KR20190002245A

KR20190002245A - 지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법

Info

Publication number: KR20190002245A
Application number: KR1020170082908A
Authority: KR
Inventors: 조용직
Original assignee: 조용직
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2019-01-08

Abstract

본 발명은 염기서열이 "GGGATCCGCGTTCACAT"인 외피 A(Envelop A), 염기서열이 "GTCCCGTGCAGTGTTTCAG"인 외피 B(Envelop B), 염기서열이 "GACACACTGAAGGAATGCC"인 NS12 A 및 염기서열이 "GATCCTCCACAAGAAAGCTG"인 NS12 B, 그리고, 랜덤 핵사머(Random Hexamer)를 포함하는 프라이머 혼합물(Primer mix)을 포함하도록 한 지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 지카바이러스의 서로 다른 2개의 도메인(domain; NS12와 envelop)에서 동시에 PCR을 일으켜서 2곳에서 동시에 반응이 발생할 경우 양성으로 판단하도록 함으로써, 위양성을 최소화할 뿐만 아니라, 감염 진단을 보다 더 정확하게 할 수 있고, PCR의 진행 상태에 해당하는 실시간 발생하는 반응의 모니터링을 가능하도록 하며, 출발 물질의 샘플에서 매우 정확한 정량화를 통해서 각 사이클에서 증폭물의 양을 정확하게 측정할 수 있고, 동적 범위(dynamic range)의 감지가 향상될 수 있으며, 증폭 및 검출이 단일 튜브로도 가능하고, PCR 후 조작 제거가 가능하도록 한다.

Description

지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법{Dual diagnostic kit and diagnostic method for zika virus}

본 발명은 지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 지카바이러스의 서로 다른 2개의 도메인(domain; NS12와 외피)에서 동시에 PCR을 일으켜서 2곳에서 동시에 반응이 발생할 경우 양성으로 판단하도록 함으로써, 위양성을 최소화할 뿐만 아니라, 감염 진단을 보다 더 정확하게 하도록 하는 지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.

일반적으로, 지카바이러스(영어: zika virus, ZIKV, 포르투갈어: Virus Zika)는 신생아의 소두증 등을 유발하는 것으로 알려진 바이러스로서, 1947년 우간다 지카(Zika) 숲에 사는 붉은털 원숭이에서 바이러스가 최초로 확인되었고, 인체감염사례로는 1952년 우간다와 탄자니아에서 처음 보고되었다.

이러한 지카바이러스는 이집트 숲모기(Aedes aegypt)가 주된 매개체이나 뎅기열 등의 전염병을 매개하는 아시아산 흰줄숲모기(Aedes albopictus)도 전파할 수 있다. 또한 수혈로 인해 감염된 사례는 아직까지 없지만 가능성이 높으며, 성 접촉을 통해 바이러스가 전염된 사례가 있으며, 감염회복 후 2달까지 정액에서 바이러스가 확인되고 있다.

지카바이러스에 감염된 모기에 물리면 3~7일이 지나 증상이 나타나기 시작하며, 최대 잠복기가 2주이다. 지카바이러스 감염의 주요 증상으로는 발열, 발진, 관절통, 눈 충혈 등이 있으며, 이에 해당된다면 감염을 의심해야 한다. 또한 다른 증상으로는 근육통, 두통, 안구통, 구토도 나타날 수 있다. 임신한 여성이 지카바이러스에 감염되면, 두뇌가 성장하지 못하는 소두증에 걸린 아이가 태어날 가능성이 있다. 소두증 상태에서는 정신지체가 되거나, 심한 경우 사망에 이르기까지 한다.

지카바이러스의 감염 진단은 다른 플라비바이러스와의 교차 반응 및/또는 감염 - 바이러스 격리의 초기 단계에서 IgM 및 IgG 항체의 부재 또는 낮은 역가로 인해 어려움을 겪는 혈청 검사에 의존하게 된다.

