CN113584063A - 一种基于转录调控序列重布的反向遗传操作方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于转录调控序列重布的反向遗传操作方法及其应用，其中，所述方法为根据HuN4‑F112感染性克隆全长测序以及转录调控前导序列（Leader TRS），下游转录调控序列(body TRSs)一级核心6碱基序列的鉴定，将HuN4‑F112全基因组设计为分别包含Leader TRS,Body TRSs在内的六段基因组序列，分别设计用于Leader TRS,Body TRSs核心6碱基序列C₅C₆定点突变的引物，获得全基因组转录调控序列整体突变的基因组片段。该TRS circuit突变PRRS弱毒疫苗株能够有效抵抗自然环境中普遍发生的基因组间重组现象，对临床上PRRS的有效防控有重要意义。

Description

一种基于转录调控序列重布的反向遗传操作方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种基于转录调控序列重布的反向遗传操作方法及其应用，利用这种方法构建病毒的突变质粒和基因工程疫苗，更具体地说，涉及一种能够抗重组并对猪繁殖与呼吸综合征病毒具有有效免疫保护的突变质粒和基因工程疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征，俗称为“蓝耳病”，在临床上引起仔猪出现呼吸系统障碍母猪流产，产死胎的繁殖障碍，自1996年在我国爆发以来，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前，减毒活疫苗（MLV）免疫普遍，PRRSV的感染率高，该病仍是猪场的主要疫病，我国的育肥猪场普遍阳性，阴性猪场屈指可数。PRRSV毒株的复杂性和多样性，类NADC30毒株广泛流行以及高致病性PRRSV减毒活疫苗的盲目使用等也都是导致PRRSV在国内难以得到有效防控，净化的原因。通过引种，人员，运输工具等传入猪场的毒株，在猪群中与流行株，疫苗株极易发生重组，以及疫苗毒的演化等病毒生命活动，从而产生新的变异毒株，在猪群中在猪群中传播、循环，猪场存在多个毒株循环感染，加上高致病性PRRSV 减毒活疫苗的无序使用，造成猪场蓝耳病不稳定局面。

PRRSV属于套式病毒目(Nidovirales) ，动脉炎病毒科(Arteriviridae），动脉炎病毒属。同大多数套式病毒一样，PRRSV基因组也采用非连续性转录（discontinuoustranscription）的方式转录出一系列具有5＇和3＇共末端的亚基因组mRNA（sg mRNA）用来翻译合成结构蛋白GP2a,2b,3,4,5a,5,M和N。在此过程中在此过程中发挥重要调控作用的顺式作用元件 (cis-acting element) 是病毒的转录调控序列 (TranscriptionRegulatory Sequence, TRS)。分为病毒基因组的先导序列（Leader）和下游的编码体（Body）的 TRS。PRRSV基因组在合成负链的body TRS时与基因组正链body TRS相结合，发生Leader-Body junction。在PRRSV基因组合成sg mRNA的非连续性转录的过程中，LeaderTRS和body TRS的碱基互补配对（base-pairing）发挥重要的作用。

RNA重组普遍存在于RNA病毒,PRRSV基因组在自然环境中也不例外。而关于RNA重组机制的研究，大多数认为重组新毒株是通过模板转换机制进行重组产生的，模板转换机制认为发生重组需要 RdRp 和 RNA 模板的共同参与，其中主要有 3 种 RNA 分子：供体，受体和产生的重组体。此机制认为发生重组需要 3 个步骤，首先以供体 RNA 分子为模板由引物起始合成新链；第二步，正在合成过程中的 RdRp 突然停止并脱离此模板；然后新合成的链随 RdRp 一起转移到受体模板上继续链的合成。通过研究总结，在自然环境中，模板转换机制产生的RNA重组现象普遍存在，对比PRRSV基因组合成sg mRNA的非连续性转录机制，两种机制十分地类似。

目前临床上防控PRRSV，弱毒活疫苗应用广泛，但是使用后引起的PRRSV基因组突变以及重组导致毒力返强的问题已经受到广泛地关注，PRRSV的防控问题变得愈加复杂困难，研制更加安全有效的PRRSV弱毒活疫苗迫在眉睫。

