KR102297191B1 - RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 2019-신규 코로나바이러스 (2019-nCoV 또는 SARS-CoV-2) 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트, 프로브, 상기 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다.

Description

RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트 {Primers specifically binding to RdRp gene for detecting SARS-CoV-2 and kit comprising the same}
본 발명은 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 2019-신규 코로나바이러스 (2019-nCoV 또는 SARS-CoV-2) 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트, 프로브, 상기 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다.
2019-신규 코로나바이러스 (2019-nCoV)는 2019년 12월 31일에 처음으로 보고되었다. 중국 정부는 WHO에 후베이성 우한의 화난 어시장에서 다수의 환자에서 원인이 알려지지 않은 호흡기 폐렴이 발생한 것으로 보고하였다. 화난 어시장에서 시작된 이 바이러스는 인간에서 인간으로의 전염을 통해 지역 사회 감염을 넘어 전세계로 빠르게 퍼져갔다. 이 신규 바이러스는 우한 위생국에서 코로나바이러스로 발표되었고, 이의 유전자는 2020년 01월 07일에 SARS-Cov 또는 MERS-Cov가 아닌 호흡기 감염을 일으키는 새로운 종의 코로나바이러스인 것으로 발표되었다. WHO는 이를 "2019-신규 코로나바이러스(2019 nCov)"로 명명하였다. BetaCov에 속하는 SARS-Cov (B 계통) 및 MERS-Cov (C 계통)는 급성 호흡기 증상을 특징으로 하는 심각한 호흡기 전염병을 유발한다. SARS-Cov 및 MERS-Cov와 관련된 사망률은 각각 최대 10% 및 35%이다. COVID-19 초기 단계에서 우한의 이형 폐렴 환자로부터 분리된 유전체 서열은 박쥐 SARS-유사-CoVZXC21에 89%의 뉴클레오티드 상동성을 가지며 SARS-CoV에 대해 82%의 상동성을 갖는 것으로 분석되었고, 동일한 betaCoV에 속하는 것으로 밝혀졌다. 이의 명칭은 SARS-CoV-2이다.
HCoV는 일반적으로 양성 (positive-sense)의 매우 긴 (30,000bp) 단일 가닥 RNA 바이러스이다. HCoV는 스파이크 (Spike; S), 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid; N), 매트릭스 (Matrix; M) 및 막 (Envelope; E)과 같은 구조 단백질과 RNA 의존성 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase; RdRp 또는 nsp12)와 같은 비구조 단백질의 두 가지 단백질 그룹을 특징으로 한다.
S 단백질에는 S1, S2 및 S2'단백질이 있다. S1 단백질은 숙주 수용체와 상호 작용하여 세포막에 비리온을 부착시켜 감염을 시작한다 (유사성에 의함). 인간 ACE2 및 CLEC4M/DC-SIGNR 수용체에 대한 결합 및 숙주 세포의 엔도솜 내로의 바이러스 내재화는 S 당단백질의 입체 구조 변화를 유도한다. 카텝신 CTSL에 의한 단백질 분해는 S2의 융합 펩티드를 드러내게 하고 엔도솜 내의 막 융합을 활성화시킬 수 있다.
S2 단백질은 클래스 I 바이러스 융합 단백질로 작용함으로써 비리온 및 세포막의 융합을 매개한다. 현재 모델에서, 단백질은 적어도 3개의 입체 형태를 갖는다: 전-융합 천연 상태 (pre-fusion native state), 전-헤어핀 중간 상태 (pre-hairpin intermediate state), 및 후-융합 헤어핀 상태 (post-fusion hairpin state). 바이러스 및 표적 세포막 융합 동안, 코일형 코일 영역 (7번 반복; heptad repeats)은 헤어핀 삼량체 구조 (trimer-of-hairpins structure)를 가정하여, 융합 펩티드를 엑토도메인 (ectodomain)의 C-말단 영역에 근접하게 위치시킨다. 이 구조의 형성은 바이러스 및 표적 세포막의 부착 (apposition) 및 후속 융합을 유도하는 것으로 보인다.
S2' 단백질은 바이러스 세포내이입 (endocytosis) 시 발생하는 S2 절단 후 드러나는 바이러스 융합 펩티드로 작용한다.
N 단백질은 양성 가닥 바이러스 유전체 RNA를 나선형 (helical) 리보뉴클레오캡시드 (RNP)로 포장하고 (package), 바이러스 유전체와 막 단백질 M과의 상호 작용을 통해 비리온 (virion) 조립 동안 기본 역할을 수행한다. 하위 유전체 (subgenomic) 바이러스 RNA 전사 및 바이러스 복제의 효율을 향상시키는데 중요한 역할을 한다.