그러나, 이러한 종래의 지카바이러스 감염 진단은 노동 집약적이고, 시간이 오래 걸리며, 적절한 봉쇄가 필요하다는 단점을 가진다. 따라서 실시간 RT-PCR(RT-qPCR)은 감염의 초기 단계에서 지카바이러스의 검출을 위해 빠르고, 민감한 특정 방법으로서 매력적인 옵션이다. 즉, 현재 지카바이러스의 감염 진단은 시간이 많이 소요되는 특정 항체 또는 동물이나 모기로부터의 바이러스 격리의 탐지를 기반으로한다. 표준 RT-qPCR 및 정량적 RT-qPCR은 지카바이러스의 조기 발견을 위한 빠르고 특수하고 민감한 방법을 제공한다. 실시간 PCR은 기존의 분석법과 달리 신속성, 정량적 측정, 낮은 오염률 및 쉬운 표준화 등 많은 이점을 가지고 있다.

지금까지 미크로네시안 지카바이러스(Micronesian ZIKV) 균주의 검출에 초점을 맞춘 하나의 RT-qPCR 분석이 가능하지만, 지카바이러스의 유전적 다양성과 지리적 분포를 다루고 있지는 않다. 따라서, 아프리카와 아시아에서 순환하는 지카바러스의 균주를 정확하면서도 효과적으로 검출할 수 있는 원스텝(one-step) RT-PCR 분석법의 개발이 필요하게 되었다.

또한, 지카바이러스는 아르보바이러스(arbovirus; 모기에 의해 전파된 Flaviviridae 계열속 플라비바이러스)이다. 모든 플라비바이러스와 마찬가지로, 지카바이러스는 단일 가닥 RNA 바이러스이고, 대략 양성인 RNA 게놈으로 11 kb이며, 게놈의 양쪽 말단이 바이러스 단백질을 코딩하지 않고, 5'와 3'에 번역되지 않은 지역을 가지며, 암호화된 폴리프로테인이 번역되고, 바이러스에 의해 동시 및 사후 번역 처리된다.

이러한 지카바이러스의 감염을 측정하기 위해서는 혈액에서 RNA를 추출하고, 추출된 RNA로 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 연쇄 PCR(중합효소반응)으로 감염 여부를 확인한다. 이와 같이 2번에 걸쳐 파이펫팅(pipetting)하기 때문에 오염(contamination)으로 인한 위양성(false positive) 결과가 많다는 문제점을 가지고 있었다.

한국등록특허 제10-1692436호(2016년12월28일 등록) "지카바이러스 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 지카바이러스 진단용 키트, 및 이를 이용한 지카바이러스 진단방법"

상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 지카바이러스의 서로 다른 2개의 도메인(domain; 외피와 NS12)에서 동시에 PCR을 일으켜서 2곳에서 동시에 반응이 발생할 경우 양성으로 판단하도록 함으로써, 위양성을 최소화할 뿐만 아니라, 감염 진단을 보다 더 정확하게 하고, PCR의 진행 상태에 해당하는 실시간 발생하는 반응의 모니터링을 가능하도록 하며, 출발 물질의 샘플에서 매우 정확한 정량화를 통해서 각 사이클에서 증폭물의 양을 정확하게 측정할 수 있고, 동적 범위(dynamic range)의 감지가 향상되며, 증폭 및 검출이 단일 튜브로도 가능하고, PCR 후 조작 제거가 가능하도록 하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적들은 이하의 실시례에 대한 설명을 통해 쉽게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일측면에 따르면, 염기서열이 "GGGATCCGCGTTCACAT"인 외피 A(Envelop A), 염기서열이 "GTCCCGTGCAGTGTTTCAG"인 외피 B(Envelop B), 염기서열이 "GACACACTGAAGGAATGCC"인 NS12 A 및 염기서열이 "GATCCTCCACAAGAAAGCTG"인 NS12 B, 그리고, 랜덤 핵사머(Random Hexamer)를 포함하는 프라이머 혼합물(Primer mix)을 포함하는, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트가 제공된다.

RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)에 의해 진단이 수행되도록 할 수 있고, 나아가서, Onestep RT-PCR에 의해 진단이 수행되도록 할 수 있다.

