CN113736799B - 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用，属于生物技术领域。该构建方法包括：以山羊副流感病毒3型的总RNA反转录产物为模板，扩增A、B、C和D片段；将片段A和B、片段C和D分别插入pCI‑neo‑1载体中，得到重组载体pCI‑A‑B、pCI‑C‑D；以pCI‑A‑B为模板，扩增片段A‑B；以pCI‑C‑D为模板，扩增C‑D片段；将线性化pYES1L载体、A‑B和C‑D片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染细胞后能够快速产生细胞病变，病毒滴度高，且保持稳定。

Description

山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用。
背景技术
山羊副流感病毒3型(Caprine parainfluenza virus 3，CPIV3)是新近鉴定的一种副粘病毒科呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒，主要感染山羊和绵羊。CPIV3基因组大小为15624bp，与同属的病毒相似，从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白(N)基因、磷蛋白(P)基因、基质蛋白(M)基因、融合蛋白(F)基因、血凝素蛋白(HN)基因、大转录蛋白(L)基因和5’端序列。该病毒主要通过呼吸道传播，引起呼吸道疾病，在应激、混合或继发感染其他病原等情况下会导致明显的临床症状，引起严重的呼吸道疾病，导致较高的发病率和死亡率。流行病学研究表明国内羊群存在较高的病毒感染率。该病毒为新近发现的新病原，尽管已经分别围绕病毒感染与I型干扰素反应、细胞凋亡、miRNA及外泌体的相互作用开展研究，但目前对其感染和致病机制的研究尚不深入。国内外均无对该病毒有效防控方法的报道，且尚无可以预防山羊副流感病毒3型感染的疫苗。
反向遗传技术是新兴的一种定向修饰或改造病毒的重要技术，应用前景非常广阔，该技术已成功广泛应用于多种病毒的疫苗和致病机制研究。但是，现有技术中还未有人构建出山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆。
发明内容
本发明的目的在于提供山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用，构建效率高，该感染性cDNA克隆拯救的病毒rCPIV3感染MDBK细胞后能够快速产生细胞病变，病毒滴度可达到108TCID50/mL以上，且保持稳定。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法，包括以下步骤：
(1)将SEQ ID NO:1所示序列插入pCI-neo质粒，得到重组质粒pCI-neo-1；
(2)以山羊副流感病毒3型的总RNA的反转录产物为模板，用引物AF1、AF2和AR扩增A片段，用引物BF和BR扩增B片段，用引物CF和CR扩增C片段，用引物DF、DR1和DR2扩增D片段；将扩增得到的片段A和B插入pCI-neo-1载体，得到重组载体pCI-A-B；将扩增得到的片段C和D插入pCI-neo-1载体中，得到重组载体pCI-C-D；
(3)以pCI-A-B为模板，用引物AB-F和AB-R扩增片段A-B；以pCI-C-D为模板，用引物CD-F和CD-R，扩增C-D片段；以pYESlL质粒为模板，用引物Vector-F和Vector-R扩增，获得线性化的pYES1L载体；
(4)将线性化的pYES1L载体、A-B和C-D片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒pYES1L-CPIV3。
在本发明中，用引物AF1、AF2和AR扩增A片段，包括两个PCR扩增反应；首先，以AF1和AR为引物进行第一次PCR扩增；然后以第一次PCR扩增产物为模板，以AF2和AR为引物，进行第二次PCR扩增，得到A片段。
在本发明中，用引物DF、DR1和DR2扩增D片段，包括两个PCR扩增反应；首先，以DF和DR1为引物进行第一次PCR扩增；然后以第一次PCR扩增产物为模板，以DF和DR2为引物，进行第二次PCR扩增，得到D片段。
本发明还提供上述方法得到的山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒及其在拯救山羊副流感病毒3型中的应用。
在本发明中，所述应用包括如下步骤：分别构建表达山羊副流感病毒3型N、P、L蛋白的辅助质粒，利用转染试剂LipofectamineTM 2000将权利要求4所述感染性cDNA克隆质粒和辅助质粒共转染293T细胞，收获细胞培养物并接种MDBK细胞，收获细胞培养物，获得拯救的感染性山羊副流感病毒3型rCPIV3。
在本发明中，所述辅助质粒是将通山羊副流感病毒3型N、P和L蛋白的编码基因分别克隆至pCAGGS，得到pCAGGS-N，pCAGGS-P和pCAGGS-L三个辅助质粒。
优选的技术方案中，感染性cDNA克隆质粒、辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P和pCAGGS-L的质量比为5：5：2：1。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明以高效同源重组系统，以pYES1L为骨架载体，利用基于酵母的同源重组技术，率先构建了山羊副流感病毒3型毒株JS14-2株全基因组cDNA感染性克隆以及3个辅助质粒，建立了山羊副流感病毒3型反向遗传操作系统，利用该系统能够实现重组病毒的稳定高效拯救。本发明构建方法，效率高。拯救的病毒rCPIV3感染MDBK细胞后，于感染后24h-48h产生细胞病变，获得的rCPIV3病毒滴度可达到108TCID50/mL以上，病毒增殖速度高于野生型毒株，滴度与野生毒株一致，且保持稳定。为未来山羊副流感病毒3型新型疫苗、羊用多联疫苗研制和山羊副流感病毒3型致病机理研究奠定基础。
