析。每组剩余的三头猪在42dpi进行安乐死。使用以前开发的基于每个肺叶贡献给整个肺的大概容量的系统来评估研究动物的肺损伤：左顶叶和右顶叶、左心叶和右心叶以及中叶各自贡献了总肺容量的10％，而左尾叶和右尾叶各自贡献了25％。然后使用这些得分基于每个肺叶的相对贡献计算总的肺损伤得分(Halbur等，1995)。
为检测病毒RNA及确定病毒量，0、7、14、21、28、35和42dpi的血清样品使用实时定量PCR(Tetracore VetAlert PRRS；Wasilk等，2004)来检测，此技术在南达科他动物疾病研究和诊断实验室(SDSU-ADRDL)是常规使用的。所有血清样品使用IDEXX
Figure GPA00001035001100132
PRRS 2XR ELISA和病毒中和分析(VN)来评估抗-PRRSV抗体。在SDSU-ADRDL，这些检测也是以严格的质量保证方针常规实施的。
所有接受病毒的猪都被感染，这一点通过病毒RNA在血清中存在的阳性RT-PCR结果和血清学得到证实。血清中的病毒在感染后约14天(dpi)达到峰值(图5A；表3)。在14dpi，克隆病毒组6头猪中的5头，亲本病毒组5头猪中的4头，以及疫苗组的所有5头猪已血清转变(图5B；表3)。克隆病毒攻击组6头猪中的4头在21dpi具有可检测的中和抗体效价，而亲本病毒攻击组5头猪中的1头在21dpi发展出中和抗体。MLV疫苗攻击组中的2头猪在42dpi发展出可检测的中和抗体效价(表3)。
表3.感染后不同天数(dpi)接种的猪的血清的血清学和PCR结果小结。
Figure GPA00001035001100141
apCR：由实时PCR确定的每一组中PCR阳性的猪的数量/猪的总数；bELISA：由IDEXX
Figure GPA00001035001100142
PRRS 2XR ELISA确定的每一组中血清阳性的猪的数量/猪的总数；cVN：由荧光灶中和分析确定的发展中和抗体应答的猪的数量/猪的总数。结果被解释为病毒感染减少90％。
*两头猪在21天被实施安乐死用于急性感染的分析。
所有模拟感染的猪在整个研究期间保持RT-PCR和PRRSV抗体阴性。在任何被感染的猪中都没有观察到明显的临床病征。仅在克隆病毒组6头猪中的3头，亲本病毒组5头猪中的5头以及疫苗组5头猪中的2头观察到轻微的PRRSV特征的病理性肺损伤，例如微弱的间质性肺炎。其余的猪没有表现出总的肺损伤(表4)。有趣的是，当比较不同组的猪的病理性损伤时，被亲本病毒感染的猪显示略高的损伤得分。
表4.被感染的猪中具有总的肺炎损伤的肺的百分比。
Figure GPA00001035001100151
*总的肺的病理学通过使用总的猪肺损伤评分系统来评测，这个系统评估肺的每个肺叶的％肺炎，且每个肺叶的％肺炎加起来为整个肺的％肺炎(10)。
将绿色荧光蛋白引入感染性克隆的Nsp2区。我们探索了利用此感染性克隆表达外源基因的潜力。以前的研究显示Nsp2是外源基因插入的优秀候选位点。1型和2型两者的Nsp2的C末端区都含有高变结构域，包括氨基酸插入和缺失(7、8、27)。SD01-08和欧洲1型病毒的原型成员LV的主要不同之一是Nsp2中存在17个氨基酸的缺失，该缺失位于LV的ORF1的734到750位氨基酸之间。我们将绿色荧光蛋白(GFP)插入Nsp2的这一独特缺失位点(SD01-08ORF1a的733/734位氨基酸，图7)。构建体pSD01-08-GFP被体外转录并转染进BHK-21细胞。转染后48小时后在荧光显微镜下直接检查活细胞。将来自转染的BHK细胞的细胞培养物上清液在MARC-145细胞上传代，导致表达GFP细胞的出现，这些细胞最早在感染后6小时就可以清楚显现(图6A)。为确认GFP-Nsp2融合蛋白的表达，在感染后48小时，固定细胞并用Nsp2特异性mAb ES3-4 58-46染色。ES3-4 58-46通过用从ES3表位序列制备的合成肽免疫接种小鼠产生，ES3表位序列位于GFP插入位点的紧接上游(图7)。红色荧光Cy3偶联的山羊抗小鼠IgG被用作二抗。共聚焦显微镜显示GFP和Nsp2都定位于核周，这与亲本病毒的Nsp2定位相似(图6B和6C)。为确定GFP的表达是否影响病毒复制，将GFP病毒的生长特性与亲本野生型及克隆病毒的生长特性进行比较。pSD01-08-GFP病毒的复制周期与其它病毒相似，包括在48hpi达到病毒效价峰值；但是，GFP病毒感染的效价的峰值降低了约10倍(图3)。
为研究多轮病毒复制后GFP表达的稳定性，将GFP病毒在MARC-145细胞上连续传代8次。到第7代，出现了不表达GFP的病毒的亚群体，它占总病毒群体的15％。GFP的丢失也通过RT-PCR被分析。从用第7代的GFP病毒感染的细胞中分离总细胞RNA，并将RNA用作RT-PCR反应的模板，此反应使用扩增GFP插入区域的引物。RT-PCR产物被克隆和测序。结果显示GFP的N末端1-159位氨基酸被缺失(图7)。更有趣的是，在1-159位氨基酸被缺失的同时，两个氨基酸，即甲硫氨酸(M)和谷氨酸(E)，被病毒插在GFP的160位氨基酸前面(图7)。因此，编码GFP基因中的缺失的病毒基因组的选择解释了表达GFP的感染细胞的百分比的下降。综合而言，这些结果表明Nsp2区能够耐受外源基因的引入。然而，外源基因的插入降低病毒的复制水平。因此，正标记，即GFP基因，是不稳定的。
II.负标记病毒GFP/ΔES4
GFP/ΔES4负标记疫苗病毒的构建。为获得潜在的负标记疫苗病毒，使用引物对ΔES4F/E3448R和E1895F/ΔES4R(表5)通过重叠延伸PCR技术(Hayashi等，1994)缺失位于GFP下游(在SD01-08病毒基因组的2427到2591位核苷酸)的B细胞表位ES4。PCR产物经过Rsrl1和EcoRV限制性酶消化并连入经过相同限制性酶消化的pSD01-08-GFP质粒。得到的质粒构建体被命名为pSD01-08-GFP/ΔES4(图8)。
表5.用于ES4表位缺失和ELISA抗原表达的引物。
引物名称 序列*   SD01-08中的基因组位置@
  ΔES4F   5’caa gtc ctc tac agg gcc cat act cSEQ ID NO.32   2421-24262592-2606
  ΔES4R   5’ggc cct gta gag gac ttg tac agc tcSEQ ID NO.33   2421-24262592-2599
  E1895F   5’ctt gct gat cca cct cct cag gSEQ ID NO.34   1905-1926
  E3448R   5’ccg tcg gag ggg gtg gca tccSEQ ID NO.35   3377-3397
  Nsp2-2144F   5’gtc tgt gtc ctt gga cga gtgSEQ ID NO.36   2144-2164
  Nsp2-2694R   5’cca agc ggc caa gga tag atcSEQ ID NO.37   2694-2714
  pET-EGFP-F   5’cgg gat cca tgg tga gca agg gcg aggagcSEQ ID NO.38   -
  pET-EGFP-R   5’cct aag ctt cct tgt aca gct cgt cca tgccgSEQ ID NO.39   -
  pET-ES4F1   5’gc aga tct tca gac tcc aag aga gaaSEQ ID NO.40   2427-2444
引物名称 序列*   SD01-08中的基因组位置@
  pET-ES4F2   5’gc aga tct ggt ggt ggt ggt tcc tca gac tccaag aga gaaSEQ ID NO.41   2427-2444
  pET-ES4R   5’at ccc aag ctt gcg ggg atc ccg gga caaatc ctc gSEQ ID NO.42   2577-2591
*GFP的核苷酸为粗体，限制性酶位点为斜体带下划线；
@数字对应于SD01-08基因组内的核苷酸位置。
图8是pSD01-08-GFP/ΔES4构建体的示意图。GFP被插入到ORF1a的733和734位氨基酸之间，而位于GFP下游的免疫原性B细胞表位ES4(736到790位氨基酸)从SD01-08病毒中被缺失。将此质粒DNA直接转染入BHK-21细胞启动了完整的病毒复制周期。转染后48小时获得的来自BHK-21细胞的细胞培养物上清液在MARC-145细胞上传代，回收感染性后代病毒，并将得到的病毒命名为GFP/ΔES4标记病毒。亲本病毒SD01-08平行地从pSD01-08 cDNA克隆中产生。从MARC-145细胞得到的病毒的第2代用于体外和体内表征。
生长动力学研究显示GFP/ΔES4标记病毒以较慢的动力学进行复制，比亲本病毒SD01-08晚几个小时达到最高效价。标记病毒的病毒效价峰值(3.34×104FFU/ml)比亲本病毒的病毒效价峰值(2.56×106FFU/ml)低约两个对数级(图9)。图9显示GFP/ΔES4标记病毒的生长动力学。MARC-145细胞平行地用MOI为0.1的第三代的GFP/ΔES4标记病毒和亲本病毒进行感染。感染后0、6、12、24、36、48、60和72小时，收获细胞并通过对MARC-145细胞进行IFA以确定病毒效价。这些结果是实验的三个重复的平均值，并且病毒的效价被表示为每毫升的荧光灶单位(FFU/ml)。标记病毒和亲本病毒的噬斑形态通过对MARC-145细胞进行噬斑分析来比较。由GFP/ΔES4标记病毒形成的病毒噬斑的大小急剧减小，并且大多数噬斑为针尖大小(图10)，这暗示GFP插入/ES4缺失对于感染过程中细胞到细胞的扩散速率有负效应。图10显示GFP/ΔES4标记病毒(10-1)和亲本病毒(10-2)的噬斑形态。汇合的细胞培养物单层用MOI为0.1的病毒进行感染。感染2小时后，移去细胞培养物上清液并加上琼脂覆盖层。37℃下5天后检测噬斑，并用0.1％结晶紫染色。
