CN103087996A

CN103087996A - 重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103087996A
Application number: CN2013100187155A
Authority: CN
Inventors: 封文海; 王良海; 侯隽; 高丽; 郭雪坤; 余志彬; 朱耀华; 刘翼浩; 唐军
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: CN103087996B

Abstract

本发明公开了一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用。本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒是将野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA进行替换或缺失得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的结构蛋白ORF2a、结构蛋白ORF2b、结构蛋白ORF3、结构蛋白ORF4、结构蛋白ORF5a和结构蛋白ORF5这六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分替换为标记蛋白的编码RNA；所述缺失为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的所述六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分进行缺失。实验证明，本发明所提供的重组病毒对于高致病性猪繁殖与呼吸综合征有很好的预防作用，对于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的研制具重要意义。

Description

重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）感染所导致的病毒性急性传染病。该病可以感染任何年龄的猪，临床上以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高发病率和高死亡率、持续性感染和免疫抑制为主要特征，对世界养猪业产生了极大的危害。2005年的一份报告表明，该病每年给美国养猪业造成的损失就有5.6亿美元，给全球养猪业造成的损失将更大。目前，PRRSV已经形成全球性大流行，成为影响养猪业的主要疾病因素之一，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV为单股、正链、不分节段且有囊膜的RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为45-80nm，有25-35nm的立方体核心。基因组全长约15kb，5’末端为具有甲基化的帽子结构，3’末端为多聚腺甘酸（polyA）尾，包含10个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）。大部分ORF基因结构末端都和相邻的ORF有部分重叠，只在编码非结构蛋白（non-structural protein，NSP）的ORF1b和编码第一个结构蛋白的ORF2a之间存在1个碱基的间隔。

病毒的复制受到转录调控序列（transcription-regulatory sequences，TRS）的控制，在5’非翻译区存在一段前导转录调控序列（leader TRS），在每个ORF前面都有各自的体转录调控序列（body TRS）（如调控ORF6转录的TRS命名为TRS6，位于ORF5 3’端、ORF6之前），通过体转录调控序列与前导转录调控序列的结合完成各个亚基因组mRNA的转录。

对不同地域的分离株序列分析表明，PRRSV有2种基因型，即欧洲型（代表株为Lelystad病毒，LV）和美洲型（代表株为ATCC VR-2332株），二者核苷酸的同源性约为60%，血清学特性不同。美洲型毒株之间的差异性较大，而欧洲型毒株之间则相对保守。美洲型和欧洲型毒株虽然在基因组核苷酸序列和血清学上差异很大，但其二者具有相同的复制机制，均可引起相似的临床症状。

2006年5月我国自南方地区开始爆发了高致病性（highly pathogenic，HP）“蓝耳病”，主要特征为高热、食欲下降、蓝耳、腹泻、高发病率和高死亡率，其波及全国25个省份，经济损失巨大。与传统毒株感染后只有妊娠母猪和仔猪发病不同，高致病性PRRSV感染后各种年龄、不同性别的猪群均可发病，发病猪体温升高至41℃以上，精神沉郁，采食量下降或食欲废绝；耳后耳缘发绀，呈现“蓝耳”，乳头、外阴、腹部、尾部等肢体末端多处皮肤有紫色斑块；呼吸困难，部分猪出现严重的腹式呼吸，有的表现喘气或不规则呼吸；部分患猪鼻分泌物增多，咳嗽、打喷嚏、眼部分泌物增多，出现结膜炎症状；个别病猪濒死前不能站立，全身抽搐。此次爆发时猪群发病率为50-100%，死亡率为20-100%。中国动物疾病控制中心的权威统计表明，截止到2006年9月，此次疫情影响了约212万头猪，造成至少40万头猪死亡，平均死亡率为19.68%。所有病死猪剖检后均可见肺肿胀、变硬，部分猪肺伴有出血；所有猪均出现不同程度的肺炎，大多数都是混合感染肺炎，间质明显增宽，间质内有大量淋巴细胞浸润。

已经证实其主要病原为NSP2基因部分缺失为特征的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）。研究表明，这些分离株在NSP2上均存在30个氨基酸的不连续缺失。但后来的研究表明，这30个氨基酸的不连续缺失与高致病性PRRSV的毒力增强并没有直接关系。高致病性PRRSV毒力增强的具体机制还有待进一步研究。