附图说明
图1山羊副流感病毒3型全长cDNA分段扩增策略，其中数字表示病毒基因组位置(bp)。
图2山羊副流感病毒3型全长cDNA克隆质粒构建策略。
图3山羊副流感病毒3型辅助质粒构建的鉴定，其中A图：泳道1为DNA markerDL2000，泳道2为BglII酶切后的pCAGGS-N，泳道3为BglII酶切后的pCAGGS-P，泳道4为DNAmarker 1kb plus；B图中泳道1为DNA marker DL2000，泳道2为HindIII酶切后的pCAGGS-L，泳道3为DNA marker 1kb plus。
图4重组病毒的MDBK细胞病变，其中A图：正常MDBK细胞，B图：接毒2天的细胞病变，C图：接毒3天的细胞病变。
图5重组病毒的间接免疫荧光鉴定，A图：正常细胞，B图：接毒细胞。
图6重组病毒的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1山羊副流感病毒3型JS14-2株感染性cDNA克隆质粒的构建
1.CDV-3株全基因组克隆及序列测定
取冻存的山羊副流感病毒3型JS14-2株(公开于中国专利ZL 201810926226.2中，保藏号为CCTCC NO:V201832)细胞培养悬液200μL，根据Axygen核酸提取试剂盒操作说明，提取总RNA。根据CPIV3 JS2013株参考序列，将病毒全基因组序列划分为9个目标片段，用软件Primer Premier 5.0设计了9对特异性引物(如表1)分别扩增目标片段1-9，将引物送南京擎科生物科技有限公司合成。以提取的RNA为模板，分别以各对特异性引物用一步法RT-PCR试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)进行RT-PCR扩增。RT-PCR总体积20μL，其中2×R-Mix Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，E-Mix 0.4μL，RNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：45℃反转录30min；94℃5min；94℃30s，55-60℃30s(根据不同引物对的Tm值调整退火温度)，72℃2min，35个循环；72℃10min。对目的片段1-9进行回收纯化，产物送南京擎科生物科技有限公司进行序列测定。根据测序结果，拼接得到病毒全基因组序列，比对发现该序列与已有毒株序列同源性为99.6％-99.9％，与同源性最高的AHQJ2015-1株(MF693177.1)相比有15个核苷酸突变(表2)。
表1全基因组扩增用引物
表2JS14-2与AHQJ2015-1全基因组序列差异情况
2.CPIV3全基因组cDNA重组质粒的构建
利用软件分析JS14-2株全基因组序列的单一性酶切位点，选取适当的位置作为衔接点，将全基因组分为四个片段A、B、C、D，具体见图1。首先人工合成序列1(SEQ ID NO:1)(TAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGGTCGACGGTACCGTTTAAACGGGTTATTAATTAAATCATTCGCGGCCGCTTCC)，插入pCI-neo质粒(购自Promega)的XhoI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pCI-neo-1，其序列中依次包含酶切位点XhoI-SalI-PmeI-PacI-NotI。
利用Primer Premier5.0设计特异性引物(如表3)分别扩增A、B、C、D四个片段，其中扩增的A片段的一端连接有锤头状核酶序列，扩增的D片段的一端连接有丁型肝炎核酶序列。
以提取的JS14-2株病毒的总RNA为模板，按照反转录试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)说明书制备山羊副流感病毒3型JS14-2株cDNA。
扩增A片段包括两次PCR扩增。第一次PCR扩增，总体积20μL，其中2×PCR Buffer10μL，上下游引物(AF1、AR)各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。以第一次PCR扩增产物为模板，以AF2、AR为引物，进行第二次PCR扩增，得到一端连接有锤头状核酶序列的A片段，PCR体系的构成同第一次PCR扩增，PCR程序同第一次PCR扩增。
扩增D片段包括两次PCR扩增。第一次PCR扩增，PCR体系总体积20μL，其中2×PCRBuffer 10μL，上下游引物(DF、DR1)各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。以第一次PCR扩增产物为模板，以DF、DR2为引物，进行第二次PCR扩增，得到一端连接有丁型肝炎核酶序列的D片段，PCR体系的构成同第一次PCR扩增，PCR程序同第一次PCR扩增。
扩增B片段时，引物为BF和BR，PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
扩增C片段时，引物为CF和CR，PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。
