KR20230111360A - 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus)를 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 주요 모기 매개 CHIKV를 진단하는 민감하고 구체적이며 신속한 프로세스를 제공하고 조기에 강력한 검출을 통해 환자의 임상 치료 가능성을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV)를 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.
치쿤군야열병(Chikungunya fever disease)의 재출현은 전 세계적으로 인류에게 위협이 되고 있다[1-3]. 치쿤군야 바이러스(Alphavirus genus 및 Togaviridae family)에 의해 유발되는 치쿤군야열병은 사람에게 돌발성 발열, 다발성 관절통 및 발진을 일으키는 인수공통 질환이다. 모기에 의해 전파되는데 이집트숲모기(Aedes aegypti)와 알보픽투스(Aedes albopictus)가 주요 매개체로 알려져 있다[4,5]. 세계의 열대, 아열대 및 온대 지역에서 발생한 발병은 벡터의 자연 서식지이다[4]. 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV)는 1952-1953년 탄자니아에서 열성 질환의 출현에서 처음 분리되었다[6,7]. 발병은 2004년 이전에 아프리카와 일부 동남아시아에서 가끔 확인되었다[8-10]. 2005년에서 2007년 사이에 세계적인 전염병으로 전환되었다. 대규모 발병은 인도양의 섬과 인도, 동남아시아, 중국, 이탈리아, 프랑스에서 반복적으로 발생했다[11-14]. 2013년 카리브해 세인트 마틴 섬에서 확진자가 보고된 후 미국을 비롯한 남미 국가들에 전염병이 퍼졌다[11,15,16]. 94개국에서 100만 건 이상의 사례가 보고되었다[17]. 그러나 CHIKV에 대한 백신과 약물은 아직 사용할 수 없다[18,19]. 게다가, 연구자들은 여전히 재출현의 가능성을 제안했다[20-22]. CHIKV에 대한 백신과 약물이 없는 상황에서 CHIKV 검출을 위한 신뢰할 수 있고 민감한 분석은 임상 진단에 중요하다[23].
CHIKV의 임상 및 지리적 특성은 뎅기열 바이러스(Dengue virus, DENV)[13,24], 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV), 일본 뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis virus, JEV) 및 리프트 밸리 열병 바이러스(Rift Valley Fever virus, RVFV)와 상당히 유사하다[4,25]. 따라서 이러한 바이러스가 함께 확인된 국가에서는 이러한 바이러스의 감별 진단이 중요하다[26]. 그러나 CHIKV에 대한 기존의 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)은 2002년에 처음 발표되었고 CHIKV에 대한 실시간 RT-PCR은 2005년에 발표되었다[27,28]. 디지털 액적 PCR(digital droplet PCR, ddPCR) 및 기타 핵산 기반 진단 시스템(예: LAMP, RPA)은 많이 연구되지 않았다[29-31].
Real-time PCR은 template 증폭 시 형광 신호를 실시간으로 검출할 수 있는 기술이다. 주로 이중 표지 형광 혼성화 프로브인 Taqman 프로브를 사용하여 수행했다. Taqman 프로브는 5' 말단에 리포터로 형광 염료가 있고 3' 말단에 소광제가 있다. 리포터 염료는 중합효소에 의해 소광제에서 멀어질 때 확장 단계에서 형광을 방출한다. 형광 신호는 대상 템플릿의 농도에 따라 증폭 곡선을 나타낸다. 신호가 임계값을 넘으면 분석 값인 사이클 임계값(Ct)과 함께 양수가 된다[32]. 그리고 최근에는 이중 소광제 프로브가 한 연구 그룹에서 처음으로 연구되었다. 이중 소광제 프로브는 염료와 두 개의 소광제로 구성된다. 5' 염료(FAM), 내부 소광제(ZEN) 및 3' 소광제(iowa Black 형광 소광제, IBFQ). 단일 소광제 프로브의 동일한 시퀀스를 사용하여 이중 소광제 프로브를 생성할 수 있다. 배경 신호를 줄여 감지 감도를 향상시킨다[33,34].