重组病毒中GFP插入或者ES4缺失的体外稳定性通过MARC-145细胞中的10次连续传代(每次传代孵育72小时)来追踪。第十代病毒的GFP/ΔES4区被测序。令人惊奇地是，与经历了N末端159氨基酸缺失的先前的SD01-08-GFP病毒不同，GFP/ΔES4标记病毒中的GFP保持为完整的全长基因，且ES4缺失仍然存在。这一结果表明ES4表位区的缺失提高了插入的外源基因GFP的稳定性。感染细胞中的一小部分被鉴定到GFP相关荧光的丢失(图11)。用第10代的GFP/ΔES4标记病毒感染的MARC-145细胞中的GFP表达显示于11-1。用AlexiFluor标记的抗核壳体单克隆抗体SDOW17(Nelson等，1993)染色的相同病毒灶显示于11-2。丢失GFP荧光的病毒群体用圆圈标出。
对于GFP/ΔES4区域，我们进行了三次独立重复的PCR和测序(正反两个方向)。因而，总共得到六个序列。在其中一个序列中，核苷酸C-289到T-289的突变被鉴定出，这个突变引起GFP的位置97处由精氨酸到半胱氨酸的氨基酸突变，而这可能对应于丢失GFP相关荧光的小部分被感染细胞(图12)。在其他5个序列上没有检测到突变。图12显示野生型GFP基因和Arg-97突变的GFP基因相比较的电泳图。细胞培养的第10代的GFP/ΔES4标记病毒的GFP插入区域被测序。氨基酸由单字母符号表示，粗体字母指示从CGC(Arg)到TGC(Cys)的突变氨基酸。
ES4和GFP抗原的表达。ES4抗原使用以前描述的改良方法(Sun等，2004)表达为串联重复的ES4表位。简述之，将三个拷贝的ES4表位(SD01-08的ORF1a的736-790位氨基酸)构建进蛋白表达载体pET-28a(+)(Novagen)。在表位之间加入柔性肽连接体，即GGTGGTGGTGGTTCC，以帮助展示表位。有两个正向引物。正向引物1 pET-ES4F1含有BglII限制性位点，但是没有连接体序列，而正向引物2pET-ES4F2不仅包含BglII限制性位点，而且包含连接体序列。ES4基因片段首先用正向引物1和反向引物pET-ES4R扩增。PCR产物用BglII和HindIII消化，然后克隆进用BamHI和HindIII消化的pET-28a。这个克隆被命名为pET-28a-ES4(+1)。ES4的第二个拷贝用正向引物2和反向引物pET ES4R进行PCR扩增。PCR产物用BglII和HindIII消化，然后克隆进用BamHI和HindIII消化的pET-28a-ES4(+1)。ES4的第三个拷贝利用和第二个拷贝同样的策略插入。最终的构建体被命名为pET-28a-ES4(+3)。用引物对pET-EGFP-F/pET-EGFP-R从pEGFP-N1质粒(Clontech)扩增GFP基因。PCR产物用BamHI和HindIII限制性酶消化并连入用相同酶消化的pET-28a载体。重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，从而生成N末端带有6个组氨酸残基的融合蛋白。所述蛋白用镍亲和层析纯化，并用SDS-PAGE分析，如我们以前的出版物中所述(Ferrin等，2004)。
GFP/ΔES4标记病毒的体内表征。GFP/ΔES4标记病毒的体内特性在看护猪疾病模型中进行研究。18头4周大的猪购自无PRRSV的猪群。动物被随机分成三组(n＝6/组)，在BL2隔离条件下圈养，在开始实验接种前先驯化7天的时间。组1的猪用GFP/ΔES4标记病毒感染，组2的猪用亲本SD01-08病毒感染作为正对照，组3的猪用细胞培养基模拟感染。组1和组2的猪用1x10650％组织培养感染剂量(TCID50)的病毒(每个部位1毫升)通过鼻内和肌肉内两个部位进行接种。感染后42天(dpi)，组1和组2的猪用异源的1型株系即SD03-15病毒攻击。
SD03-15是另一个美国1型株系，是在2003年提交到我们诊断实验室的临床样品中分离得到的。在实地报告中，感染了SD03-15的猪经历了3周时间内80-90％的断奶前死亡率。减少的表现持续到肥育期。在成年母猪群体中，和以前的美国PRRSV爆发相比具有轻微的流产发作。我们以前的实验动物研究也证明了这种病毒的致病本质(Lawson等，Proc.Conf.Res.Work.Anim.Dis.，abstr.99，2005)。
组3中的三头猪用SD03-15病毒进行攻击，另外三头猪保持为模拟感染对照。在感染后的前7天和攻击后的前7天每日观测猪的临床病征和体温。比较不同攻击组之间的平均温度应答。在攻击前一天和攻击后7天测量直肠温度。在最初感染之后没有在任何猪中检测到温度升高并且没有观察到临床病征。攻击后，组3(最初模拟感染)中的三头被攻击的猪中的直肠温度在攻击后一天和两天升高(图13)。在这三头猪中也观测到了临床病征(咳嗽和鼻分泌物)。剩余的猪依旧无症状。每周一次从所有猪获取血液样品。在攻击后21天猪被实施安乐死。使用以前开发的基于每个肺叶贡献给整个肺的大概容量的系统来评估研究动物的总的肺损伤：左顶叶和右顶叶、左心叶和右心叶以及中叶各自贡献了总肺容量的10％，而左尾叶和右尾叶各自贡献了25％。然后使用这些得分基于每个肺叶的相对贡献计算总的肺损伤得分(Halbur等，1995)。验尸时，在组1、组2和所述的三头严格负对照的猪中没有观察到总的病理学损伤。相反，在组3中的最初模拟感染后来用SD03-15攻击的那三头猪中观察到了轻微的PRRSV特征性的总的病理学肺损伤。
病毒学和免疫学性质。确定了标记病毒的体内病毒学和免疫学性质。猪在42dpi时接受攻击，在图14A-14C中被显示为垂直虚线。病毒血症的持续时间和高度用实时PCR确定，并且结果被解释为每毫升的RNA拷贝数。在感染后的每一天，具有不同大写字母(A、B或C)的平均病毒量差异显著(P＜0.05)。与组2用亲本病毒感染的猪(平均病毒效价的峰值＝5.9x107拷贝/毫升)相比，用GFP/ΔES4标记病毒感染的猪具有较低的病毒量峰值(平均病毒效价的峰值＝2.08x105拷贝/毫升，图14A)。在攻击后7天，接种疫苗的猪比最初模拟感染然后用SD03-15病毒攻击的那些猪的病毒量低二到三个对数。到攻击后21天，GFP/ΔES4标记病毒感染组的猪与亲本组相比具有低10倍的病毒量，并且3/5的猪消除了血清中的病毒(图14A；表6)。
表6.通过定量PCR测定的用遗传不同的株系SD03-15攻击后21天血清中的病毒量。
*负对照组中的三头猪在42dpi时用异源株系SD 03-15进行攻击。
到14dpi时，感染组中的所有猪已血清转变。PRRSV特异性血清抗体通过IDEXX
Figure GPA00001035001100212
PRRSV ELISA 2XR试剂盒测定。S/P比率大于0.4被认为是阳性。抗体应答在21dpi后达到近似水平(图14B)。
病毒中和抗体应答通过荧光灶中和分析确定(图14C)。结果被解释为病毒感染有90％的减少，并且中和抗体效价表达为平均值(n＝6)并表示为log2标度。亲本的SD01-08病毒被用于病毒中和分析。在感染后的每一天，具有不同大写字母(A、B或者C)的平均值差异显著(P＜0.05)。血清中和(SN)抗体水平的进一步测量显示，在感染亲本病毒的猪中，到感染后21天从六头猪中的一头猪中检测出SN抗体，并且到感染后35天，3/6的猪发展出可检测的SN效价，其几何平均效价(GMT)达到了2。相反，在感染了GFP/ΔES4标记病毒的猪中，中和抗体应答发展得更快且更高。到感染后14天，从六头猪中的一头猪中检测出SN抗体，并且到感染后35天，在这个组中的所有猪中检测到SN效价，其达到了9.2的平均GMT。在用SD03-15攻击后，观察到增强的效应，在49dpi(攻击后一周)时GFP/ΔES4标记病毒感染组的GMT为18.4，与之相比亲本病毒感染组的GMT为5.7。两组在62dpi(攻击后三周)达到了相似的SN效价(图14C)。这些数据表明在最初感染时，感染了GFP/ΔES4标记病毒的猪比亲本病毒感染的猪产生更高的中和抗体效价。
病毒分离和测序。来自7、14、21和28dpi的血清样品被用于如前所述的病毒分离(Wasilk等，2004)。病毒的存在通过使用PRRSV特异性抗体SDOW17(Nelson等，1993)的IFA证实。为确定GFP插入和ES4表位缺失的稳定性，利用QIAamp Viral RNA微量试剂盒(Qiagen)按照生产商的说明书从血清分离的病毒中提取病毒RNA。使用如前所述的方法(Fang等，2004)进行RT-PCR。RT-PCR扩增的片段被凝胶纯化，并在爱荷华州立大学测序机构(Ames，IA)确定序列。引物对nsp2-2144F/nsp2-2694R(表5)被用于RT-PCR和测序，并扩增包含GFP插入和ES4缺失的核苷酸区域(SD01-08基因组的2144到2694)。GFP/ΔES4标记病毒的全长序列被提供在SEQ ID NO.43中(表7)。
