CN104513865A - 反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法，本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述6-FAM探针具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。本发明所建立的反转录PCR体系可以有效的扩增RNA，即可以快速、有效地扩增临床样品中基孔肯雅病毒RNA核酸。

Description

反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
基孔肯雅热Chikungunya fever，CHIK是由基孔肯雅病毒Chikungunya virus，CHIKV引起，以伊蚊即埃及伊蚊Aedes aegypti，白纹伊蚊Aedes albopictus，非洲伊蚊Aedes africana等吸血昆虫为主要传播媒介，以发热、皮疹及剧烈关节疼痛为主要临床症状的急性病毒性虫媒传染病，潜伏期3-12天。主要流行于非洲和东南亚地区，但近年来在东非海岸、印度洋岛屿、美洲及加勒比海地区岛屿流行，且流行地区呈现不断扩大的趋势，发病数也不断上升。目前我国主要是输入性感染病例，但已有学者从人血清和猪、鼠等血清中检测到基孔肯雅病毒抗体并分离到病原体。主要流行于非洲和东南亚地区，但近年来流行地区呈现不断扩大的趋势，发病数也不断上升。而且在2010年10月，广东省东莞市发生了我国首起基孔肯雅热社区聚集性疫情。CHIKV属于披膜病毒科Togaviridae甲病毒属Alphavirus，通过病毒E1基因的系统发生分析可将CHIKV分为4个基因型：基孔肯雅病毒西非基因型Chikungunya virus West African genotype，CHIKV-WA，基孔肯雅病毒亚洲基因型Chikungunya virus Asian genotype，CHIKV-Asian，基孔肯雅病毒印度洋基因型Chikungunya virus Indian Ocean genotype，CHIKV-IO，基孔肯雅病毒东/中/南非基因型Chikungunya virus East/Central/South African genotype,CHIKV-ECSA。但近年来，随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧为该病由流行地区向非流行地区的传播创造了条件；同时，由于基孔肯雅热与登革热和疟疾的临床症状相似且传播媒介雷同，使得很多基孔肯雅热被误诊为登革热。
目前基孔肯雅病毒的检测方法主要有：(1)病毒分离培养。本病毒可以在C6/36、BHK-21、Verona、Hela细胞和原代鼠肾细胞等细胞系以及乳鼠、蚊子等动物中增殖，病毒分离培养具有灵敏度高、特异性强等优点，但同时对培养环境、人员、培养条件和仪器设备要求较高；
(2)血清学方法。以免疫层析、免疫荧光和ELISA为主的血清学方法是目前实验室诊断 和商业化试剂盒应用最广泛的方法，血清学检测是目前应用最广泛的方法，但抗体一般会在机体感染病毒5天后产生以及不同基因型的基孔肯雅病毒及基孔肯雅病毒与其他与之相近的病原体之间的交叉反应，使得本方法对基孔肯雅热集中爆发时的检测和确诊比较困难；
(3)分子生物学方法。以反转录PCR，其是实时荧光RT-PCR为主的分子生物学方法为基孔肯雅病毒感染的诊断、预防和控制提供了快速、准确的诊断方法。但目前的实时荧光RT-PCR检测方法仍不能实时、特异和灵敏地检测所有基因型的基孔肯雅病。
(1)病毒分离。CHIKV能在C6/36、BHK-21、Verona、Hela细胞和原代鼠肾细胞中增殖，可产生典型的细胞病变，并可产生蚀斑；用上述细胞分离病毒与用乳鼠分离病毒同样敏感。可在乳鼠、某些脊椎动物细胞和蚊子中增殖，病毒分离方法包括乳鼠脑内接种、脊椎动物细胞培养、蚊子细胞培养等，最常用的方法是细胞接种培养法。
(2)血清学检测。血清学检测的时间范围较广，既可对机体内抗原进行检测，也可对抗体进行检测。CHIKV感染并出现临床症状后3-6天，在病人血清中能检测到IgM和IgG抗体。目前，CHIKV抗原血清学检测方法研究较少，抗体检测方法较多。主要包括免疫层析法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法ELISA、血凝抑制法、病毒中和试验等。
(a)免疫层析法。当足够量的样本加入到检测卡样品孔后，样本中的CHIKV抗体会结合到CHIKV抗原结合物上，并被膜上包被的抗抗体捕捉。目前已有商品化的检测试剂盒。本方法操作简单，不需要大型仪器设备，适合检测一线及基层医疗单位开展该病的初选，但该方法灵敏度和特异性较低，其检测阳性病例需通过其他方法进一步确诊。
(b)免疫荧光法。又称荧光抗体法，是一种将抗原、抗体的结合反应与形态学相结合的方法。该方法集血清学反应的特异性、荧光色素的敏感性和显微镜检法于一体，扩大了免疫学诊断的效果，是近代免疫学的一种重要研究手段，且目前已经有商业化试剂盒。该方法灵敏度较高，目前在CHIK疫情恢复性调查等领域应用较广泛，但对实验者的经验要求高，需防止假阳性的诊断结果，且需要荧光显微镜等精密仪器。
(c)血凝抑制试验。当PH和温度控制在适当的条件时，CHIKV能使鸽的红细胞发生凝集，而在特异性抗体存在的条件下，由于抗体与病毒抗原相结合，因而凝集现象被抑制。本方法具有特异性强、敏感度高以及操作简便的优点，而且不需要特殊设备，但同时假阳性的发生几率也很高。
(d)中和试验。该方法特异性较高，可用抗体交叉反应或特异性单克隆抗体进行试验，可以与同群的其他病毒进行鉴别。本方法属于CHIK确诊试验，但需要CHIKV活病毒，试验操 作具有一定的危险性，且目前我国规定CHIKV培养需要在BSL-3实验室内进行，因此限制了该方法的应用。
(e)ELISA法。可利用间接IgG ELISA法检测病例血清中的IgG抗体，及样品血清中的IgG抗体可以与ELISA板上包被的CHIKV抗原结合，当加入显色剂后并通过读取其OD值的方法判断样品为阴性或阳性。本方法已经有商业化的试剂盒，且操作简单，对仪器没有特殊要求，但此方法检测的基础是需要血清中的抗体水平达到检测水平，一般在病毒感染机体后5天。
