CN113186359B - 猪星状病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，包括5对猪星状病毒基因型特异性组合引物(CP)和1条通用引物(UP)；还包括PCR反应液、PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品；PCR标准品由PAstV1标准品、PAstV2标准品、PAstV2标准品、PAstV3标准品、PAstV4标准品、PAstV5标准品组成。本发明还同时提供了试剂盒在富集多重PCR检测5种猪星状病毒基因型快速诊断中的应用。

Description

猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种同时检测所有已知猪星状病毒基因型的多重PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测所有已知猪星状病毒基因型，适用于临床及科研中对猪星状病毒的快速检测。

背景技术

星状病毒病是在全球流行的一种感染对象范围较广的疾病，可感染人，也可感染动物。猪星状病毒病是由猪星状病毒(Porcine Astrovirus，PAstV)引起的一种以生猪腹泻为主要症状的流行性疾病。PAstV属于星状病毒科(Astroviridae)，哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)。星状病毒为单链正股RNA病毒，病毒颗粒外表有5～6个突起结构，处理后呈典型星状结构，因此被命名为星状病毒。星状病毒基因组长度大小不一(6.8kb～7.3kb)，但结构基本相同，主要包括：5′非编码区、三个阅读开放框(ORF1a、ORF1b、ORF2)、3′非编码区以及一个约30bp的Poly(A)尾。

猪星状病毒作为一种单链RNA病毒，具有较高的遗传变异性。随着生物测序技术的不断发展，越来越多的新型毒株被发现，猪星状病毒也由原来的1种基因型发展到现在5种基因型(PAstV1～PAstV5)，其中PAstV2～PAstV5均到2010年以后才被发现，不同基因型序列差异很大，彼此同源性在40％-46.6％之间。

目前对猪星状病毒诊断手段主要为电镜观察、免疫荧光、ELISA，但是这些手段价格昂贵、操作繁琐，不适用猪星状病毒临床检测。随着分子生物学的发展，PCR技术开始流行，尤其是多重PCR以其灵敏度高、快速高效等优点被广泛应用于病毒检测。关于猪星状病毒的多重PCR研究报道不少，但大多只是检测猪星状病毒的存在，无法判断病毒基因型。少量关于猪星状病毒基因型多重PCR研究，或仅仅是针对其中3～4个基因型，或需两组不同多重PCR，且灵敏度不是很高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，即，提供一种同时特异灵敏地检测所有已知猪星状病毒基因型感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒(富集多重PCR检测5种猪星状病毒基因型快速诊断试剂盒)，其为同时特异灵敏地检测所有已知猪星状病毒基因型感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒包括5对猪星状病毒基因型特异性组合引物(CP)和1条通用引物(UP)；

所述5对猪星状病毒基因型特异性组合引物为：

PAstV1-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACACAGAAGAGCAACTCCATTACATT-3’

PAstV1-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACGTTGACGGATTGCTGGT-3’

PAstV2-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACTGARTGGGARGARATGAGYGA-3’

PAstV2-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAATGGTTCTGGTCCCGCTTC-3’

PAstV3-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAACTGTTCAACAGGGTAAGTGGT-3’

PAstV3-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAGGTCCATCATGGAGTAGGTAAT-3’

PAstV4-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAGGATTTACAGTTGGCCCAGA-3’；

PAstV4-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAAAGCCTGTCCATCTGCCT-3’

PAstV5-F-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACATGTYTCCACYTCAGTTGA-3’

PAstV5-R-UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGATCAGAGCCAACACGAGCC-3’

1条通用引物为：

UP：5’-CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGA-3’。

说明：所述每对猪星状病毒基因型特异性组合引物均在病毒基因型特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列，上述带下划线的序列，指共同的通用引物序列。

作为本发明的猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒的改进，该试剂盒包括a)PCR反应液、b)标准品、c)阳性对照品、d)阴性对照品、e)引物。