GFP/ΔES4标记的体内稳定性。为确定GFP/ΔES4标记的稳定性，来自7到28dpi的血清样品被用于MARC-145细胞中的病毒分离。从7、14和21dpi收集的血清样品中回收病毒，但从28dpi收集的血清样品中没有分离出病毒。在细胞培养物中，我们仅观察到一小部分用7和14dpi分离的病毒感染的细胞显示微弱的GFP荧光，用21dpi分离的病毒感染的细胞中没有观察到GFP荧光。但是，使用核壳蛋白特异性单克隆抗体SDOW17的免疫荧光染色证实大量病毒的存在，这与体外研究中观察到的相似(图11)。GFP插入/ΔES4缺失的稳定性通过对相应区域的测序来确定。结果证实ES4缺失的存在，并且GFP完整的保持为全长基因。然而，测序结果揭示出位于GFP的144位核苷酸(C到T)和289位核苷酸(C到T)的两个点突变。144位核苷酸突变是沉默的，但是289位核苷酸突变引起GFP的97位由精氨酸(R)到半胱氨酸(C)的氨基酸突变，这和我们的体外测序分析是一致的(图12)。有趣的是，在7和14dpi分离的病毒中还检测到小部分无突变的GFP基因。对于每个dpi，我们对从三头猪分离的病毒进行了测序，并且测序使用正向和反向两种引物来进行，对于每个dpi得到总共六个序列。对于7dpi分离的病毒，1/6序列被发现没有97位的突变，而其他五个序列被确定包含所述R到C的突变。对于14dpi分离的病毒，2/6序列被鉴定为无突变，而这两个序列是从两头不同的猪而来。其他4个序列也被鉴定为包含所述R到C的突变。所有从21dpi的病毒产生的序列包含所述R到C的突变。这一数据与GFP荧光的丢失是因为R到C突变的先前报道(Kim等，2007)是一致的。小部分的无突变的GFP的存在可以解释在细胞培养物中观察到的微弱地发荧光的细胞。这些结果暗示选择可能是逐渐地发生的，以产生有利于提高的病毒复制的突变。
基于GFP和ES4表位的ELISA。ELISA使用Immulon II HB 96孔微量滴定板(Thermo Labsystems，Franklin，MA)进行。重组蛋白在包被缓冲液(15mM碳酸钠-35mM碳酸氢钠，pH9.6)中进行稀释，并在第1、3、5、7、9和11列用100微升稀释的抗原包被所述板。用100微升包被缓冲液对第2、4、6、8、10和12列进行处理以作为背景对照。将板在37℃孵育1个小时，然后用于PBST缓冲液(具有0.05％Tween 20的1x PBS)中的10％牛奶在4℃过夜封闭多余的蛋白结合位点。所测试的血清按照于具有5％牛奶的PBST缓冲液中的1∶5的稀释度应用。在37℃孵育1小时后，板用PBST洗涤，并加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗猪IgG(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)以结合任何PRRSV血清抗体，所述PRRSV血清抗体结合板上的抗原。板在37℃孵育另一个小时，洗涤，并加入过氧化物酶底物ABTS(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)以进行显色。显色通过用XChek软件(IDEXXLaboratories)控制的EL800微板读数器(BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT.)在405nm读数来量化。
开发了伴随区分诊断分析以区分接种标记疫苗的动物和那些自然感染野生病毒的动物。因为使用了两个标记GFP插入(正标记)和ES4缺失(负标记)，所以我们开发了基于GFP和ES4表位的两种ELISA分析来检测标记。GFP和ES4表位二者都被表达为可溶性重组蛋白。我们评估这两种ELISA测试来检测特异性抗体。图15A显示来自基于ES4表位的ELISA的结果，而图15B显示来自基于GFP抗原的ELISA的结果。猪在感染后42天被攻击，显示为图15A中的垂直虚线。如所预期的，用GFP/ΔES4标记病毒对组1的猪的感染没有诱导可检测的抗缺失的ES4表位的抗体应答(图15A)，但是诱导了强烈的抗GFP抗原的抗体应答，该应答从14dpi开始并持续至研究的持续时间到62dpi(图15B)。相反地，组2的猪用亲本病毒感染，对ES4重组蛋白特异性抗体能够在21dpi被检测到，并同样地持续到62dpi(图15A)，但没有检测到抗GFP抗原的特异性抗体应答(图15B)。在周03-15攻击之后，组1的猪在攻击后一周表现出对ES4表位的可检测的抗体应答，因为03-15病毒包含ES4表位(图15A)。对于来自三个严格负对照的猪的血清样品，基于GFP和ES4表位的两种ELISA均没有检测到特异性抗体应答(图15A和15B)。
来自其他1型和2型PRRSV感染动物的血清样品。对于负标记的基本要求是其抗原区域应该能够和一大组野生病毒反应。为确保ES4表位在各种病毒的株系中能够是反应的，我们使用来自感染美国1型病毒的四种代表性株系，即SD01-07、SD01-08、SD02-11和SD03-15(Lawson等，Proc.Conf.Res.Work.Anim.Dis.，abstr.99，2005)中的每个的猪的血清样品。SD01-07和SD01-08分离株从没有表现临床疾病的猪群获得，而SD02-11和SD03-15从幼猪有显著发病率和死亡率的猪群中获得。这四个分离株也被归入针对美国起源的1型PRRSV分离株(Fang等，2007)开发的系统树的不同分支。来自感染2型病毒VR2332的实验猪的血清样品，是从PRRSV合作农业项目(CAP)的共享试剂资源中获得的。如图15C所示，ES4表位与来自感染这四个病毒株系的所有猪的抗血清反应。结果被表示为平均值(n＝6)。抗体应答在14dpi被检测，并持续超过62dpi。然而，来自感染2型原型株系VR2332的实验猪组的血清样品的进一步检验，显示与ES4表位在ELISA上没有反应性(数据未显示)。因而，需要另一血清学测试以区分感染1型病毒的动物和那些感染2型病毒的动物。
III.讨论
在PRRS病毒nsp2区域中的两个遗传标记被构建。正标记(GFP插入)将允许已经接种疫苗的动物的检测，而负标记(ES4表位缺失)将允许检测动物中野生型病毒的存在。与由传统的多轮细胞培养传代技术制备的MLV相比，使用这种精确限定的减毒的缺失/插入类型构建的疫苗以及反向遗传学技术的使用降低了回复突变成毒性的野生型病毒的潜在危险。
标记疫苗仅在适合的测试(伴随诊断测试)可用于监控疫苗接种水平和跟踪感染的空间过程时是有用的。基于GFP抗原的ELISA在感染标记病毒的猪的组中检测到高水平的抗-GFP应答。基于ES4表位的ELISA在感染亲本病毒的猪的组中也检测到高水平的抗体应答，但表现出比抗-GFP应答的水平发展得更慢。高水平、稳健的抗-GFP应答能够在14dpi时在感染标记病毒的猪中检测到，而在感染野生型病毒的猪中，抗-ES4抗体应答在21dpi时被检测到并在28dpi时达到更高水平。ES4表位在1型病毒的nsp2鉴定出的六个B-细胞表位(Oleksiewicz等，2001)中具有最高的亲水性值(Hopp&Woods，1981)。对现在可利用的1型PRRSV的nsp2氨基酸序列(Meulenberg等，1993；Fang等，2007)的分析显示这个区域在1型基因型内拥有63.6％到100％的氨基酸序列同一性。蛋白序列分析显示ES4表位区，AA736-AA790，实际上包含7个小的B-细胞表位(Pep Tool，Bio Tools，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada)。表位AA745-AA754和AA768-AA780在1型基因型中是相当保守的。我们的ES4 ELISA数据与蛋白序列分析是一致的，表明ES4表位能够与感染1型PRRSV的4个代表性野生株系的动物的血清样品反应。然而，ES4表位不和感染2型分离株的动物的血清样品反应。在nsp2区域鉴定出的B-细胞表位(Oleksiewicz等，2001；de Lima等，2006)的比较中，nsp2区域中鉴定出的表位没有一个是在1型和2型分离株之间保守的。因而，需要另一诊断分析以区别接种ES4表位缺失的突变体的猪和那些感染2型野生株系的猪。
nsp2区域中的ES4表位看起来对于PRRSV复制不是必须的，但可能在体内的病毒衰减和致病中起重要的作用。单独的GFP插入没有大量地减弱病毒的体外生长特性，然而，当GFP下游的ES4表位被缺失掉时，病毒效价与亲本病毒的效价相比被降低了至少两个对数。噬斑形态也显示标记对于病毒生长的负效应。体内表征进一步显示GFP/ΔES4标记病毒被减毒，其比野生型病毒具有更低水平的病毒血症和更高水平的中和抗体应答。蛋白质序列分析显示ES4表位区包含nsp2上最高的亲水性值(Hopp&Woods，1981)。
令人惊奇的是，ES4表位的缺失提高了nsp2中GFP插入的稳定性。另一个有趣的观察结果是体外和体内的GFP荧光丢失，尽管GFP基因保持完整。序列分析鉴定出在GFP中Arg-97到Cys的突变。所述Arg-97到Cys的突变正是从插入2型病毒nsp2区的GFP中鉴定出的相同的氨基酸突变(Kim等，2007)。如Kim等(2007)所示，Arg-97在GFP发色团的形成中起关键作用，这暗示发色团的形成可能影响nsp2的功能。此外，因为Cys是通常参与形成蛋白质中二硫键的氨基酸，额外的二硫键可能是维持nsp2的正确构象以行使功能所需要的。尽管如此，GFP在体内保持它的免疫原性，并且用作区别接种疫苗的动物和野生型病毒感染的动物的优秀的正标记。
本说明书中的所有出版物和专利申请表明此项发明所属的领域中的普通技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个个体出版物或者专利申请被特别地且单独地通过引用而指出的程度。
本发明已经通过参考各种实施方案和技术来描述。但是，应该理解的是可进行许多变化和修改，而仍保持在本发明的精神和范围中。
表7GFP/ΔES4标记病毒的全长序列(SEQ ID NO：43)
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<400>17
caacgatcct accgccgcac aa                       22
 
