CN109517926A - 一种同步检测四种猪冠状病毒的多重rt-pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步检测四种猪冠状病毒的多重RT‑PCR方法,PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT‑PCR引物;一种同步检测四种猪冠状病毒的RT‑PCR试剂盒,它包括:所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT‑PCR引物;一种同步检测四种猪冠状病毒的RT‑PCR反应体系,其中引物对的摩尔比为PHEV:PEDV:TGEV:PDCoV=5:3:5:5;本发明的优点是:多重性:可同时检测和区分PHEV、PEDV、TGEV和PDCoV 4种猪冠状病毒,有利于混合感染的及时诊断;特异性:检测引物具有特异性,大大提高了检测效率;节约资源:节约了扩增体系中各试剂的使用量,降低检测成本。
Description
技术领域
本发明属RT-PCR检测技术领域,具体涉及一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒及反应体系。
背景技术
猪的腹泻病每年都给养殖业造成巨大的经济损失。近年来猪腹泻病呈现出旧病新发,新病频发的流行特点。引起猪腹泻病的病因十分复杂,不但包含生物因素,而且包含非生物因素,所有因素中影响最大的是病毒性腹泻。与猪病毒性腹泻相关的病原主要以猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcinehemmagglutinatipg encephalomyelitis virus,PHEV) 及猪丁型冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)为主。以上四种病毒均属于冠状病毒科冠状病毒属,而且在临床上都可引起猪的呕吐、腹泻等症状,而难以从临床特征和病原的形态上加以区分。
分子生物学诊断方法具有快速、特异等优点,现己经广泛应用于畜禽各种疾病的快速鉴别诊断。随着科技的发展,研发出了多种基于核酸的检测技术,例如多重PCR、核酸等温扩增及基因芯片等。而多重PCR是利用一次PCR 反应,同时对两种及以上目的基因进行同时扩增的检测技术。其反应原理、反应试剂及操作方法都与普通PCR方法相同,但是可以同时检测、鉴别出多种病原体,所以更加适用于混合感染的快速诊断。
发明内容
本发明目的是提供一种同时检测、鉴别出多种病原体的同步检测4种猪冠状病毒的试剂盒及反应体系。
同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物,它包括:
PHEV F:5´-GGTATCAAAGTGTTGCCTCC-3´;
PHEV R:5´-GAACCCTTCCTGGATAGAAT-3´;
PEDV F:5´-TATCCCTCTATGCTCCTCTT-3´;
PEDV R:5´-TTCAACAATCTCAACTACGC-3´;
TGEV F:5´-GGCACGCTTGTAGACCTTTG-3´;
TGEV R:5´-CGGAATTTCACCGTAACTGG-3´;
PDCoV F:5´-CCATCGCTCCAAGTCATTCT-3´;
PDCoV R:5´-TGGGTGGGTTTAACAGACATAG-3´。
一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,它包括:所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物。
所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,其中引物对的摩尔比为PHEV:PEDV:TGEV:PDCoV=5:3:5:5;
所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,总体积为25uL,其中含有:
cDNA 6uL
10×PCR buffer 2.5uL
2.5mM dNTP 2uL
rTaq 0.5uL
10umol/L PHEV上下游引物 各1uL
10umol/L PEDV上下游引物 各0.6uL
10umol/L TGEV上下游引物 各1uL
10umol/L PDCoV上下游引物 各1uL,
去离子水 6.8uL;
其反应条件如下:95℃5min;95℃30s;55℃30s;72℃45s共35个循环;12℃20min。
本发明提供了同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物;一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,它包括:所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物;一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR反应体系,其中引物对的摩尔比为PHEV:PEDV:TGEV:PDCoV=5:3:5:5;本发明的优点是:1)多重性:可同时检测和区分PHEV、PEDV、TGEV和PDCoV 4种猪冠状病毒,有利于混合感染的及时诊断;2)特异性:检测引物具有特异性,大大提高了检测效率;3)节约资源:PCR反应是在同一个体系完成,节约了扩增体系中各试剂的使用量,降低检测成本。