本发明基于前期针对PRRSV系列TRS在基因组中的位置、功能和不同TRS调控效率的系统解析，利用反向遗传操作技术，对PRRSV弱毒疫苗株基因组中整个TRS“电路（circuit）”进行重新设计，构建并拯救新的TRS circuit的PRRSV弱毒疫苗株。目前自然环境中流行PRRS毒株其TRS核心六碱基序列的5,6位均为碱基“CC”, 经我们设计的这种拥有突变TRS circuit（5,6位碱基为“GG”）的PRRS弱毒疫苗株在自然环境中是不存在的，由于PRRSV独特的非连续性转录机制以及模板交换RNA重组机制的联系。TRS circuit突变弱毒疫苗株与自然环境中流行PRRS发生模板交换重组时的TRS碱基互补配对被破坏，所产生的重组病毒将会由于TRS circuit的破坏失去活性或者复制能力受阻而发生致死。该TRScircuit突变PRRS弱毒疫苗株能够有效抵抗自然环境中普遍发生的基因组间重组现象，对临床上PRRS的有效防控有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于转录调控序列重布，能够有效防止猪繁殖与呼吸综合征病毒发生模板转换型重组的病毒突变质粒的构建方法。

本发明的构建PRRSV全基因组转录调控序列突变的猪繁殖与呼吸综合征病毒的突变质粒的方法。根据HuN4-F112基因组中Leader TRS和各个body TRS的位置以及核心六碱基一级序列的鉴定序列，分别设计HuN4-F112全基因组分段（A,B,C,D,E,F）PCR扩增引物以及TRS核心六碱基定点突变引物。在获得HuN4-F112全基因组包含Leader TRS和各开放阅读框（ORFs）的body TRSs在内的六段基因组突变序列后，于pBluescript SK(+)载体进行全基因组分段序列的同源重组连接，构建HuN4-F112全基因组转录调控序列的突变质粒pHuTRSall。

本发明的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112转录调控序列整体突变的突变病毒。

本发明的转录调控序列重布的突变PRRSV质粒的构建方法：首先通过设计的全基因组分段扩增引物扩增获得HuN4-F112全基因组的六个片段。然后通过各片段与中间载体连接后利用定点突变引物将各段中的TRSs进行核心六碱基的定点突变；最后将TRSs已成功突变的各段基因组片段序列进行同源扩增并逐一连接，并转化TOP10感受态细胞，通过筛选获得TRSs突变全长感染性克隆质粒pHuSTRSall提供了相应的构建方法。

使用本发明构建的TRSs突变质粒pHuTRSall 转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒与亲本病毒HuN4-F112相比具有同样的PRRS病毒的蛋白表达特性，而病毒生长特性与亲本病毒HuN4-F112存在差异，并且在连续传代5代的过程中，病毒基因组能够保持稳定。

本发明的转录调控序列整体突变的病毒PRRS弱毒疫苗株vA-TRSall能够在与流行PRRS毒株NADC30-like于体外细胞共感染的条件下，有效降低两个毒株发生模板交换型重组的几率，说明该TRS circuit整体突变PRRS弱毒疫苗株能够破坏与流行PRRS毒株基因组TRS circuit的碱基互补配对过程，从而达到有效抵抗两个基因组间发生模板交换型重组的作用，有望今后临床上作为一种能够抗PRRSV发生重组产生新毒株的基因工程弱毒疫苗，用于临床防控PRRSV的免疫保护。

附图说明

图1是HuN4-F112全基因组转录调控序列突变质粒构建示意图

图2是引物扩增高致病性PRRS弱毒疫苗株HuN4-F112基因组的不同基因组片段的1%凝胶电泳检测结果。

图3是最终筛选构建成功的TRSs突变全长基因组质粒鉴定筛选电泳结果图和对全长突变质粒SwaI线性化模板体外转录RNA的电泳鉴定。

图4是用TRSs突变的全长质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。

图5是对拯救病毒的N蛋白和NSP2蛋白的间接免疫荧光照片，A是亲本病毒HuN4-F112的N蛋白、NSP2蛋白免疫荧光照片；B是被拯救病毒vA-TRSall的N蛋白、NSP2蛋白免疫荧光照片；C为阴性对照。