Droplet Digital PCR(ddPCR)은 매우 제한된 양의 템플릿을 절대적으로 정량하기 위한 매우 민감하고 정확한 정량 기술이다. end-point 방식의 ddPCR은 최대 200만개의 PCR 반응에 대한 high-throughput을 검출하여 정확한 양으로 정량화할 수 있다. ddPCR은 템플릿과 검출 가능한 분석을 포함하는 나노리터 크기의 물방울을 생성한다. PCR 반응은 그 액적에서 수행된다. 각 액적의 종말점 PCR 신호는 푸아송 통계 분석(Poisson statistical analysis)으로 분석된다. 결과적으로 단일 사본에서 최대 105 사본까지 수량화할 수 있다[35-37].
RPA(Recombinase Polymerase Amplification)는 2006년에 처음 설계된 등온 증폭 기술이다[38]. RPA 기술은 샘플의 열 변성 없이 몇 분 안에 표적 시퀀스를 감지할 수 있다. 변성 단계 대신에, 재조합효소-프라이머 복합체가 이중 가닥 DNA(dsDNA) 사이의 상동 서열에 결합하고 중합효소로 전환한다. 표적 서열의 프로브는 특정 뉴클레아제에 의해 절단되고 형광 신호를 방출한다[38,39]. 적시적용이 가능하고 사용이 간편하여 현장에서 빠른 진단으로 주목받고 있다.
본 발명은 이러한 검출 기술을 사용하여 CHIKV의 민감하고 정확한 검출을 위한 분석법을 개발했다. Real-time RT-PCR을 위해 설계되고 RT-ddPCR에 함께 사용되는 단일 소광 분석. 동일한 시퀀스의 단일 소광 분석을 기반으로 설계된 이중 소광 분석은 동일한 실험을 수행했다. exo 프로브 유형에 맞게 설계된 RPA 분석으로 20분 동안 연구되었다. 설계된 모든 분석은 2개의 구조적 단백질을 표적으로 한다. 캡시드 단백질(Capsid protein, C), 엔벨로프 단백질 2(Envelope protein 2, E2) 유전자, 그리고 한국의 여행 관련 환자로부터 분리되어 국립 병원균 컬렉션(National Culture Collection for Pathogens, NCCP)에 기탁된 균주 NCCP43132(균주 KNIH/2009/77)를 사용하여 테스트했다.
한국등록특허 제2030245호는 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도에 관해 개시하고 있고, 한국공개특허 제2011-0118176호는 치쿤군야의 검출을 위한 프로브 및 프라이머에 관해 개시하고 있으며, 미국공개특허 제2019/0367998호는 치쿤군야 바이러스 검출 방법이 개시되어 있다.
하지만, 본 발명의 특정 서열을 갖는 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 치쿤군야 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 치쿤군야 바이러스 검출 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머; 및 서열번호 3의 프로브; 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머; 및 서열번호 6의 프로브; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머; 및 서열번호 9의 프로브; 또는 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머; 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 프라이머 세트는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 액적 디지털 중합효소 연쇄반응(droplet digital PCR) 또는 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 프로브는 프로브는 5' 말단, 3' 말단 및 서열내부로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 형광단, 소광체 또는 테트라하이드로퓨란(THF)이 표지된 것이고, 상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 6-카르복시플루오레세인(FAM, 6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(HEX, hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(TET, tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 2-클로로-7-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인(VIC, 2-chloro-7-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), 2,7-디메톡시-4,5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE, 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein), 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산(5-((2-aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 시아닌-5(Cy5, Cyanine-5), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 야키마 옐로우(YG, Yakima Yellow), 및 칼 플루오르 레드 610(CFR, Cal Fluor Red 610)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며, 상기 소광체는 테트라메틸로다민(TAMRA, tetramethylrhodamine), 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4-maleimide), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 염료(BHQ dyes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 치쿤군야 바이러스 검출용 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 치쿤군야 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 치쿤군야 바이러스 감염증은 돌발성 발열, 다발성 관절통 및 발진으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 분리된 RNA 시료를 준비하는 단계; 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 증폭 결과를 획득하는 단계;를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 치쿤군야 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법은 주요 모기 매개 CHIKV를 진단하는 민감하고 구체적이며 신속한 프로세스를 제공하고 조기에 강력한 검출을 통해 환자의 임상 치료 가능성 향상에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 각 분석에서 캡시드(C) 단백질에 대한 기기에 따른 Cq 데이터 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 각 분석에서 엔벨로프 단백질 2(E2)에 대한 기기에 따른 Cq 데이터 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 각 분석에서 엔벨로프 단백질 2(E2)에 대한 기기에 따른 Cq 데이터 분포 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
<실시예 1> 프라이머 및 프로브 디자인
CHIKV의 게놈 서열은 Virus Pathogen Resource(VIPR; www.viprbrc.org) 데이터베이스에서 검색 및 정렬되었다. 분석을 위한 프라이머와 프로브는 캡시드 단백질(C) 유전자와 엔벨로프 단백질 2(E2) 유전자의 보존적 영역을 기반으로 설계되었다. 이중-소광제 프로브는 FAM(형광), ZEN 및 IBFQ(소광제)로 표지되었다. RPA 프로브는 제조업체의 지침에 따라 설계되었다. RPA 분석을 위한 프로브는 특정 프로브 서열 내부에 FAM(형광단), BHQ1(소광제) 및 테트라하이드로퓨란(THF) 잔기로 표지되었다. qPCR 및 ddPCR 분석용 프라이머는 Macrogen(한국)에서 합성했으며 이중 소광제 프로브는 IDT(미국)에서 합성했다. RPA 분석을 위한 프라이머와 프로브는 Biosearch Technologies, Inc.(미국)에서 합성되었다. 프라이머 및 프로브는 표 1에 나와 있다.