(3)分子生物学检测方法。分子生物学技术的进步为病原体的检测和特性分析提供了快速、可靠的技术手段。相对于血清学检测，分子生物学检测是CHIKV理想的早期诊断方法。该方法的所需的样本量极少，可在短时间内得到准确结果；同时可以检测到不同来源的样本，病毒培养液、血液、蚊子标本均可利用分子生物学方法进行检测。
(a)等温基因扩增技术。该方法对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。此方法扩增效率高、操作简单，且实验过程中不需要大型精密仪器，但此方法的灵敏度较低，同时对于种属较复杂的病原体选择保守区间设置4对引物会很困难。
(b)RT-PCR即为verse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR技术。PCR方法是一种灵敏、特异、快速、低污染的检测技术，尤其是实时荧光RT-CPR。应用常规的RT-PCR检测方法，一般在发病后4天内在多感染者血清中均可检测到病毒核酸；而应用更灵敏的实时荧光RT-PCR技术甚至在发病7天后仍可检测到病毒核酸。因此，对处于发热期的可疑病例，首选的实验室检测方法为实时荧光RT-PCR，而且可将PCR产物进行序列测定，准确判定是否为CHIKV感染或者感染的是哪种基因型。
基孔肯雅病毒属于披膜病毒科Togaviridae甲病毒属Alphavirus，而甲病毒属成员众多，且分类及其复杂。目前为止，主要分为7个抗原性复合群antigenic complex。其基因组为不分节段的正链RNA，含有5个结构蛋白，壳蛋白C，包膜蛋白E1、E2、E3和6K和4个非机构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。其中包膜蛋白E1对其抗原性和分类学有重要意义，通过病毒E1基因的系统发生分析可将CHIKV分为4个基因型：基孔肯雅病毒西非基因型Chikungunya virus West African genotype，CHIKV-WA，主要流行于西非、美洲及加勒比海地区；基孔肯雅病毒亚洲基因型Chikungunya virus Asian genotype，CHIKV-Asian，主要流行于东南亚及南亚地区；基孔肯雅病毒印度洋基因型Chikungunya virus Indian Ocean  genotype，CHIKV-IO，此基因型是最近流行并定义的基因型，主要流行于印度洋岛屿及印度；基孔肯雅病毒东/中/南非基因型Chikungunya virus East/Central/South African genotype,CHIKV-ECSA,是四个基因型中流行最广泛的CHIKV，主要分布于非洲的东部、中部和南部以及印度洋地区。基孔肯雅热首先发现于坦桑尼亚，主要流行于非洲和亚洲的热带及亚热带地区。但近年来，随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧为该病由流行地区向非流行地区的传播创造了条件，在我国南部沿海省份每年都有输入性基孔肯雅热病例，时刻威胁着我国沿海防线；同时，由于基孔肯雅热与登革热和疟疾的临床症状相似且传播媒介雷同，使得很多基孔肯雅热被误诊为登革病毒感染。
因此，建立基孔肯雅病毒的快速、准确检验检测方法，有利于了解基孔肯雅病毒的生物学特性、临床诊断，并将其应用于基孔肯雅病毒感染的检测工作，对防止其传入我国具有重要意义。
目前，缺乏一种高度灵敏、特异、快速检测的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、快速检测的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法。
本发明的技术方案如下：本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；
所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述6-FAM探针具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述LCRed640探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；
所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。
进一步地，所述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
进一步地，所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒标准品模板进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
更进一步地，所述DNA质粒标准品模板的浓度为100gene copies/μl。
本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系,实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性对照；
实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系：10μl的样品DNA模板或者定量DNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。
本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系,反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照； 
反转录PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系包含：10μl的样品RNA模板或者定量RNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述PCR扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：1x2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x1sec95℃,8sec56℃,30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1x1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；降温循环：1x1sec38℃。