所述PCR反应液包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。所述PCR反应缓冲液含有缓冲液，氯化镁混合物。

所述PCR标准品由PAstV1标准品、PAstV2标准品、PAstV3标准品、PAstV4标准品和PAstV5标准品组成；所述PAstV1标准品序列如SEQ ID NO:1所述，所述PAstV2标准品序列如SEQ ID NO:2所述，所述PAstV3标准品序列如SEQ ID NO:3所述，所述PAstV4标准品序列如SEQ ID NO:4所述，所述PAstV5标准品序列如SEQ ID NO:5所述。

所述阳性对照品为：含PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5这五种猪星状病毒基因型的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μL)。

所述阴性对照品为灭菌双蒸水ddH₂O。

所述引物为5对猪星状病毒基因群组特异性组合引物和1对通用引物，序列如表1。

表1、本发明中所设计的PCR引物

在本发明中，5对猪星状病毒基因型特异性组合引物的上下游引物和一条通用引物可同管包装。

本发明的同时特异检测所有已知猪星状病毒基因型感染的富集多重PCR快速诊断试剂盒保存于-20度。本发明的试剂盒能用于检测猪星状病毒5个基因型PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5。

本发明试剂盒的使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

病毒样品核酸提取和反转录PCR：根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸。核酸样品反转录PCR：取5μL提取好的核酸样品(DNA/RNA)，加入随机引物后经热变性后进行反转录实验，反应条件和程序参照Vazyme公司的HiScript ll 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明。反应后的cDNA放入-20℃冰箱保存待后续检测。

病毒的检测：取1.0μL已抽提的待测样品核酸cDNA为模板进行多重PCR反应，其中7.5μL 2×Vazyme Mix，PAstV1～V5的上下游引物终浓度各为20nM，通用引物UP终浓度为500nM；双蒸水补足至15μL。扩增程序为：95℃3min；10个循环：95℃30s、58℃30s、72℃30s；再加上35个循环：95℃30s、65℃30s、72℃30s；最后72℃5min。产物用2％琼脂糖凝胶跑电泳。

结果报告：根据PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5基因目标片段的有无，对是否有猪星状病毒及属于哪个猪星状病毒基因型进行鉴定。

本发明具有如下技术优势：本发明通过5对猪星状病毒基因型特异性组合引物和一条通用引物联合使用，建立富集五重PCR扩增体系，能够对待测样品是否含有猪星状病毒及属于PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5哪个基因型进行快速鉴定，特异性高。试剂盒的最低灵敏度为5copies/μL，可检测出样品中的低浓度RNA。使用范围广，能够用于该病毒流行病学调查以及实验室检测。

本发明分别针对猪星状病毒5个基因型设计特异性引物，特异性引物能扩增各基因型内的所有序列，但不能扩增其它基因型的序列，结合多重PCR技术可以一次同时检测所有基因型猪星状病毒，并具有高特异性、检测时间短、检测成本低等优点。针对普通多重PCR存在的各组引物对扩增效率不一致，采用靶标富集多重PCR方法，即通过分别设计特异性组合引物(特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列)和1条通用引物，在特异性组合引物先进行适当扩增再利用通用引物对扩增产物进行扩增，达到均衡扩增各靶标的目的，是一种较为理想的检测方法。开发一种同时特异灵敏地检测所有已知猪星状病毒基因型感染的多重PCR快速诊断试剂盒，有助于提升病毒检测水平，在猪星状病毒分子流行病毒学研究，疾病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。