图6是对被拯救病毒株与亲本病毒的滴度比较变化，多步生长曲线的绘制。

图7是拯救病毒与亲本病毒噬斑形态比较图。

具体实施方式

在本发明中，所述的TRSs突变PRRSV质粒指的是，利用反向遗传技术，将高致病性PRRS传代致弱株HuN4-F112基因组中的所有TRSs的核心六碱基突变所得到的突变质粒pA-TRSall。

在本发明中，所述TRSs整体突变的病毒是指，利用基因组定点突变技术所获得的全长TRSs突变质粒pA-TRSall转染MARC-145细胞后拯救的活病毒vA-TRSall。

在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言，是在获得的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的感染性克隆骨架上，通过将全长基因组分段后做TRSs定点突变的方法对病毒基因组中TRSs核心六碱基进行定点突变，再进行突变的HuN4-F112全长感染性克隆进行重新构建，再使该感染性克隆装配出具有生物活性的病毒粒子，研究该突变病毒与亲本病毒在病毒生物学特性上的变化，以及该TRSs整体突变的PRRSV弱毒株对病毒的基因组抗重组特性方面的影响的内容。

在本发明中，所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112的Genbank登录号是EF635006。

在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的感染性克隆HuN4-F112指的是，参考文献ShanruZhang, YanjunZhou, Yifeng Jiang, Guoxin Li,Liping Yan, Hai Yu, Guangzhi Tong. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus的方法所构建的感染性克隆。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系）。

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司，T7 mMESSAGE High YieldCapped RNA Transcription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和Quant ReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入0.01MOI的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加入维持液（含有2％FBS的DMEM）培养基，37℃5％CO2培养箱中培养。

实施例中TRSs整体突变的PRRSV突变质粒的构建

根据Genbank登录号为EF635006以及前期研究中获得的Leader TRS以及bodyTRSs位置以及结合核心序列，分别设计6对扩增基因组分段序列以及7条针对基因组中所有TRSs定点突变的引物，如图2所示，然后分别通过细胞转染试验，验证了获得的TRSs突变质粒的感染性，具体过程如下：

1.1引物设计

根据Genbank上的HuN4的碱基序列以及前期研究中的Leader TRS和body TRSs所在基因组位置和结合位置核心六碱基序列，设计PCR扩增引物以及定点突变引物。其序列分别如下：

A- F: GGTACCGGGCCCCCCctcgagTTAATTAAATTTAGGTGA（SEQ ID NO.1）

A-R: AGCTCCACCGCGGTGgcggccgccaattgGACAGTGAG（SEQ ID NO.2）

B-F: CTGACCGCCTTCTCACTGTCcaattgCTATTACCCT(SEQ ID NO.3)

B-R: AGCTCCACCGCGGTGgcggccgcggatccAGAATCGCCACACGCGGTGAAGCAGAA (SEQ IDNO.4)

C-F: GCGTGTGGCGATTCTggatccCCAGTGATTACCGAA(SEQ ID NO.5)

C-R: AGCTCCACCGCGGTGgcggccgcatcgatCGCAGGACGCAAGATCAGCTTCAA(SEQ IDNO.6)

D-F: ATCTTGCGTCCTGCGATCGATCCACACCTGCAATTGT(SEQ ID NO.7)

D-R: AGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCGGCGCGCCCGAAACGCATCATTGTAATCCTCCCAGT(SEQID NO.8)

E-F: GATTACAATGATGCGTTTCGggcgcgccAGAAAGGGAAAATTT(SEQ ID NO.9)

E-R: AGCTCCACCGCGGTGgcggccgcacgcgtGGTTATCATTTGCCGCAATCG(SEQ ID NO.10)

F-F: GATTGCGGCAAATGATAAggacgcgtTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCT(SEQ ID NO.11)

F-R: AGCTCCACCGCGGTGgcggccgcatttaaatTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTACGGCC(SEQ ID NO.12)

L-TRS-F：GGTCTCTCCACCCCTTTAAggATGTCTGGGATACTTG(SEQ ID NO.13)

L-TRS-R:CAAGTATCCCAGACATccTTAAAGGGGTGGAGAGACC(SEQ ID NO.14)