本发明的一种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述反转录PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环；
反转录：1x30min55℃；预变性：1x2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x1sec95℃,8sec56℃,30sec67℃,and30sec72℃；降温循环：1x1sec38℃。
本发明所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病中的应用。
有益效果:本发明所建立的反转录PCR体系可以有效的扩增RNA，即可以快速、有效地扩增临床样品中基孔肯雅病毒RNA核酸，为基孔肯雅热爆发时的快速、准确地诊断大批临床 样品，并尽快地控制本病提供了坚实的基础。反转录PCR体系可以特异、稳定地扩增所有基因型的基孔肯雅病毒。本发明还具有一种高度灵敏、特异、快速检测所有基孔肯雅病毒基因型CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA的方法体系。
本发明具有如下优点：
(1)本发明可以特异性地检测所有基孔肯雅病毒的基因型。本发明RT-PCR体系具有极高的灵敏度。在病毒感染的早期或恢复期，机体内病毒的含量相对较低，这就需要灵敏度、准确度更高的检测方法，从而能够及时、快速地诊断、监测和控制传染病，尤其像基孔肯雅热这种急性传染病。常规RT-PCR检测方法，一般在发病后4天内在多数患者血清中均可检测到病毒核酸；而应用更灵敏的实时荧光RT-PCR技术甚至在发病7天仍可检测到病毒核酸。因此对处于发热期的可疑CHIK感染病例，首选的实验室检测方法为实时荧光RT-PCR，而且反转录PCR产物可以进行核酸序列测定，准确判定是否为CHIKV感染。本发明实时荧光RT-PCR体系可以检测到单拷贝的质粒核酸，载有基孔肯雅病毒4种基因型DNA核酸的质粒标准品，同时可以有效地扩增最低10-7禽流感病毒H1N1的RNA核酸，从鸡胚尿囊液中制备的RNA核酸标准品。
(2)本发明操作便捷，适合于检测大量样本。基孔肯雅热目前是一种地方流行性传染病，主要流行于非洲、东南亚、地中海地区和加勒比海地区，但随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧为该病由流行地区向非流行地区的传播创造了条件，这就迫切需要一种快速、准确的检测方法更好地应用于边检，为防止该病的传入提供诊断学基础；同时，基孔肯雅热作为一种急性传染病，其在流行地区的预防，尤其是爆发流行地区的诊断和控制尤其重要。(3)本发明根据基孔肯雅病毒4种基因型核酸序列中保守区间建立了一种可以对所有基孔肯雅病毒基因型进行检测的反转录PCR系统。首先从NCBI上获得所有基孔肯雅病毒基因型以及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，并选择相对保守的区间设计引物和探针，然后用该引物和探针对样品进行实时、特异、灵敏和快速地检测。
(4)本发明确保此系统不扩增其它非基孔肯雅病毒的微生物，尤其是与其同源性相近的其他病原体，如马雅罗病毒Mayaro virus，MAYV、盖塔病毒Gatah virus，GETV、阿尼昂尼昂O’nyong-nyong virus，ONNV、西门利克森林病毒Semliki Forest virus，SFV、委内瑞拉马脑炎Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV、东方马脑炎Eastern equine encephalitis virus，EEEV和辛德毕斯病毒Sindbis virus，SINV；以及与其临床表现相似且传播媒介相同、经常被误诊的传染病，如登革热、疟疾等。本发明选择基孔肯雅病毒保守区域作为目的片段设计引物和探针。总体的思路是：巧妙地设计RT-PCR的引物和探针，可以特异地扩增所有基孔肯雅病毒基因型的核酸，如基孔肯雅病毒亚洲基因型CHIKV-Asian、基 孔肯雅病毒东/中/南非基因型CHIKV-ECSA、基孔肯雅病毒印度洋基因型CHIKV-IO、基孔肯雅病毒西非基因型CHIKV-WA，从而快速的判断出阳性样品。
附图说明
图1为本发明反转录PCR的上游引物的示意图；
图2为本发明反转录PCR的6-FAM探针的示意图；
图3为本发明反转录PCR的LCRed640探针的示意图；
图4为本发明反转录PCR的下游引物的示意图；
图5为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的扩增曲线的示意图；
图6为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的熔解曲线的示意图；
图7为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的扩增曲线的示意图；
图8为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的熔解曲线的示意图；
图9为本发明基孔肯雅病毒IO基因型的扩增曲线的示意图；
图10为本发明基孔肯雅病毒IO基因型的熔解曲线的示意图；
图11为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的扩增曲线的示意图；
图12为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的熔解曲线的示意图；
图13为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的扩增曲线的示意图；