附图说明
图1 单一RT-PCR退火温度优化结果,A:TGEV 退火温度优化电泳图,B:PEDV 退火温度优化电泳图,C:PHEV 退火温度优化电泳图,D:PDCoV退火温度优化电泳图,A-D图中,M2000bp DNA分子质量标准;1:50℃ 2:52℃3:54℃4:56℃5:58℃ 6:60℃ 7:阴性对照。
图2 二重RT-PCR方法的退火温度的优化结果图,A:TGEV-PEDV RT-PCR退火温度的优化图,B:TGEV-PHEV RT-PCR 退火温度的优化图,C:PEDV-PHEV RT-PCR 退火温度的优化图,D:TGEV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图,E:PEDV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图,F:PHEV-PDCoVRT-PCR 退火温度的优化图,A-F图中:M 2000bp DNA分子质量标准;1 52℃;254℃;3 56℃;4:阴性对照。
图3 三重RT-PCR方法的退火温度的优化结果图,A:TGEV-PEDV-PHEV RT-PCR退火温度的优化图,B:TGEV-PEDV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图,C:TGEV-PHEV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图,D:PEDV-PHEV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图,A-D图中:M2000bp DNA分子质量标准;1 52℃;2 54℃;3 56℃;4:阴性对照。
图4 多重 RT-PCR 退火温度的优化结果图,其中M 2000bp DNA分子质量标准;1、52℃;2、54℃;3、56℃;4:阴性对照。
图5 多重RT-PCR的引物浓度的优化结果图,其中M 2000bp DNA分子质量标准;1-5TGEV引物浓度(µmol/L)分别为 0.24、0.24、0.4、0.4、0.4;1-5 PEDV引物浓度(µmol/L)分别为 0.24、0.4、0.24、0.4、0.4;1-5 PHEV引物浓度(µmol/L)分别为 0.24、0.4、0.4、0.24、0.4;1-5 PDCoV引物浓度(µmol/L)分别为0.24、0.4、0.4、0.4、0.24;6:阴性对照。
图6 多重RT-PCR方法的特异性检测结果图,A:四种病毒引物间的特异性检测结果,其中M 2000bp DNA分子质量标准;1:四种病毒混合模板;2:TGEV;3:PEDV;4:PHEV;5:PDCoV;6:阴性对照;B:多重RT-PCR特异性检测结果图,其中M 2000bp DNA分子质量标准;1:四种病毒混合模板;2:PRV;3:PCV-2;4:PPV;5:阴性对照。
图7 多重RT-PCR方法的灵敏性检测结果图,其中M:DL 2000 Marker;1~9:四种病毒阳性质粒混合模板倍比稀释10-1~10-9;10:阴性对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1 引物的设计与合成
多重RT- PCR的引物在设计时不但要满足普通RT-PCR的原则外,而且要注意下面几个问题:①各条引物之间不能互补,尤其是形成二聚体;所以在引物设计好以后进行单一RT-PCR扩增,以检验各对引物间是否配对形成二聚体;②各引物与其余扩增产物和模板不能产生较大的互补性,扩增产物之间也不能存在较大的同源性;③各条引物的长度(bp)、(G+C)含量、Tm值尽量一样;④各引物扩增的片段大小要呈梯度变化,便于用电泳的方法观察结果。
每种病毒参照Gen Bank数据库中的序列,运用Primer Premier6.0分别针对PHEV(67N株 序列号:AY078417)、PEDV(CH/S株 序列号:JN547228)、TGEV(H16-S 株 序列号:FJ755618)和PDCoV (序列号:KJ481931)设计4对引物;引物由长春库美生物技术有限公司合成,预期扩增片段长度分别为234bp、362bp、513bp和1118bp;
所述的4对引物具体为:
1)扩增PHEV病毒的特异性引物的核苷酸序列为:
5´-GGTATCAAAGTGTTGCCTCC-3´;
5´-GAACCCTTCCTGGATAGAAT-3´;
2)扩增PEDV病毒的特异性引物的核苷酸序列为:
5´-TATCCCTCTATGCTCCTCTT-3´;
5´-TTCAACAATCTCAACTACGC-3´;
3)扩增TGEV病毒的特异性引物的核苷酸序列为:
5´-GGCACGCTTGTAGACCTTTG-3´;
5´-CGGAATTTCACCGTAACTGG-3´;
4)扩增PDCoV病毒的特异性引物的核苷酸序列为:
5´-CCATCGCTCCAAGTCATTCT-3´;
5´-TGGGTGGGTTTAACAGACATAG-3´。
实施例2 RNA的提取