到目前为止仍没有有效治疗高致病性“蓝耳病”的药物，因此开发出一种有效的疫苗对该病进行预防显得尤其重要。目前商品化的PRRS疫苗主要包括：由经典毒株制备的弱毒疫苗、由高致病毒株制备的灭活苗以及由高致病毒株经过连续传代制备的弱毒苗。然而由于经典毒株与高致病毒株序列的差异性导致经典毒株制备的弱毒疫苗对高致病毒株的保护性不够全面；灭活疫苗往往不能诱导很好的细胞免疫反应，由于PRRSV的逃逸作用又使得体液免疫反应的效果一般；由高致病毒株经过连续传代制备的弱毒苗又存在毒力返强的风险，且无法与野生型毒株进行很好的区分，使得疫病爆发后不能确定到底是由于野生型毒株导致的还是由于弱毒疫苗株发生了毒力返强。

因此，构建出一种既能很好的保护猪免于高致病性PRRSV的危害又能很好的与野生型毒株进行区分的弱毒疫苗将具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用。本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为重组高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株。

本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，是将野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA进行替换或缺失得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的结构蛋白ORF2a、结构蛋白ORF2b、结构蛋白ORF3、结构蛋白ORF4、结构蛋白ORF5a和结构蛋白ORF5这六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分替换为标记蛋白的编码RNA；所述缺失为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的所述六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分进行缺失。

在本发明中，所述结构蛋白ORF2a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第11983-12753位；所述结构蛋白ORF2b的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第11988-12209位；所述结构蛋白ORF3的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第12606-13370位；所述结构蛋白ORF4的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第13151-13687位；所述结构蛋白ORF5a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第13688-13828位；所述结构蛋白ORF5的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第13698-14300位。

所述标记蛋白可为绿色荧光蛋白，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示。

在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码RNA反转录的cDNA序列为将序列表中序列2的第11990-12709位。

在本发明的一个实施例中，所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1。

具体的，本发明所提供的所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA反转录的cDNA序列如下：将序列表中序列2的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位或序列2的第15018-15057位，同时保持序列2的其他核苷酸不变。

其中，序列1共由15320位核苷酸组成，第14245-14284位为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株基因组自身携带的TRS6序列；序列2共由16093位核苷酸组成，第11983-12755位的序列为与序列1相比多出的序列，序列2的第12716-12755位和第15018-15057位序列相同，为用于发生同源重组的TRS6序列。

本发明所提供的制备所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，具体可包括如下步骤：

（1）将序列表中序列2所示的DNA片段克隆至真核表达载体中，得到重组载体；

（2）用步骤（1）的重组载体转染哺乳动物细胞；在所述哺乳动物细胞中，所述重组载体中序列2所示的DNA片段，通过序列2上第12716-1755位和第15018-15057位所示的两个TRS6序列发生同源重组，致使序列2的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位（或第15018-15057位）所示的一个TSR6序列，从而获得所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。

在上述方法中，所述真核表达载体可为pcDNA3.1(+)；所述哺乳动物细胞可为293FT细胞或293T细胞。

所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在如下（a）-（c）中的应用也属于本发明的保护范围：

（a）制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗；

（b）制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物；

（c）制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征的产品。

任何通过插入TRS6序列从而获得发生了同源重组的弱毒疫苗及其制备方法均属于本发明的保护范围内。

本发明的再一个目的是提供如下（a1）或（a2）的生物材料：

（a1）含有所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的离体动物细胞或重组菌；

（a2）含有所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA或cDNA的载体。

本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒对于高致病性猪繁殖与呼吸综合征有很好的预防作用，与传统传代致弱方法得到的疫苗相比具有更高的安全性，外源标记基因GFP的表达还便于对该弱毒疫苗进行监控。

附图说明

图1为插入额外转录单元的重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP的构建的示意图。

图2为转染重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP至293FT细胞后直接观察外源基因GFP的表达，左图为荧光照片，右图为同一视野下的白光照片。

图3为同源重组的验证结果。其中，A为三种病毒的PCR检测琼脂糖凝胶电泳图；B为通过real-time PCR检测各代弱毒疫苗rHV-GFP中发生了同源重组的基因组所占的比例的结果；C为弱毒疫苗rHV-GFP同源重组区域的模式图。

图4为对野生型毒株HV（WT）、病毒rHV（CK）以及弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）体外性状的比较结果。其中，A为三种病毒在肺泡巨噬细胞上的生长曲线（病毒滴度测定结果），B为分别感染三种病毒36小时后肺泡巨噬细胞的死亡率统计结果。A和B中，*表示差异显著（p<0.05）。