| Assay | Target gene |
Name | 5'-Sequence-3' | Length (bp) |
Site* | Size (bp) |
| qPCR ddPCR |
C | C_F | CAA CTT GCC CAG CTG ATC TC (서열번호 1) |
20 | 7684-7703 | 89 |
| C_R | TT CTT ATT CTT CCG ATT CYT GCG (서열번호 2) |
23 | 7750-7772 | |||
| C_P | ATA AAC TGA CAA TGC GCG YGG TAC C (서열번호 3) |
25 | 7712-7736 | |||
| E2 | E2_F | CAY GAT TGG ACC AAG CTG CG (서열번호 4) |
20 | 8725-8744 | 201 | |
| E2_R | TGG GTG CGT ACA TGA RTG AC (서열번호 5) |
20 | 8906-8925 | |||
| E2_P | TGY ACG ATT ACT GGA ACA ATG GGA CAC TTC (서열번호 6) |
30 | 8812-8841 | |||
| RPA | C | RPA_C_F | GTA CTC AGG AGG CCG RTT CAC CAT CCC TAC (서열번호 7) |
30 | 8151-8180 | 153 |
| RPA_C_R | TTC CAG GTC ACC ACC GAG AGG GCT GTA CGG (서열번호 8) |
30 | 8274-8303 | |||
| RPA_C_P | TCT TCG ACA ACA AGG GRC GCG TGG TGG CCA FHG QYT TAG GAG GAG CTA A (서열번호 9) |
49 | 8216-8264 | |||
| E2 | RPA_E2_F | GAC TGT GGA GAA GGG CAC TCG TGC CAT AGT (서열번호 10) |
30 | 8602-8631 | 161 | |
| RPA_E2_R | ATG TGR TTG TCC ATA TAA CGC AGC TTG GTC (서열번호 11) |
30 | 8733-8762 | |||
| RPA_E2_P | AAG CGA CAG ACG GGA CGY TGA AAA TCC AGG FHQ CCT TGC AAA TCG GAA (서열번호 12) |
48 | 8660-8707 |
* Genomic site are provided based on the reference sequence CHKV strain S27-African prototype (NC_004162)
<실시예 2> RNA 준비
CHIKV, DENV, ZIKV, JEV, RVFV, SFTS 바이러스의 게놈 RNA는 National Culture Collection for Pathogens에서 입수했다. genomic RNA의 strain 정보는 표 2와 같다.
| Family | Virus - Serotype | Isolation Target | Year of Isolation | Resource Number |
| Togaviridae | Chikungunya | Human serum | 2010 | NCCP 43132 |
| Flaviviridae | Dengue-1 | Human Blood | 2008 | NCCP 43252 |
| Dengue-2 | Human Blood | 2015 | NCCP 43255 | |
| Dengue-3 | Human Blood | 2015 | NCCP 43256 | |
| Dengue-4 | Human Blood | 2010 | NCCP 43257 | |
| Zika-asian | Human specimens* | 2016 | NCCP 43245 | |
| Japanese encephalitis-1 | Human specimens* | 1994 | NCCP 41303 | |
| Japanese encephalitis-3 | Human specimens* | 1989 | NCCP 41307 | |
| Japanese encephalitis-5 | Human CSF | 2015 | NCCP 43279 | |
| Japanese encephalitis-5 | Human CSF | 2015 | NCCP 43279 | |
| Phenuiviridae | Rift Valley fever virus | |||
| Rift Valley fever virus | ||||
| Rift Valley fever virus |
* Human specimens: isolation from one of human serum, urine, saliva, and semen.