효소의 작용을 돕는 버퍼에 해당하는 10X 효소 혼합물(Enzyme mix), RT-PCR용 효소들에 해당하는 RT-PCR 효소 혼합물, 뉴클레아제 프리 워터(Nuclease free water), RT-PCR에 사용되는 내부 대조군(Internal control) 및 진단을 확인하기 위한 양성 대조군(Positive control)을 더 포함할 수 있다.

상기 내부 대조군은, 포워드 프라이머의 염기서열이 "GCA CCA CAC CTT CTA CAA TG"이고, 리버스 프라이머의 염기서열이 "TGC TTG CTG ATC CAC ATC TG"인 β-액틴 프라이머(Beta-actin primer)로 이루어질 수 있다.

상기 양성 대조군은, 지카바이러스의 여러 도메인 중에서 외피(envelop)와 NS1, NS2a, NS2b의 염기를 2개의 pET28a 플라스미드에 각각 인서트(insertion)해서 제작할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 단일 가닥인 RNA를 이중 나선 구조인 cDNA로 만드는 역전사(Reverse transcription) 단계; 상기 역전사 단계에서 cDNA를 만들 때 사용한 효소인 역전사효소와 리보뉴클라아제 억제제(RNase inhibitor)를 무력화시키고, DNA를 증폭시키는 Taq 중합효소(Taq polymerase)를 활성화시키는 효소 활성화(Enzyme activation) 단계; 상기 cDNA가 열에 의해 단일 나선 구조가 되도록 하는 변성(Denaturation) 단계; 상기 변성된 단일 나선 구조의 DNA에 프라이머가 붙도록 하는 어닐링(Annealing) 단계; 및 상기 어닐링을 마친 DNA에 붙은 프라이머를 이용하여 원하는 부분(Target sequence)의 염기를 증폭하는 DNA 합성(Synthesis) 단계;를 포함하는, 지카바이러스 2중 진단방법이 제공된다.

본 발명에 따른 지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법에 의하면, 지카바이러스의 서로 다른 2개의 도메인(domain; NS12와 envelop)에서 동시에 PCR을 일으켜서 2곳에서 동시에 반응이 발생할 경우 양성으로 판단하도록 함으로써, 위양성을 최소화할 뿐만 아니라, 감염 진단을 보다 더 정확하게 할 수 있고, PCR의 진행 상태에 해당하는 실시간 발생하는 반응의 모니터링을 가능하도록 하며, 출발 물질의 샘플에서 매우 정확한 정량화를 통해서 각 사이클에서 증폭물의 양을 정확하게 측정할 수 있고, 동적 범위(dynamic range)의 감지가 향상될 수 있으며, 증폭 및 검출이 단일 튜브로도 가능하고, PCR 후 조작 제거가 가능하도록 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시례에 따른 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트에서 외피의 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 일 실시례에 따른 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트에서 NS12의 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법을 도시한 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법에서 스탠다드 커브를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시례에 따른 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트를 사용하여 RT-qPCR을 실시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법에서 융합 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법에서 스캔다드 커브의 다른 예를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법에서 동적 범위를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시례를 가질 수 있는 바, 특정 실시례들을 도면에 예시하고, 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니고, 본 발명의 기술 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 식으로 이해되어야 하고, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시례에 한정되는 것은 아니다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시례를 상세히 설명하며, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성요소에 대해서는 동일한 참조 번호를 부여하고, 이에 대해 중복되는 설명을 생략하기로 한다.

본 발명의 일 실시례에 따른 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트는, 염기서열이 "GGGATCCGCGTTCACAT"인 외피 A(Envelop A), 염기서열이 "GTCCCGTGCAGTGTTTCAG"인 외피 B(Envelop B), 염기서열이 "GACACACTGAAGGAATGCC"인 NS12 A 및 염기서열이 "GATCCTCCACAAGAAAGCTG"인 NS12 B, 그리고, 랜덤 핵사머(Random Hexamer)를 포함하는 프라이머 혼합물(Primer mix)을 포함하며, 나아가서, RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)에 의해 진단이 수행되도록 하고, 일례로 Onestep RT-PCR에 의해 진단이 수행되도록 할 수 있다.