图5为等量接种三种病毒至四周龄小猪后，三种病毒的体内性状比较结果。其中，A为小猪的存活情况，B为小猪直肠温度的变化情况，C为小猪血清中的病毒滴度测定结果。

图6为接种三种病毒后的小猪脏器的病理检测结果。

图7为弱毒疫苗rHV-GFP对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株HV和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株JX感染的保护力测定结果。其中，A、D是小猪的存活情况，B、E是直肠温度的变化情况，C、F是小猪血清中的病毒滴度测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pcDNA3.1(+)质粒：Invitrogen公司产品。

293FT细胞：Invitrogen公司产品。

猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）：记载在“Lianghai Wang，HexiaoZhang，Xiong Suo，et al.Increse of CD163 but not sialoadhesin on cultured peripheral bloodmonocytes is coordinated with enhanced susceptibility to porcine reproductive and respiratorysyndrome virus infection.Veterinary Immunology and Immunopathology，141(2011):209-220”一文中，公众可从中国农业大学获得。另外，Rural Technologies公司也有销售，其网址详见如下：http://ruraltechinc.com/diagnostic-reagents/porcine-pulmonary-alveolar-macrophages-pams/

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JX株（HP-PRRSV strain JX）：记载在“Lianghai Wang,Jun Hou,Hexiao Zhang,et al.Complete Genome Sequence of a Novel Highly Pathogenic PoricneReproductive and Respiratory Syndrome Virus Variant.J.Virol,2012,86(23):13121.”一文中，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV毒株的分离与鉴定

一、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV毒株的分离

2007年6月，从我国北京爆发高致病性“蓝耳病”的猪场取回病猪的脏器作为病料，用液氮研磨成粉末，加入适量RPMI1640培养液重悬后冻融三次，离心取上清液，然后用0.22μm的滤器过滤得到病料上清。接种该上清至猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs），在37℃培养，当60%-80%的细胞出现病变时收毒并继续传代，获得病毒上清。

二、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV毒株的鉴定

1、蛋白水平鉴定

将步骤一所得的病毒上清感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）后，用针对PRRSV N蛋白的特异性抗体（Rural Technologies公司产品）进行间接免疫荧光染色，发现接种病毒上清后的细胞呈阳性，证明步骤一所得病毒上清中的病原确实是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将其命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株。

2、基因水平鉴定

进一步，根据猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株序列的保守区域（GenBank：EF641008.1、EF112445.1以及U87392.3）设计若干对测序引物，将HV毒株基因组RNA反转录为cDNA后，进行全基因组测序，拼接得到的序列如序列表中序列1所示。测序结果发现HV毒株具有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的特有标志：NSP2区域中90个碱基的不连续缺失（序列1中第1339-4836位为NSP2基因序列，与GenBank：U87392.3所示的NSP2基因序列相比，缺失GenBank：U87392.3的第2779-2781位和2938-3024位）。

另外，对序列1按照PRRSV不同蛋白解析如下：第190-7611位核苷酸为非结构蛋白ORF1a的编码序列，第7599-11981位核苷酸为非结构蛋白ORF1b的编码序列，第11983-12753位核苷酸为结构蛋白ORF2a的编码序列，第11988-12209位核苷酸为结构蛋白ORF2b的编码序列，第12606-13370位核苷酸为结构蛋白ORF3的编码序列，第13151-13687位核苷酸为结构蛋白ORF4的编码序列，第13688-13828位核苷酸为结构蛋白ORF5a的编码序列，第13698-14300位核苷酸为结构蛋白ORF5的编码序列，第14285-14809位核苷酸为结构蛋白ORF6的编码序列，第14799-15170位核苷酸为结构蛋白ORF7的编码序列。再则，序列1的14245-14284位为病毒自身所携带的转录调控序列（TRS6）。

3、致病性鉴定

将HV毒株按照2×10⁷TCID₅₀的用量接种至4周龄小猪（北京市SPF猪育种管理中心），接种后10天内发现所有猪均发病（出现高烧、咳嗽、呼吸困难、厌食、浑身颤抖等临床症状）并且最终死亡。即HV毒株表现出高发病率与高死亡率。

以上三方面的结果显示PRRSV HV毒株完全符合HP-PRRSV的特点，将其鉴定为HP-PRRSV。

实施例2、重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备

一、携带有HV毒株基因组的重组质粒的构建

分析实施例1中测得的HV毒株的基因组全长序列（序列1），挑选出了6个用于分段拼接基因组全长序列的酶切位点，分别为SmiI、XhoI、AflII、ClaI、EcoRV和NotI。HV毒株的基因组全长序列（序列1）中含有酶切位点XhoI（序列1的第3400位，以及第6901位）、AflII（序列1的第6465位）、ClaI（序列1的第8798位）和EcoRV（序列1的第12071位）的识别序列，而不含有酶切位点SmiI和NotI的识别序列。通过基因组上的四个酶切位点将基因组全长分为5个片段，同时将酶切位点SmiI和NotI分别添加到病毒基因组的两端，再将5个片段按照其在病毒基因组中的排列次序插入到真核表达载体中，得到携带有病毒基因组的重组质粒。具体如下：