TRS2-F:GGGCCCTGTCATTGAAggAACTTTAGGCCTG(SEQ ID NO.15)

TRS2-R:CAGGCCTAAAGTTccTTCAATGACAGGGCCC(SEQ ID NO.16)

TRS3-F:GACAGGGGCAAATGTAAggATAGTGTATAATAG(SEQ ID NO.17)

TRS3-R:CTATTATACACTATccTTACATTTGCCCCTGTC(SEQ ID NO.18)

TRS4-F:GGCGGCAATTGGTTTCAggTGGAATGGC(SEQ ID NO.19)

TRS4-R:GCCATTCCAccTGAAACCAATTGCCGCC(SEQ ID NO.20)

TRS5-F:GTGGGCAACCGTTTTAGggTGTCTTTTTGC(SEQ ID NO.21)

TRS5-R:GCAAAAAGACAccCTAAAACGGTTGCCCAC(SEQ ID NO.22)

TRS6-F:CGCGGCAACCCCTTTAAggAGAGTTTCAGCGG(SEQ ID NO.23)

TRS6-R:CCGCTGAAACTCTccTTAAAGGGGTTGCCGCG(SEQ ID NO.24)

TRS7-F:CGATTGCGGCAAATGATAAggACGCGTTTGTCGTCCGGCG(SEQ ID NO.25)

TRS7R:CGGGACGCCGGACGACAAACGCGTccTTATCATTTGCCGCAATCGG(SEQ ID NO.26)

具体构建步骤如下：

1.1.1扩增PRRSV基因组分段产物

以pHuN4-F112作为模板，引物A-F，A-R……F-F，F-R等上述12条，共6组引物（SEQID1-12）

分别作为上下游引物，PCR扩增基因组分段序列A,B,C,D,E,F序列，具体如下：

PCR反应体系为：pHuN4-F112质粒(1:1000稀释)为模板1μL,上下游引物对（10μM）各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共进行35个循环，然后72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，根据检测结果，获得的目的片段大小分别为2418bp，3578bp，2960bp，3108bp，2843bp，728bp。

1.1.2定点突变所有TRSs核心六碱基序列C₅C₆位

以1.1.1中通过PCR扩增所得到的基因组各段序列分别与pBlunt连接构建的质粒为模板，引物TRS2-F,TRS2-R……TRS7-F,TRS7-R等上述14条引物，共7组引物(SEQ ID 13-26)分别作为上下游引物，通过定点突变PCR将各段中所包含的TRS核心六碱基C5C6为突变为G5G6，具体如下：

PCR反应体系为:含有各段基因组序列的质粒pBlunt-A, pBlunt-B, pBlunt-C,pBlunt-D, pBlunt-E, pBlunt-F质粒为模板（1:1000稀释）1μL，上下游引物对（10μM）各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。（每个样品体系各做两个）

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，58 ℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取共100μLPCR反应产物，200μL无水乙醇加入混匀后静置10min,12000rpm,离心10min后弃去上清，在沉淀中加入DpnＩ酶，反应体系：ddH₂O:17μL，cutsmart buffer:2μL,DpnＩ酶：1μL（总反应体系20μL）,37℃反应2h。

待DpnI酶切反应结束后，转化TOP10感受态细胞，挑取单菌落后进行培养，提取质粒DNA后进行测序，筛选出成功突变的质粒，做之后备用。

1.2 TRSs整体突变PRRSV质粒的构建

以上述所有通过定点突变成功的片段质粒为模板，利用1.1.1中相应的引物（SEQID1-12）PCR扩增得到其中TRSs成功突变的基因组序列，依次进行同源重组连接，并在连接E,F片段后进行全长PRRSV全长阳性质粒的筛选，通过1%琼脂糖凝胶电泳，与阳性pHuN4-F112质粒对照，以及测序，筛选得到TRSs整体突变PRRSV阳性克隆质粒。

利用双酶切后同源重组的方法，具体步骤如下：如图1所示，连接A段时，将pBluescript载体质粒利用XhoI,MfeI双酶切后凝胶电泳纯化回收载体片段pBluescript(XhoI/MfeI),将上述所得到的得到的PCR产物与双酶切后的载体利用同源重组酶进行连接，转化TOP10，挑取独立的菌落进行培养，提取质粒DNA后进行测序鉴定，得到连接成功的阳性质粒pBlue-A(G)。