<실시예 3> 진단 민감도 및 특이도
검출 한계를 위해 희석된 주형을 10-2에서 10-8까지 10배 시리즈로 삼중으로 평가했다. 검출 형식은 FAM(470nM/514nM)이었다. RT-qPCR 및 RT-ddPCR은 민감도와 정확도를 비교하기 위해 동일한 분석을 실험했다. RPA는 감도와 신속성에 대한 자체 분석을 연구했다.
분석의 특이성 분석은 RT-qPCR 및 RT-RPA 분석으로 수행되었다. CHIKV의 바이러스 RNA는 양성으로, DENV, ZIKV, JEV, RVFV, SFTS 바이러스는 음성으로 사용했다. DENV, ZIKV, JEV, RVFV, SFTS 바이러스 특이적 분석을 동일한 실행에서 사용하여 바이러스가 분해되지 않았음을 확인했다.
<실시예 4> 실시간 RT-qPCR 분석
One-step RT-qPCR은 One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit(Perfect Real Time, TaKaRa, Japan)를 사용하여 평가되었다. 20 μl의 단일 반응은 템플릿 2 μl, assay mix 3 μl, 2X One Step RT-PCR Buffer III 10 μl, TaKaRa Ex Taq HS (5U/ μl) 0.4 μl, PrimeScript RT enzyme Mix II 0.4 μl 및 nuclease-free water로 구성된다. StepOne에 대한 반응에는 0.4μl의 ROX Reference Dye가 추가로 포함되었다. 프로그램 조건은 다음과 같다. 5분 동안 42℃(역전사); 95℃에서 10초(초기 변성); 95℃ 10초(변성) 및 60℃ 35초(어닐링/신장)의 40 사이클러. 프로토콜은 기기 유형에 따라 차등 PCR 조건을 알려주지만 하나의 PCR 조건을 3개의 기기로 통합했다. 검출 형식은 정량 계수가 10.00인 FAM으로 설정되었다.
실험은 3개의 실시간 정량 기기 및 호환 소프트웨어로 수행 및 분석되었다. LightCycler® 96(Roche, Switzerland) 및 LightCycler® 96 소프트웨어(버전 1.1); CFX96TM 실시간 시스템(BioRad Laboratories, USA) 및 CFX Maestro Software(버전 1.0); StepOne™ Real-Time PCR System(Applied Biosystems™, USA) 및 StepOne™ 소프트웨어(버전 2.3). 따라서, 원시 데이터(즉, cycle threshold(Ct))를 Microsoft Excel(2016)로 내보내 표준 곡선을 설정했다.
<실시예 5> 액적 디지털 PCR(ddPCR) 분석
1단계 RT-ddPCR 반응의 부피는 2 μl의 템플릿, 3μl의 assay mix(최종 농도 0.2μM), 5 μl의 프로브용 ddPCR 슈퍼믹스, 1 μl의 300mM DTT, 2 μl의 역전사 효소 및 멸균 증류수 7 μl로 구성되었다.
모든 유효한 사본 수는 제조업체의 지침에 따라 동적 범위(10-2에서 10-8 희석)에서 선택되었다. ddPCR 실험은 QX200 시스템(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 원시 데이터는 처음에 QuantaSoft 소프트웨어(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 분석되었다. 그 후, 데이터(즉, 액적에 대한 형광 값)를 QuantaSoft 소프트웨어에서 Microsoft Excel로 내보냈다. 객관적인 분리 값 k는 임계값에 의한 양수 및 음수 액적의 분리에 따라 계산되었다.