图14为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的熔解曲线的示意图；
图15为本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图；
图16为本发明中反转录PCR体系的熔解曲线的示意图；
图17为本发明四种基孔肯雅病毒基因型琼脂糖凝胶电泳的示意图。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明 保护范围的限定。
实施例1
本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；
如图1至图4所示，图1为本发明反转录PCR的上游引物的示意图；反转录PCR上游引物序列：5’-CGGCTTCTTCAATATGATGCAGATG-3’(25bp)。此引物序列与所有基因型的基孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
图2为本发明反转录PCR的6-FAM探针的示意图；反转录PCR的6-FAM探针序列：5’-GACACAATGGCAGTCACAGGCAGT-6-FAM-3’(24bp)，此序列为图中获得序列的对称链核苷酸序列。此FAM探针序列与CHIKV-IO基因型核酸序列有1个错配碱基，而与其他基因型的基孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
图3为本发明反转录PCR的LCRed640探针的示意图；反转录PCR的LCRed640探针序列：5’-LCRed640-TACACCGCCTGGARATACTTTTGTGGT-磷酸基团-3’(27bp)，此序列为图中获得序列的对称链核苷酸序列。此下游引物序列中有1个兼并碱基R,此兼并碱基R可以同时扩增A和G碱基。因此，此LCRed640探针序列与CHIKV-WA基因型核酸序列有1个错配碱基，而与其他基因型的基孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
图4为本发明反转录PCR的下游引物的示意图；反转录PCR下游引物序列：5’-GCATTTTGCCTTCGTAATGCAACGA-3’(25bp)，此序列为图中获得序列的对称链核苷酸序列。此引物序列和所有基因型的基孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
基孔肯雅病毒反转录PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CGGCTTCTTCAATATGATGCAGATG-3’SEQ ID No.1；
6-FAM探针：5’-GACACAATGGCAGTCACAGGCAGT-6-FAM-3’SEQ ID No.2；
LCRed640探针:5’-LCRed640-TACACCGCCTGGARATACTTTTGTGGT-磷酸基团-3’SEQ ID No.3；
下游引物：5’-GCATTTTGCCTTCGTAATGCAACGA-3’SEQ ID No.4。
所述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒标准品模板进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
所述DNA质粒标准品模板的浓度为100gene copies/μl。
本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系,实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性对照；
实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系：10μl的样品DNA模板或者定量DNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。
本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系，反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照； 
实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系：10μl的样品DNA模板或者定量DNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。
本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的PCR扩增体系,所述反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照； 
所述反转录PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系包含：10μl的样品RNA模板或者定量RNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述PCR扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：1x2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x1sec95℃,8sec56℃,30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1x1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；降温循环：1x1sec38℃。
本发明的一种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述反转录PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环；
反转录：1x30min55℃；预变性：1x2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获 得循环：40x1sec95℃,8sec56℃,30sec67℃,and30sec72℃；降温循环：1x1sec38℃。