RdRp는 코로나바이러스를 포함한 RNA 바이러스의 생활 주기에 중요한 효소로, RdRp 활성 부위는 고도로 보존되어 베타-턴 (beta-turn) 구조로부터 돌출된 2개의 연속적인 아스파르테이트 (Aspartate)를 나타내고 뉴클레오티드 채널을 통해 (유리 뉴클레오티드가 이를 통해 통과할 수 있음) 이들을 표면에 접근 가능하게 한다.
COVID-19의 전염병이 시작되고 유전자 서열이 공개됨에 따라, WHO는 SARS-CoV-2의 분자 진단을 공유하였다. 분자 진단을 위해, 대부분의 국가와 기관은 실시간 PCR (Real-time PCR; RT-qPCR)을 사용하고 있으며, 현재 미국 질병통제예방센터 (Centers for Disease Control and Prevention; CDC)에서는 N 유전자에 대한 3종의 프라이머-프로브 세트를 제공하고 있다 (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html).
그러나, SARS-CoV-2를 표적하는 qRT-PCR 어세이는 몇 가지 주의사항이 있다. 첫 번째로, SARS-CoV-2와 SARS-Cov의 높은 유사성으로 인해, 프라이머-프로브 세트가 교차반응 할 수 있다는 것이며, 두 번째로, 어세이의 민감도가 입원 후 초기에 의심스러운 환자를 확인하기에 충분하지 않을 수 있다는 것이다. 또한, 인간에서 인간으로의 전염이 쉽게 발생하고 빠르게 감염이 증가하고 있는 만큼, 보다 민감하고 조기에 진단 가능한 프라이머-프로브 세트의 개발이 요구되고 있다.
관련 기술분야의 종래 기술로는 인간 코로나바이러스 계통인 HCoV-229E 및 HCoV-OC43와 구분하여 SARS-CoV의 존재를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 세트가 미국공개특허 US 2010/0279276호에 공개된 바 있다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, SARS-CoV-2를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및/또는 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 SARS-CoV-2 검출용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출방법을 제공한다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는, SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 14106 내지 14241의 영역, 위치 13963 내지 14119의 영역, 위치 14177 내지 14283의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 10 및 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트, 또는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 10 및 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 각가 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, SARS-CoV-2의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는, SARS-CoV-2 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 서열번호 9, 12 또는 15의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 서열번호 9, 12 또는 15의 뉴클레오티드 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 각각 5'-말단에 FAM, CAL Fluor Orange 560, VIC, HEX, JOE, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 NFQ-MGB, BHQ-1 BHQ1 nova 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지될 수 있다.
추가로, 본 발명은 전술한 프라이머 세트 및/또는 프로브를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 이를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 SARS-CoV-2의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 22363 내지 22488의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 SARS-CoV-2의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 29422 내지 29514의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 16 및 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, E 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 내부 대조군 (internal control)으로 인간 RPP30 (RNase P) 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 인간 RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 Taq DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 교차 오염 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용할 수 있다.
추가로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA에 전술한 키트를 처리하여 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 실시간 PCR (Real-time PCR)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SARS-CoV-2 검출방법은 (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 높은 검출 민감도 (RdRp 유전자: 6 카피/rxn, N 유전자: 2~3 카피/rxn 및 E 유전자: 6 카피/rxn)로 SARS-CoV-1 및 MERS-CoV을 포함한 31종의 다른 바이러스 및 유기체 (organism)에 대해 교차 반응 없이 SARS-CoV-2만을 특이적으로 검출할 수 있다 (다만, 예외적으로 E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-1에 대해 교차 반응성을 나타냄). 또한, 3% 미만의 Ct 값의 CV로 높은 재현성을 나타내고, 단일 튜브에서 단일 단계의 멀티플렉스 RT-qPCR로 쉽고 빠르게 SARS-CoV-2를 검출할 수 있으며, UNG (우라실-DNA N-글리코실라아제) 시스템을 사용하여 교차 오염 (Carry-over contamination)을 방지할 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2의 S 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여 상기 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브로 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control).
도 2는 SARS-CoV-2의 N 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여 상기 N 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브로 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control).
도 3 내지 5는 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여 상기 RdRp 유전자에 특이적인 3종의 프라이머 세트 및 프로브로 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control), 도 3은 서열번호 7 내지 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 결과이고 (Set 1), 도 4는 서열번호 10 내지 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 결과이며 (Set 2), 도 5는 서열번호 13 내지 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 결과이다 (Set 3).
