CN109517926B

CN109517926B - 一种同步检测四种猪冠状病毒的多重rt-pcr方法

Info

Publication number: CN109517926B
Application number: CN201811282339.XA
Authority: CN
Inventors: 陆慧君; 高丰; 贺文琦; 杨艳楠; 吕晓玲; 李姿; 关继羽; 赵魁
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109517926A

Abstract

本发明公开了一种同步检测四种猪冠状病毒的多重RT‑PCR方法，PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT‑PCR引物；一种同步检测四种猪冠状病毒的RT‑PCR试剂盒，它包括：所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT‑PCR引物；一种同步检测四种猪冠状病毒的RT‑PCR反应体系，其中引物对的摩尔比为PHEV：PEDV：TGEV：PDCoV=5:3:5:5；本发明的优点是：多重性：可同时检测和区分PHEV、PEDV、TGEV和PDCoV 4种猪冠状病毒，有利于混合感染的及时诊断；特异性：检测引物具有特异性，大大提高了检测效率；节约资源：节约了扩增体系中各试剂的使用量，降低检测成本。

Description

一种同步检测四种猪冠状病毒的多重RT-PCR方法

技术领域

本发明属RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒及反应体系。

背景技术

猪的腹泻病每年都给养殖业造成巨大的经济损失。近年来猪腹泻病呈现出旧病新发，新病频发的流行特点。引起猪腹泻病的病因十分复杂，不但包含生物因素，而且包含非生物因素，所有因素中影响最大的是病毒性腹泻。与猪病毒性腹泻相关的病原主要以猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcinehemmagglutinatipg encephalomyelitis virus，PHEV) 及猪丁型冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）为主。以上四种病毒均属于冠状病毒科冠状病毒属，而且在临床上都可引起猪的呕吐、腹泻等症状，而难以从临床特征和病原的形态上加以区分。

分子生物学诊断方法具有快速、特异等优点，现己经广泛应用于畜禽各种疾病的快速鉴别诊断。随着科技的发展，研发出了多种基于核酸的检测技术，例如多重PCR、核酸等温扩增及基因芯片等。而多重PCR是利用一次PCR 反应，同时对两种及以上目的基因进行同时扩增的检测技术。其反应原理、反应试剂及操作方法都与普通PCR方法相同，但是可以同时检测、鉴别出多种病原体，所以更加适用于混合感染的快速诊断。

发明内容

本发明目的是提供一种同时检测、鉴别出多种病原体的同步检测4种猪冠状病毒的试剂盒及反应体系。

同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物，它包括：

PHEV F：5´-GGTATCAAAGTGTTGCCTCC-3´；

PHEV R：5´-GAACCCTTCCTGGATAGAAT-3´；

PEDV F：5´-TATCCCTCTATGCTCCTCTT-3´；

PEDV R：5´-TTCAACAATCTCAACTACGC-3´；

TGEV F：5´-GGCACGCTTGTAGACCTTTG-3´；

TGEV R：5´-CGGAATTTCACCGTAACTGG-3´；

PDCoV F：5´-CCATCGCTCCAAGTCATTCT-3´；

PDCoV R：5´-TGGGTGGGTTTAACAGACATAG-3´。

一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，它包括：所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物。

所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其中引物对的摩尔比为PHEV：PEDV：TGEV：PDCoV=5:3:5:5；

所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，总体积为25uL，其中含有：

cDNA 6uL

10×PCR buffer 2.5uL

2.5mM dNTP 2uL

rTaq 0.5uL

10umol/L PHEV上下游引物各1uL

10umol/L PEDV上下游引物各0.6uL

10umol/L TGEV上下游引物各1uL

10umol/L PDCoV上下游引物各1uL，

去离子水 6.8uL；

其反应条件如下：95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃45s共35个循环；12℃20min。