<210>18
<211>79
<212>DNA
<213>人工；引物
<400>18
ggcgatcggg cgtctaggaa ttctagattt tttttttttt tttttttttt tttttttttt    60
ttttttttaa tttggtcac                                                 79
 
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>19
ggcgatcggg cgtctaggaa ttc                                            23
 
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>20
caacgatcct accgccgcac aa                                             22
 
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>21
ggccccagtg ctgcaatgat ac                                             22
 
<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>22
agaagaaaaa gaaaagtact gctccaatgg g                                   31
 
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>23
ccccattgga gcagtacttt tctttttctt      30
 
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>24
gctcagatgg tgagcaaggg cgaggagc        28
 
<210>25
<211>31
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>25
gagtctgaag aggacttgta cagctcgtcc a    31
 
<210>26
<211>28
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>26
tgctgacttt cttgctgatc cacctcct        28
 
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>27
ccttgctcac catctgagca ctcccg          26
 
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>28
gctgtacaag tcctcttcag actccaaga    29
 
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>29
gcggacccag ccaggatcag ac           22
 
<210>30
<211>100
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORFla的691至790
 
<400>30
 
Gln Glu Ser Gly His Lys Ala Val His Ala Val Pro Leu Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Pro Asn Asn Glu Gln Val Gln Val Val Ala Gly Glu Gln Leu Glu Leu
            20                  25                  30
Gly Gly Cys Gly Leu Ala Ile Gly Ser Ala Gln Ser Ser Ser Asp Ser
        35                  40                  45
Lys Arg Glu Asn Met His Asn Ser Arg Glu Asp Glu Pro Leu Asp Leu
    50                  55                  60
Ser His Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr Thr Leu Val Gly Glu Gln Thr
65                  70                  75                  80
Pro Asp Asn Pro Gly Ser Asp Ala Ser Ala Leu Pro Ile Ala Val Arg
                85                  90                  95
Gly Phe Val Pro
            100
 