도 6은 SARS-CoV-2의 E 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여 상기 E 유전자를 검출하는 프라이머 세트 및 프로브로 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control).
상술한 바와 같이, 현재 대부분의 국가와 기관은 SARS-CoV-2의 분자 진단을 위해 실시간 PCR (Real-time PCR; RT-qPCR)을 사용하고 있으나, SARS-CoV-2와 SARS-Cov의 높은 유사성으로 인해, 프라이머-프로브 세트가 교차반응 할 수 있고, 민감도가 입원 후 초기에 의심스러운 환자를 확인하기에 충분하지 않을 수 있다는 문제점이 제기되고 있다.
이에, 본 발명자들은 SARS-CoV-2의 RdRP 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 고안하여 6 카피/rxn의 높은 민감도를 가지고 SARS-CoV-1과의 교차 반응성을 나타내지 않는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 개발하고 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 제1 측면은 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트 및/또는 프로브에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오티드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오티드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오티드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오티드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오티드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 세트"는 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는, SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 NCBI 접근번호 NC_045512에 공지된 SARS-CoV-2 유전체 (genome) 서열의 위치 14106 내지 14241의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열 내의 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 10 및 11의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 10 및 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는, SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브와 함께 사용된다.
본 발명에서 용어 "프로브"란 상보적인 염기서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지되어 (labeling) 있으므로 특정 염기서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 소광물질 (quencher)로 표지한 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응액에 첨가한다. 또한, 사이클링 (Cycling) 프로브를 이용한 실시간 PCR은 RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 프로브와 RNAse H로 구성된 고감도의 검출방법이다. 이 역시 프로브의 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 소광물질로 표지한다.
프로브는 증폭 과정 동안 정방향 및 역방향 프라이머 사이에 위치한 특정 표적 서열에 어닐링되며, PCR 사이클의 연장 단계 (extension phase) 동안 Taq 중합효소의 5'뉴클레아제 활성에 의해 절단되어 형광물질 (리포터 염료)이 소광물질 (소광 염료)로부터 분리되어 형광 강도가 증가된다. 형광 강도는 실시간 PCR 시스템에 의해 각 PCR 사이클에서 모니터링될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 내의 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열 내의 23개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면은 전술한 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및/또는 프로브를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및/또는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트에 있어서, 서열번호 7 내지 9의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 및 프로브 (Set 1), 서열번호 10 내지 12의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 및 프로브 (Set 2) 및 서열번호 13 내지 15의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 및 프로브 (Set 3)는 각각 SARS-CoV-2 검출에 있어서 유사한 수준의 검출 한계 (LoD)를 나타내며, 표 9의 31종의 병원체에 대해 교차 반응을 나타내지 않는다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 SARS-CoV-2의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트에 있어서, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 22363 내지 22488의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 내의 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 내의 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상 또는 25개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 내의 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 SARS-CoV-2의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트에 있어서, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 29422 내지 29514의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 SAR-CoV-1과 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트에 있어서, SAR-CoV-1과 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 26272 내지 26382의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 16 및 17의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 16 및 17의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열 내의 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상 또는 27개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 내부 대조군 (internal control)으로 인간 RPP30 (RNase P) 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19및 20의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열 내의 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 또한 다음과 같은 대조군을 포함할 수 있다:
1) 음성 대조군 (No Template Control, NTC)은 어세이 실행 시 오염 가능성을 제거하기 위해 필요하며, 모든 어세이에 사용된다. 이러한 NTC는 분자 등급 (molecular grade), DNase 및 RNase-무첨가 수(water)이다.
2) 양성 주형 대조군 (positive template control)은 어세이가 의도한대로 수행되었는지 확인하기 위해 필요하며, 300 카피 /μL 농도로 마스터 믹스 첨가에서 시작하는 모든 어세이에 사용된다. 양성 대조군은 플라스미드 혼합물 (RdRp, S, N, E 및 RNase P)로 구성된다.
