CN105483291A - 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物 - Google Patents

猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物。本发明多重RT-PCR对这3种病毒的最低检测量分别是4.05×101拷贝/μL、4.52×103拷贝/μL和5.47×103拷贝/μL，而对猪细小病毒（PPV），猪伪狂犬病毒（PRV）的扩增结果均为阴性。57份临床样品的多重RT-PCR检测结果显示，有1份同时感染这3种病毒，11份样品感染PDCoV，15份样品感染PEDV，1份样品感染TGEV，5份样品感染PDCoV和PEDV，1份样品感染PDCoV和TGEV。

Description

猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物
技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的Delta冠状病毒，为有囊膜的单股正链RNA病毒。早在2012年，Woo等发表的文章中就有PDCoV的报道：他们对广东和香港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行Delta冠状病毒检测，其中在猪粪便样品(169份)中检测到近10％的PDCoV。2014年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的猪肠道冠状病毒PDCoV，截止2014年底美国发现PDCoV感染病例达17个州。随后在加拿和韩国也报道检测到了PDCoV，其阳性检出率高达25％。猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)与PDCoV属于同一个科，但是属于Alpha冠状病毒。首次报道于英国，此后在世界多国均见有PEDV感染的报道，我国于1976年有PEDV感染的报道。自20世纪80年代后期PEDV在我国呈现大面积流行。猪传染性胃肠炎病毒(Tansmissiblegastroenteritisvirusofswine，TGEV)为套式病毒目冠状病毒科、Alpha冠状病毒属的病毒，是猪传染性胃肠炎的主要病原。由于PDCoV、TGEV和PEDV的临床表现、病理变化、流行病学等方面非常相似，给临床诊断带来了一定的困难。诊断这三种疾病的传统方法有临床观察、病毒分离、显微病变观察、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。然而这些方法操作较繁复，且难以有效区分具体病毒感染情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
本发明的技术方案是：猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物：
猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇
下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇
扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp；
猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
上游引物P3：5＇-TGGCGACTGTGACGAAAT-3＇
下游引物P4：5＇-TGTAACGCTAACACTCCTT-3＇
扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp；
猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
上游引物P5：5＇-CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3＇
下游引物P6：5＇-GCAACCCAGACAACTCCA-3＇
扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：
所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
本发明的有益效果是：根据GenBank中登录的猪Deltacoronavir(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列，设计了3对引物分别用于扩增PDCoVN基因、PEDVM基因和TGEVN基因的目的片段。通过对RT-PCR反应条件进行优化，建立了检测PDCoV、PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法。敏感性和特异性结果显示，该多重RT-PCR对这3种病毒的最低检测量分别是4.05×101拷贝/μL、4.52×103拷贝/μL和5.47×103拷贝/μL，而对猪细小病毒(PPV)，猪伪狂犬病毒(PRV)的扩增结果均为阴性。57份临床样品的多重RT-PCR检测结果显示，有1份同时感染这3种病毒，11份样品感染PDCoV，15份样品感染PEDV，1份样品感染TGEV，5份样品感染PDCoV和PEDV，1份样品感染PDCoV和TGEV。结果表明，建立多重RT-PCR方法能够对PDCoV、PEDV和TGEV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。
附图说明
图1多重RT-PCR电泳图，M:DL2000DNAmarks1:PDCoV/PEDV/TGEV2:PDCoV3:TGEV4:PEDV5:阴性对照；
图2多重RT-PCR特异性试验，M:DL2000DNAmarks1:PDCoV、TGEV、PEDV多重RT-PCR产物；2～7分别是:PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、RV的RT-PCR产物；8:阴性对照；
图3PDCoV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～9:4.05×108拷贝/μL～4.05×100拷贝/μL10:阴性对照；
图4TGEV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～9:5.47×108拷贝/μL～5.47×100拷贝/μL10:阴性对照；
图5PEDV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～9:4.52×108拷贝/μL～4.52×100拷贝/μL10:阴性对照；