1、用于基因组序列拼接的改造质粒pcDNA3.1M的构建

将真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点区域的酶切位点进行改造，使其与上述6个酶切位点（SmiI、XhoI、AflII、ClaI、EcoRV和NotI）一致。具体如下：

设计引物对3.1F和3.1R用于质粒的改造，其中引物3.1R的反向互补序列的前18个碱基与pcDNA3.1(+)质粒上紧接着TATA box（TATATAA，pcDNA3.1(+)质粒的第804-810位）的序列（对应于pcDNA3.1(+)质粒的第811-828位）一致；接下来是酶切位点SmiI的识别序列ATTTAA∣AT（AT可以直接作为病毒基因组的前两个碱基），使得pcDNA3.1(+)质粒上TATA box和病毒基因组第一个碱基之间的碱基数调整为24；再接下来是酶切位点XhoI的识别序列和酶切位点AflII识别序列（CTTAAG）的前4个碱基。引物3.1F包含酶切位点AflII识别序列的后2个碱基、酶切位点ClaI、EcoRV和NotI的识别序列，3’端的18个碱基与pcDNA3.1(+)质粒上的BGH引物结合位点的序列（pcDNA3.1(+)质粒的第1022-1039位）一致。将引物用T4多核苷酸激酶（Takara公司产品）按照说明书进行磷酸化处理，然后用高保真的Phusion DNA聚合酶（Finnzymes公司产品）以pcDNA3.1(+)为模板进行PCR扩增，将扩增产物切胶回收后用T4连接酶（NEB公司产品）进行连接并转化DH5α感受态。挑取单克隆并提取得到的重组质粒。

将所得重组质粒进行测序验证，结果表明该重组质粒为将pcDNA3.1(+)的第829-1021位替换成了序列表中序列4所示的多克隆位点连接片段，将该重组质粒命名为pcDNA3.1M，用于拼接病毒基因组全长序列。

2、携带有HV毒株基因组的重组质粒pcDNA3.1M-HV的构建

根据实施例1中测得的HV毒株的基因组全长序列（序列1），以及个选定的6个酶切位点（SmiI、XhoI、AflII、ClaI、EcoRV和NotI），分别设计扩增所述5个片段的引物对：HP1F和HP1R（用于扩增片段1），HP2F和HP2R（用于扩增片段2），HP3F和HP3R（用于扩增片段3），HP4F和HP4R（用于扩增片段4）和HP5F和HP5R（用于扩增片段5），见表1。

用试剂盒E.Z.N.A.Viral RNA Kit（OMEGA bio-tek公司产品）提取实施例1所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株的基因组RNA，由于RNA长达15kb，故分别用随机引物（Random6mers）和Oligo dT（15）（Takara公司产品）将RNA反转录成cDNA。由随机引物（Random6mers）合成的cDNA用作片段1-4扩增的模板，由Oligo dT（15）合成的cDNA用作片段5扩增的模板。利用高保真的Phusion DNA聚合酶（Finnzymes公司产品）进行PCR扩增，将5个PCR产物均进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用rTaq（Takara公司产品）进行末端加A，然后分别与pMD18-T载体（Takara公司产品）连接得到5个重组质粒。对于每个重组质粒挑选至少3个克隆进行测序，依据连接片段的不同，将测序正确的5个重组质粒依次命名为pMD18-T-HP1、pMD18-T-HP2、pMD18-T-HP3、pMD18-T-HP4和pMD18-T-HP5。分别将5个片段（以上5个重组质粒）通过双酶切连接至步骤1构建的改造质粒pcDNA3.1M，具体为：将片段1（重组质粒pMD18-T-HP1）用SmiI和XhoI双酶切，酶切后与经过同样酶切的改造质粒pcDNA3.1M相连，得到中间质粒1；将片段2（重组质粒pMD18-T-HP2）用XhoI和AflII双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒1相连，得到中间质粒2；将片段3（重组质粒pMD18-T-HP3）用AflII和ClaI双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒2相连，得到中间质粒3；将片段4（重组质粒pMD18-T-HP4）用ClaI和EcoRV双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒3相连，得到中间质粒4；将片段5（重组质粒pMD18-T-HP5）用EcoRV和NotI双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒4相连，得到重组质粒。将经测序表明在改造质粒pcDNA3.1M的酶切位点SmiI和NotI之间插入了序列表中序列2的第3-10693位所示DNA片段的重组质粒命名为pcDNA3.1M-HV，该重组质粒即为携带有HV毒株基因组全长cDNA克隆的重组质粒。