<210>3l
<211>241
<212>PRT
<213>人工；GFP插入
 
<400>31
 
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1               5                   10                  15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
        35                  40                  45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
    50                  55                  60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65                  70                  75                  80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
                85                  90                  95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
            100                 105                 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
        115                 120                 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
    130                 135                 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Met
145                 150                 155                 160
Glu Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
            180                 185                 190
Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser
        195                 200                 205
Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu
    210                 215                 220
Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr
225                 230                 235                 240
Lys
 
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>32
caagtcctct acagggccca tactc    25
 
<210>33
<211>26
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>33
ggccctgtag aggacttgta cagctc   26
 
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>34
cttgctgatc cacctcctca gg       22
 
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>35
ccgtcggagg gggtggcatc c        21
 
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>36
gtctgtgtcc ttggacgagt g        21
 
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>37
ccaagcggcc aaggatagat c        21
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>38
cgggatccat ggtgagcaag ggcgaggagc              30
 
<210>39
<211>32
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>39
cctaagcttc cttgtacagc tcgtccatgc cg           32
 
<210>40
<211>26
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>40
gcagatcttc agactccaag agagaa                  26
 
<210>41
<211>41
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>41
gcagatctgg tggtggtggt tcctcagact ccaagagaga a 41
 
<210>42
<211>34
<212>DNA
<213>人工；引物
 
<400>42
cccaagcttg cggggatccc gggacaaatc ctcg         34
<210>43
<211>15521
<212>DNA
<213>人工；SD01-08GFP/ES4标记病毒
 