本发明所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病中的应用。
从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取如下基孔肯雅病毒4个基因型和其他与其同源性较高的种属的全基因序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对。
图5为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的扩增曲线的示意图；表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒Asian基因型DNA分子，且具有可重复性；
图6为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的熔解曲线的示意图；本发明系统对于基孔肯雅病毒Asian基因型具有稳定的Tm值。
图7为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的扩增曲线的示意图；表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒ECSA基因型DNA分子，且具有可重复性；
图8为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的熔解曲线的示意图；表明本发明系统对于基孔肯雅病毒ECSA基因型具有稳定的Tm值。
图9为本发明基孔肯雅病毒IO基因型的扩增曲线的示意图；表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒IO基因型DNA分子，且具有可重复性；
图10为本发明基孔肯雅病毒IO基因型的熔解曲线的示意图；表明本发明系统对于基孔肯雅病毒IO基因型具有稳定的Tm值。
图11为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的扩增曲线的示意图；表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒WA基因型DNA分子，且具有可重复性；
图12为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的熔解曲线的示意图；表明本发明系统对于基孔肯雅病毒WA基因型具有稳定的Tm值。
图13为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的扩增曲线的示意图；表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒Asian、ECSA、IO和WA基因型DNA分子，且具有可重复性；
图14为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的熔解曲线的示意图；表明本发明系统对于基孔肯雅病毒Asian、ECSA、IO和WA基因型具有稳定的Tm值。
如图5至图9所示，本发明检测载有基孔肯雅病毒4个基因型(CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)DNA序列的四种质粒(金斯瑞生物科技，中国南京)标准品。结果表 明，本发明系统可以特异、高效的扩增所有血清型的基孔肯雅病毒DNA；
如图6至图14所示，本发明依据基孔肯雅病毒各基因型中保守区间巧妙地设计一对引物和探针，可以同时检测到所有4种基孔肯雅病毒基因型(CIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)
图15为本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图；将从鸡胚尿囊液中提取的流感病毒(H1N1)RNA进行梯度稀释，并用本发明RT-PCR反应条件和流感病毒引物和探针检测。结果表明本发明中的反转录PCR体系可以检测到最低10-7拷贝的目的RNA核酸，且具有可重复性；
图16为本发明中反转录PCR体系的熔解曲线的示意图；所有稀释梯度表现出稳定的熔解曲线。
图17为本发明四种基孔肯雅病毒基因型琼脂糖凝胶电泳的示意图。本发明RT-PCR体系扩增四种基孔肯雅病毒基因型(Asian、ECSA、IO和WA)DNA的目的核苷酸片段大小为139个碱基对(bp)。各泳道依次为：泳道-1：标准品(Ladder)，泳道-2：基孔肯雅病毒亚洲基因型(Chikungunya virus Asian genotype，CHIKV-Asian),泳道-3：基孔肯雅病毒东/中/南非基因型(Chikungunya virus East/Central/South African genotype，CHIKV-ECSA)，泳道-4：基孔肯雅病毒西非基因型(Chikungunya virus West African genotype CHIKV-WA)，泳道-5：基孔肯雅病毒印度洋基因型(Chikungunya virus Indian Ocean genotype，CHIKV-IO),泳道-6：阴性对照(NC)。其中，标准品(Ladder)各条带大小依次为20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp,140bp，160bp，180bp，200bp和300bp。阳性样品和阳性对照PCR的荧光扩增曲线在640nm有荧光的出现或增强，且PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中的条带大小为139bp。
本发明反转录PCR特异性的确定：
本发明的特异性从三个方面得到保证：
(1)设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增所有的基孔肯雅病毒基因型(CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)，而不扩增其它非基孔肯雅热病原体尤其是与其同源性相近(马雅罗病毒、盖塔病毒、阿尼昂尼昂、西门利克森林病毒、委内瑞拉马脑炎、东方马脑炎和辛德毕斯病毒等)或临床特征相似(登革热等)的病原体核酸。通过BLAST确认,本发明RT-PCR的探针和引物可以特异地扩增和检测所有基孔肯雅病毒的核酸但不扩增其他相关病毒的核酸；