将一端连接有锤头状核酶序列的片段A和pCI-neo-1分别采用XhoI和SalI酶进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将片段A插入pCI-neo-1中，得到了pCI-A。将pCI-A和片段B分别采用SalI和PmeI酶进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将片段B插入pCI-A中，得到了pCI-A-B。
将片段C、pCI-neo-1分别用PmeI和PacI酶进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将片段C插入pCI-neo-1中，得到pCI-C。将pCI-C和一端连接有丁型肝炎核酶序列的片段D分别采用PacI和NotI进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将连接有丁型肝炎核酶序列的片段D插入pCI-neo-1中，获得pCI-C-D。
以pCI-A-B为模板，用引物AB-F和AB-R，扩增片段A-B(片段A和B相连形成的片段)。PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。
以pCI-C-D为模板，用引物CD-F和CD-R，扩增C-D片段(片段C和D相连形成的片段)。PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。
以pYESlL质粒(购自Thermo Fisher scientific)为模板，以引物Vector-F和Vector-R进行PCR扩增，获得线性化的pYES1L载体。
将线性化的pYES1L载体、片段A-B和片段C-D混和，加入到MaV203酵母感受态(购自Thermo Fisher scientific)中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，然后接种于色氨酸(Trp)缺陷型平板(购自Thermo Fisher scientific)上，在30℃培养3天后，用引物CPIV3-F和CPIV3-R进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性克隆(克隆策略如图2所示)。由于线性化的pYES1L载体和片段A-B、片段A-B和片段C-D、线性化的pYES1L载体和片段C-D分别存在着末端同源臂，因此，在宿主细胞酵母内，通过同源重组机制组装成携带CPIV3全长cDNA的重组质粒。
将菌落PCR筛选阳性的酵母菌落的裂解液电转化DH10B感受态细胞，通过大观霉素抗性筛选阳性重组子，增殖后通过质粒中量提取试剂盒纯化携带CPIV3全长cDNA的重组质粒，命名为pYES1L-CPIV3。大量提取重组质粒pYES1L-CPIV3，测定浓度后分装，置-20℃保存。
表3病毒cDNA克隆构建扩增引物
注：表3中下划线为核酶序列，斜体为酶切位点。
实施例2辅助质粒的构建与鉴定
针对CPIV3中N、P和L基因的开放阅读框区域，利用Primer Premier5.0设计特异性引物(包含同源臂，见表4)，以重组质粒pYES1L-CPIV3为模板，进行PCR扩增，获得N、P和L基因片段。回收纯化后的N、P和L基因片段，分别采用南京诺唯赞生物科技有限公司ClonExpress II One Step Cloningkit，通过同源重组的方法(参照试剂盒说明书操作)克隆至pCAGGS质粒的XhoI和BglII位点之间，然后将携带各基因的重组质粒分别转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经PCR酶切鉴定的阳性菌落克隆(图3)，进一步测序鉴定筛选出正确的重组质粒pCAGGS-N(携带N基因的重组质粒)，pCAGGS-P(携带P基因的重组质粒)和pCAGGS-L(携带L基因的重组质粒)。按照无内毒素质粒提取试剂盒的操作说明提取质粒，测定浓度后分装，于-20℃保存。
表4N、P、L基因扩增引物
注：表4引物中画横线的部分是酶切位点。
实施例3山羊副流感病毒3型JS14-2株重组病毒的拯救与生物学特性鉴定
1.重组病毒的拯救与扩增
于24孔板中按照5×104个细胞/孔接种293T细胞，待细胞生长至90％汇合度时开始转染，每孔中的质粒用量为：感染性cDNA克隆质粒(重组质粒pYES1L-CPIV3)0.5μg，辅助质粒pCAGGS-N 0.5μg，pCAGGS-P 0.2μg和pCAGGS-L 0.1μg，转染试剂(LipofectamineTM2000)1.5μL，具体转染方法按照LipofectamineTM2000说明书进行操作。
将转染后的细胞在37℃、5％CO2条件下培养4-5d，收获细胞悬液，冻融三次，2000rpm离心5min，取上清接种MDBK细胞，观察细胞病变。结果：接种后第二天，MDBK细胞即出现山羊副流感病毒3型典型的细胞病变：出现合胞体、融合、脱落(图4)。收获细胞培养物，得到第一代拯救病毒rCPIV3。将拯救病毒rCPIV3连续传代，每一代培养物均置-70℃保存。
2.重组病毒的鉴定
2.1间接免疫荧光检测
将收获的拯救病毒rCPIV3接种至MDBK细胞，培养72h。弃去培养液，使用免疫染色固定液固定细胞15min；再加入免疫染色封闭液37℃通透封闭30min；加入CPIV3特异单克隆抗体，37℃孵育1h；PBS洗涤3次；加入FITC标记羊抗小鼠IgG荧光二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤3次。在荧光显微镜下观察可见感染病毒的细胞呈现特异的绿色荧光，而未接毒的对照细胞无荧光(图5)。说明重组病毒拯救成功，具有感染性。
2.2RT-PCR鉴定