表1 PCR引物序列

注：*表示序列1的第12169-12187位；**表示序列1的第15303-15320位。

二、插入额外转录单元的重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP的制备

本研究将在步骤一制备的携带有HV毒株基因组全长cDNA克隆的重组质粒pcDNA3.1M-HV的基础上，在PRRSV非结构蛋白ORF1b与结构蛋白ORF2a之间顺次插入外源标记蛋白GFP的编码序列和转录调控序列（TRS6，序列1中第14245-14284位），从而获得插入额外转录单元的重组质粒，以用于重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备。思路如下：由于非结构蛋白ORF1b下游序列与结构蛋白ORF2a上游序列同处于片段4所包含的区域，故在含有片段4的亚克隆上完成GFP和TRS6的插入。通过序列分析，确定利用酶切位点StuI、MluI（PRRSV HV毒株基因组上没有）和EcoRV完成序列的插入，模式图见图1，用于插入的引物为StG F、StG R和G2F（见表1）。具体操作如下：

1、额外转录单元的获得

以质粒pEGFP-N1（Clontech公司产品）为模板，用引物对StG F（含酶切位点StuI）和StG R（含酶切位点MluI）扩增出含有Kozak序列的GFP基因；用引物对TRS6F（含酶切位点MluI）和HV4R（含酶切位点EcoRV）扩增出TRS6拷贝；将以上两个扩增产物（GFP基因和TRS6拷贝）用限制性内切酶MluI切割，后用T4连接酶连接；以连接产物作为模板，用引物对StG F和HV4R进行PCR扩增，所得产物即为额外转录单元。

2、重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP的制备

将步骤1所得的额外转录单元进行凝胶电泳、切胶回收后用内切酶StuI和EcoRV进行双酶切，与经过同样双酶切的含有HV毒株基因组第4个片段的重组质粒pMD18-T-HP4骨架大片段相连，目的是将额外的转录单元（GFP基因和TRS6的拷贝）插入其中，将经测序表明在质粒pMD18-T-HP4的酶切位点StuI和EcoRV之间的序列替换为了序列表中序列2的第11975-12841所示DNA片段后所得的重组质粒命名为pMD18-T-HP4-GFP。用内切酶ClaI和EcoRV双酶切重组质粒pMD18-T-HP4-GFP，将目的片段（大小约为4kb）与经过同样双酶切的pcDNA3.1M-HV骨架大片段相连，目的是将含有额外转录单元的第4个片段与HV毒株全长cDNA克隆中的第4个片段进行替换，达到将额外转录单元插入HV毒株基因组的目的。将经测序表明在pcDNA3.1M-HV的酶切位点ClaI和EcoRV之间插入了序列表中序列2的第8803-12841位所示DNA片段的重组质粒命名为pcDNA3.1M-△HV-GFP，该重组质粒即为用于制备重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的插入额外转录单元的重组质粒。其中，序列2的第11990-12709位为绿色荧光蛋白（GFP）的编码基因。

三、重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备及其鉴定

1、重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP转染细胞后荧光显微观察

将步骤二制备得到的重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP，借助转染试剂

（Roche公司产品，产品目录号04709705001）转染293FT细胞，具体操作参照转染试剂说明书进行。转染约48小时后，进行荧光显微观察，可见大部分293FT细胞具有明显的绿色荧光（图2），这表明确实有很高的重组病毒拯救效率。

2、验证同源重组的发生

由于步骤二构建重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP时插入的TRS6序列包括6个碱基的核心序列（TTAACC）和两侧各17个碱基的侧翼序列共40个碱基，与病毒基因组本身的TRS6序列完全一致，理论上存在同源重组的可能。如若发生了同源重组，重组病毒的基因组将会在序列2的基础上缺失两个TRS6序列之间的序列，重组后的基因组将缺失结构蛋白ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a和ORF5，仅保留一个TRS6序列，即序列2中的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位（或第15018-15057位）（计算序列2缺失大小片段约为2.3Kb）（如图3中C所示）。以下将验证由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP是否发生了以上所述的同源重组。