본 발명의 일 실시례에 따른 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트는 상기의 프라이머 혼합물 외에도, 효소의 작용을 돕는 버퍼에 해당하는 10X 효소 혼합물(Enzyme mix), RT-PCR용 효소들에 해당하는 RT-PCR 효소 혼합물, 뉴클레아제 프리 워터(Nuclease free water), RT-PCR에 사용되는 내부 대조군(Internal control) 및 진단을 확인하기 위한 양성 대조군(Positive control)을 더 포함할 수 있다.

프라이머 혼합물(Primer mix)은 지카바이러스 슈퍼 믹스(ZIKV super mix)로서, 2개의 프라이머 쌍이 있고, 지카바이러스의 한 곳에서 감염 여부를 확인하는 것이 아니라, 위양성을 감소하기 위해 2곳에서 동시에 감염 여부를 확인하도록 한다. 프라이머 혼합물은 앞서 설명한 바와 같은 염기서열을 각각 가지는 외피 A, 외피 B, NS12 A, NS12 B 각각이 일례로 100㎛이고, 랜덤 헥사머가 일례로 50㎛이다. 여기서, 외피 1쌍(2개)과 NS12 1쌍(2개), 이렇게 모두 2쌍(4개)은 지카바이러스를 증폭하는 프라이머로서, 이들 각각의 염기 서열을 도 1 및 도 2에 나타내었고, 랜덤 헥사머는 RNA를 cDNA로 만들어 주는 프라이머로서, 다양한 헥사머들을 혼합하도록 제작될 수 있다.

프라이머 혼합물에서 주요 프라이머에 대한 사항은 아래의 표 1에 나타내었다.

프라이머	염기서열	베이스	사이즈	Tm	사이트
외피 A	GGGATCCGCGTTCACAT	17	51	58	6-22
외피 B	GTCCCGTGCAGTGTTTCAG	19		58	38-56
NS12 A	GACACACTGAAGGAATGCC	19	61	56	430-448
NA12 B	GATCCTCCACAAGAAAGCTG	20		56	471-490

프라이머의 염기는 세포성 프로테아제를 3개 구조 단백질(캡시드 [C], 막 전막 [prM] 또는 막 [M] 및 포락선 [E]) 및 7개의 비구조적 단백질(NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b 및 NS5)을 포함하며, 실시간 중합효소 반응을 이용한 지카바이러스 진단키트에 사용한 프라이머는 2곳(envelop과 NS1, NS2a, NS2b)에서 디자인했다.

10X 효소 혼합물(Enzyme mix)은 여러 효소들이 잘 작용할 수 있게 만든 버퍼로서, 여기에는 각종 효소들을 잘 작용하게 하는 각종 시약이 들어있고, 추가로 dNTP Mix(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)와 형광 물질인 SyBr Green이 들어 있다. 10X 효소 혼합물은 그 구성성분이 예컨대, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, SyBr Green, dNTP(2.5mM each dNTP)일 수 있다.

RT-PCR 효소 혼합물은 여러 효소들이 있는데, 예컨대, DNA Taq 중합효소(polymerase) 역전사 효소(Reverse transcriptase), RNA 억제제(RNA inhibitor) 등이 있다. 또한 RT-PCR 효소 혼합물은 리보뉴클라아제 억제제(RNase inhibitor) 10 units/㎕, Taq 중합효소(polymerase) 5U/㎕, 역전사 효소(everse transcriptase) M-MLV-RT 100 units/㎕ 등이 사용될 수 있다. 여기서 역전사 효소 M-MLV-RT는 RNA를 cDNA로 만들어 주는 것이고, 이때 리보뉴클라아제 억제제는 RNA가 디그러데이션(degradation)되는 것을 방지해 주고, 이렇게 만들어진 cDNA는 Taq 중합효소를 이용해서 지카바이러스 유전자를 증폭하는 것이다.

뉴클레아제 프리 워터는 PCE 등급의 물이 사용될 수 있다.