分别提取重组病毒(拯救病毒rCPIV3)和亲本病毒(山羊副流感病毒3型JS14-2株)RNA，用一步法RT-PCR试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)，使用引物CF和CR进行RT-PCR扩增，RT-PCR总体积20μL，其中2×R-Mix Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，E-Mix 0.4μL，RNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：45℃反转录30min；94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
1％琼脂糖凝胶电泳后回收片段，送南京擎科生物科技有限公司测序，比较序列是否与设计的一致。结果：扩增的序列与病毒cDNA质粒序列一致。
3.生物学特性鉴定
3.1TCID50测定
用细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养基)将第三代重组病毒(拯救病毒rCPIV3)作10倍梯度稀释。然后将各稀释度的病毒液分别接种于长满单层MDBK细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度病毒液接种4个孔，每孔接种100μL。同时设定不接毒的阴性对照。37℃培养5天，观察细胞病变并按照Reed-Muench方法计算TCID50。结果表明：第三代重组病毒滴度可达108TCID50/mL以上。
3.2生长曲线测定
在长满单层MDBK细胞的24孔细胞培养板中，按感染复数(MOI＝1)接种重组病毒(拯救病毒rCPIV3)和亲本病毒(山羊副流感病毒3型JS14-2株)，37℃培养。于感染后24h、48h、72h、96h和120h，分别取细胞培养上清，按照标题3.1中方法测定病毒的TCID50，绘制病毒生长曲线。结果表明重组病毒和亲本病毒滴度在24-72h之间处于增长期，72-120h之间达到稳定，重组病毒在24-48h滴度高于亲本病毒(0.5log10)，说明重组病毒增殖速度高于亲本病毒(图6)。
3.3稳定性测定
按照标题3.1中方法在MDBK细胞上分别测定不同代次(第三代、第五代、第八代、第十代)重组病毒的滴度，结果表明各代次重组病毒滴度分别为108TCID50/mL、108.5TCID50/mL、108.15TCID50/mL和108.25TCID50/mL，病毒生长滴度均可达108TCID50/mL以上且保持稳定。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
扬州大学
<120> 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用
<130> 20210917
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 85
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 序列1
<400> 1
tagcctcgag aattcacgcg tggtacctct aggtcgacgg taccgtttaa acgggttatt 60
aattaaatca ttcgcggccg cttcc 85
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AF1
<400> 2
aaggaattcc tatagtcacc aaacaagaga gaaaacctg 39
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AF2
<400> 3
atctcgagtc tgtttggtct gatgagtccg tgaggacgaa actataggaa aggaattcct 60
atagtcac 68
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AR
<400> 4
gctgtcgaca aacaatttgc tatgacc 27
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> BF
<400> 5
gcaaattgtt tgtcgacaac atgtacatgc 30
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> BR
<400> 6
gggcgtttaa actcttatga tttatttcta tg 32
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CF
<400> 7
agagtttaaa caccctccaa cct 23
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CR
<400> 8
cgatttaatt aataaccctg atacct 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DF
<400> 9
gttattaatt aaatcattcc cctcgac 27
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DR1
<400> 10
accgcgagga ggtggagatg ccatgccgac ccaccaaaca agagaagaac tct 53
<210> 11
<211> 81
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DR2
<400> 11
tatgcggccg cctcccttag ccatccgagt ggacgtgcgt cctccttcgg atgcccaggt 60