<실시예 6> 실시간 RPA 분석
TwistAmp® exo kit(TwistDx™ Inc., England) 및 SuperScript IV Reverse Transcriptase(Invitrogen, USA)를 사용하여 1단계 RPA 분석을 수행했다. single-plex용 반응혼합물은 각각의 primer 2.1μl(10μM), RPA exo probe 0.6μl(10μM), primer free rehydration buffer 29.5μl, 멸균증류수 11μl 및 enzyme powder tube (tube당 단일 반응)로 설정하였다. 2μl의 템플릿, 0.2μl의 역전사효소 및 2.5μl의 마그네슘 아세테이트 용액(MgOAc, 280mM)을 추가하여 샘플당 최종 반응 부피를 50μl로 만들었다. MgOAc를 첨가한 직후에 RPA 반응이 시작되기 때문에 MgOAc를 튜브의 뚜껑에 첨가한 다음 스핀다운하여 동시에 반응을 시작하였다. 실시간 정량 기기에 튜브를 신속하게 배치했다. 총 20분의 실행 시간은 40초의 30 사이클을 프로그래밍하여 설정되었다. Roche 96 기기는 해당 시간 데이터를 제공할 수 없으므로 시간 데이터는 Cq 값을 기준으로 계산되었다.
<시험예 1> 분석의 설계 및 최적화
CHIKV 특이적인 실시간 RT-qPCR 분석의 개발을 위해 여러 프라이머-프로브 세트가 설계되었다. 두 개의 프라이머-프로브 세트가 C 분석을 위해 설계되었다. 그러나 4개의 프로브가 있는 24개의 프라이머 조합이 E2 분석을 위해 스크리닝되었다. 모든 조합은 비표적 대역의 부재, 기존 PCR 및 실시간 PCR에 의한 배경 신호를 조사했다. 마지막으로, 각 표적에 대해 선택된 프라이머의 조합을 추가 실험에 사용했다. CHIKV에 대한 적용 범위 수준을 확인하기 위해 모든 737개의 CHIKV 전체 게놈과 일치하는 프라이머-프로브 서열을 매치했다. 게놈 서열의 'N' 또는 축퇴 염기는 분석으로 검출 가능한 것으로 간주된다. C 분석은 737개 게놈의 93.62% 범위를 가지며 E2 분석은 93.89% 범위를 갖는다. 일반적으로 두 분석 모두 높은 변동성으로 인해 단 14개의 게놈을 포함하는 WA 계통에서 감지할 수 없다.
CHIKV 특이적 RPA 분석법의 개발을 위해 각 엑소 프로브는 보존된 C 및 E2 유전자 영역에서 설계되었다. 여러 정방향 및 역방향 프라이머가 프로브 근처에 설계되었다. C에 대한 8개의 정방향 및 7개의 역방향 프라이머; E2의 경우 7개의 정방향 및 6개의 역방향. 프라이머의 모든 조합은 기본 RPA 프로토콜 및 실시간 RPA 분석에 의해 테스트되어 다량의 비표적 밴드 또는 강한 배경 신호를 나타내는 후보를 트리밍했다. 그 후, 다음 실험을 위해 각 타겟의 두 가지 선택된 조합을 수행했다. RPA 프라이머-프로브 디자인 가이드라인에 따르면 프라이머와 프로브는 최대 9개의 변성 염기를 커버할 수 있다. 즉, 각 프라이머와 프로브에서 5-9개의 염기쌍 불일치가 RPA 성능에 영향을 미치지 않는다. 이러한 이유로 RPA에 대한 설계는 737개의 게놈을 모두 포함할 수 있다.
<시험예 2> 이중 소광제 분석의 감도를 위한 연속 희석 분석
이중 소광제 분석의 감도를 확인하기 위해 4개의 진단 기기를 사용하여 RT에서 동일한 연속 10배 희석 RNA(10-2 ~ 10-8)를 검사했다. 실시간 검출 기기(LC96, StepOne 및 CFX96)에서 정량 값(Cq)을 관찰하고 디지털 액적 PCR 장비(QX200)에서 복사 수를 관찰했다. 데이터는 3회의 반복에서 얻었고 표 3에 나와 있다. 3개의 기기(LC96, StepOne, CFX96)는 각 분석에서 유사한 한계 수준(CHIKV의 10-6 희석)까지 검출했다. CFX96을 사용한 C 분석에서 10-7 희석의 삼중(표 3 참조) 중 하나만 검출되었지만 진단적으로 의미가 없다. 결과는 모든 장비에서 C 분석이 약 6-7 사본/μl의 CHIKV(반응 중 12-14 사본)를 감지할 수 있고 E2 분석이 약 1-2 사본/μl의 CHIKV(반응 중 2-4 사본)를 감지할 수 있음을 보여주었다. 도 1 및 2는 각 분석에서 기기에 따른 Cq 데이터 분포를 나타낸다. C 분석에서, 10-6 희석의 모든 삼중은 RT-qPCR 및 ddPCR 모두에서 검출되었다. 그러나 E2 assay에서는 모든 RT-qPCR과 ddPCR에서 10-6 dilution 3중 2개가 검출되었다.
| Assay | C | E2 | ||||||||
| Real-Time PCR | ddPCR* | RPA | Real-Time PCR | ddPCR* | RPA | |||||
| Dilution Factor | LC96 | StepOne | CFX | QX200 | LC96 | StepOne | CFX | QX200 | ||
| -2 | 19.77 | 20.19 | 21.18 | Sb | 8m 10s | 19.96 | 18.40 | 20.79 | Sb | 5m 13s |
| -3 | 24.21 | 24.74 | 25.47 | 31440.00 | 12m 18s | 24.22 | 22.63 | 25.36 | 5100.00 | 8m 2s |
| -4 | 28.08 | 28.64 | 29.19 | 2723.33 | - | 28.15 | 26.67 | 28.83 | 523.00 | 13m 21s |
| -5 | 32.88 | 34.10 | 34.55 | 194.67 | - | 33.69 | 33.54 | 34.93 | 35.33 | - |
| -6 | 37.03 | 36.63 | 37.08 | 16.33 | - | 36.10 | 36.83 | 36.85 | 1.70 | - |
| -7 | - | - | 39.53c | 0.67 | - | - | - | - | 0.27 | - |
| -8 | - | - | - | 0.43 | - | - | - | - | 0.43 | - |
| R2 | 0.9992 | 0.9911 | 0.9851 | 0.9902 | 0.9892 | 0.9827 | ||||
aLog value of dilution ratio
bSaturation ; template amount is too high.
*ddPCR indicate the copy numbers in 1 ul of loading template.
cone
<시험예 3> RPA 분석의 분석 민감도
바이러스 RNA의 동일한 유효한 희석 시리즈(10-2 ~ 10-8)를 RPA용 Roche 기기에서 평가했다. Roche96은 시간에 대한 원시 데이터를 제공하지 않으므로 Cq 값을 기반으로 시간 값을 계산했다. 예를 들어, 10.5의 Cq 데이터는 5분 15초의 시간 데이터로 전송된다. 이런 식으로 먼저 3개의 복제에서 Cq 값을 얻은 다음 Cq 값에서 시간 데이터를 얻는다. 결과는 표 3에 나와 있다. E2 분석은 20분 내에 523 사본/μl의 CHIKV를 감지할 수 있지만 C 분석은 1000 사본 μl의 CHIKV 미만에서 감지할 수 없었다. RPA의 감도 능력은 qPCR 분석보다 상당히 감소하였다.
<시험예 4> 분석 특이성
특이성 분석은 RNA가 있는 Roche에서만 평가되었다. 모든 이중 소광제 분석 및 RPA 분석에서 DENV, ZIKV, JEV, RVFV와의 교차 반응성은 관찰되지 않았다.
<시험예 5> 고찰
치쿤군야병은 특정 백신과 치료법이 없는 100만 건 이상의 사례를 보고했지만 대부분의 환자는 낮은 사망률로 진통제와 항염증제로 치료를 받았다. 그러나 기후 변화나 바이러스 돌연변이 등의 측면에서 재발 가능성이 높아지고 있다. CHIKV의 실험실 진단은 매개체와 발병을 통제하는 데 중요한 역할을 한다. 본 발명에서는 신뢰할 수 있고 정확한 진단을 위해 RT-qPCR 분석법을 개발했다. 이 연구를 위한 프라이머와 프로브는 ViPR의 데이터베이스(www.viprbrc.org)에 존재하는 전체 게놈 서열의 정렬에 따라 선택되었다. 프라이머와 프로브의 구체적이고 효과적인 조합을 구성하고 CHIKV의 C 및 E2 유전자의 보존 영역에서 평가했다. 이 연구에서 개발된 프라이머와 프로브 세트는 CHIKV의 매우 안정적이고 특이적인 RT-PCR 및 RT-dPCR 검출의 개발에 중요하고 필수적이다. 본 발명의 결과는 실시간 RT-qPCR 및 RT-ddPCR에서 매우 정확하고 민감한 검출 능력을 보여주었다. 연구의 목적은 바이러스의 진행을 적시에 제한하고 환자에 대한 더 나은 치료를 예측해야 할 수 있는 CHIKV 감염을 교정하고 신속하게 감지하는 것이다. 본 발명에서는 상업적으로 이용 가능한 qPCR 및 dPCR 장비를 사용하여 CHIKV의 특이적이고 민감한 검출에 대한 다양한 진단 분석을 평가했다. CHIKV의 C 및 E2 유전자를 표적으로 하는 진단 분석은 사용된 모든 PCR 장비와 거의 유사한 경향을 반영했다. 그러나 CHIKV의 E2 assay에서는 예외가 관찰되었는데, StepOne은 다른 것보다 약간 큰 분산을 보였다. StepOne은 정규화를 위해 ROX 참조 염료가 필요한 반면 Roche96 및 CFX96은 필요하지 않기 때문일 수 있다. 더욱이, dPCR은 C 및 E2 유전자 분석에서 우수한 효능을 보였고(표 3), CHIKV C 및 E2 유전자의 매우 낮은 카피 수도 검출할 수 있었다. 또한 현장 사용에서 CHIKV의 신속한 검출을 위한 RPA 분석도 개발했다. 그러나 결과는 우리의 기대에 부응하지 못했다. Pranav Patel et al. nsp1 표적 RPA 분석을 보고했으며 15분 실행 시간에 CHIKV 바이러스 RPA의 게놈 사본 80개를 탐지했다[31]. 그러나 본 발명에서는 CHIKV의 C 및 E2 유전자를 모두 사용하여 RPA 분석을 개발했으며, 이는 E2 유전자에 대해 15분 이내에 최대 500개 사본 수까지 비교적 낮은 바이러스 부하를 감지할 수 있다(표 3). RPA가 현장에서 사용하기에는 여전히 많은 도전 과제가 있다고 생각된다.
요약하면, 매우 신뢰할 수 있고 특정한 1단계 RT-qPCR 및 RT-dPCR 분석이 개발되었고 다른 qPCR 기계로 평가되었다. 이러한 분석은 임상 실험실이 주요 모기 매개 CHIKV를 진단하는 민감하고 구체적이며 신속한 프로세스를 제공하고 조기에 강력한 검출을 통해 환자의 임상 치료 가능성을 향상시킨다.