实验组：按照步骤1所述的方法将重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP转染293FT细胞，转染后约48小时后可见明显的绿色荧光，此时收获细胞，通过反复冻融裂解细胞，使病毒粒子释放，离心取上清获得第零代（P0）病毒液；将第零代病毒液按照培养液体积的10%的用量加入到猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）培养瓶中，待大约60-80%的细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）时，再次收获细胞，按照如上方法提取第一代病毒液，依此类推，获得由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP的第零代（P0）、第五代（P5）、第三十六代（P36）和第五十代（P50）的病毒。

阴性对照组（CK）：按照步骤1所述的方法将重组质粒pcDNA3.1M-HV转染293FT细胞，转染后约48小时收获细胞，通过反复冻融裂解细胞，使病毒粒子释放，离心取上清获得第零代（P0）病毒液；将第零代病毒液按照培养液体积的10%的用量加入到猪肺泡巨噬细胞培养瓶中，待大约60-80%的细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）时，再次收获细胞，按照如上方法提取第一代病毒液，依此类推，获得由重组质粒pcDNA3.1M-HV拯救出的病毒rHV的第五代（P5）的病毒。

野生型对照组（WT）：将实施例1步骤一中所得的PRRSV野生型HV毒株病毒上清，按照0.1MOI的用量加入到猪肺泡巨噬细胞培养瓶中，待大约60-80%的细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）时，收获细胞，通过反复冻融裂解细胞，使病毒粒子释放，离心取上清获得病毒液，依此类推，获得PRRSV野生型HV的第二代（P2）和第五代（P5）的病毒。

将以上三组中所获得的各代病毒，分别用试剂盒E.Z.N.A.Viral RNA Kit（OMEGA bio-tek公司产品）进行RNA提取，并用随机引物（Random6mers）（Takara公司产品）将病毒RNA反转录成cDNA。随后用位于PRRSV HV毒株基因组中非结构蛋白ORF1b内部的上游引物和位于结构蛋白ORF7内部的下游引物对反转录出的cDNA进行PCR反应。

上游引物：5’-AGGATTACAATGATGCGTTTCG-3’（序列1和序列2的第11860-11881位）

下游引物：5’-GCCGCTCACTAGGGGTAAAG-3’（序列1的第14996-15015位的反向互补序列，序列2的第15769-15788位的反向互补序列）

以上三组中各代病毒的琼脂糖凝胶电泳结果如图3中A所示，各代野生型HV（WT）以及rHV（CK）只有一条约3kb的条带（理论大小为3156bp）；而各代弱毒疫苗rHV-GFP均有两条带，较大的一条是由全长基因组扩增出的约3.9kb的条带（理论大小为3929bp），较小的一条为从发生了同源重组的基因组上扩增出的条带约1.6kb的条带（同源重组导致基因组缺失了约2.3kb）。以上结果与理论推测相符。进一步，将上述1.6kb的条带切胶回收后连接至pMD18-T载体（Takara公司产品），随机挑取30个克隆进行测序，测序结果证实1.6kb的条带确实是由于序列2中的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位（或第15018-15057位）所造成的，即在插入的TRS6序列与病毒基因组本身的TRS6序列处发生同源重组，导致病毒基因组中间部分即ORF2a-ORF5的缺失。另外对发生了同源重组的基因组进行全序列测定，结果证实，发生了同源重组的基因组为将序列表中的序列2的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位（或第15018-15057位）后所得的序列。

本发明的发明人利用分别针对ORF3和ORF7的引物，对第五代（P5）野生型毒株HV（WT）和各代弱毒疫苗rHV-GFP两种病毒的由随机引物反转录得到的cDNA作real-timePCR，将野生型毒株HV（WT）的ORF3/ORF7设为1，进而分析各代弱毒疫苗rHV-GFP中发生了同源重组的基因组所占的比例。

ORF3-up：5’-CTGGTTGGCGTTCCTGTCC-3’（序列1的第12932-12950位，序列2的第13705-13723位）

ORF3-down：5’-GGTGGCGTTATCCCCGTC-3’（序列1的第13050-13067位的反向互补序列，序列2的第13823-13840位的反向互补序列）

ORF7-up：5’-AAACCAGTCCAGAGGCAAGG-3’（序列1的第14897-14916位，序列2的第15670-15689位）

ORF7-down：5’-GCCGCTCACTAGGGGTAAAG-3’（序列1的第14996-15015位的反向互补序列，序列2的第15769-15788位的反向互补序列）

结果如图3中B所示。弱毒疫苗rHV-GFP第0代（P0）、第五代（P5）、第三十六代（P36）中均存在发生了同源重组的缺失基因组，且全长基因组所占的比例有随着病毒代数的增加逐渐降低的趋势，即同源重组的基因组所占的比例有随着病毒代数的增加逐渐升高的趋势。