3) RNase P를 표적하는 내부 대조군 (RPP30)은 모든 시료에 핵산이 존재하는지 확인하기 위해 필요하며, 처리된 모든 시료에 사용된다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단용 키트 및 진단용 조성물은 역전사 반응 및 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 키트는 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 SARS-CoV-2의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 키트는, 예를 들어, 표 1과 같이 구성될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
구성 주요 성분 양
100회 테스트 1,000회 테스트
2X One-step RT-qPCR MMX 버퍼, dNTP w/dUTP, UNG, 역전사 효소, RNase 억제제, Taq DNA 중합효소 1,000μL/튜브×1 10 mL/병×1
10X 프라이머/
프로브 믹스		 - RdRP, S, N 유전자 : SARS-CoV-2 특이적
- E 유전자 : SARS-CoV-1/2 공통
- RPP30 (RNase P) 유전자 : 내부 대조군		 200μL/튜브×1 1 mL/튜브×2
SARS-CoV-2
양성 대조군		 RdRP, S, N, E 및 RNase P 플라스미드의 혼합물 50μL/튜브×1 0.5 mL/튜브×1
뉴클레아제
무첨가 수 		PCR 등급 수 (water) 500μL/튜브×1 5 mL/병×1
본 발명의 키트는 개별 튜브에 제공된 모든 시약을 포함하며, 이들 시약은 어세이 전에 첨가된다. 예시적인 검출 정보는 표 2와 같다.
형광 신호
FAM VIC CY5
SARS-CoV-2 특이적 SARS-CoV-1/2 공통 내부 대조군 (IC)
RdRp 유전자
S 유전자
N 유전자		 E 유전자 RPP30 (RNase P) 유전자
본 발명의 키트는 교차 오염 (carryover contamination) 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용할 수 있다.
PCR은 매우 높은 감도의 검출 방법이므로, 앞서 진행한 PCR 증폭산물의 교차 오염에 의해 위양성 (false positive)이 생기는 경우가 있다. dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 사용하면, 이러한 오염(carryover)에 의한 위양성 반응을 방지할 수 있어 검사의 신뢰성을 올릴 수 있다. 구체적으로, 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템은 dTTP 대신에 dUTP를 포함한 dNTP 혼합물을 기질로 사용하여, 티민 대신 우라실을 포함한 증폭산물을 만들어낸다. 만약 이 증폭산물이 교차 오염이 되었더라도, 다음 반응 전에 우라실-N-글리코실라아제 (UNG)로 처리한 후 PCR 반응을 하게 되면, 오염된 증폭산물은 분해되고 우라실을 포함하지 않는 검체 유래의 DNA만 남아 PCR 반응의 주형이 된다. 따라서, 반복적인 PCR에 의한 교차 오염을 방지할 수 있게 된다.
본 발명의 키트는 생체 외 진단용 (In-Vitro Diagnostic, IVD)으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 키트는 SARS-CoV-2 감염으로 인한 질환, 예를 들어 폐렴 진단에 적용될 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA에 본 발명의 키트를 처리하여 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법에 사용되는 키트는 각각 SARS-CoV-2의 S, N 및 RdRp 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
예를 들어, 각 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 단독으로 포함하거나, S, N 및 RdRp 유전자 중 2개 또는 3개의 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 포함할 수 있다. 표 10 및 11에서 확인되는 바와 같이, 각 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 2~6 카피/rxn의 LoD (RdRp 유전자: 6 카피/rxn, N 유전자: 2 카피/rxn 및 E 유전자: 6 카피/rxn)를 나타내어, 높은 민감도로 SARS-CoV-2를 검출할 수 있고, 표 12에서 확인되는 바와 같이 SARS-CoV-1 및 MERS-CoV을 포함한 31종의 다른 바이러스 및 유기체 (organism)에 대해 교차 반응 없이 SARS-CoV-2만을 특이적으로 검출할 수 있다.
따라서, 각 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 단독으로 사용하더라도, SARS-CoV-2를 높은 민감도로 다른 바이러스 및 유기체 (organism)에 대해 교차 반응 없이 검출할 수 있으며, 3개의 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 다양한 조합으로 사용하는 경우, SARS-CoV-2 검출 또는 SARS-CoV-2 감염 진단의 정확도를 높일 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, SARS-CoV-2를 검출하고자 하는 시료 또는 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단하고자 하는 개체로부터 분리된 SARS-CoV-2의 RNA를 포함할 수 있는 생물학적 시료라면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단하고자 하는 개체는 척추동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체일 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법은 실시간 PCR (Real-time PCR)로 수행될 수 있다.
상기 "실시간 PCR"은 PCR을 수행할 때 실시간으로 그 과정을 모니터링할 수 있다. 따라서, 데이터는 PCR이 종료되는 시점이 아니라, PCR 과정 전반에 걸쳐 수집된다. 실시간 PCR에서, 반응은 고정된 사이클 수 후에 축적된 표적 양보다는 증폭이 처음으로 검출될 때의 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 주로 염료 기반 검출 및 프로브 기반 검출의 두 가지 방법이 정량적 PCR을 수행하는데 사용된다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법은 (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 염료의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 염료의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다 (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 소광물질(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 소광물질(NFQ))을 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오티드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오티드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 소광물질에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 소광물질에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광물질에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 소광물질 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YOPRO TM-1 (509), YOYO TM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green TM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
적합한 리포터-소광물질 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 TaqMan 프로브를 의미한다.
MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신(netropsin), 디스타마이신 (distamycin), 렉시트롭신 (lexitropsin), 미트라마이신 (mithramycin), 크로모마이신 (chromomycin) A3, 올리보마이신 (olivomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 시비로마이신 (sibiromycin), 펜타미딘 (pentamidine), 스틸바미딘 (stilbamidine), 베레닐 (berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC (N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오티드)의 이용을 가능하게 해준다.
또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다. 따라서, 본 발명의 프로브는 TaqMan MGB-컨쥬게이트 형태일 수도 있으며, 이때 프로브의 길이는 15-30개의 뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 방법에 있어서, 양성 대조군 및 음성 대조군에 대한 예시적인 결과 해석은 아래 표 3과 같다.
FAM VIC CY5 결정
양성 대조군 25 ≤ Ct ≤ 31 25 ≤ Ct ≤ 31 27 ≤ Ct ≤ 33 유효
음성 대조군 검출되지 않음 검출되지 않음 검출되지 않음 무효
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 방법에 있어서, 각 유전자에 대한 컷-오프 (Cut-off) Ct 값에 따른 예시적인 결과 해석은 표 4 및 5와 같다.
임상 시료에서 각 표적의 컷-오프 Ct 값
유효 결과 결정 컷-오프 Ct 값 결정
컷-오프 Ct 값 RpRd 유전자
N 유전자
S 유전자
E 유전자		 ≤40 양성
>40 또는 N/A 음성
케이스 1 케이스 2 케이스 3 케이스 4
IC (CY5) +/- +/- + -
E 유전자 +/- + - -
S+N+RdRP 유전자 + - - -
결과 해석 양성
(SARS-CoV-2 검출)		 음성 (SARS-CoV-2 비검출,
사르베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출)		 음성 무효
본 발명의 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출 방법은 표 6의 31종의 병원체에 대해 교차 반응을 나타내지 않는다. 다만, E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 예외적으로 SARS-CoV-1에 대해 교차 반응성을 나타낸다.
동일한 유전자 패밀리로부터 다른 높은 우선 순위의 병원체 순환 영역 (circulating area)에서 높은 우선 순위의 유기체
Human coronavirus 229E Human Adenovirus 1
Human coronavirus OC43 Human Adenovirus 3
Human coronavirus HKU1 Human Cytomegalovirus
Human coronavirus NL63 Human rhinovirus B14
SARS-coronavirus Human parainfluenza virus 1
MERS-coronavirus Human parainfluenza virus 2
Human parainfluenza virus 3
Influenza A virus (H1N1)
Influenza A virus (H3N2)
Influenza B virus
Human respiratory syncytial virus A
Human respiratory syncytial virus B
Human Rhinovirus A1
Coxsackie virus (B3)
Echovirus (E6)
Mumps virus (H)
Measles virus
Streptococcus pyogenes
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumonia
Legionella pneumophila
Mycobacterium Tuberculosis
Mycobacterium Avium
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
프라이머 및 프로브의 제작
SARS-CoV-2를 특이적으로 검출하는, S, N 및 RdRp 유전자를 표적하는 프라이머와 프로브, SARS-CoV-1/2 공통인 E 유전자를 표적하는 프라이머와 프로브 및 내부 대조군으로 사용하기 위한 RPP30 (RNase P) 유전자를 표적하는 프라이머 및 프로브를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램과 Multiple primer analyzer (https://www.thermofisher.com/kr/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html) 를 이용하여 프라이머 크기, Tm값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부, 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성, 프라이머 간의 homo-dimer, hetero-dimer 형성 가능성을 배제한 후 표 7에 나타난 바와 같이 프라이머를 디자인하였다.
디자인된 프라이머는 BLAST 분석 (Nucleotide BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통해 해당서열이 검출하고자 하는 SARS-CoV-2에 특이적인 것을 확인하였으며, 표 6의 병원체를 포함한 NCBI 데이터베이스의 서열에 대한 교차반응 가능성이 없음을 확인하였다. 다만, E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 예외적으로 SARS-CoV-1에 대해 BLAST 결과가 도출되었다.