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Claims (12)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머; 및 서열번호 3의 프로브;
서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머; 및 서열번호 6의 프로브;
서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머; 및 서열번호 9의 프로브; 또는
서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머; 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트 - 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 액적 디지털 중합효소 연쇄반응(droplet digital PCR) 또는 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification)에 사용하기 위한 것인 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단, 3' 말단 및 서열내부로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 형광단, 소광체 또는 테트라하이드로퓨란(THF)이 표지되는 것인 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트
- 제3항에 있어서, 상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 6-카르복시플루오레세인(FAM, 6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(HEX, hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(TET, tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 2-클로로-7-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인(VIC, 2-chloro-7-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), 2,7-디메톡시-4,5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE, 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein), 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산(5-((2-aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 시아닌-5(Cy5, Cyanine-5), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 야키마 옐로우(YG, Yakima Yellow), 및 칼 플루오르 레드 610(CFR, Cal Fluor Red 610)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트
- 제3항에 있어서, 상기 소광체는 테트라메틸로다민(TAMRA, tetramethylrhodamine), 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4-maleimide), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 염료(BHQ dyes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 치쿤군야 바이러스 검출용 프라이머 세트
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출용 조성물
- 제6항에 있어서, 치쿤군야 바이러스 검출용 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인 치쿤군야 바이러스 검출용 조성물
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 치쿤군야 바이러스 감염증 진단용 조성물
- 제8항에 있어서, 상기 치쿤군야 바이러스 감염증은 돌발성 발열, 다발성 관절통 및 발진으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 치쿤군야 바이러스 감염증 진단용 조성물
- 제8항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 치쿤군야 바이러스 감염증 진단용 조성물
- 분리된 RNA 시료를 준비하는 단계;
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
증폭 결과를 획득하는 단계;를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출방법 - 제11항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 치쿤군야 바이러스 검출방법
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| KR20110118176A (ko) | 2009-02-25 | 2011-10-28 | 빅텍 프라이빗 리미티드 | 치쿤군야의 검출을 위한 프로브 및 프라이머 |
| KR102030245B1 (ko) | 2017-10-12 | 2019-10-08 | 고려대학교 산학협력단 | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Patent Citations (2)
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