<400>43
atgatgtgta gggtatcccc cctacataca caacactttt tgtgtttgtg tactttggag     60
gcgtgggtac agccccgccc caccccttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct    120
ccctcggggc gagtgcgccg cctgctgctc ccttgcagtg ggaaggacct cccgagtatt    180
tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc    240
ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggaacgc cggccaagtc ttttgcacac    300
ggtgtctcag tgcgcggcct cttctctctc cggaacttca ggacactgac ctcggtgtag    360
ttggattgtt ttacaagcct aaggacaaga ttcactggaa agttcctatc ggcattcctc    420
aggtggagtg tactccatcc gggtgctgct ggctctcagc cgtattccct ttggcgcgca    480
tgacttccgg taatcacaac ttcctccaac gacttgttaa ggttgctgat gttttgtatc    540
gcgatggttg cttggcgcct cgacacctcc gtgaactcca agtttacgag cgcggttgta    600
gctggtaccc aattacgggg cccgtacccg gaatgggttt gtttgcgaac tccatgcacg    660
tgtctgacca gccgttccct ggtgccaccc atgtgttgac taactcgcct ctgcctcagc    720
gggcgtgccg gcagccgttc tgtccatttg aggaagctca ttctgacgtt tacaggtgga    780
agaaatttgt gatttttacg gactcctctc ccaacggtcg atttcgcatg atgtggacgc    840
cggaatccga tgactcagcc gccctggagg tgctgccgcc cgagttagaa cgtcaggtcg    900
agatcctcac tcggagtttt cccgctcatc accctatcaa cctagctgac tgggagctca    960
ctgagtcccc tgagaacggt ttttctttcg gcacgtccca ttcttgcggc cacatcgtcc   1020
agaaccccaa cgtgtttgac ggcaagtgct ggctcacctg ctttttgggc caatcggctg   1080
aagtgtgcta ccacgaggaa catctagcta acgccctcgg ttaccaaacc aagtggggcg   1140
tgcatggtaa gtacctccaa cgcaggcttc aagtccgcgg catgcgtgct gtggtcgatc    1200
ctgacggccc tattcacgtt gaagcgctgt cttgctccca gtcttgggtc aggcacctga    1260
ctctgaataa tgatgtcacc ccaggattcg ttcgcctgac atccatccgc attgtgtcca    1320
acacagaacc caccgctttc cggatctttc ggtttggagc acataagtgg tatggcgctg    1380
ccggcaaacg ggctcgtgcc aaacgtgcca ccaaaagtgg gaaggattcg gccctcgctc    1440
ccaagattgc cccaccggtc cccacctgtg gaatcaccac ctactctcca ccgacagacg    1500
ggtcttgtgg ttggcacgtt cttgccgcca tagtgaatcg gatgataaac ggtgacttta    1560
cgtcccccct gcctcagtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg    1620
ctcaggcgat tcaatgttta caactgcctg ccaccgtggt tcggaatcgc gcctgtccta    1680
acgccaagta cctcataaag ctaaacgggg ttcactggga agtagaggtg agatctggaa    1740
tggctcctcg ttccctttct cgtgaatgtg tagttggcgt ttgctctgaa ggctgtgtcg    1800
caccgcctta tccagcggac gggcttccta aacgtgcact cgaggccttg gcgtctgcct    1860
acagactacc ctcagattgt gttagctctg gtattgctga ctttcttgct gatccacctc    1920
ctcaggaatt ctggactctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccggag cggtccggct    1980
tctccagctt gtataaatta ctcttagagg ttgttccgca aaaatgtggt gctacggaag    2040
gggctttcgt ctatgctgtt gagaggatgt taaaggactg tccgagcccc gaacaggcca    2100
tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tccttggacg    2160
agtgttttcc tgcgggtgtt ccagccgact tcgagccagc atttcaggaa aggccccaaa    2220
gtcccggtgc tgctgtcgcc ctgtgttcac cggacgcaaa agggttcgag ggaacagcct    2280
cggaagaagc tcaagagagt ggccataagg ccgtccacgc tgtacccctt gccgaaggtc    2340
ccaataatga acaggtacag gtggttgctg gtgagcagct agagctcggc ggttgtggtt    2400
tggcaatcgg gagtgctcag atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc    2460
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg    2520
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc    2580
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc    2640
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg    2700
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga    2760
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg    2820
acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca    2880
tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg    2940
acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg    3000
tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg    3060
agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca    3120
tggacgagct gtacaagtcc tctacagggc ccatactccg tcatgttgag cactgcggca    3180
cagagtcagg cgacagcagt tcgcctttgg atctgtcttt tgcgcaaacg ttggaccagc    3240
ctttagatct atccttggcc gcttggccgg tgaaggccac cgcgtctgat cctggctggg    3300
tccgcggtag gtgcgagcct gtctttttaa agcctcggaa agctttctct gatggcgatt    3360
cggcccttca gttcggggag ctttctgagt ccagctctgt catcgagttt gaccagacaa    3420
aagatactct ggtggctgac gcccctgttg acttgacgac ttcgaacgag gccctctctg    3480
cagtcgaccc ttccgaattt gtcgaactca ggcgcccgcg tcattccgca caagccttaa    3540
ttgaccgagg cggtccactt gctgatgtcc atgcgaaaat aaagaaccgg gtgtatgaac    3600
agtgcctcca agcttgtgag cctggtagtc gtgcaacccc agccaccagg gagtggctcg    3660
acaaaatgtg ggatagggtg gacatgaaaa cttggcgctg cacttcacag ttccaggccg    3720
gtcgcattct tgcgtccctc aaatttcttc ctgacatgat tcaagacacg ccgcctcctg    3780
tccccaagaa gaaccgagct agtgacagtg ccggtcagac cgtccctccg cctacggata    3840
tccagcaaga ggatgccacc ccctccgacg ggttatccca tgcatcggat ttttctagtc    3900
gagtgagcac gagctggagt tggaaaggcc ttatgctttc cggcacccgt ctcgcggggt    3960
ctgctggtca gcgcctcatg acatgggttt ttgaagttta ctcccatctc ccagctttta    4020
tactcacact tttctcgccg cggggctcta tggctccagg cgattggttg tttgcaggtg    4080
ttgttttact tgctctcttg ctctgtcgtt cttacccaat actcggatgc cttcccttac    4140
tgggtgtctt ctctggttct ttgcggcgtg ttcgtctggg tgtttttggt tcttggatgg    4200
cttttgctgt atttttattc tcgactccat ccaacccagt cggttcttct tgtgaccacg    4260
attcgccgga atgtcatgct gagcttttgg ctcttgagca gcgccaactt tgggaacctg    4320
tgcgcggcct tgtggttggc ccctcaggtc tcttatgtgt catccttggc aagttactcg    4380
gtgggtcacg tcatctctgg catgttatcc tacgtttatg catgcttaca gatttggccc    4440
tttctcttgt ttatgtggtg tcccaagggc gttgtcacaa gtgttgggga aagtgtataa    4500
ggacagctcc tgctgaggtg gctctcaatg tatttccttt ctcgcgcgcc actcgcaact    4560
ctctcacatc cttgtgtgat cggttccaaa ctcctaaagg agttgatccc gtgcacttgg    4620
caacgggttg gcgcgggtgt tggcgtggtg agagtcccat ccatcaacca caccaaaagc    4680
ccatagctta tgccaatttg gatgaaaaga aaatatctgc tcaaacggtg gttgctgtcc    4740
catacgaccc cagtcaggct atcaaatgtc tgaaggttct gcaggcggga ggggctatcg    4800
tggaccagcc tacgcctgaa gttgttcgtg tgtctgaaat ccccttttca gccccatttt    4860
tcccaaaagt tccagtcaac ccagattgca ggattgtggt ggattcagat acttttgtgg    4920
ctgcagtccg ctgcggttac tcgacagcac aactggtcct aggccggggc aactttgcca    4980
agttgaatca gacccccctt agggactctg cctccaccaa aacgactggt ggggcctctt    5040
atactcttgc tgtggctcaa gtgtctgtgt ggactcttgt tcatttcatc ctcggtcttt    5100
ggttcacatc acctcaagtg tgtggccgag gaaccgctga cccatggtgt tcaaatccct    5160
tttcgtatcc tgcctacggc cctggagttg tgtgctcctc tcgactttgt gtgtctgccg    5220
atggggtcac cctgccattg ttctcagctg tggcacaact ctccggtaga gaggtaggga    5280
tttttatttt agtgcttgtt tccttgactg ccttggccca tcgcctggct cttaaggcag    5340
acatgttagt ggtcttttca gctttttgtg cttacgcctg gcccatgagc tcctggttaa    5400
tctgcttctt tcctatactc ttaaagtggg ttacccttca ccccctcact atgctttggg    5460
tgcactcatt cttggtgttt tgtatgccag cagccggcat cctctcacta gggataactg    5520
gccttctctg ggcagttggc cgctttaccc aggttgccgg aattattaca ccttatgaca    5580
tccaccagta tacctctggg ccacgcggtg cagccgctgt agccacagcc ccagaaggca    5640
cttatatggc cgccgtccgg agagctgctt taactggacg aactttgatc ttcaccccgt    5700
ctgcggtcgg atcccttctt gaaggtgctt tcaggactca taaaccctgc cttaacaccg    5760
tgaatgttgt gggttcttcc cttggttctg gaggggtttt taccattgat ggcagaaaga    5820
ccgtcgtcac tgctgctcat gtgttgaacg gcgacacagc tagagttacc ggcgactctt    5880
acaaccgcat gcacactttt aagaccagtg gcgattatgc ctggtcccat gctgatgact    5940
ggcagggcgt tgcccctgtg gtcaaggttg cgaaggggta tcgcggtcgt gcctactggc    6000
aaacatcaac cggtgtcgaa cccggcgtca ttggggaagg gttcgccttc tgtttcacca    6060
actgtggcga ttcggggtca cccgtcatct cagaatctgg tgatctcatc ggaatccata    6120
ccggttcaaa caaactcggt tctggtcttg tgacgacccc tgaaggggaa acctgcgcca    6180
tcaaagaaac caagctctct gacctttcca gacattttgc gggcccgagc gtccctcttg    6240
gggacattaa attgagtccg gccatcgtcc ctgatgtaac atctattccg agtgacttgg    6300
catcgctcct agcttccgtc cctgtaatgg aaggcggcct ctcgaccgtt caacttctgt    6360
gtgtcttttt ccttctctgg cgcatgatgg gccatgcctg gacacccatt gttgccgtgg    6420
gcttcttttt gctgaatgaa attcttccag cagttttggt ccgagccgtg ttttcctttg    6480
cactctttat tcttgcatgg gccaccccct ggtccgcaca ggtgttaatg attagactcc    6540
tcacggcatc cctcaaccgc aacaagttgt ctctggcgtt ctacgcactt gggggtgtcg    6600
tcggtttggc cgctgaaatc ggggcttttg ccggcaggct gcctgaattg tctcaagctc    6660
tttcgacata ctgtttctta cctagggtcc ttgccatggc cagttatgtt cccatcatca    6720
tcattggtgg actccatgcc ctcggtgtga ttctgtggtt gttcaaatac cggtgcctcc    6780
acaacatgct ggttggtgat gggagtttct caagcgcttt cttcctacgg tattttgcag    6840
agggtaatct tagaaaaggt gtttcacagt cttgtggcat gagtaacgag tccctgacgg    6900
ctgctctagc ttgcaagttg tcgcaggctg accttgactt tttgtccagc ttaacgaact    6960
tcaagtgctt tgtatctgct tcaaacatga aaaatgctgc cggccagtat attgaagcag    7020
cgtatgccaa ggccctgcgc caagagttgg cctccctagt tcaggttgac aaaatgaaag    7080
gaattttgtc taagcttgag gcctttgctg aaacagccac tccgtccctt gacgcaggtg    7140
acgtggttgt tctgcttggg caacatcctc acggatccat cctcgatatt aatgtgggga    7200
ctgaaaggaa aactgtgtcc gtgcaagaga cccggagctt aggtggttcc aaattcagtg    7260
tttgcactgt cgtgtccaac acacccgtgg acgccttaac tggcatccca ctccagacac    7320
caacccctct ttttgagaat ggtccgcgtc accgtggtga ggaagacgat cttagagtcg    7380
agaggatgaa gaaacactgt gtgtccctcg gcttccacaa cattaatggc aaagtttact    7440
gcaaaatttg ggacaagtcc accggtgata ccttttatac cgatgattcc cggtacaccc    7500
aagaccttgc attccaggac aggtcagccg actacagaga cagggattat gagggtgtgc    7560
aaaccgcccc ccaacagggc tttgatccaa agtctgaaac ccctattggc actgtggtga    7620
tcggcggtat cacgtataac aggtacctga tcaaaggtaa ggaggtcttg gttcccaagc    7680
ctgacaactg ccttgaagct gccaagctgt cccttgagca agctctcgct gggatgggcc    7740
aaacttgcga ccttacagct gccgaggtgg aaaagttgag gcgcatcatt agccagctcc    7800
