CN105154588A

CN105154588A - 一种用于检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对

Info

Publication number: CN105154588A
Application number: CN201510569941.1A
Authority: CN
Inventors: 郝飞; 李文良; 毛立; 杨蕾蕾; 江杰元; 张纹纹; 王钟毓
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明涉及一种用于检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，属于生物技术领域。本发明提供了检测病毒的专用引物，包括引物对A和引物对B，引物对A包括引物1和引物2，引物对B包括引物3和引物4；引物1、引物2引物3和引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明所提供的CPIV3和PPRV双重RT-PCR检测专用引物敏感性高，最低可检测到RNA含量约为1×10^-3ng/μL，其灵敏度远高于1ng/μL的灵敏度。发明的双重RT-PCR检测方法特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床上的应用。

Description

一种用于检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对

技术领域

本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对。

背景技术

山羊副流感病毒3型(Caprineparainfluenzavirustype3，CPIV3)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒属(Respirovirus)的成员，该病毒可导致山羊轻重不等的呼吸道感染，如感冒、咳嗽、眼鼻分泌物增加、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎等。2014年本实验室首次从表现为严重呼吸道症状的山羊临床病料中分离鉴定出该病毒(属国内外首次)，通过人工感染试验证明了该病毒对山羊的致病性。小反刍兽疫(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)是副黏病毒科(Paramyxovirinae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员，可导致山羊、绵羊等小反刍动物发热、眼鼻出现大量分泌物、肺炎、上消化道溃疡和腹泻等临床症状，亚临床感染的山羊可通过分泌物和排泄物持续排毒。

病毒分离是检测病原的常用方法，但其耗时较长且不利于临床快速诊断，RT-PCR方法与之相比更加简便快速，适合实验室诊断。CPIV3为本实验室新发现的病毒，PPRV自2014年传入国内多数省区后危害巨大，二者均为引起山羊呼吸道疫病的主要病原，临床上存在混合感染，需要通过分子生物学方法来区分两者。目前临床上仅有检测PPRV的RT-PCR方法，但是，单独检测CPIV3和同时检测CPIV3和PPRV的RT-PCR方法尚未投入应用。

CPIV3基质蛋白(M)基因和PPRV核蛋白(N)基因序列高度保守，因此，针对CPIV3M蛋白基因和PPRVN蛋白基因的保守区进行双重RT-PCR检测方法的建立，能够提高RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低，能单独或/和同时检测CPIV3和PPRV的引物对；所述CPIV3为山羊副流感病毒3型，PPRV为小反刍兽疫病毒。

技术方案

本发明参考GenBank登录的山羊副流感病毒3型M基因序列(GenBank登录号：KJ850331)以及小反刍兽疫病毒N基因序列(GenBank登录号：JN647718)，利用MPprimer软件设计了10组引物组合(共20对引物)，然后使用多因素引物特异性评估系统MFEprimer对所有引物组合进行严格的特异性评估，最终选择了未发现存在非特异性扩增的引物对组合引物对A(346bp)、引物对B(189bp)。

一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，包括引物对A和/或引物对B：

引物对A，包括引物1和引物2：

引物1：5’-GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3’；

引物2：5’-GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’；

引物对B，包括引物3和引物3：

引物3：5’-GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3’；

引物4：5’-TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3’。

用所述引物对A和引物对B扩增待测样本RNA，如扩增产物同时出现346bp和189bp两条条带，则待测样本为阳性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒同时存在；如扩增产物出现346bp条带，则待测样本山羊副流感病毒3型为阳性，即山羊副流感病毒3型存在；如扩增产物出现189bp条带，则待测样本小反刍兽疫病毒为阳性，即小反刍兽疫病毒存在；如扩增产物无346bp和189bp条带，判为阴性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒都不存在。

用所述引物对A扩增待测样本RNA，如扩增产物出现346bp条带，则待测样本判为阳性，即山羊副流感病毒3型存在；如扩增产物无346bp，判为阴性，即山羊副流感病毒3型不存在。

用所述引物对B扩增待测样本RNA，如扩增产物出现189bp条带，则待测样本判为阳性，即小反刍兽疫病毒存在；如扩增产物无189bp，判为阴性，即小反刍兽疫病毒不存在。

所述的一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对用于检测待测样本病毒的方法，包括：

(1)待测样本病毒RNA的提取：取200μL待测样本血清/鼻拭子溶解液，或取100mg的动物组织加入1mLPBS缓冲液进行充分研磨，-70℃反复冻融3次，12000rpm4℃离心10min，取上清液200μL置于1.5mL的EP管中，加入Trizol试剂800μL，混匀后室温静置5min；加入氯仿200μL，振荡30s，室温静置3min，12000rpm4℃离心15min；转移上清至新的1.5mL的EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，12000rpm4℃离心10min；加入75％的乙醇1mL洗涤，12000rpm4℃离心5min，弃去液体，这时候可以看到EP管底部有少量白色沉淀，室温干燥5min；加入RNA溶解液20μL溶解沉淀，即为检测用待检样品RNA；