图1所示，连接B时，以pBlue-A(G)，MfeI,BamHI双酶切后大片段为载体，PCR扩增的TRS已突变的B段为目的片段，以1:3的比例，同源重组酶mix 5μL，共10μL体系，进行连接，转化TOP10，进行阳性克隆的筛选。

后续试验方法相同，逐一进行基因组目的序列的连接，最终构建TRSs整体突变的PRRSV全基因组质粒pHuTRSall。

1.3病毒RNA的制备

1.3.1质粒的SwaI线性化

于25℃水浴中，用Swa I分别对TRSs整体突变质粒pHuTRSall和亲本质粒pHuN4-F112进行线性化酶切(反应体系为：突变质粒3μg，Swa I 3μL，ddH2O 0μL，100×BSA 0.5μL，10×NEB Buffer3 5μL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquick PCR PurificationKit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒，见图3。

1.3.体外转录

参考说明书的方法，使用T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA TranscriptionKit（购自Ambion公司）体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，见图3。获得了pA-TRSall的体外转录RNA。

1.4 TRSs整体突变PRRSV的检测

1.4.1 RNA的转染

接种MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系，购自美国ATCC）于六孔板中培养，待细胞密度为80-90％时，向每孔中分别加入pA-TRSall的in vitro RNA和2μL DMRIE-C转染试剂，在1mL的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染MARC-145细胞，并且逐日观察细胞病变。

待出现如图4所示的细胞病变（CPE）后，收取细胞上清后传代，具体过程如下：MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液（含2％FBS的DMEM）按照1∶10的比例接种上清液200μL，置37℃继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒vA-TRSall。

根据上述结果，所获得的突变质粒pHu TRSall具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变成具有活性的病毒粒子，并具有病毒感染性。

1.4.2 间接免疫荧光检测

按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒vA-TRSall，感染单层MARC-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定10min，1％BSA室温封闭30min，分别用PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗（1∶800稀释）和NSP2蛋白的特异性单抗（鼠源 ，1:1000倍稀释）室温孵育2h，再加入FITC标记的羊抗鼠或者羊抗兔的二抗室温孵育1h，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图5所示。

1.4.3 病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

参照Pizzi，M.，Sampling variation of the fifty percent end-point，determined by the Reed-Muench (Behrens) method，Hum Biol，1950. 22(3)：p151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液（含有2％FBS的DMEM）作10倍系列稀释后，将10-1-10-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种8孔，每孔0.1mL，再设2列对照(即用维持液代替病毒液)，置37℃ 5％的二氧化碳培养箱中培养，6-7天后观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，并按Reed-Muench法计算TCID50。

1.4.4 病毒多步生长曲线的绘制

分别以低剂量（0.01MOI）病毒（vH-TRSall-F5和vHuN4-F112）感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段（12h、32h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h）收取细胞培养上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCID50计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图6所示，根据该图，可以看出，12h时亲本病毒HuN4-F112与突变病毒vA-TRSall滴度差异显著；vA-TRSall在32h形成第一个复制高峰期，随后36h出现第二个复制高峰期，并在第48h出现病毒滴度的短暂降低，随后基本保持平台；而亲本病毒在地36h形成病毒第一个复制高峰期，48h出现第二个复制高峰期，并在达到峰值后到达病毒滴度平台期。96h,108hvA-TRSall与HuN4-F112均出现滴度下降并趋于稳定。由该图也可以看出，TRSs整体突变的PRRSV病毒与亲本病毒HuN4-F112的生长特性存在显著的差异，这也可以说明TRSs的突变影响了PRRSV的复制转录，对比病毒的生长特性产生了显著的影响。