实验例3、三种病毒体外性状的比较

分别将野生型病毒HV（WT）、由重组质粒pcDNA3.1M-HV拯救出的病毒rHV（CK）以及由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）以相同的毒量（MOI=0.1）接种至肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）。其中，野生型病毒HV（WT）采用第五代（P5），病毒rHV（CK）采用第五代（P5），弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）采用第五代（P5）。之后进行如下两方面的检测：

一、病毒滴度测定

分别于接种病毒后12小时、24小时、36小时以及48小时收集细胞上清液。将细胞上清液10倍梯度稀释后接种至培养于96孔板的肺泡巨噬细胞以检测细胞上清液中病毒滴度。具体如下：接种3天后用针对PRRSV N蛋白的特异性抗体（Rural Technologies公司产品）检测病毒，分别数出各个稀释度下病毒阳性和病毒阴性的孔数，利用Reed-Muench两氏法计算出12小时、24小时、36小时以及48小时细胞上清液的病毒滴度，结果以TCID₅₀/ml表示。实验重复3次，结果取平均值。所涉及公式如下：

距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）

lgTCID₅₀=距离比例×稀释梯度的对数+高于50%病变率的稀释度的对数。

结果如图4中A所示。野生型病毒HV（WT）与由重组质粒pcDNA3.1M-HV拯救出的病毒rHV（CK）的生长曲线相似，说明病毒基因组全长cDNA克隆的方法不会影响病毒的复制。然而由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）在接种至肺泡巨噬细胞36小时的病毒滴度要显著低于HV与rHV，即由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）使得病毒的复制显著变慢。

二、细胞死亡率统计

将感染三种病毒36小时的肺泡巨噬细胞进行台盼蓝染色，由于台盼蓝不能透过完整的细胞膜，故死细胞会被染成蓝色，活细胞不着色。对死细胞和活细胞分别计数统计。同时设置未经病毒感染的肺泡巨噬细胞作为空白对照（control）。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图4中B所示，野生型病毒HV（WT）与由重组质粒pcDNA3.1M-HV拯救出的病毒rHV（CK）感染诱导了大量的细胞死亡，而感染由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）的肺泡巨噬细胞的死亡率要显著低于HV和rHV感染后的细胞（p<0.05），也就是说弱毒疫苗rHV-GFP对肺泡巨噬细胞的损伤被明显弱化。

实验例4、三种病毒体内性状的比较

实验动物：10头四周龄小猪（北京市SPF猪育种管理中心）。

将10头四周龄普通小猪随机分为三组。组一：3头小猪，滴鼻接种致死剂量的野生型病毒HV（WT），病毒滴度为1.0×10⁷/ml，每个鼻孔接种1ml；组二：3头小猪，滴鼻接种同样毒量的由重组质粒pcDNA3.1M-HV拯救出的病毒rHV（CK）；组三：4头小猪，滴鼻接种同样毒量的由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）。对以上三组小猪进行如下两方面的检测：

一、存活率、直肠温度及血清病毒滴度测定

接种后每天观察小猪的健康状况，统计存活率；隔天测定直肠温度；每3-4天采集前腔静脉血，利用针对ORF7的引物对通过real-time PCR的方法检测血清中的病毒滴度。具体如下：

用试剂盒E.Z.N.A.Viral RNA Kit（OMEGA bio-tek公司产品）进行RNA提取，并用OligodT(15)（Takara公司产品）将病毒RNA反转录成cDNA；用针对ORF7的引物对（5’-AAACCAGTCCAGAGGCAAGG-3’和5’-GCCGCTCACTAGGGGTAAAG-3’）、试剂FastSYBR Mixture（With ROX，康为世纪公司产品）、ABI ViiA7Real-Time PCR仪（AppliedBiosystems公司产品）按照说明书进行real-time PCR对血清中的病毒定量）。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图5所示，接种野生型病毒HV（WT）和病毒rHV（CK）的小猪两天后即出现发热，随后持续40.5℃以上的高温（图5中B），其他病理变化包括厌食、嗜睡、结膜炎、振颤、腹式呼吸等。接种野生型病毒HV（WT）的3头小猪10天内全部死亡，接种病毒rHV（CK）的小猪12天内全部死亡（图5中A），部分小猪的耳缘以及四肢末端、外阴等身体末端变蓝。接种野生型病毒HV（WT）和病毒rHV（CK）的小猪血清中的病毒滴度呈现逐渐升高的趋势，高达10⁷TCID₅₀/ml（图5中C）。上述结果验证了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的高热、高发病率与高死亡率；同时也从体内方面证明本发明中病毒基因组全长cDNA克隆的方法不会对病毒的毒力造成任何影响。然而接种了弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）的4头小猪仅1头在21天时死亡，其余3头均存活至28天，且健康状态良好（图5中A）。在28天的试验过程中直肠温度基本在40.5℃以下，感染20天以后回复至正常体温（图5中B）。另外仅出现一过性的厌食及结膜炎，血清中病毒滴度基本维持在10⁵TCID₅₀/ml以内（比HV和rHV组低100倍）（图5中C），28天后有一头猪的血清中的病毒已被完全清除，检测不到病毒的存在。