(2)采用20μL的RT-PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管中分别加入2×R-MixBuffer10μL，CPIV3上下游引物各0.5μL，PPRV上下游引物各0.7μL，E-Mix0.4μL，RNA模版4μL，无Rnase水加至总体积，混匀；

(3)扩增条件为：45℃反转录40min；94℃预变性5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min；

(4)取PCR产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳。

有益效果

本发明根据GenBank中发表的有关山羊副流感病毒3型(CPIV3)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的基因序列，经过序列比对分析，选取CPIV3M基因(GenBank登录号：KJ850331)和PPRVN基因(GenBank登录号：JN647718)中保守的片段设计并合成一对特异性引物，对CPIV3和PPRV进行RT-PCR扩增，得到约346bp和189bp的特异性条带。

本研究建立的山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒双重RT-PCR检测方法对其他常见山羊病原体(山羊痘病毒、蓝舌病病毒、边界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹泻病毒、伪狂犬病毒)均无反应；敏感性试验表明，最小检出量为10^-3ng/μL。

病毒感染山羊的血清、鼻拭子等RNA提取物用本发明建立的RT-PCR方法检测，均扩增出相应片段，适用于临床检测。

附图说明

图1：双重RT-PCR引物最佳量的测定结果

M表示Trans2KplusDNAMarker；1-5泳道表示在固定CPIV3引物的量为0.5μL情况下，PPRV引物量分别为1.5μL、1.0μL、0.7μL、0.5μL、0.3μL的结果；泳道6为阴性对照。图2：双重RT-PCR最佳退火温度的测定结果

M表示Trans2KplusDNAMarker；泳道1-8退火温度分别为55℃、54℃、53℃、52℃、51℃、50℃、49℃、48℃；泳道9为阴性对照。

图3：CPIV3和PPRV双重RT-PCR扩增结果

M表示Trans2KplusDNAMarker；泳道1为阴性对照；泳道2为PPRVRT-PCR扩增结果；泳道3为CPIV3RT-PCR扩增结果；泳道4为CPIV3和PPRV双重RT-PCR扩增结果。图4：特异性试验电泳结果图

泳道1为山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒；泳道2-7分别为：山羊痘病毒、蓝舌病病毒、边界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹泻病毒、伪狂犬病毒；泳道8为阴性对照；M表示Trans2KplusDNAMarker。

图5：敏感性试验电泳结果图

M表示Trans2KplusDNAMarker；泳道1-15为连续10倍稀释的RNA模板；泳道16为阴性对照。

具体实施方式

1引物设计与合成

CPIV3为本实验室新发现的病毒，此前虽已公开发表，但还没有对外公开发放，PPRV自2014年传入国内多数省区后危害巨大，二者均为引起山羊呼吸道疫病的主要病原，临床上存在混合感染，需要通过分子生物学方法来区分两者。目前临床上仅有检测PPRV的RT-PCR方法，但是，单独检测CPIV3和同时检测CPIV3和PPRV的RT-PCR方法尚未投入应用。

引物设计是决定多重PCR成败的关键。本发明通过长期研究和对本实验室新发现的病毒CPIV3的系统性研究，通过序列分析比对，分别选择CPIV3M蛋白基因和PPRVN蛋白基因的保守区进行引物设计，在确保鉴定病原正确的同时，又避免出现同种不同株病原的漏检情况。本发明所使用的引物利用多重PCR引物设计系统MPprimer软件设计完成，在设计多重引物时，除考虑单对引物的Tm值、GC含量、ΔG和引物是否特异等因素外，还确保了这些引物对之间有相近的Tm值，同时对各个扩增产物的大小进行了限定，保证不同的扩增产物能够很清晰地用肉眼分辨。当引物设计完成时，还需对各个引物对的特异性进行严格地审查，确保引物对不存在非特异性扩增。

参考GenBank登录的山羊副流感病毒3型M基因序列(GenBank登录号：KJ850331)以及小反刍兽疫病毒N基因序列(GenBank登录号：JN647718)，利用MPprimer软件设计了10组引物组合(共20对引物)，然后使用多因素引物特异性评估系统MFEprimer对所有引物组合进行严格的特异性评估，最终选择了未发现存在非特异性扩增的引物对组合引物对A(346bp)、引物对B(189bp)。