1.4.5 突变病毒与亲本病毒噬斑形态对比

将突变病毒vH-TRSall和亲本病毒vHuN4-F112分别做10倍系列稀释后，用 300 μL吸附六孔板中的 MARC-145 细胞，37℃孵育 1 h 后，弃掉病毒液，加入等比例的 2%低熔点琼脂糖与 2×MEM，再加入 4%FBS（终浓度为含 2%FBS 的 MEM，含 1%的琼脂糖），5 mL/孔铺到 6 孔细胞板中。室温凝固后，于 37℃培养箱倒置培养 4～5 d，待出现空斑后，在孔中加入 2 mL 4%的甲醛溶液固定后甩掉凝胶，用 5%结晶紫溶液染色。待染色结束后观察突变病毒与亲本病毒的噬斑形态与数目。如图7所示，亲本病毒HuN4-F112的同一个稀释倍数下产生的噬斑形态较小，数目正常可观，对比被拯救病毒vA-TRSall，其病毒噬斑大小与亲本病毒HuN4-F112相比较大，而形态相比无明显的差异，数目较亲本病毒更密。

〈110〉 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

〈120〉一种基于转录调控序列重布的反向遗传操作方法及其应用

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〈170〉 PatentIn version 3.3

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〈213〉TRS3-F

〈400〉

GACAGGGGCAAATGTAAggATAGTGTATAATAG

〈210〉18

〈211〉 28

〈212〉 nt

〈213〉TRS3-R

〈400〉CTATTATACACTATccTTACATTTGCCCCTGTC

〈210〉19

〈211〉 26

〈212〉 nt

〈213〉TRS4-F

〈400〉GGCGGCAATTGGTTTCAggTGGAATGGC

〈210〉20

〈211〉 28

〈212〉 nt

〈213〉TRS4-R

〈400〉GCCATTCCAccTGAAACCAATTGCCGCC

〈210〉21

〈211〉 28

〈212〉 nt

〈213〉TRS5-F

〈400〉GTGGGCAACCGTTTTAGggTGTCTTTTTGC

〈210〉22

〈211〉 28

〈212〉 nt

〈213〉TRS5-R

〈400〉GCAAAAAGACAccCTAAAACGGTTGCCCAC

〈210〉23

〈211〉 28

〈212〉 nt

〈213〉TRS6-F

〈400〉CGCGGCAACCCCTTTAAggAGAGTTTCAGCGG

〈210〉24

〈211〉 28

〈212〉 nt

〈213〉TRS6-R

〈400〉CCGCTGAAACTCTccTTAAAGGGGTTGCCGCG

〈210〉25

〈211〉 34

〈212〉 nt

〈213〉TRS7-F

〈400〉CGATTGCGGCAAATGATAAggACGCGTTTGTCGTCCGGCG

〈210〉26

〈211〉38

〈212〉 nt

〈213〉TRS7-R

〈400〉CGGGACGCCGGACGACAAACGCGTccTTATCATTTGCCGCAATCGG

〈210〉 2

〈211〉20

〈212〉 nt

〈213〉Et.Actin基因编辑位点的crRNA序列

〈400〉

ctgcaaacttagaagcactt

〈210〉 3

〈211〉4154t

〈213〉pActin-P2A-DHFR-EYFP基因

〈400〉

AAGCTTccgccgagaaagaaattgtgcgcgacattaaggagaagctctgctacatcgcgctcgacttcgatgaaGAGATGAAGGTTCGGCGCCGAAACATTTTATTGCTGTTGGTCTTGGAGTGACAATTTGTTGCCAGTAGACCTCACGCGCTCAGTTCTAACATCCATCGTACGAGTTGCCTGATGGCAACATAATCACTGTTGGCAATGGGCGTTTGCGTTGCCCTGACATCCGGTTCTAACTGCGTCTTTCATTCTGAGCTGTTTTTTCACGTGAATGGTTTGTGTCTTTTTTGTTTCCGCAGaatgctgaggactcgagtgacatcgagaagtcgtacgagttgcctgatggcaacataatcactgttggcaatgagcgtttccgttgccctgaggctcttttccagccttcattcttgggcaaggaggcatcgggtatccatcgtaccacgttcgactccatcatgaagtgcgatgtggatatcaggaaggacctctacggcaatgttgttctctctggcggcacaaccatgtacgaaggcattggcgagcgccttaccagggagctcacatcgctggctccgtctacgatgaagattaaggttgttgcgcctcctgagcgcaagtacagtgtctggattggagggtcaattctgtcttcgttatcgactttccagcagatgtggatcacgaaggaagaatatgatgagtctgggccgagcatcgttcaccgcaagtgcttcGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCAGAAGCCGGTGTGTCTGGTCGTCGCGATGACCCCCAAGAGGGGCATCGGCATCAACAACGGCCTCCCGTGGCCCCACTTGACCACAGATTTCAAACACTTTCGTCGTGTGACAAAAACGACGCCCGAAGAAGCCAGTCGCCTGAACGGGTGGCTTCCCAGGAAATTTGCAAAGACGGGCGACTCTGGACTTCCCTCTCCATCAGTCGGCAAGAGATTCAACGCCGTTGTCATGGGACGGAAAAACTGGGAAAGCATGCCTCGAAAGTTTAGACCCCTCGTGGACAGATTGAACATCGTCGTTTCCTCTTCCCTCAAAGAAGAAGACATTGCGGCGGAGAAGCCTCAAGCTGAAGGCCAGCAGCGCGTCCGAGTCTGTGCTTCACTCCCAGCAGCTCTCAGCCTTCTGGAGGAAGAGTACAAGGATTCTGTCGACCAGATTTTTGTCGTGGGAGGAGCGGGACTGTACGAGGCAGCGCTGTCTCTGGGCGTTGCCTCTCACCTGTACATCACGCGTGTAGCCCGCGAGTTTCCGTGCGACGTTTTCTTCCCTGCGTTCCCCGGAGATGACATTCTTTCAAACAAATCAACTGCTGCGCAGGCTGCAGCTCCTGCCGAGTCTGTGTTCGTTCCCTTTTGTCCGGAGCTCGGAAGAGAGAAGGACAATGAAGCGACGTATCGACCCATCTTCATTTCCAAGACCTTCTCAGACAACGGCGTACCCTACGACTTTGTGGTTCTCGAGAAGAGAAGGAAGACTGACGACGCAGCCACTGCGGAACCGAGCAACGCAATGAGCTCCTTGACGTCCACGAGGGAGACAACTCCCGTGCACGGGTTGCAGGCTCCTTCTTCGGCCGCAGCCATTGCCCCGGTGTTGGCGTGGATGGACGAAGAAGACCGGAAAAAACGCGAGCAAAAGGAACTGATTCGGGCCGTTCCGCATGTTCACTTTAGAGGCCATGAAGAATTCCAGTACCTTGATCTCATTGCCGACATTATTAACAATGGAAGGACAATGGATGACCGAACGGGCGTTGGTGTCATCTCCAAATTCGGCTGCACTATGCGCTACTCGCTGGATCAGGCCTTTCCACTTCTCACCACAAAGCGTGTGTTCTGGAAAGGGGTCCTCGAAGAGTTGCTGTGGTTCATTCGCGGCGACACGAACGCAAACCATCTTTCTGAGAAGGGCGTGAAGATCTGGGACAAGAATGTGACACGCGAGTTCCTCGATTCGCGCAATCTCCCCCACCGAGAGGTCGGAGACATCGGCCCGGGCTACGGCTTCCAGTGGAGACACTTCGGCGCGGCATACAAAGACATGCACACAGACTACACAGGGCAGGGCGTCGACCAGCTGAAGAATGTGATCCAGATGCTGAGAACGAATCCAACAGATCGTCGCATGCTCATGACTGCCTGGAATCCTGCAGCGCTGGACGAAATGGCGCTGCCGCCTTGTCACTTGTTGTGCCAGTTCTACGTGAACGACCAGAAGGAGCTGTCGTGCATCATGTATCAGCGGTCGTGCGATGTCGGCCTCGGCGTCCCCTTCAACATCGCTTCCTATTCGCTTTTGACGCTCATGGTTGCACACGTCTGCAACCTAAAACCTAAGGAGTTCATTCACTTCATGGGGAACACGCATGTCTACACGAACCATGTCGAGGCTTTAAAAGAGCAGCTGCGGAGAGAACCGAGACCGTTCCCCATTGTGAACATCCTCAACAAGGAACGCATCAAGGAAATCGACGATTTCACCGCCGAGGATTTTGAGGTCGTGGGCTACGTCCCGCACGGACGAATCCAGATGGAGATGGCTGTCTTGGATCCTGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGCTGTAGAGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGCCGCGTTTGCAGCAGAGTAGTTCATGACTTGCGAAACGGCCTCTCGATTAATAATACGCTTTGCCGCAACGTGAAGTAGGCGTTATTGTGTGCTGCCTGTCGCTGAGCTCCTGCATCGAGCGGCAAGGGGTTCAACCGAGCGCAAATTCTGTGGAAATAGCTGGACAAAAGCATCTGCGACGGGTGGGGGCAGGCGCAGCTAGCTGTTGCTCCCGACATCAGTCATGGAAATGCGTTTCAGGCTAAGCAAGTAGCTGCCCGCCTGGTGGGAAGATGAGGCTAGGAACTGCTATGTTTGCCCCTCACTTGGCGGTATTGCAGTGTAGTACGTGCATTGTGAACCCAGAGAAATGTGCTCCGCGTGACGCAGCGAGGCACAGGGGAACAGCAAGAGGGGCCGTTATTGCTCAGCGTGCTGGACCCCCTTGTTCCTTCAAACCTTACTTATGAGGGCTTACGCATCGCACCTGATGGGTCGGTGTAGCGTGATCATTTCACTGTTCAGTAGTAGGTATGGGAGGAGTGTAGTTGGCAGGATGTAGGAGCTTTGCAAGCGGTGGAACGGTTGAGATGAGTAGTGAACAGAGGCTTTGCCCAATGTCGGATAGTGAGTGTTTCTCGAGCACGAAACGTGCAAGGCAACAGGTTACTGTAGGTTTATGTAGTTGGCAAGAGTGGGCCTTGCCCAGTATTCGGTAGTAAGTGTCAAGCACGACACCAGATTGCGAAGCAACAGGTAATTGTAGGTTTACGTA