本发明提供了同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物；一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，它包括：所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物；一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR反应体系，其中引物对的摩尔比为PHEV：PEDV：TGEV：PDCoV=5:3:5:5；本发明的优点是：1）多重性：可同时检测和区分PHEV、PEDV、TGEV和PDCoV 4种猪冠状病毒，有利于混合感染的及时诊断；2）特异性：检测引物具有特异性，大大提高了检测效率；3）节约资源：PCR反应是在同一个体系完成，节约了扩增体系中各试剂的使用量，降低检测成本。

附图说明

图1 单一RT-PCR退火温度优化结果，A：TGEV 退火温度优化电泳图，B：PEDV 退火温度优化电泳图，C：PHEV 退火温度优化电泳图，D：PDCoV退火温度优化电泳图，A-D图中，M2000bp DNA分子质量标准；1：50℃ 2：52℃3：54℃4：56℃5：58℃ 6：60℃ 7：阴性对照。

图2 二重RT-PCR方法的退火温度的优化结果图，A：TGEV-PEDV RT-PCR退火温度的优化图，B：TGEV-PHEV RT-PCR 退火温度的优化图，C：PEDV-PHEV RT-PCR 退火温度的优化图，D：TGEV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图，E：PEDV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图，F：PHEV-PDCoVRT-PCR 退火温度的优化图，A-F图中：M 2000bp DNA分子质量标准；1 52℃；254℃；3 56℃；4：阴性对照。

图3 三重RT-PCR方法的退火温度的优化结果图，A：TGEV-PEDV-PHEV RT-PCR退火温度的优化图，B：TGEV-PEDV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图，C：TGEV-PHEV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图，D：PEDV-PHEV-PDCoV RT-PCR 退火温度的优化图，A-D图中：M2000bp DNA分子质量标准；1 52℃；2 54℃；3 56℃；4：阴性对照。

图4 多重 RT-PCR 退火温度的优化结果图，其中M 2000bp DNA分子质量标准；1、52℃；2、54℃；3、56℃；4：阴性对照。

图5 多重RT-PCR的引物浓度的优化结果图，其中M 2000bp DNA分子质量标准；1-5TGEV引物浓度（µmol/L）分别为 0.24、0.24、0.4、0.4、0.4；1-5 PEDV引物浓度（µmol/L）分别为 0.24、0.4、0.24、0.4、0.4；1-5 PHEV引物浓度（µmol/L）分别为 0.24、0.4、0.4、0.24、0.4；1-5 PDCoV引物浓度（µmol/L）分别为0.24、0.4、0.4、0.4、0.24；6：阴性对照。

图6 多重RT-PCR方法的特异性检测结果图，A：四种病毒引物间的特异性检测结果，其中M 2000bp DNA分子质量标准；1：四种病毒混合模板；2：TGEV；3：PEDV；4：PHEV；5：PDCoV；6：阴性对照；B：多重RT-PCR特异性检测结果图，其中M 2000bp DNA分子质量标准；1：四种病毒混合模板；2：PRV；3：PCV-2；4：PPV；5:阴性对照。

图7 多重RT-PCR方法的灵敏性检测结果图，其中M：DL 2000 Marker；1～9：四种病毒阳性质粒混合模板倍比稀释10^-1～10^-9；10：阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1 引物的设计与合成

多重RT- PCR的引物在设计时不但要满足普通RT-PCR的原则外，而且要注意下面几个问题：①各条引物之间不能互补，尤其是形成二聚体；所以在引物设计好以后进行单一RT-PCR扩增，以检验各对引物间是否配对形成二聚体；②各引物与其余扩增产物和模板不能产生较大的互补性，扩增产物之间也不能存在较大的同源性；③各条引物的长度（bp）、（G+C）含量、Tm值尽量一样；④各引物扩增的片段大小要呈梯度变化，便于用电泳的方法观察结果。

每种病毒参照Gen Bank数据库中的序列，运用Primer Premier6.0分别针对PHEV（67N株序列号：AY078417）、PEDV（CH/S株序列号：JN547228）、TGEV（H16-S 株序列号：FJ755618）和PDCoV （序列号：KJ481931）设计4对引物；引物由长春库美生物技术有限公司合成，预期扩增片段长度分别为234bp、362bp、513bp和1118bp；