aaggtttgac cactgaacag gctttaaact gttagccgcc agcggcttga cccgctgtgg    7860
ccgcggcggc ttagttgtaa ctgaaacagc ggtaaaaatc gtaaagtacc acagcagaac    7920
tttcacccta ggccctctgg acctgaaagt cacctccgag gctgaggtaa agaaatcaac    7980
tgagcagggc cacgctgttg tggcaaactt atgttctggt gtcatcttga tgagacctca    8040
cccaccgtcc cttgttgatg ttcttctgaa acccggactt gacacaaaac ccggcattca    8100
accagggcat ggggccggga atatgggcgt agacggctct acttgggatt ttgaaaccgc    8160
acccacaaag gcagaacttg agttgtccaa acaaataatt caagcatgtg aagttaggcg    8220
cggggacgcc ccgaacctcc aactccctta caagctctat cctgttagag gggatcctga    8280
gcggcatggg ggccgcctta tcaataccag gtttggagat ctatcttaca aaacccctca    8340
agacaccaag tccgcaatcc atgcggcttg ttgcctgcac cccaacgggg cccctgtgtc    8400
tgatggtaag tcaacactag gtaccaccct tcaacatggt ttcgaacttt atgtccccac    8460
tgtgccctat agtgtcatgg agtacctcga ttcacgccct gacacccctt tcatgtgcac    8520
taaacatggt acttccaagg ctgctgcaga agacctccaa aaatacgacc tatctactca    8580
aggatttgtc ctgcccgggg tcttacgcct tgtacgcaga ttcatctttg gccatattgg    8640
taaggcaccg ccattgttcc tcccgtcaac ctatcccgct aaaaattcta tggcagggat    8700
caatggccag aggttcccaa caaaggacgt ccagagcata cctgaaattg acgaaatgtg    8760
tgcccgcgcc gtcaaggaga attggcaaac tgtgacacct tgtaccctca agaaacagta    8820
ctgttccaag cccaaaacca ggaccatcct gggcaccaac aactttattg ccctggctca    8880
ccgatcggcg ctcagtggtg tcacccaggc attcatgaag aaggcttgga agtccccgat    8940
tgccttggga aaaaacaaat tcaaggagct gcattgcact gtcgccggca ggtgtcttga    9000
agccgacttg gcctcctgtg accgcagcac ccccgccatt gtgaggtggt tcgtcgccaa    9060
cctcctgtat gaacttgcag gatgtgaaga gtacttgcct agctatgtgc ttaactgctg    9120
ccatgacctt gtggcaacac aggatggtgc cttcacaaaa cgcggtggcc tgtcgtccgg    9180
ggaccccgtc accagtgtgt ctaacaccgt atattcactg ataatctatg cccagcacat    9240
ggtgttgtcg gccttaaaaa tgggtcatga aatcggtctc aagttcctcg aggaacagct    9300
caaattcgag gacctcctcg aaatccagcc tatgttggtc tattctgatg accttgtctt    9360
gtacgctgaa aggcccactt ttcctaatta tcactggtgg gtcgagcacc ttgacctaat    9420
gctgggtttc agaacggacc caaagaagac agtcataact gataaaccca gcttcctcgg    9480
ctgcagaatt gaggcggggc gacagctggt ccctaatcgc gaccgcatcc tggctgctct    9540
cgcatatcac atgaaggcgc agaacgcctc agagtattat gcgtctgctg ccgcaatcct    9600
gatggattca tgtgcttgca ttgatcatga ccctgagtgg tatgaggacc tcatctgcgg    9660
tatcgcccga tgcgcccgcc aggatggtta tagtttccca ggcccggcat ttttcatgtc    9720
catgtgggaa aagctgagaa gtcacaatga agggaagaaa tttcgacact gcggcatctg    9780
cgacgccaaa gccgaccatg catccgcctg tgggcttgat ttgtgtttgt tccactcaca    9840
ctttcatcaa cactgccccg tcactctgag ctgtggtcat catgccggtt caagggaatg    9900
ttcgcagtgt cagtcacctg ttggggctgg cagatctcct cttgatgccg tgctaaaaca    9960
aatcctgtac aaacctcctc gtacagtcat catgaaggtg ggtaacaaaa caacggccct   10020
cgatccgggg aggtaccagt cccgtcgagg tcttgttgca gtcaagaggg gtattgcagg   10080
caatgaagtt gatcttcctg atggggacta ccaagtagtg cctcttttac caacttgtaa   10140
agacataaac atggtaaagg tggcttgcaa tgtactactc agtaagttca tagtggggcc   10200
accaggttcc ggaaagacca cctggttact gagtcaagtc caggacgatg atgtcattta   10260
cacacccacc catcagacca tgtttgatat agtcagtgct ctcaaagttt gcaggtattc   10320
tattccagga gcctcaggac ttcctttccc accacctgcc aggtccgggc cgtgggttag   10380
gctcgtggcc agcgggcacg tccccggccg aacatcatac ctcgatgagg ctggatattg    10440
taatcatctg gacattctca gactgctttc caaaacaccc ctcgtgtgtt tgggtgacct    10500
tcaacaactt caccctgtcg gctttgactc ctactgttat gtgtttgatc agatgcctca    10560
aaagcaactg accactattt atagatttgg ccctaacatc tgcgcagcca tccagccttg    10620
ttacagggag aagcttgaat ctaaggctag gaacaccagg gtggtcttta ccacctggcc    10680
tgtggccttt ggtcaggtgc tgacaccata ccataaagat cgcatcggct ctgcgataac    10740
catagactca tcccaggggg ccactttcga cattgtgaca ttgcatctac catcaccaaa    10800
gtccctaaat aaatcccgag cacttgtagc catcactcgg gcaagacacg ggttgttcat    10860
ttatgaccct cacaaccagc tccaggagtt tttcaacctg atccctgagc gcactgattg    10920
caaccttgtg ttcagccgtg gggatgatct ggtagttctt agtgcggaca atgcagtcac    10980
aactgtagcg aaggccctag ggacaggtcc atctcgattt cgagtatcag acccgaggtg    11040
caagtctctc ttagctgctt gttcggccag tctggagggg agctgtatgc cactaccaca    11100
agtggcacat aacctggggt tttacttctc cccagacagt ccagcatttg cacctctgcc    11160
aaaggagtta gcgccacatt ggccagtggt tactcaccag aacaatcggg cgtggcccga    11220
tcgacttgtc gctagtatgc gcccaattga tgcccgctac agcaagccaa tggtcggtgc    11280
agggtatgtg gtcgggccgt ccacctttct tggtactcct ggtgtagtgt catactacct    11340
cacgctatac atcaggggtg agccccaggc cttgccagag acactcgttt caacaggacg    11400
catagccact gactgccggg agtatctcga cgcggctgag gaagaggcag caaaagaact    11460
cccccacgca ttcattggcg atgtcaaagg taccacggtc ggggggtgtc accacatcac    11520
atcaaaatac ctacccagga ccctgcctaa ggactctgtt gctgtagttg gagtaagctc    11580
gcccggcagg gctgctaaag ccatgtgcac tctcactgat gtgtatctcc ccgaactccg    11640
gccatacctg caacctgaga cggcgtcgaa atgctggaaa ctcaaattag acttcaggga    11700
cgtccgacta atggtctgga aaggagccac cgcctatttc cagttggaag gacttacatg    11760
gtcagcgctg cctgactatg ccaggtttat tcagcttccc aaggacgccg ttgtgtacat    11820
tgatccgtgt ataggaccgg caacagccaa ccgcaaggtc gtgcgaacca cagactggcg    11880
ggccgacctg gcagtgacac cgtatgatta cggtgcccag aacattttga caacagcctg    11940
gttcgaggac ctcgggccgc agtggaagat tttggggttg cagcccttca ggcgggcatt    12000
tggctttgaa aatactgagg attgggcaat ccttgcacgc cgtatgagtg acggcaaaga    12060
ctacactgac tacaactggg attgtgttcg agaacgccca cacgccatct acgggcgtgc    12120
tcgtgaccat acatatcatt ttgcccccgg cacggaattg caggtagagc tgggtaaacc    12180
ccggctgccg cctggacgag agccgtaaac ttggagtgat gcaatggggt cactgtggag    12240
taaaatcagc cagctgttcg tggatgcctt cactgagttt cttgtcagtg tggttgatat    12300
tgtcattttc cttgccatac tgtttgggtt caccgtcgca ggatggttat tggtctttct    12360
tctcagagtg gtttgctccg cgcttctccg ttcgcgctct gccattcact ctcccgaact    12420
atcgaaggtc ctatgaaagc ttgttgccca actgcaggcc ggatgtccca caatttgcat    12480
ttaagcaccc attgggtata ctttggcaca tgcgagtttc ccacctgatt gatgagatgg    12540
tctctcgccg catttaccag accatggaac attcaggtca agcggcctgg aaatatgtgg    12600
tcggtgaggc cactctcacg aagctatcaa agcttgatat agttactcat ttccaacatc    12660
tggccgcagt agaggcggat tcttgccgct ttctcagctc acgactcgtg atgctaaaaa    12720
atcttgccgt tggcaatgtg agcctacagt acaacaccac gttggatcgc gttgaactca    12780
ttttccccac gccaggtacg aggcccaagt tgaccgactt cagacaatgg ctcatcagtg    12840
tgcatgcttc cattttttcc tctgtggctt catctgttac cttgttcata gtgctttggc    12900
tgcgaattcc agctctacgc tatgtttttg gtttccattg gcccacggca acacatcatt    12960
cgagctgacc atcaattata ccatatgcat gccctgtctt accagtcaag cagctcgcca    13020
aaggctcgag cccggtcgta acatgtggtg cagaataggg catgataggt gtgaggagcg    13080
tgaccatgat gagttgttaa tgtccatccc gtccgggtac gacaacctca aacttgaggg    13140
atattatgct tggctggctt ttttgtcctt ttcctacgcg gcccaattcc atccggagct    13200
gttcgggata gggaatgtgt cgcgcgtctt cgtggacaag cgacaccagt ttatttgtgc    13260
cgagcatggt ggactcaatt caaccttatc taccgagcac aatatctccg cattatatgc    13320
ggtatattat caccaccaaa tagacggggg taattggttc catttggaat ggctgcggcc    13380
gcttttttcc tcctggttgg tgctcaacat atcatggttt ctgaggcgtt cgcctgtaag    13440
ccctgtttct cgacgcatct atcagatatt aagaccaaca cgaccgcggc tgccggtttc    13500
atggtccttc agaacatcaa ttgttcccgg cctcacgagg cctcagcaac gcaaggtcaa    13560
gttccctcca gaaagtcgtc ccaatgccgt gaagccgtcg gtgttcccca atacatcacg    13620
ataacggcca acgtgaccga cgaatcatat ttgtacaacg cggacttgct gatgctttct    13680
gcgtgccttt tctacgcctc ggaaatgagc gagaaaggct ttaaagttat ctttgggaat    13740
gtctctggcg ttgtttctgc ttgtgtcaat ttcacagatt atgtggccca tgtgacccaa    13800
catacccagc agcatcatct ggtgattaat cacatccggt tactgcactt cctgacacca    13860
tctgcaatga ggtgggctac aaccattgct tgtctgttcg ccattctctt ggcgatatga    13920
aatgttctca caaattgggg cattccttga ctccgcactc ttgcttctgg tggctttttt    13980
tgctgtgtac cggcttgtcc tggtcctttg ccgatggcaa cggcaacaac tcgacatacc    14040
aatacatata taatttgacg atatgcgagt tgaatgggac caattggctg tccggccatt    14100
ttgaatgggc agttgagacc tttgtgcttt acccggttgt cactcatatc ctctcactgg    14160
gttttctcac gacaagtcat ttttttgacg cgctcggtct cggcgctgta tccactgcag    14220
gatttgtcgg agggcggtat gtacttagca gcgtctacgg cgcttgtgct ttcgcagcgt    14280
tcgtatgctt cgtcatccgt gctgctaaaa attgcatggc ctgccgctat gcccgtaccc    14340
ggttcaccaa cttcattgtg gacgaccggg ggggagttca tagatggaag tctccaatag    14400
tggtagaaaa actgggcaaa gccgaaattg gcggcaacct tgtcaccatc aaacatgtcg    14460
tcctcgaagg ggttaaagct caacccttga cgagaacttc ggccgagcaa tgggaggcct    14520
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tcattctacc caccgtgtcg cacttaccct gggggctgtt gtcgcccttt tgtggggtgt    14760
ctacagcctc acagagtcat ggaagtttat cacttccaga tgcagattgt gttgcctcgg    14820
ccggcgatac attctggccc ctgcccatca cgtagaaagt gctgcaggtc tccattcaat    14880
ctcagcgtct ggtaaccgag catacgctgt gagaaagccc ggactaacat cagtgaacgg    14940
cactctagta ccaggacttc ggagcctcgt gctgggcggc aaacgagctg ttaaacgagg    15000
agtggttaac ctcgtcaagt atggccggta aaaatcagag ccagaagaaa aagaaaagta    15060
cggctccaat ggggaatggc cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtgcaatga    15120
taaagtccca gcgccagcaa cctaggggag gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc    15180
cacattttcc cctggctgca gaagatgaca tccggcacca cctcacccaa actgaacgct    15240
ccctctgctt gcaatcgatc cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt    15300
catccagcgg gaaggtcagt ttccaggttg agtttatgct gccggttgct catacagtgc    15360
gcctgattcg cgtgacttct acatccgcca gtcagggtgc aaattaattt gacagtcagg    15420
tgaatggccg cgattggcgt gtggcctctg agtcacctat tcaattaggg cgatcacatg    15480
ggggtcatac ttaatcaggc aggaaccatg tgaccgaaat t                        15521