서브세트 표적 영역 프라이머/ 프로브 서열 (5'-3') 서열 번호 Ref. 유전체 (NC_045512)에서의 영역
SARS-CoV-2 특이적 프라이머 S S_F1 GGG TTA TCT TCA ACC TAG GAC TTT TC 1 22363-22488
S_R1 TCT ACA GTG AAG GAT TTC AAC GTA C 2
S_FAM1 CTG TGC ACT TGA CCC TCT CTC AGA AA 3
N N_F2 GCA GAG ACA GAA GAA ACA GCA A 4 29422-29514
N_R2 GCA CTG CTC ATG GAT TGT T 5
N_FAM2 CTT CCT GCT GCA GAT TTG GAT GAT T 6
RdRp
(Set 1)		 RdRp_F1 CAT ACA AAC CAC GCC AGG TAG T 7 14106-14241
RdRp_R1 CTT AAT GTA AGG CTT TGT TAA GTC AGT G 8
RdRp_FAM1 ATT AAC CTT GAC CAG GGC TTT AAC TGC A 9
RdRp
(Set 2)		 RdRp_F2 CAA ACA TAC AAC GTG TTG TAG CTT G 10 13963-14119
RdRp_R2 AGT TGT GGC ATC TCC TGA TGA G 11
RdRp_FAM2 TAA TGA GTG TGC TCA AGT ATT GAG TGA AAT 12
RdRp
(Set 3)
 RdRp_F4 CCT TGA CCA GGG CTT TAA C 13 14177-14283
RdRp_R4 TTT TAA CCT CTC TTC CGT GAA G 14
RdRp_FAM4 TGT AAG GCT TTG TTA AGT CAG TGT C 15
SARS-CoV-1/2
공통 프라이머		 E E_F1 GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GTA CTT C 16 26272-26382
E_R1 AAT ATT GCA GCA GTA CGC ACA C 17
E_CFO560 ACT AGC CAT CCT TAC TGC GCT TCG A 18
내부 대조군 RPP30
(RNase P)		 RPP30 F2 GAT GCA AAT CTG CAA AGG AAA GA 19 　
RPP30 R2 CCC AAA CAG CAA GCC TAG AT 20
RPP30 QS670_2 TAA GAG GGC CAT ATG ACG TGG CAA 21
SARS-CoV-2 검출
2-1. 시료의 준비
현재 2019-nCoV의 정량화된 바이러스 분리물은 이용할 수 없으므로, 각 유전자 플라스미드 (Ref. 유전체 (genome): NC_045512)로부터 시험관 내 전사된 RNA (IVT RNA)로 테스트를 수행하였다. S 유전자의 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 21536-23500 nt 영역), N 유전자의 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 28274-29533 nt 영역), RdRp 유전자 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 13901-15530 nt 영역) 및 E 유전자 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 26245-26472 nt 영역)로 테스트를 수행하였다.
2-2. SARS-CoV-2 검출
각 유전자의 SARS-CoV-2 합성 RNA (IVT RNA)의 특성화된 스톡 (characterized stocks)의 10배 연속 희석물 (104, 103, 102 및 101)을 테스트하였다. 구체적인 qPCR 실험 조건은 하기 표 8 및 9와 같다.
SARS-CoV-2 반응 마스터 혼합물
성분 테스트 당 부피 (μL)
뉴클레아제 무첨가 수 3
2X One-step RT-qPCR MMX 10
10X 프라이머/프로브 믹스 2
시료 5
총 20
사이클링 파라미터
단계 사이클 온도 시간 데이터 수집
UNG 배양 1 1 25℃ 2분 -
역전사 2 1 50℃ 15분
초기 변성 3 1 95℃ 5분
변성 4 45 95℃ 10초 -
어닐링 5* 60℃ 30초 FAM / VIC / CY5
연장 6 72℃ 10초 -
* 단계 5의 데이터 수집. 60℃에서 형광이 검출됨.
도 1 내지 6에서 확인되는 바와 같이, 상기 표 7의 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 각각 표적하는 유전자를 모든 시료에서 검출할 수 있었다.
2-3. 검출 한계 (LoD) 확인
LoD를 확인하기 위해, 각 유전자의 SARS-CoV-2 합성 RNA (IVT RNA)의 특성화된 스톡 (characterized stocks)의 10배 연속 희석물을 LoD에 근접한 농도의 5개의 희석된 시료 (8카피/rxn, 6카피/rxn, 4카피/rxn, 3카피/rxn 및 2카피/rxn)로 준비하였고, 이들 각 시료에 대해 20회 반복 테스트를 수행하였다. AB 7500 Fast (Applied Biosystems 7500 Fast) 및 Bio-rad CFX96에서의 LoD를 각각 표 10 및 11에 나타냈다.