图6多重RT-PCR的敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～9:108～100拷贝/μL10:阴性对照。
具体实施方式
本发明根据GenBank登录的PDCoV的HKU15-155株N基因序列，TGEV的H155株N基因序列，PEDV的JXNC1302株M基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了两对特异性引物。在此基础上建立了PDCoV、TGEV和PEDV的多重RT-PCR检测方法，并对此方法进行了评价分析。对河南地区送检的病料样品进行检测分析，进一步在实践中验证方法的可靠性，从而为兽医临床的诊断和治疗提供理论依据。
猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物：
猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇
下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇
扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp；
猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
上游引物P3：5＇-TGGCGACTGTGACGAAAT-3＇
下游引物P4：5＇-TGTAACGCTAACACTCCTT-3＇
扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp；
猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
上游引物P5：5＇-CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3＇
下游引物P6：5＇-GCAACCCAGACAACTCCA-3＇
扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测：
所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
本发明具体操作如下：
1材料和方法
1.1病毒和细胞
猪Deltacoronavirus(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(，TGEV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、ST细胞、LLC-PK细胞、Vero细胞均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存。PDCoV接种LLC-PK细胞、PEDV接种Vero细胞、TGEV接种ST细胞传至8代后出现80％以上的细胞病变(CPE)时收毒。
1.2主要试剂
pMD18-T载体、QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒和QIAGEN反转录试剂盒购自QIAGEN公司、PCR相关试剂、DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司。
1.3引物的设计及合成
应用PrimerPremier5.0基因分析软件，参照Genbank中登录的PDCoVN基因、PEDVM基因、TGEVN基因设计3对引物(表1)，扩增PDCoVN基因部分片段383bp，PEDVM基因部分片段101bp，TGEVN基因部分片段229bp引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用双蒸水稀释为25μmol/L，-20℃保存
表1多重RT-PCR引物信息
1.4病毒RNA的提取及反转录
接毒细胞悬液和临床样品于-80℃反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒提取病毒总RNA，并利用反转录试剂盒制备反转录为cDNA，-80℃保存。
1.5RT-PCR产物的鉴定
单一病毒的RT-PCR反应在25μL体系中进行，包括2×TaqDNAMasterMix25μL，上下游引物各1μL(25μmol/L)，cDNA模板2μL，ddH2O补足25μL。PCR反应扩增参数为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.6单一RT-PCR的反应
在25μL体系中进行，2×TaqDNAMasterMix12μL，上下游引物各0.5μL(25μmol/L)，质粒模板各1μL，ddH2O补足25μL。反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。取5μLRT-PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.7多重RT-PCR反应
先对多重RT-PCR反应条件，包括退火温度(53～60℃)，引物终浓度(0.1～1μmol/L)，2×TaqDNAMasterMix浓度，反应体积(25～50μL)进行优化，确定最佳反应条件为25μL反应体系，包括2×TaqDNAMasterMix12μL，2对引物上下游各0.5μL(25μmol/L)，质粒模板各1μL，ddH2O补足25μL。反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。取5μLRT-PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.8特异性试验
采用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、RV、PRRSV进行扩增，并选择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。
1.9敏感性试验
将测序正确的阳性质粒作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后将两种质粒混合后进行10倍系列稀释。根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝数。用优化后的反应条件进行多重RT-PCR扩增。
1.10重复性试验
应用建立的多重RT-PCR，用优化后条件每隔一周重复检测一次，连续检测3次，以检测结果的可靠性。
1.11临床样品
收集河南地区的25份猪腹泻肠内容物样品(编号1～25)、32份粪便样品(编号26～57)，用已经建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR反应条件同时对这57份样品进行检测。
2结果