四种病毒样品及待检测样品用TRIzol方法提取总RNA;取少量病料放入干净的EP管中,加入1ML的TRIzol;剪碎后用匀浆机匀浆,放于室温静置5min;后续实验在超净台中操作;向EP 管中加入 200μL 氯仿,剧烈震荡30s,室温静置 5min;用高速离心机12000×g/min 4℃离心15min,此时,在冰盒上预冷新的离心管;小心取EP管,将需要的无色上清液用移液枪转移到新的离心管中;向装有上清液的离心管中等量加入异丙醇,旋转混匀;放置于-30度冰箱中静置20min;后于4℃离心机中12000×g/min离心10min,离心后底部有沉淀;小心弃去上清液,切勿触及沉淀;向离心管中加入75%乙醇1mL,12000×g/min 室温离心5min,弃去上清液,开盖离心5min;取出离心管,用移液器吸取管中多余液体;加入30-100μL DEPC水完全溶解沉淀,即得到病毒RNA。
实施例3 cDNA制备
将实施例2中提取的 RNA 进行反转录,合成体系为21µL;取10µLRNA溶液,向溶液中加入2µL OLigod(T),5×M-MLV Buffer 4µL,dNTP (10mmol/µL) 4µL,RNA抑制剂0.5µL,M-MLV0.5µL;后放入42℃水浴中孵育1h20min,再次放入72℃水浴锅中10min后取出,即得到cDNA,在-80℃下保存。
实施例4 四种病毒单一RT-PCR反应
分别以TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV 四种病毒的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,同时设立阴性对照组,初步建立四种病毒的单一RT-PCR方法;在建立单一RT-PCR反应的同时进行退火温度在50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 6个温度的优化,以及引物浓度从0.16、0.24、0.32、0.40和0.48μmol/L共5个浓度进行优化。
单一RT-PCR退火温度及引物浓度经优化后,其结果如下:TGEV引物随着温度的改变而目的条带有所改变,从52-58℃温度范围内均出现条带(如图1-A)。PEDV退火温度从图1-B可以看出,选择退火温度范围为52-56℃。根据电泳图1-C结果选择50-54℃为PHEV的退火温度范围。依据图1-D实验结果,选择52-54℃为 PDCoV的退火温度范围。
单一RT-PCR中引物浓度确定优化结果如下:TGEV引物的合适浓度范围为:0.24μmol/L−0.48μmol/L。PEDV引物最有效反应范围为0.24μmol/L到0.48μmol/L。PHEV引物有效浓度从0.32μmol/L到0.48μmol/L。PDCoV引物浓度范围为0.24μmol/L到0.48μmol/L。
将得到的PCR产物切胶回收,与pMD18-T克隆载体的连接,导入到感受态细胞中进行转化;挑取若干菌落,经菌液扩增PCR阳性并送样测序,每个样品送3个进行测序,测序工作由长春库美生物技术有限公司完成。
实施例5 二重RT-PCR方法的扩增及退火温度的优化
根据实施例4结果,取TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV四种病毒阳性质粒为模板,用上述实验条件进行四种病毒两两之间双重RT-PCR实验,初步建立六个双重RT-PCR方法,分别是TGEV-PEDV、TGEV-PHEV、PEDV-PHEV、TGEV-PDCoV、PEDV-PDCoV和PHEV-PDCoV的双重RT-PCR,并同时对PCR反应进行退火温度的优化,结果如图2(A-F)。
双重RT-PCR退火温度优化的结果为:TGEV-PEDV RT-PCR方法最适退火温度为52℃、54℃和56℃。TGEV-PHEV RT-PCR方法退火温度54℃和56℃的温度更为适合。TGEV-PDCoVRT-PCR方法退火温度为54℃。PEDV-PHEV RT-PCR方法退火温度54℃是反应中效果最好的。PEDV-PDCoV RT-PCR方法退火温度54℃和56℃均可。PHEV-PDCoV的双重RT-PCR方法可以选择52℃或54℃。
实施例6 三重RT-PCR方法的扩增及退火温度的优化
由二重RT-PCR过渡到三重RT-PCR时,每个反应体系中又多加了一对引物和相对应的模板。为探索三重RT-PCR方法中退火温度对于反应的影响,设计TGEV-PEDV-PHEV、TGEV-PEDV-PDCoV、TGEV-PHEV-PDCoV和PEDV-PHEV-PDCoV四个RT-PCR方法,对每种方法的退火温度进行优化,结果如图3(A-D)。
TGEV-PEDV-PHEV三重RT-PCR反应在52-56℃范围内扩增出清晰的条带,三者之间没有相互反应。TGEV-PEDV-PDCoV退火温度在52-54℃。TGEV-PHEV-PDCoV RT-PCR反应在52-56℃范围内均可扩增,选择54℃最佳。PEDV-PHEV-PDCoV RT-PCR反应在52-56℃温度范围内可正常扩增,56℃条带较亮。
实施例7 四种病毒的四重RT-PCR体系的建立与优化
为了优化多重RT-PCR体系,将不同的退火温度以及不同的引物浓度作为影响因素进行优化;以四种病毒的混合cDNA为模板,通过梯度PCR仪设置52℃、54℃和56℃三个退火温度下进行PCR扩增,TGEV、PEDV、PHEV 和PDCoV 可分别获得513bp、362bp、234bp 和1118bp的与预期大小相符的目的片段。通过实验结果可以得出,四种引物在同一反应体系中不会产生不良反应。各对引物的目的片段具有唯一性。TGEV 的引物对温度的影响不大,在三个温度下都可以产生很好的反应结果。其余三种病毒的引物在不同温度下在同一反应体系中没有TGEV的效果好。结果如图4所示,退火温度54℃为四重RT-PCR的最佳退火温度。将引物浓度最终稀释到10μmol/L,然后针对不同病毒特异引物的取不同添加量进行四重RT-PCR反应,比例如表1所示,结果如图5,从图中可以看出引物浓度组合比例3效果最好。