AB 7500 Fast에서 검출 한계 확인
표적 RNA 농도* 양성/전체 % 반복 검출
(Replicate Detection)		 평균 Ct** 표준 편차 (Ct)
2019-nCoV_N 8 카피/반응 24/24 100.0 33.8 0.6
6 카피/반응 24/24 100.0 34.3 0.5
4 카피/반응 24/24 100.0 34.9 0.7
3 카피/반응 23/24 95.8 35.5 0.7
2 카피/반응 18/24 75.0 36.6 1.2
2019-nCoV_S 8 카피/반응 24/24 100.0 34.9 0.7
6 카피/반응 24/24 100.0 35.4 0.7
4 카피/반응 24/24 100.0 35.9 0.8
3 카피/반응 24/24 100.0 36.3 0.9
2 카피/반응 21/24 87.5 37.4 2.0
2019-nCoV_RdRp
(Set 1)		 8 카피/반응 24/24 100.0 34.1 0.5
6 카피/반응 24/24 100.0 34.3 1.1
4 카피/반응 22/24 91.7 36.3 1.0
3 카피/반응 22/24 91.7 36.6 1.1
2 카피/반응 16/24 66.7 37.2 1.4
2019-nCoV_E 8 카피/반응 24/24 100.0 32.8 1.1
6 카피/반응 24/24 100.0 33.1 0.8
4 카피/반응 18/24 75.0 34.8 1.6
3 카피/반응 11/24 45.8 35.2 1.7
2 카피/반응 9/24 37.5 35.3 1.7
Bio-rad CFX96에서 검출 한계 확인
표적 RNA 농도* 양성/전체 % 반복 검출
(Replicate Detection)		 평균 Ct** 표준 편차 (Ct)
2019-nCoV_N 8 카피/반응 24/24 100.0 34.0 0.3
6 카피/반응 24/24 100.0 34.6 0.3
4 카피/반응 24/24 100.0 34.9 0.0
3 카피/반응 24/24 100.0 35.2 0.2
2 카피/반응 23/24 95.8 36.3 0.3
2019-nCoV_S
(Set 1)		 8 카피/반응 24/24 100.0 34.5 0.1
6 카피/반응 24/24 100.0 35.1 0.1
4 카피/반응 24/24 100.0 35.3 0.1
3 카피/반응 24/24 100.0 35.6 0.1
2 카피/반응 20/24 83.3 36.5 0.2
2019-nCoV_RdRp 8 카피/반응 24/24 100.0 34.5 0.4
6 카피/반응 24/24 100.0 34.8 0.5
4 카피/반응 24/24 100.0 35.7 0.8
3 카피/반응 23/24 95.8 36.4 0.6
2 카피/반응 22/24 91.7 37.5 0.7
2019-nCoV_E 8 카피/반응 24/24 100.0 32.9 0.2
6 카피/반응 24/24 100.0 33.4 0.1
4 카피/반응 21/24 87.5 34.0 0.3
3 카피/반응 21/24 87.5 35.5 0.1
2 카피/반응 14/24 58.3 35.8 0.7
* 농도는 RNA 카피/반응으로 나타냄.
* 평균 Ct는 양성 결과만 포함함.
표 10 및 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출 방법은 2~6 카피/rxn의 검출 한계 (LoD)를 나타낸다. 구체적으로, AB 7500 Fast에서 3~6 카피/rxn, Bio-Rad CFX96에서 2~6 카피/rxn을 나타냈다.
교차 반응 확인
표 7의 각 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브로 표 6의 31종의 바이러스 및 유기체 (organisms)에 대한 교차 반응을 테스트하였다 (wet-tested). 모든 바이러스 및 유기체는 핵산으로 테스트되었고, 각 바이러스 및 유기체는 표 12에 나타낸 농도로 표 8의 RT-qPCR 반응 마스터 혼합물에 직접 혼합하였다 (spiked).