cggaccgcga ggaggtggag a 81
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AB-F
<400> 12
cttgagctct aataggtctg tttggtctga tga 33
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AB-R
<400> 13
cataggttgg agggtgttta aactcttatg atttatttct atg 43
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CD-F
<400> 14
cataagagtt taaacaccct ccaacc 26
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CD-R
<400> 15
aactagaagg cacagctccc ttagccatcc ga 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Vector-F
<400> 16
ggatggctaa gggagctgtg ccttctagtt gc 32
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Vector-R
<400> 17
tcagaccaaa cagacctatt agagctcaag ctctg 35
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CPIV3-F
<400> 18
ggatgtataa caggagtc 18
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CPIV3-R
<400> 19
aggagaattc aaatggc 17

Claims (8)

1.山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将SEQ ID NO:1所示序列插入pCI-neo质粒，得到重组质粒pCI-neo-1；
（2）以山羊副流感病毒3型毒株JS14-2株的总RNA的反转录产物为模板，用引物AF1、AF2和AR扩增A片段，用引物BF和BR扩增B片段，用引物CF和CR扩增C片段，用引物DF、DR1和DR2扩增D片段；将扩增得到的片段A和B插入步骤（1）所述pCI-neo-1中，得到重组载体pCI-A-B；将扩增得到的片段C和D插入步骤（1）所述pCI-neo-1中，得到重组载体pCI-C-D；
（3）以步骤（2）所述pCI-A-B为模板，用引物AB-F和AB-R扩增片段A-B；以步骤（2）所述pCI-C-D为模板，用引物CD-F和CD-R，扩增C-D片段；以pYESlL质粒为模板，用引物Vector-F和Vector-R扩增，获得线性化的pYES1L载体；
（4）将步骤（3）所述线性化的pYES1L载体、A-B和C-D片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒pYES1L-CPIV3；
所述引物AF1、AF2、AR、BF、BR、CF、CR、DF、DR1、DR2、AB-F、AB-R、CD-F、CD-R、Vector-F和Vector-R的序列分别如SEQ ID NO:2-17所示；
所述山羊副流感病毒3型毒株JS14-2株的保藏号为CCTCC NO:V201832。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于用引物AF1、AF2和AR扩增A片段，包括两个PCR扩增反应；首先，以AF1和AR为引物进行第一次PCR扩增；然后以第一次PCR扩增产物为模板，以AF2和AR为引物，进行第二次PCR扩增，得到A片段。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于用引物DF、DR1和DR2扩增D片段，包括两个PCR扩增反应；首先，以DF和DR1 为引物进行第一次PCR扩增；然后以第一次PCR扩增产物为模板，以DF和DR2为引物，进行第二次PCR扩增，得到D片段。
4.权利要求1-3之一所述方法得到的山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒。
5.权利要求4所述的山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒在拯救山羊副流感病毒3型中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，包括如下步骤：分别构建表达山羊副流感病毒3型N、P、L蛋白的辅助质粒，利用转染试剂LipofectamineTM 2000将辅助质粒和权利要求4所述感染性cDNA克隆质粒共转染293T细胞，收获细胞培养物并接种MDBK细胞，收获细胞培养物，获得拯救的感染性山羊副流感病毒3型rCPIV3。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述辅助质粒是将山羊副流感病毒3型N、P和L蛋白的编码基因分别克隆至pCAGGS，得到的pCAGGS-N、pCAGGS-P和pCAGGS-L三个辅助质粒。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，权利要求4所述感染性cDNA克隆质粒、pCAGGS-N、pCAGGS-P 和pCAGGS-L的质量比为5：5：2：1。
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