引物对A：

引物1：5’-GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3’，在基因组中的位置为134-155bp；

引物2：5’-GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’，在基因组中的位置为456-479bp

引物对B：

引物3：5’-GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3’，在基因组中的位置为555-580bp；

引物4：5’-TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3’，在基因组中的位置为732-753bp

2总RNA提取

取200μLCPIV3病毒液(10⁶TCID₅₀)，(李文良等，Anovelparainfluenzavirustype3(PIV3)identifiedfromgoatherdswithrespiratorydiseasesineasternChina.VeterinaryMicrobiology,2014Nov7；174(1-2):100-106.)/PPRV弱毒苗(10⁴TCID₅₀)(PPRVNigeria75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)置于1.5mL的EP管(RNasefree)中，加入Trizol试剂800μL，混匀后室温静置5min；加入氯仿200μL，振荡30s，室温静置3min，12000rpm4℃离心15min；转移上清至新的1.5mL的EP管(RNasefree)中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，12000rpm4℃离心10min；加入75％的乙醇1mL洗涤，12000rpm4℃离心5min，弃去液体，这时候可以看到EP管底部有少量白色沉淀，室温干燥5min；加入RNA溶解液20μL溶解沉淀，即为检测用RNA模板。

3双重RT-PCR检测方法的优化

3.1引物浓度的优化

固定CPIV3引物的量为0.5μL情况下，PPRV引物量设置5个梯度(0.3μL、0.5μL、0.7μL、1.0μL和1.5μL)以确定最佳引物浓度。

3.2退火温度的优化

固定引物及模板量，逐步优化多重RT-PCR反应体系的退火温度，设置8个梯度退火温度(55℃、54℃、53℃、52℃、51℃、50℃、49℃、48℃)以确定最佳退火温度。

3.3检测待测样本病毒的方法，包括以下步骤：

(1)待测样本病毒RNA的提取：取200μL待测样本血清/鼻拭子溶解液，或取100mg的动物组织加入1mLPBS缓冲液进行充分研磨，-70℃反复冻融3次，12000rpm4℃离心10min，取上清液200μL置于1.5mL的EP管(RNasefree)中，加入Trizol试剂800μL，混匀后室温静置5min；加入氯仿200μL，振荡30s，室温静置3min，12000rpm4℃离心15min；转移上清至新的1.5mL的EP管(RNasefree)中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，12000rpm4℃离心10min；加入75％的乙醇1mL洗涤，12000rpm4℃离心5min，弃去液体，这时候可以看到EP管底部有少量白色沉淀，室温干燥5min；加入RNA溶解液20μL溶解沉淀，即为检测用待检样品RNA；

(3)扩增条件为：45℃反转录40min；94℃预变性5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

(4)取PCR产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳；

(5)结果判定：扩增产物同时出现约346bp和189bp两条条带，为阳性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒同时存在；扩增产物出现约346bp条带，判为山羊副流感病毒3型阳性，即山羊副流感病毒3型存在；扩增产物出现约189bp条带，判为小反刍兽疫病毒阳性，即小反刍兽疫病毒存在；无扩增产物约为346bp和/或189bp条带，判为阴性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒不存在；

4特异性

以用CPIV3病毒液(10⁶TCID₅₀)(李文良等，Anovelparainfluenzavirustype3(PIV3)identifiedfromgoatherdswithrespiratorydiseasesineasternChina.VeterinaryMicrobiology,2014；174(1-2):100-106.)和PPRV弱毒苗(10⁴TCID₅₀)(PPRVNigeria75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)作为阳性对照，分别对山羊痘病毒(“痘必应”山羊痘活疫苗，购自哈药集团生物疫苗有限公司)、蓝舌病病毒(朱建波等，Full-GenomeSequenceofBluetongueVirusSerotype1(BTV-1)StrainY863,theFirstBTV-1IsolateofEasternOriginFoundinChina.GenomeAnnounc.2013；1(4).pii:e00403-13.)、边界病病毒(李文良等，Detectionofborderdiseasevirus(BDV)ingoatherdssufferingdiarrheaineasternChina.VirologyJournal,2013,10:80.)、呼吸道合胞病毒(李文良等，Anovelparainfluenzavirustype3(PIV3)identifiedfromgoatherdswithrespiratorydiseasesineasternChina.VeterinaryMicrobiology,2014；174(1-2):100-106.)、牛病毒性腹泻病毒(毛立等，山羊源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定.中国兽医科学,2013，43(7)：684-688.)和伪狂犬病毒(“威必宁”猪伪狂犬病活疫苗，购自南京天邦生物科技有限公司)进行检测，判定该方法的特异性。