所述的4对引物具体为：

1）扩增PHEV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

5´-GGTATCAAAGTGTTGCCTCC-3´；

5´-GAACCCTTCCTGGATAGAAT-3´；

2）扩增PEDV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

5´-TATCCCTCTATGCTCCTCTT-3´；

5´-TTCAACAATCTCAACTACGC-3´；

3）扩增TGEV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

5´-GGCACGCTTGTAGACCTTTG-3´；

5´-CGGAATTTCACCGTAACTGG-3´；

4）扩增PDCoV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

5´-CCATCGCTCCAAGTCATTCT-3´；

5´-TGGGTGGGTTTAACAGACATAG-3´。

实施例2 RNA的提取

四种病毒样品及待检测样品用TRIzol方法提取总RNA；取少量病料放入干净的EP管中，加入1ML的TRIzol；剪碎后用匀浆机匀浆，放于室温静置5min；后续实验在超净台中操作；向 EP 管中加入 200μL 氯仿，剧烈震荡30s，室温静置 5min；用高速离心机12000×g/min 4℃离心15min，此时，在冰盒上预冷新的离心管；小心取EP管，将需要的无色上清液用移液枪转移到新的离心管中；向装有上清液的离心管中等量加入异丙醇，旋转混匀；放置于-30度冰箱中静置20min；后于4℃离心机中12000×g/min离心10min，离心后底部有沉淀；小心弃去上清液，切勿触及沉淀；向离心管中加入75%乙醇1mL，12000×g/min 室温离心5min，弃去上清液，开盖离心5min；取出离心管，用移液器吸取管中多余液体；加入30-100μLDEPC水完全溶解沉淀，即得到病毒RNA。

实施例3 cDNA制备

将实施例2中提取的 RNA 进行反转录，合成体系为21µL；取10µLRNA溶液，向溶液中加入2µL OLigod(T)，5×M-MLV Buffer 4µL，dNTP (10mmol/µL) 4µL，RNA抑制剂0.5µL，M-MLV 0.5µL；后放入42℃水浴中孵育1h20min，再次放入72℃水浴锅中10min后取出，即得到cDNA，在-80℃下保存。

实施例4 四种病毒单一RT-PCR反应

分别以TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV 四种病毒的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，同时设立阴性对照组，初步建立四种病毒的单一RT-PCR方法；在建立单一RT-PCR反应的同时进行退火温度在50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 6个温度的优化，以及引物浓度从0.16、0.24、0.32、0.40和0.48μmol/L共5个浓度进行优化。

单一RT-PCR退火温度及引物浓度经优化后，其结果如下：TGEV引物随着温度的改变而目的条带有所改变，从52-58℃温度范围内均出现条带（如图1-A）。PEDV退火温度从图1-B可以看出，选择退火温度范围为52-56℃。根据电泳图1-C结果选择50-54℃为PHEV的退火温度范围。依据图1-D实验结果，选择52-54℃为 PDCoV的退火温度范围。

单一RT-PCR中引物浓度确定优化结果如下：TGEV引物的合适浓度范围为：0.24μmol/L−0.48μmol/L。PEDV引物最有效反应范围为0.24μmol/L到0.48μmol/L。PHEV引物有效浓度从0.32μmol/L到0.48μmol/L。PDCoV引物浓度范围为0.24μmol/L到0.48μmol/L。

将得到的PCR产物切胶回收，与pMD18-T克隆载体的连接，导入到感受态细胞中进行转化；挑取若干菌落，经菌液扩增PCR阳性并送样测序，每个样品送3个进行测序，测序工作由长春库美生物技术有限公司完成。

实施例5 二重RT-PCR方法的扩增及退火温度的优化

根据实施例4结果，取TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV四种病毒阳性质粒为模板，用上述实验条件进行四种病毒两两之间双重RT-PCR实验，初步建立六个双重RT-PCR方法，分别是TGEV-PEDV、TGEV-PHEV、PEDV-PHEV、TGEV-PDCoV、PEDV-PDCoV和PHEV-PDCoV的双重RT-PCR，并同时对PCR反应进行退火温度的优化，结果如图2（A-F）。