综上所述，本发明提供一种同时检测所有已知猪星状病毒基因型的富集多重PCR快速诊断试剂盒，包含PCR反应液、标准品、对照品，盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液管、PAstV1病毒标准品管、PAstV2病毒标准品管、PAstV3病毒标准品管、PAstV4病毒标准品管、PAstV5病毒标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管和引物管，通过一次PCR反应，能够对待测样品是否为猪星状病毒及属于PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5哪个基因型进行快速鉴定，特异性好、灵敏度高、简便快捷，适用于流行病学调查、临床及科研中对猪星状病毒的快速检测及分类研究，具有较高的使用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为猪星状病毒5种基因型多重PCR特异性检测。泳道1-24从左至右依次为：1:PAstV1；2:PAstV2；3:PAstV3；4:PAstV4；5:PAstV5；6:PAstV1+PAstV2；7:PAstV2+PAstV3；8:PAstV3+PAstV4；9:PAstV4+PAstV5；10:PAstV2+PAstV4；11:PAstV3+PAstV5；12:PAstV1+PAstV2+PAstV3；13:PAstV1+PAstV3+PAstV4；14:PAstV1+PAstV4+PAstV5；15:PAstV2+PAstV3+PAstV4；16:PAstV2+PAstV4+PAstV5；17:PAstV3+PAstV4+PAstV5；18:PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV4；19:PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV5；20:PAstV1+PAstV2+PAstV4+PAstV5；21:PAstV1+PAstV3+PAstV4+PAstV5；22:PAstV2+PAstV3+PAstV4+PAstV5；23:PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV4+PAstV5；24:阴性对照；M代表DL2000 DNA分子量标志。

图2为本发明对猪星状病毒5种基因型的灵敏性检测。泳道1-7从左至右依次为：5×10⁶、5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹、5×10⁰copies/μL PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5质粒标准品混合物，泳8为阴性对照；M代表DL2000 DNA分子量标志。注：上述浓度是指PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5各自的浓度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于本发明。

实施例1、试剂盒

一种同时特异检测五种猪星状病毒基因型感染的富集多重PCR快速诊断试剂盒，包含PCR反应液、引物、PAstV1病毒标准品、PAstV2病毒标准品、PAstV3病毒标准品、PAstV4病毒标准品、PAstV5病毒标准品、阳性对照品、阴性对照品；还包括一个盒体，盒体设有容器孔，分别用于放置PCR反应液管、引物管、PAstV1病毒标准品管、PAstV2病毒标准品管、PAstV3病毒标准品管、PAstV4病毒标准品管、PAstV5病毒标准品管、阳性对照品管和阴性对照品管等，其中PCR反应液包含PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，引物管为五种猪星状病毒基因型异性组合引物对和通用引物混合。每对猪星状病毒基因型特异性组合引物的上下游引物和通用引物可同管包装。

实施例2质粒标准品制备

第一步：引物合成

本发明所设计的5对猪星状病毒基因型特异性组合引物及通用引物序列(见表1)由苏州金唯智公司合成，合成量为每引物4OD。

第二步：病毒总DNA/RNA提取和反转录反应

将测序验证含有PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5毒源的猪粪样品置于1.5mL离心管中，根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸，反转录反应参照Vazyme公司的HiScript ll 1st Strand cDNASynthesis Kit说明得到病毒cDNA。反应后的cDNA直接进行后续检测或放入-20℃冰箱保存待后续检测。

第三步：PCR扩增

PCR反应体系(总反应体积25μL)：12.5μL 2×Vazyme Mix，以第二步中提取的1.0μL的每种猪星状病毒基因型cDNA为模板，第一步中合成的每对猪星状病毒基因型特异性引物(上下游引物终浓度各为300nM)，加ddH₂O至反应体系总体积为25μL。反应在Bio-RadS1000PCR扩增仪进行，反应参数为：扩增程序为：95℃3min；35个循环：95℃30s、55℃30s、72℃30s；最后72℃5min。产物用1％琼脂糖凝胶跑电泳。

第四步：质粒标准品制备

将第三步获得的5种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA Gel ExtractionKit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到PMD18-T载体上，通过大肠杆菌DH5α感受态转化，挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用Plasmid Miniprep Kit提取测序正确的重组质粒DNA，利用Nanodrop 2000定量PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5重组质粒浓度分别为5.1×10¹¹copies/μL、3.5×10¹¹copies/μL、4.7×10¹¹copies/μL、7.2×10¹¹copies/μL、5.6×10¹¹copies/μL，以无菌双蒸水将重组质粒按照5.0×10⁶～5.0×10⁰copies/μL 10倍梯度稀释制备质粒标准品。