5敏感性

将提取的CPIV3和PPRVRNA混合后(体积比1:1)用配置的TE(PH8.0)10倍递增稀释作为模板，每个稀释度各取4μL作为模板进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性。

6重复性

应用优化后的RT-PCR方法对CPIV3和PPRV均为阳性的样本进行扩增，三次重复，确定其重复性。在0.2mlPCR反应管中分别加入2×R-MixBuffer10μL，CPIV3上下游引物各0.5μL，PPRV上下游引物各0.7μL，E-Mix0.4μL，RNA模版4μL，无Rnase水加至总体积20μL，混匀；45℃反转录40min；94℃预变性5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。取PCR产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳，证明从阳性样本中都能扩增出目的条带，而且目的条带的亮度基本一致。

7临床病料的检测

利用建立的双重RT-PCR方法将从2013年至今采集的疑似样本(鼻拭子和血清)进行检测，并与单一的RT-PCR方法进行对比。

8PCR产物的序列分析

将部分临床病料中阳性PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按照微量胶回收试剂盒(Axygen公司)使用说明回收DNA片段，送南京斯普金公司测序，并在NCBI网站进行BLAST比对分析。

用以上所述建立的山羊副流感病毒3型(CPIV3)和小反刍兽疫病毒(PPRV)双重RT-PCR检测方法。对于CPIV3和PPRV基因RNA最低检测量分别为1.1×10^-3ng/μL和1.6×10^-3ng/μL。对于山羊痘病毒、蓝舌病病毒、边界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹泻病毒和伪狂犬病毒的PCR结果均为阴性。用该方法对采集的150份鼻拭子和血清(采集自江苏省南京市、淮安市、南通市、宿迁市及安徽省滁州市、马鞍山市)进行了检测，结果CPIV3有65份阳性，PPRV有20份阳性(均为2014年血清样品)，其中CPIV3和PPRV混合感染的有12份(均为2014年血清样品)，CPIV3和PPRV与单一RT-PCR的检测结果符合率分别为98％和95.3％，证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中CPIV3和PPRV的检测。

序列表

SEQUENCELISTING

<110>江苏省农业科学院

<120>一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对

<130>0

<160>4

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>

<220>

<221>引物1

<222>(1)..(22)

<223>

<400>1

gcaatccaccaaagcatggggt22

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>

<220>

<221>引物2

<222>(1)..(24)

<223>

<400>2

ggggcaagtgctactttttgagca24

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>

<220>

<221>引物3

<222>(1)..(26)

<223>

<400>3

gctgactcagaactgagaaggtgggt26

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>引物4

<222>(1)..(22)

<223>

<400>4

tgcaatccttggcttgttgccg22

Claims

1.一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，包括引物对A和/或引物对B：

引物对A，包括引物1和引物2：

引物1：5’-GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3’；

引物2：5’-GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’；

引物对B，包括引物3和引物3：

引物3：5’-GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3’；

引物4：5’-TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3’。

2.根据权利要求1所述的一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，

用所述引物对A和引物对B扩增待测样本RNA，如扩增产物同时出现346bp和189bp两条条带，则待测样本山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒为阳性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒同时存在；如扩增产物出现346bp条带，则待测样本山羊副流感病毒3型为阳性，即山羊副流感病毒3型存在；如扩增产物出现189bp条带，则待测样本小反刍兽疫病毒为阳性，即小反刍兽疫病毒存在；如扩增产物无346bp和189bp条带，判为阴性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒都不存在。

3.根据权利要求1所述的一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，

5.根据权利要求1-4之一所述的一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，所述引物对用于检测待测样本病毒的方法，包括：

（1）待测样本病毒RNA的提取：取200μL待测样本血清/鼻拭子溶解液，或取100mg的动物组织加入1mLPBS缓冲液进行充分研磨，-70℃反复冻融3次，12000rpm4℃离心10min，取上清液200μL置于1.5mL的EP管中，加入Trizol试剂800μL，混匀后室温静置5min；加入氯仿200μL，振荡30s，室温静置3min，12000rpm4℃离心15min；转移上清至新的1.5mL的EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，12000rpm4℃离心10min；加入75%的乙醇1mL洗涤，12000rpm4℃离心5min，弃去液体，这时候可以看到EP管底部有少量白色沉淀，室温干燥5min；加入RNA溶解液20μL溶解沉淀，即为检测用待检样品RNA；

（2）采用20μL的RT-PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管中分别加入2×R-MixBuffer10μL，CPIV3上下游引物各0.5μL，PPRV上下游引物各0.7μL，E-Mix0.4μL，RNA模版4μL，无Rnase水加至总体积，混匀；

（3）扩增条件为：45℃反转录40min；94℃预变性5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min；

（4）取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶上电泳。