双重RT-PCR退火温度优化的结果为：TGEV-PEDV RT-PCR方法最适退火温度为52℃、54℃和56℃。TGEV-PHEV RT-PCR方法退火温度54℃和56℃的温度更为适合。TGEV-PDCoVRT-PCR方法退火温度为54℃。PEDV-PHEV RT-PCR方法退火温度54℃是反应中效果最好的。PEDV-PDCoV RT-PCR方法退火温度54℃和56℃均可。PHEV-PDCoV的双重RT-PCR方法可以选择52℃或54℃。

实施例6 三重RT-PCR方法的扩增及退火温度的优化

由二重RT-PCR过渡到三重RT-PCR时，每个反应体系中又多加了一对引物和相对应的模板。为探索三重RT-PCR方法中退火温度对于反应的影响，设计TGEV-PEDV-PHEV、TGEV-PEDV-PDCoV、TGEV-PHEV-PDCoV和PEDV-PHEV-PDCoV四个RT-PCR方法，对每种方法的退火温度进行优化，结果如图3（A-D）。

TGEV-PEDV-PHEV三重RT-PCR反应在52-56℃范围内扩增出清晰的条带，三者之间没有相互反应。TGEV-PEDV-PDCoV退火温度在52-54℃。TGEV-PHEV-PDCoV RT-PCR反应在52-56℃范围内均可扩增，选择54℃最佳。PEDV-PHEV-PDCoV RT-PCR反应在52-56℃温度范围内可正常扩增，56℃条带较亮。

实施例7 四种病毒的四重RT-PCR体系的建立与优化

为了优化多重RT-PCR体系，将不同的退火温度以及不同的引物浓度作为影响因素进行优化；以四种病毒的混合cDNA为模板，通过梯度PCR仪设置52℃、54℃和56℃三个退火温度下进行PCR扩增，TGEV、PEDV、PHEV 和PDCoV 可分别获得513bp、362bp、234bp 和1118bp的与预期大小相符的目的片段。通过实验结果可以得出，四种引物在同一反应体系中不会产生不良反应。各对引物的目的片段具有唯一性。TGEV 的引物对温度的影响不大，在三个温度下都可以产生很好的反应结果。其余三种病毒的引物在不同温度下在同一反应体系中没有TGEV的效果好。结果如图4所示，退火温度54℃为四重RT-PCR的最佳退火温度。将引物浓度最终稀释到10μmol/L，然后针对不同病毒特异引物的取不同添加量进行四重RT-PCR反应，比例如表1所示，结果如图5，从图中可以看出引物浓度组合比例3效果最好。

最终获得四重RT-PCR优化体系如下：反应总体积为25μL，其中含有：

cDNA 6μL

10×PCR buffer 2.5μL

2.5mM dNTP 2μL

rTaq 0.5μL

10umol/L PHEV上下游引物各1μL

10umol/L PEDV上下游引物各0.6μL

10umol/L TGEV上下游引物各1μL

10umol/L PDCoV上下游引物各1μL，

去离子水 6.8μL；

优化后的扩增体系反应条件如下：95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃45s共35个循环；12℃20min。

实施例8 多重RT-PCR方法的特异性检测

分别以猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的基因组DNA为模板，和上述的四种病毒阳性质粒混合物，以及四种病毒的单个阳性质粒为模板。按照成功优化好的四重RT-PCR方法反应体系及反应条件进行扩增，以检测多重RT-PCR的特异性，结果如图6（A-B）。在同一反应中四对引物的同时加入，模板为四种病毒混合阳性质粒以及是四种单一阳性质粒的多重RT-PCR反应，在各自预期片段大小的地方均出现片段。在多重RT-PCR的反应体系中，模板分别为四种病毒混合模板的阳性对照，PRV，PCV2和PPV。只有阳性对照出现特异性条带，其他几种病毒如PRV、PPV和PVC均未出现条带。表明建立的多重RT-PCR具有特异性。