(2)如图6至图14所示，本发明检测载有基孔肯雅病毒4个基因型(CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)DNA序列的四种质粒(金斯瑞生物科技，中国南京)标准品。结果表明，本发明系统可以特异、高效的扩增所有血清型的基孔肯雅病毒DNA；
(3)如图6至图14，图17所示，观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度(640nm)的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。结果显示，所有基孔肯雅病毒的质粒核酸的PCR扩增曲线的荧光曲线在640nm波长处出现或增强；同时PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，显示139碱基对(bp)的条带大小；
本发明RT-PCR检测基孔肯雅病毒灵敏度的确定：
如图6至图14所示，由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成基孔肯雅病毒4个基因型(CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)目的片段的DNA序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10,000拷贝、1,000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度的稀释液，来确定本发明检测此基因的灵敏度。结果显示，此发明可以在反应系统中扩增单拷贝的目的基因。
本发明中反转录PCR体系效率的确定：
如图15和图16所示，用禽流感病毒H1N1感染鸡胚后收取鸡胚尿囊液，用商业化RNA提取试剂盒(High Pure RNA Isolation Kit，罗氏，德国)从尿囊液中提取RNA，然后对其进行梯度稀释，选取10-3-10-8进行反转录PCR扩增。结果表明，本发明的反转录PCR体系可以检测到反应体系中最低为10-7拷贝的禽流感病毒RNA分子。
制备PCR用的标准定量试剂：
(1)DNA质粒标准品的制备
由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成基孔肯雅病毒4个基因型(CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)目的片段的DNA序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10,000拷贝、1,000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的目的基因作为标准品。本发明试剂盒中提供基孔肯雅病毒4个基因型、浓度为104/μl的质粒标准品。
(2)RNA标准品的制备 
用禽流感病毒H1N1感染鸡胚后收取其尿囊液，用商业RNA提取试剂盒(High Pure RNA Isolation Kit，罗氏，德国)进行RNA核酸提取后，用TE缓冲液,PH为8.0进行10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8梯度稀释后作为检测反转录PCR系统效率的标准品。
琼脂糖凝胶电泳：
配制3％琼脂糖凝胶，取10μl PCR扩增产物，并用Safe DNA Gel Stain(Safe DNA Gel Stain，invitrogenTM by l ife美国)染色，在紫外灯下观察，可 以看到139bp处的目的条带(图11)。所使用的标准品为20bp DNA Ladder(Thermo Scientific O’RangeRuler 20bp DNA Ladder,ready-to-use,by Thermo美国)]，且其条带大小依次为20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，300bp。
PCR结果的判定： 
如图6至图14所示，实时荧光PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性对照(双蒸水)；反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照(双蒸水)。此发明有着高度的特异性，可以检测到所有基孔肯雅病毒基因型(CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)的核酸。
实施例2
转录方法验证本发明PCR体系：
由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成含有基孔肯雅病毒亚洲基因型CHIKV-Asian目的片段DNA和T7启动子的质粒批pUC57，用合适的限制性内切酶(Sac I,宝生物，大连)对质粒进行酶切；通过PCR扩增提高目的DNA浓度；用商业化转录试剂盒(Kit， by life美国)对PCR扩增产物进行转录并获得RNA产物；转录完成后，将转录产物稀释后用于反转录PCR进行扩增。
(1)质粒的稀释 
将含有合成质粒的微型离心管4000转离心2分钟，然后加入40μl TE缓冲液，PH为8.0配成质粒浓度为100ng/μl的溶液；
(2)质粒的酶切 
用商业化限制性内切酶SacI(Sac I,宝生物，大连)对质粒进行酶切，其反应体系为20μl，且各试剂成分组成如下表；将各反应液混合后放入37℃环境中孵育1个小时；然后将反应体系混合液放入56℃环境中加热20分钟使限制性内切酶失火，从而终止酶切反应；
Sac I 1μl
10×L Buffer 2μl
DNA(质粒) 5μl
灭菌水 12μl
反应体系 20μl
[0125] (3)PCR扩增酶切产物 