实施例3、

本发明检测五种猪星状病毒基因型特异性实验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：特异性检测

按照富集多重PCR反应体系配制24份相同的反应液，即2×Vazyme Mix 7.5μL，表1中所述的5对组合引物和1条通用引物，其中PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5上下游组合引物终浓度各为20nM，通用引物UP终浓度为500nM，第一～第二十四份分别加入1μL如下模板1:PAstV1；2:PAstV2；3:PAstV3；4:PAstV4；5:PAstV5；6:PAstV1+PAstV2；7:PAstV2+PAstV3；8:PAstV3+PAstV4；9:PAstV4+PAstV5；10:PAstV2+PAstV4；11:PAstV3+PAstV5；12:PAstV1+PAstV2+PAstV3；13:PAstV1+PAstV3+PAstV4；14:PAstV1+PAstV4+PAstV5；15:PAstV2+PAstV3+PAstV4；16:PAstV2+PAstV4+PAstV5；17:PAstV3+PAstV4+PAstV5；18:PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV4；19:PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV5；20:PAstV1+PAstV2+PAstV4+PAstV5；21:PAstV1+PAstV3+PAstV4+PAstV5；22:PAstV2+PAstV3+PAstV4+PAstV5；23:PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV4+PAstV5；24:阴性对照加，加ddH₂O至反应体系总体积为15μL。反应参数如下：95℃3min；10个循环：95℃30s、58℃30s、72℃30s；再加上35个循环：95℃30s、65℃30s、72℃30s；最后72℃5min。

取5μL PCR产物，与1μL Loading Buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳30min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果参见图1，判定标准详见表1对应PCR产物大小PAstV1：351bp，PAstV2：388bp，PAstV3：249bp，PAstV4：297bp，PAstV5：511bp，可见本发明中构建的多重PCR反应体系特异性较好。

实施例4本发明检测五种猪星状病毒基因型敏感性实验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：敏感性检测

富集多重PCR敏感性检测体系如下：2×Vazyme Mix 7.5μL，表1中所述的5对组合引物和1条通用引物，其中PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5上下游组合引物终浓度各为20nM，通用引物UP终浓度为500nM，10倍系列稀释的同浓度的PAstV1+PAstV2+PAstV3+PAstV4+PAstV5质粒标准品(1.0×10⁶～1.0×10⁰copies/μL，指每种质粒的浓度)模板1.0μL，加ddH₂O至反应体系总体积为15μL；反应参数如下：95℃3min；10个循环：95℃30s、58℃30s、72℃30s；再加上35个循环：95℃30s、65℃30s、72℃30s；最后72℃5min。取5μL扩增产物进行2％琼脂糖电泳检测，结果参见图2。试验结果表明，本发明可检测出5copies/μL的PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5病毒量。

本发明还设置了如下的单重PCR敏感性检测反应体系：2×Vazyme Mix 7.5μL，表1中所述的每种基因型病毒引物(即，表1中所述的5对组合引物中的任一，而不使用通用引物)，上下游引物终浓度均为0.5μM，10倍系列稀释的每基因型质粒标准品(1.0×10⁶～1.0×10⁰copies/μL)模板1.0μL，加ddH₂O至反应体系总体积为15μL；在Bio-Rad S1000 PCR扩增仪进行反应，参数为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行2％的琼脂糖电泳检测。结果表明：常规单重PCR PAstV1的最低检出量为50copies，PAstV2为500copies，PAstV3为50copies，PAstV4为50copies，PAstV5为50copies。