二、病理检测

将三组小猪的脏器（肺、脑、胸腺、扁桃体和气管支气管淋巴结等）切成小块后用10%中性福尔马林溶液固定，并进行苏木精-伊红染色（HE染色）检测病理变化。实验重复3次。

结果如图6所示，接种野生型病毒HV（WT）和病毒rHV（CK）的小猪肺部可见明显的间质性肺炎以及淋巴细胞浸润；脑部可见血管周围淋巴细胞聚集；胸腺出现萎缩、扁桃体和气管支气管淋巴结的结构完整性遭到严重破坏。然而接种由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP（实验组）后存活下来的3头小猪的脏器均未见明显的病变。

实验例5、rHV-GFP对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株感染的保护力测定

为了验证由重组质粒pcDNA3.1M-△HV-GFP拯救出的弱毒疫苗rHV-GFP作为对抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗的可能性，本实施例将12头四周龄的普通小猪通过滴鼻接种剂量为2×10⁵TCID50的弱毒疫苗rHV-GFP，接种方式均为滴鼻接种，每鼻孔接种1×10⁵TCID₅₀（1ml）。接种后，参照实施例4步骤一所述方法对其存活率、直肠温度及血清病毒滴度进行测定。

结果如图7中A、B和C所示，该剂量下rHV-GFP对小猪的损伤相较于实验例4步骤一进一步降低，仅在31天和33天有两头猪死亡；直肠温度仍然保持在40.5℃以下；血清中病毒滴度也不高（平均值在10⁴TCID₅₀/ml以内）。

42天后将存活下来的10头猪随机分成两组，一组接种2×10⁷TCID₅₀的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株（实施例1步骤一中所得的PRRSV野生型HV毒株病毒上清），另一组接种2×10⁷TCID₅₀的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JX株，接种方式均为滴鼻接种，每鼻孔接种1×10⁷TCID₅₀。接种后，参照实施例4步骤一所述方法对其存活率、直肠温度及血清病毒滴度进行测定。

结果如图7中D、E和F所示，两组小猪均能很好的存活，也均未检测到直肠温度的升高，并且只能在血清中检测到微量的病毒，以上结果说明本发明所提供的弱毒疫苗rHV-GFP能提供很好的对高致病性毒株感染的保护力。

Claims

1.一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，是将野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA进行替换或缺失得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的结构蛋白ORF2a、结构蛋白ORF2b、结构蛋白ORF3、结构蛋白ORF4、结构蛋白ORF5a和结构蛋白ORF5这六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分替换为标记蛋白的编码RNA；所述缺失为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的所述六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分进行缺失。

2.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于：所述结构蛋白ORF2a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第11983-12753位；所述结构蛋白ORF2b的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第11988-12209位；所述结构蛋白ORF3的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第12606-13370位；所述结构蛋白ORF4的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第13151-13687位；所述结构蛋白ORF5a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第13688-13828位；所述结构蛋白ORF5的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1的第13698-14300位。

3.根据权利要求1或2所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于：所述标记蛋白为绿色荧光蛋白；所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

4.根据权利要求3所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的编码反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第11990-12709位。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于：所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列1。

6.根据权利要求1-5中任一所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于：所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA反转录的cDNA序列如下：将序列表中序列2的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位或序列2的第15018-15057位，序列2的其他核苷酸不变。

7.制备权利要求6所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤：

（2）用步骤（1）的重组载体转染哺乳动物细胞，从而获得所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述真核表达载体为pcDNA3.1(+)；

所述哺乳动物细胞为293FT细胞或293T细胞。

9.权利要求1-6所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在如下（a）-（c）中的应用：

（a）制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗；

（b）制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物；

（c）制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征的产品。

10.如下（a1）或（a2）的生物材料：

（a1）含有权利要求1-6中任一所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的离体动物细胞或重组菌；

（a2）含有权利要求1-6中任一所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA或cDNA的载体。