2.1多重RT-PCR产物的电泳分析
以PDCoV、PEDV和TGEV的重组质粒为模板做单重和多重RT-PCR，并以ddH2O做阴性对照，分别扩增出PDCoV383bp、PEDV101bp、TGEV229bp特异性条带；多重RT-PCR可同时扩增出三条相应的特异性条带，阴性对照未扩出条带(图1)。
2.2特异性试验
用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、TGEV、PEDV的单一及混合质粒为模板，PBoV、PRRSV、RV为模板分别使用建立的多重RT-PCR方法进行扩增，只有PDCoV、TGEV、PEDV单一和混合模板扩增出与相应目的片段大小符合的条带，而其它病毒均无条带(图2)。
2.3单重RT-PCR敏感性试验
分别以PDCoV、TGEV和PEDV10倍倍比稀释的质粒(108～100)作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05×101拷贝/μL(图3)，TGEV最低检测量为5.47×101拷贝/μL(图4)，PEDV最低检测量为4.52×101拷贝/μL(图5)。
2.4多重RT-PCR敏感性试验
以PDCoV、TGEV和PEDV的混合质粒10倍倍比稀释后作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05×101拷贝/μL，TGEV最低检测量为5.47×103拷贝/μL，PEDV最低检测量为4.52×103拷贝/μL(图6)。
2.5多重RT-PCR临床样品检测结果
用建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR对河南地区的57份样品进行检测，检测结果见表2，两种方法检测符合率是100％。
表2临床样品检测结果
3讨论
PDCoV、TGEV和PEDV是导致仔猪腹泻疾病的常见病毒，发病率高，目前均无有效的药物，并且三者在临床症状、流行病学和病理变化上无明显差异。在PDCoV感染的猪场，猪的发病率和致死率非常高，给养猪业造成了巨大的经济损失。传统的检测方法，如细胞培养、免疫学和动物实验等虽能对三者鉴别诊断，但是最大的缺点是检测周期长，灵敏度低。PCR技术是目前鉴别诊断三者的最敏感、特异的方法。相对于单重RT-PCR方法，多重RT-PCR能同时进行多种病原微生物的鉴别诊断，且具有灵敏度高、特异性好，方便快捷等特点，适用于大规模检测，在动物疫病的流行病与预防中，具有不可替代的作用。
应用多重RT-PCR方法检测临床样品时，由于样品中核酸背景复杂，使RT-PCR扩增易出现非特异性条带，对反应体系以及条件要求苛刻。因此，在建立多重RT-PCR方法时，引物设计是多重RT-PCR试验成功的关键，在设计多重RT-PCR引物时，除按常规RT-PCR引物设计常用准则外，要求所选择的靶基因具有高度的特异性；引物间不能有连续互补的碱基，当不可避免时，要求连续互补的碱基不能超过4个，尤其是在引物的3′端；引物之间无同源性，不存在交叉错配、严重的引物二聚体等；不同引物的退火温度要求相近，并且扩增的目的片段的长度相差最好在100bp以上，以便琼脂糖凝胶电泳时分辨观察。引物设计完成后，不仅要与同种病毒的不同毒株进行比对，还要与其它病毒进行比对，确定引物的特异性。此外，还必须对各对引物浓度配比、退火温度及其他PCR反应条件进行优化。由于样品多为粪便或肠道内容物且其含有多种抑制PCR反应的因子，因此为获得较好的核酸质量，建议使用商品化的核酸提取试剂盒，此外，为减少假阴性，采集新鲜样品后应尽快处理。
本发明设计合成3对引物，以PDCoV、TGEV和PEDV混合质粒为模板，在单重RT-PCR基础上，逐步优化RT-PCR反应体系和条件，建立了可以同时扩增PDCoVN基因、TGEVN基因和PEDVM基因特异性片段的多重RT-PCR方法。2013年，霍金耀建立的多重RT-PCR检测方法中对TGEV和PEDV的最低检测浓度均为125pg。2015年，逢凤娇在国内首次建立了PDCoV的RT-PCR检测方法，对PDCoV最低检测浓度为4.05×103拷贝/μL。而本实验建立的多重RT-PCR对PDCoV、TGEV和PEDV最低检测浓度分别为4.05×101拷贝/μL、5.47×103拷贝/μL和4.52×103拷贝/μL。表明，建立的多重RT-PCR反应具有很好的敏感性。利用此方法对河南省地区的57份进行检测，PDCoV、TGEV和PEDV单一感染率分别是19.30％、1.75％和26.32％，PDCoV和TGEV混合感染率是1.75％，PDCoV和PEDV混合感染率是8.77％，三者混合感染率是1.75％。与单重RT-PCR方法比较，两种方法的阳性检出符合率为100％，完全可以替代单重RT-PCR，节约了时间和成本。
综合分析表明，该方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性，不但可以应用与PDCoV和TGEV的流行性病学调查，也为PDCoV和TGEV早期感染的快速诊断奠定了重要基础。

Claims (2)

1.猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物，其特征在于：
猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇
下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇
扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp；
猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
上游引物P3：5＇-TGGCGACTGTGACGAAAT-3＇
下游引物P4：5＇-TGTAACGCTAACACTCCTT-3＇
扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp；
猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
上游引物P5：5＇-CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3＇
下游引物P6：5＇-GCAACCCAGACAACTCCA-3＇
扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
2.利用权利要求1所述引物检测猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：
所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
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