Claims (20)

1.一种重组的北美1型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其在开放读码框(ORF)1a中包括一个或多个突变，其中所述突变使得所述重组的PRRSV不能产生对应于ORF1a的至少一种功能性多肽。
2.如权利要求1所述的重组的PRRSV，其中所述突变包括缺失。
3.如权利要求2所述的重组的PRRSV，其中所述缺失是在nsp2区域中。
4.如权利要求3所述的重组的PRRSV，其中所述缺失包括表位ES4。
5.如权利要求4所述的重组的PRRSV，其中所述缺失包括ORF1a的736-790位氨基酸。
6.如权利要求3所述的重组的PRRSV，其中所述突变包括异源DNA序列的插入。
7.如权利要求6所述的重组的PRRSV，其中所述插入是在ORF1a的733位氨基酸和734位氨基酸之间。
8.如权利要求6所述的重组的PRRSV，其中所述插入是绿色荧光蛋白(GFP)。
9.一种重组的北美PRRS病毒，其由分离的多聚核苷酸分子编码，该多聚核苷酸分子包括编码感染性RNA分子的DNA序列，所述感染性RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO：43。
10.一种北美1型PRRSV疫苗，其包括在ORF1a中具有突变的重组的PRRSV和药学可接受的运载体，所述突变包括在ORF1a中的缺失、插入或者两者。
11.如权利要求10所述的疫苗，其中所述突变包括nsp2区域中的缺失。
12.如权利要求11所述的疫苗，其中所述缺失是在所述nsp2区域中的736-790位氨基酸。
13.如权利要求11所述的疫苗，其中所述突变还包括异源DNA序列的插入。
14.如权利要求13所述的疫苗，其中所述插入是在所述nsp2区域中的733位氨基酸和734位氨基酸之间。
15.一种试剂盒，其包括：
疫苗，该疫苗包括在ORF1a中具有突变的PRRSV突变体和药学可接受的运载体，所述突变使得所述PRRSV突变体不能产生功能性ORF1a多肽，所述突变包括异源DNA序列的插入；
一种或多种第一多肽，该第一多肽由所述异源DNA序列编码；以及
一种或多种第二多肽，该第二多肽由所述功能性ORF1a编码。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中PRRSV疫苗中的所述突变是在nsp2区域中的缺失。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述缺失是ES4表位，其中所述一种或多种第一多肽包括GFP并且所述一种或多种第二多肽包括所述ES4表位。
18.一种区分接种PRRSV标记疫苗的动物和自然感染PRRSV的动物的方法，其中所述PRRSV标记疫苗包括插入突变和缺失突变，所述方法包括：
提供包括所述插入突变的第一重组PRRSV蛋白；
提供包括所述缺失突变的第二重组PRRSV蛋白；
用所述第一重组PRRSV蛋白和第二重组PRRSV蛋白孵育来自动物的血清样品；以及
检测样品中的抗体与所述第一重组PRRSV蛋白和第二重组PRRSV蛋白的结合；
其中所述样品中的抗体与所述第一重组PRRSV蛋白的结合指示接种疫苗的动物，而所述样品中的抗体与所述第二重组PRRSV蛋白的结合指示自然感染的动物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一重组PRRSV蛋白包括GFP插入。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述第二重组PRRSV蛋白包括ES4缺失。
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