교차 반응 테스트
이름 공급원 농도 FAM
(RdRp, S및 N 유전자)		 VIC
(E 유전자)
Human Coronavirus 229E KBPV (KBPV-VR-9) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Coronavirus HKU1 ATCC (VR-3262SD) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Coronavirus OC43 ATCC (VR-1558DQ) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Coronavirus NL63 ATCC (VR-3263SD) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
MERS-CoV ATCC (VR-3248SD) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
SARS-CoV 플라스미드 6x103카피/rxn 0/3 3/3
Human Adenovirus 1 KBPV (VR-1) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Adenovirus 3 KBPV (VR-2) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Cytomegalovirus KBPV (VR-7) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human rhinovirus B14 KBPV (VR-39) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human parainfluenza virus 1 KBPV (VR-44) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human parainfluenza virus 2 KBPV (VR-45) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human parainfluenza virus 3 KBPV (VR-46) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Influenza A virus (H1N1) NCCP (42004) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Influenza A virus (H3N2) NCCP (42471) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Influenza B virus NCCP (43027) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human respiratory syncytial virus A NCCP (43238) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human respiratory syncytial virus B NCCP (43239) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Rhinovirus A1 NCCP (43226) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Coxsackie (B3) NCCP (43221) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Echovirus (E6) NCCP (41001) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Mumps virus (H) NCCP (40001) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Measles virus NCCP (40204) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Streptococcus pyogenes NCCP (72067) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Klebsiella pneumoniae NCCP (72008) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Pseudomonas aeruginosa NCCP (72006) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Haemophilus influenzae NCCP (72020) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Streptococcus pneumonia NCCP (72003) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Legionella pneumophila NCCP (72002) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Mycobacterium Tuberculosis vircell (MBC034) 1x104카피/rxn 0/3 0/3
Mycobacterium Avium vircell (MBC086) 1x104카피/rxn 0/3 0/3
표 12에서 확인되는 바와 같이 상기 표 7의 각 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 SARS-CoV-2 검출 방법은 표 6의 31종의 병원체에 대해 교차 반응을 나타내지 않았다. 다만, E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 예외적으로 SARS-CoV-1에 대해 교차 반응성을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> GeneCast Co., Ltd. <120> Primers specifically binding to RdRp gene for detecting SARS-CoV-2 and kit comprising the same <130> 1067530 <160> 21 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> S_F1 primer <400> 1 gggttatctt caacctagga cttttc 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> S_R1 primer <400> 2 tctacagtga aggatttcaa cgtac 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> S_FAM1 probe <400> 3 ctgtgcactt gaccctctct cagaaa 26 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> N_F2 primer <400> 4 gcagagacag aagaaacagc aa 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> N_R2 primer <400> 5 gcactgctca tggattgtt 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> N_FAM2 probe <400> 6 cttcctgctg cagatttgga tgatt 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_F1 primer <400> 7 catacaaacc acgccaggta gt 22 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_R1 primer <400> 8 cttaatgtaa ggctttgtta agtcagtg 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_FAM1 probe <400> 9 attaaccttg accagggctt taactgca 28 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_F2 primer <400> 10 caaacataca acgtgttgta gcttg 25 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_R2 primer <400> 11 agttgtggca tctcctgatg ag 22 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_FAM2 probe <400> 12 taatgagtgt gctcaagtat tgagtgaaat 30 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_F4 primer <400> 13 ccttgaccag ggctttaac 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_R4 primer <400> 14 ttttaacctc tcttccgtga ag 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_FAM4 probe <400> 15 tgtaaggctt tgttaagtca gtgtc 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E_F1 primer <400> 16 ggtacgttaa tagttaatag cgtacttc 28 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E_R1 primer <400> 17 aatattgcag cagtacgcac ac 22 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E_CFO560 probe <400> 18 actagccatc cttactgcgc ttcga 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RPP30 F2 primer <400> 19 gatgcaaatc tgcaaaggaa aga 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RPP30 R2 primer <400> 20 cccaaacagc aagcctagat 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RPP30 QS670_2 probe <400> 21 taagagggcc atatgacgtg gcaa 24

Claims (27)

  1. SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 표적으로 하는,
    서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
    서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로브;
    를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 각각 5'-말단에 FAM, CAL Fluor Orange 560, VIC, HEX, JOE, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 NFQ-MGB, BHQ-1 BHQ1 nova 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지되는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 22363 내지 22488의 영역에 특이적으로 결합하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, S 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 29422 내지 29514의 영역에 특이적으로 결합하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  16. 제15항에 있어서, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, N 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  19. 제18항에 있어서, E 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 16 및 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, E 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  20. 제1항에 있어서, 내부 대조군 (internal control)으로 인간 RPP30 (RNase P) 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  21. 제20항에 있어서, 인간 RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  22. 제1항에 있어서, Taq DNA 중합효소를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  23. 제1항에 있어서, 상기 키트는 교차 오염 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  24. 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 RNA에 제1항의 키트를 처리하여 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  25. 제24항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, SARS-CoV-2 검출방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR (Real-time PCR)인, SARS-CoV-2 검출방법.
  27. 제24항에 있어서, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출방법.
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