由此可见本发明检测病毒的敏感性高于常规PCR约10-100倍。由此可见本发明检测5个猪星状病毒基因型的敏感性较好。

实施例5本发明检测临床样品试验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：样品收集

检测样品，采集于浙江的猪场。

第三步：病毒总DNA/RNA提取和反转录反应

将可能含有PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5毒源的猪粪样品置于1.5mL离心管中，根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸，反转录反应参照Vazyme公司的HiScript ll 1st Strand cDNASynthesis Kit说明得到病毒cDNA。

第四步：单重PCR检测和富集多重PCR检测

1、普通单重PCR检测

PCR反应体系(总反应体积15μL)：2×Vazyme Mix 7.5μL，表1中所述的每基因型病毒引物(即，表1中所述的5对组合引物中的任一)，上下游引物终浓度均为0.5μM，以第三步中提取的cDNA为模板(1.0μL)，加ddH₂O至反应体系总体积为15μL；以第一步中合成的5组猪腹泻病毒引物分别进行PCR扩增。反应在Bio-Rad S1000PCR扩增仪进行，反应参数为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行2％的琼脂糖电泳检测。

2、富集多重PCR检测：取1.0μL第三步中提取的cDNA作为模板进行多重PCR反应，其中2×Vazyme Mix 7.5μL，表1中所述的5对组合引物和1条通用引物，其中PAstV1，PAstV2，PAstV3，PAstV4和PAstV5上下游组合引物终浓度各为20nM，通用引物UP终浓度为500nM，加ddH₂O至反应体系总体积为15μL；反应参数反应参数如下：95℃3min；10个循环：95℃30s、58℃30s、72℃30s；再加上35个循环：95℃30s、65℃30s、72℃30s；最后72℃5min。取5μL扩增产物进行2％琼脂糖电泳检测。

第五步：结果检测

经琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如下：普通单重PCR法检测与本发明检测结果如下：普通PCR检测出PAstV1 43份，本发明检测出48份阳性(其中43份同普通PCR检测结果)；普通PCR检测出PAstV2 29份，本发明检测出32份(其中29份同普通PCR检测结果)；普通PCR检测出PAstV3 3份，本发明检测出4份阳性(其中3份同普通PCR检测结果)；普通PCR检测出PAstV4 37份，本发明检测出42份阳性(其中37份同普通PCR检测结果)；普通PCR检测出PAstV5 3份，本发明检测出3份阳性(其中3份同普通PCR检测结果)；其中普通PCR检测出混合感染32份，本发明检测出混合感染39份(其中32份同普通PCR检测结果)。

备注说明：上述这些“普通PCR检测呈阴性通过本发明检测结果为阳性的样本”经单重实时荧光定量PCR法验证，DNA含量基本都在10⁰-10²copies/μL之间。

上述结论表明本发明检测效果较好，在具备良好灵敏度的同时，可一次检测出多个猪星状病毒基因型混合感染，大大节约时间和试剂成本，提高检测效率。

对比例1、5对猪星状病毒基因型特异性组合引物中均取消通用引物序列(即，取消带下划线的序列)，反应体系中也相应取消通用引物的使用，其余等同于实施例4，最低检出量的所得结果为：PAstV1为5×10⁴copies，PAstV2为5×10⁵copies，PAstV3为5×10⁶copies，PAstV4为5×10⁵copies，PAstV5为5×10⁴copies，因此可得知：本发明设置的特异性组合引物能提高各基因型的检测灵敏度分别达10⁴-10⁶倍。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacagaagag caactccatt acatttggag gggaggacca aaagaaagta atggctagca 60

agtctggcaa agatgtcact gtcaaggtcg aaaataacac cggccgtggc aggagcagat 120

cccgctctag atctcggtct agagccagga acaaaaatgt taaaattacc atcaactcta 180

aaccaggagc gaacggagga cagcgcagac ggggtaaacc tcagtctgat aagcgtgtcc 240

gtaatattgt caaacaacag cttgacaaat caggtgtcac aggtccaaaa ccagcaatcc 300

gtcaacgggc aa 312

<210> 2

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgagtggga agagatgagc gatggctatg acccagatga ggactgggag tttgagtctg 60