〈210〉 4

〈211〉 20

〈212〉 nt

〈213〉F1

〈400〉 TGTGTCCCACACTGTTCCTA

〈210〉 5

〈211〉 20

〈212〉 nt

〈213〉R1

〈400〉 TGCTTTCCCAGTTTTTCCGT

〈210〉 6

〈211〉 20

〈212〉 nt

〈213〉F2

〈400〉 GAACGGCATCAAGGTGAACT

〈210〉 7

〈211〉 20

〈212〉 nt

〈213〉R2

〈400〉 CCACAACTTTCCGTCACACT

〈210〉 8

〈211〉 20

〈212〉 nt

〈213〉F3

〈400〉 CCGGTTCTAACTGCGTCTTT

〈210〉 9

〈211〉 20

〈212〉 nt

〈213〉R3

〈400〉 TCTCTGGGTTCACAATGCAC

Claims (5)

1.一种基于转录调控序列重布而研发的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗重组弱毒苗的构建方法；所述方法为根据HuN4-F112感染性克隆全长测序以及转录调控前导序列（LeaderTRS），下游转录调控序列(body TRSs)一级核心6碱基序列的鉴定，将HuN4-F112全基因组设计为分别包含Leader TRS ,Body TRSs在内的六段基因组序列，根据基因组序列设计引物PCR扩增获得六段基因组片段并了分别连接中间载体，分别设计用于Leader TRS ,BodyTRSs核心6碱基序列C₅C₆定点突变的引物，获得全基因组转录调控序列整体突变的基因组片段，而后进行转录调控序列整体突变的全长感染性克隆的连接构建；最终获得转录调控序列整体突变全长质粒pHuTRSall。

2.如权利要求1所述的一种基于转录调控序列重布能够抗重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法；所述的转录调控序列整体突变全长质粒pHuTRSall是能够成功拯救获得整体突变病毒vA-TRSall。

3.如权利要求1所述的一种基于转录调控序列重布能够抗重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法；所述转录调控序列整体突变全长质粒pHuTRSall的全长序列如下全长PRRSV核苷酸序列所示。

4.一种利用权利要求1-3之一所述的一种基于转录调控序列重布能够抗重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法获得的转录调控序列整体突变全长质粒pHuTRSall。

5.一种权利要求4所述的转录调控序列核心6碱基C5C6整体突变的全长质粒的应用，所述应用为作为一种能够用于猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫保护的抗重组基因工程弱毒苗。

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