实施例9 多重RT-PCR方法的敏感性检测

将已制备好4种病毒阳性质粒进行浓度测定，按10倍倍比稀释，将同一浓度梯度的四种质粒等体积混合后作为模板，进行多重RT-PCR检测其敏感性结果如图7。经测定四种病毒的阳性质粒TGEV，PEDV，PHEV，PDCoV的含量分别为32.8pg/μL，28.4pg/μL，25.7pg/μL和59.2pg/μL。电泳结果表明，多重RT-PCR分别测出 TGEV，PEDV，PHEV，PDCoV的最低检测量分别为 32.8 pg、28.4 pg、257 pg和592 pg。表明建立的多重 RT-PCR能够检测到pg等级的核酸。

实施例10 多重RT-PCR检测方法的临床样品检测

利用已建立的多重RT-PCR方法检测了2017-2018年间吉林大学养殖基地送检的17份腹泻病例病死猪的肺脏、脾脏、淋巴结组织和25份健康猪粪样品；将42份临床样品用上述建立的多重RT-PCR以及单一RT-PCR方法进行鉴定，结果如表2。通过对42份临床样品的检测结果分析可以看出，多重RT-PCR 的方法共检出32份阳性样品，其中包括7份TGEV样品，18份PEDV样品，7份PHEV样品。而且在此次多重 PCR检测中，没有发现由PDCoV引起的腹泻病例。最终结果表明，TGEV的阳性率为16.67%（7/42），PEDV的阳性率为42.86%（18/42），PHEV的阳性率为16.67%（7/42）和PDCoV的阳性率为0。这四种猪腹泻病毒里，多重 RT-PCR 和单一RT-PCR 相比较而言，四种病毒的符合率为100% 。

。

<110>吉林大学

<120>一种同步检测四种猪冠状病毒的多重RT-PCR方法

<160> 8

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Porcine hemmagglutinatipg encephalomyelitis virus

<400> 1

ggtatcaaag tgttgcctcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Porcine hemmagglutinatipg encephalomyelitis virus

<400> 2

gaacccttcc tggatagaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 3

tatccctcta tgctcctctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 4

ttcaacaatc tcaactacgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Transmissible gastroenteritis virus

<400> 5

ggcacgcttg tagacctttg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Transmissible gastroenteritis virus

<400> 6

cggaatttca ccgtaactgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Porcine deltacoronavirus

<400> 7

ccatcgctcc aagtcattct 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Porcine deltacoronavirus

<400> 8

tgggtgggtt taacagacat ag 22

Claims

1.同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物，它包括：

PHEV F：5´-GGTATCAAAGTGTTGCCTCC-3´；

PHEV R：5´-GAACCCTTCCTGGATAGAAT-3´；

PEDV F：5´-TATCCCTCTATGCTCCTCTT-3´；

PEDV R：5´-TTCAACAATCTCAACTACGC-3´；

TGEV F：5´-GGCACGCTTGTAGACCTTTG-3´；

TGEV R：5´-CGGAATTTCACCGTAACTGG-3´；

PDCoV F：5´-CCATCGCTCCAAGTCATTCT-3´；

PDCoV R：5´-TGGGTGGGTTTAACAGACATAG-3´。

2.一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，它包括：权利要求1所述的同步检测四种猪冠状病毒PHEV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR引物。

3.根据权利要求2所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于：其中引物对的摩尔比为PHEV：PEDV：TGEV：PDCoV=5:3:5:5。

4. 根据权利要求3所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒总体积为25uL，其中含有：

cDNA 6μL

10×PCR buffer 2.5uL

2.5mM dNTP 2uL

rTaq 0.5uL

10umol/L PHEV上下游引物各1uL

10umol/L PEDV上下游引物各0.6uL

10umol/L TGEV上下游引物各1uL

10umol/L PDCoV上下游引物各1uL，

去离子水 6.8uL。

5.根据权利要求4所述的一种同步检测四种猪冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于：其反应条件如下：95℃、5min；95℃、30s；55℃、30s；72℃、45s，共35个循环；12℃、20min。