actccgactt cgggcaaaga aagataaaag ttccctcctt taaccaatat cttgagagga 120

attataaccc caaggatgtc cggagcatgc ttgactcgct gacccctgct gacatagagg 180

ccgtaggacc actctaccca ctcaccatca agtgctccaa cccaggcctc tgttcagccc 240

ttctctgctg cattgaccgc tacgccgcac ttaatggtct gtcaccaccc acacaagggc 300

ttaactacac ccagcgtcgc gttccaaaaa acgggaagcg ggcccagaac catcg 355

<210> 3

<211> 205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgttcaac agggtaagtg gttaccatca gttaacccca cagccataat tgaggaactc 60

aatgatctat ggtttggtct caacatgctg atgtgggaaa agggcttggt tccttttaca 120

caaaggaaga aaattaagcg caaggtccaa aaaaactcca agggggcccc caagaggggc 180

ccattaccta ctccatgatg gacct 205

<210> 4

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatttacag ttggcccaga taggctacct taccccactg atgaagagaa actctatgct 60

ggacttgtaa cacctgcaag aaagctccct gatgtcacag cgctgcatgg gaaactcctg 120

agcctacaac tcctgatgca taaccatcct gacagtgcct tcaaagacta catcaacaaa 180

tgtttggctg aaacagcgag gcacgccgag gatctgcctg caagactcac agaaaggcag 240

atggacaggc ttt 253

<210> 5

<211> 467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtctcca cctcagttga tgatggcatg gtcaattact atctacaagc ctatgaacac 60

tttgttctca atgggcctga tggctgggaa aagacagaca ctctcatcta tggtgatgac 120

cgtctctcag tgacagactt ctgtcctgac cctgatgaca tcataaaatt ctaccatgac 180

tacttcggta tgtgggtcaa gagagagaac attaaagtcc aggaaacacc tgttggcctt 240

tctttctgtg gttttacgat aactgaagac tataaaccct gcttgcagag accaatgaag 300

cttttggcat ctatcttgac acccgtgtcc aaattgcggg accctgaagt cctttatggg 360

aaactcctga gtatgctgat cctgtcacac aatgacccgc ctgattcacc acttcggcgc 420

tatgtgcgtc gttgtgttga cgtcttgcgg gctcgtgttg gctctga 467

Claims (5)

1.猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

引物由5对病毒特异性组合引物和1条通用引物组成；

5对猪星状病毒基因型特异性组合引物为：

PAstV1-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACACAGAAGAGCAACTCCATTACATT

PAstV1-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACGTTGACGGATTGCTGGT

PAstV2-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACTGARTGGGARGARATGAGYGA

PAstV2-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAATGGTTCTGGTCCCGCTTC

PAstV3-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAACTGTTCAACAGGGTAAGTGGT

PAstV3-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAGGTCCATCATGGAGTAGGTAAT

PAstV4-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAGGATTTACAGTTGGCCCAGA

PAstV4-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGAAAAGCCTGTCCATCTGCCT

PAstV5-F-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGACATGTYTCCACYTCAGTTGA

PAstV5-R-UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGATCAGAGCCAACACGAGCC；

通用引物为：

UP：CGACAGTGTGGTTCTGCGGCGA。

2.根据权利要求1所述的猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

a)、PCR反应液，b)、PCR标准品，c)、阳性对照品，d)、阴性对照品，e)、引物。

3.根据权利要求2所述的猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

PCR标准品由以下5种标准品组成：PAstV1标准品、PAstV2标准品、PAstV2标准品、PAstV3标准品、PAstV4标准品、PAstV5标准品；

PAstV1标准品、PAstV2标准品、PAstV2标准品、PAstV3标准品、PAstV4标准品、PAstV5标准品的序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5所述。

4.根据权利要求3所述的猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

所述PCR反应液包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，氯化镁。

5.根据权利要求4所述的猪星状病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒保存于-20℃。

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