用以下引物从线性质粒上扩增一段含有T7转录启动子和目的DNA片段、长度为733个碱基对(bp)的片段，从而为后续转录提供足够浓度的目的DNA，大于等于1μg/μl；
P-上游引物：5’-GGTACCTCGCGAATGCATC-3’
P-下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGACCA-3’
(4)体外转录
在室温条件下溶解试剂盒中所有相关试剂(将RNA Polymerase Enzyme Mix置于-20℃冰箱中待使用时取出)；
在室温下混合下表中的各试剂并通过移液器上下吹打混匀；
Amount Component
7μl Nuclease-free Water
2μl ATP solution
2μl CTP solution
2μl GTP solution
2μl UTP solution
2μl 10×Reaction Buffer
1μl PCR products
2μl Enzyme Mix
20μl  
在37℃环境中孵育4小时；加入1μl TURBO DNase，混匀后在37℃环境中孵育15分钟，从而去除反应体系中的核酸DNA；将上述转录产物用TE缓冲液(PH8.0)进行10-3,10-4,10-5稀释；用本发明建立的可以检测所有基孔肯雅病毒基因型的RT-PCR体系扩增通过上述方法获得的转录产物稀释液(核酸RNA)。
结果表明，转录产物荧光扩增曲线在640nm处有荧光的出现和增强，且熔解曲线处有单一、稳定的熔解峰和Tm值。因此，本发明所建立的反转录PCR体系可以有效的扩增RNA，即可以快速、有效地扩增临床样品中基孔肯雅病毒RNA核酸。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，其特征在于：所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；
所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述6-FAM探针具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述LCRed640探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；
所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
3.根据权利要求2所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于:所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒标准品模板进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述DNA质粒标准品模板的浓度为100gene copies/μl。
5.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系,其特征在于：实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性对照；
实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系：10μl的样品DNA模板或者定量DNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。
6.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系,其特征在于：反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照；
反转录PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系包含：10μl的样品RNA模板或者定量RNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
7.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：1x 2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x 1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x 1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x 1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x 1sec95℃,8sec56℃,30sec67℃,and 30sec72℃；1个熔解循环：1x 1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；降温循环：1x 1sec38℃。
8.一种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述反转录PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环；
反转录：1x 30min55℃；预变性：1x 2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x 1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x 1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x 1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x 1sec95℃,8sec56℃,30sec67℃,and 30sec72℃；降温循环：1x 1sec38℃。
9.权利要求1-4任一项所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病中的应用。
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