最终获得四重RT-PCR优化体系如下:反应总体积为25μL,其中含有:
cDNA 6μL
10×PCR buffer 2.5μL
2.5mM dNTP 2μL
rTaq 0.5μL
10umol/L PHEV上下游引物 各1μL
10umol/L PEDV上下游引物 各0.6μL
10umol/L TGEV上下游引物 各1μL
10umol/L PDCoV上下游引物 各1μL,
去离子水 6.8μL;
优化后的扩增体系反应条件如下:95℃5min;95℃30s;55℃30s;72℃45s共35个循环;12℃20min。
实施例8 多重RT-PCR方法的特异性检测
分别以猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的基因组DNA为模板,和上述的四种病毒阳性质粒混合物,以及四种病毒的单个阳性质粒为模板。按照成功优化好的四重RT-PCR方法反应体系及反应条件进行扩增,以检测多重RT-PCR的特异性,结果如图6(A-B)。在同一反应中四对引物的同时加入,模板为四种病毒混合阳性质粒以及是四种单一阳性质粒的多重RT-PCR反应,在各自预期片段大小的地方均出现片段。在多重RT-PCR的反应体系中,模板分别为四种病毒混合模板的阳性对照,PRV,PCV2和PPV。只有阳性对照出现特异性条带,其他几种病毒如PRV、PPV和PVC均未出现条带。表明建立的多重RT-PCR具有特异性。
实施例9 多重RT-PCR方法的敏感性检测
将已制备好4种病毒阳性质粒进行浓度测定,按10倍倍比稀释,将同一浓度梯度的四种质粒等体积混合后作为模板,进行多重RT-PCR检测其敏感性结果如图7。经测定四种病毒的阳性质粒TGEV,PEDV,PHEV,PDCoV的含量分别为32.8pg/μL,28.4pg/μL,25.7pg/μL和59.2pg/μL。电泳结果表明,多重RT-PCR分别测出 TGEV,PEDV,PHEV,PDCoV的最低检测量分别为 32.8 pg、28.4 pg、257 pg和592 pg。表明建立的多重 RT-PCR能够检测到pg等级的核酸。
实施例10 多重RT-PCR检测方法的临床样品检测
利用已建立的多重RT-PCR方法检测了2017-2018年间吉林大学养殖基地送检的17份腹泻病例病死猪的肺脏、脾脏、淋巴结组织和25份健康猪粪样品;将42份临床样品用上述建立的多重RT-PCR以及单一RT-PCR方法进行鉴定,结果如表2。通过对42份临床样品的检测结果分析可以看出,多重RT-PCR 的方法共检出32份阳性样品,其中包括7份TGEV样品,18份PEDV样品,7份PHEV样品。而且在此次多重 PCR检测中,没有发现由PDCoV引起的腹泻病例。最终结果表明,TGEV的阳性率为16.67%(7/42),PEDV的阳性率为42.86%(18/42),PHEV的阳性率为16.67%(7/42)和PDCoV的阳性率为0。这四种猪腹泻病毒里,多重 RT-PCR 和单一 RT-PCR相比较而言,四种病毒的符合率为100% 。
。
Claims (5)
1.同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物,它包括:
PHEV F:5´-GGTATCAAAGTGTTGCCTCC-3´;
PHEV R:5´-GAACCCTTCCTGGATAGAAT-3´;
PEDV F:5´-TATCCCTCTATGCTCCTCTT-3´;
PEDV R:5´-TTCAACAATCTCAACTACGC-3´;
TGEV F:5´-GGCACGCTTGTAGACCTTTG-3´;
TGEV R:5´-CGGAATTTCACCGTAACTGG-3´;
PDCoV F:5´-CCATCGCTCCAAGTCATTCT-3´;
PDCoV R:5´-TGGGTGGGTTTAACAGACATAG-3´。
2.一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,它包括:权利要求1所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物。
3.根据权利要求2所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,其特征在于:其中引物对的摩尔比为PHEV:PEDV:TGEV:PDCoV=5:3:5:5。
4. 根据权利要求3所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒总体积为25uL,其中含有:
10×PCR buffer 2.5uL
2.5mM dNTP 2uL
rTaq 0.5uL
10umol/L PHEV上下游引物 各1uL
10umol/L PEDV上下游引物 各0.6uL
10umol/L TGEV上下游引物 各1uL
10umol/L PDCoV上下游引物 各1uL,
去离子水 6.8uL。
5.根据权利要求4所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒,其特征在于:其反应条件如下:95℃、5min;95℃、30s;55℃、30s;72℃、45s,共35个循环;12℃、20min。
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