내부 대조군(Internal control)은 포워드 프라이머의 염기서열이 "GCA CCA CAC CTT CTA CAA TG"일 수 있고, 리버스 프라이머의 염기서열이 "TGC TTG CTG ATC CAC ATC TG"인 β-액틴 프라이머(Beta-actin primer)로 이루어질 수 있다. β-액틴 프라이머는 길이가 125bp일 수 있다.

양성 대조군(Positive control)은 pET28a 플라스미드에 결찰(Ligation)한 것일 수 있는데, 양성대조군은 qPCR을 실시했을 때 키트가 정확하게 지카바이러스를 진단하는지를 확인하는 것이고, 스탠다드 커브(Standard curve)를 만들기 위한 것이다. 스탠다드 커브는 사용한 샘플이 지카바이러스에 감염되었으면, 감염된 카피 넘버(Copy number)를 측정할 수 있도록 하는 그래프이다. 본 발명에서는 양성 대조군이 2개인데, 그 이유는 2중 진단을 위함이다. 양성 대조군은 예컨대 황열 바이러스 양성 대조군(Yellow fever virus positive control, 1×10⁷copies/㎖)이 사용될 수 있으며, 지카바이러스의 여러 도메인 중에서 외피(envelop)와 NS1, NS2a, NS2b의 염기를 2개의 pET28a 플라스미드에 각각 인서트(insertion)해서 제작한 것일 수 있다.

도 3은 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법을 도시한 흐름도이다.

도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시례에 따른 지카바이러스 2중 진단방법은 역전사(Reverse transcription) 단계(S11), 효소 활성화(Enzyme activation) 단계(S12), 변성(Denaturation) 단계(S13), 어닐링(Annealing) 단계(S14) 및 DNA 합성(Synthesis) 단계(S15)를 포함할 수 있으며, 각 단계(S11~S15)의 실시 조건에 대해서 표 2에 정리하였으며, 이하에서 각 단계별로 설명하기로 한다.

단계	시간	온도	비고
Reverse transcription	10 min	55℃
Enzyme activation	2 min	95℃
Denaturation	10 sec	95℃	50cycles
Annealing & DNA Synthesis)	60 sec	60℃	50cycles

역전사(Reverse transcription) 단계(S11)는 단일 가닥인 RNA를 이중 나선 구조인 cDNA로 만드는 과정이다. 이를 위해 사전에 RNA를 추출해야 하는데, 이를 위해, 예컨대 2㎖의 혈액 및 세포 배양 상등액으로부터 바이러스성 RNA를 분리할 수 있고, QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분석할 수 있다. RNA는 60㎕의 AVE 완충액에서 용출될 수 있고, 사용시까지 -80℃에서 보관되도록 할 수 있다. 각 RNA 시료의 농도와 순도는 UV- 분광 광도계로 측정할 수 있다.

효소 활성화(Enzyme activation) 단계(S12)는 역전사 단계(S11)에서 cDNA를 만들 때 사용한 효소인 역전사효소 M-MLV-RT와 리보뉴클라아제 억제제(RNase inhibitor)를 무력화시키고, DNA를 증폭시키는 Taq 중합효소(Taq polymerase)를 활성화시키는 과정이다.

변성(Denaturation) 단계(S13)는 상기의 cDNA가 열에 의해 단일 나선 구조가 되도록 하는 과정이다.

어닐링(Annealing) 단계(S14)는 상기의 변성된 단일 나선 구조의 DNA에 프라이머가 붙도록 하는 과정이다.

DNA 합성(Synthesis) 단계(S15)는 상기의 어닐링을 마친 DNA에 붙은 프라이머를 이용하여 원하는 부분(Target sequence)의 염기를 증폭하는 과정이다.

실시간 중합효소 반응을 이용한 지카바이러스 진단은 one-step RT-qPCR 방법으로 실시할 수 있는데, one-step RT-qPCR은 간단한 폐쇄 튜브 프로토콜에서 역전사와 실시간 PCR 반응을 결합한다. 이로써 상당한 벤치 시간을 절약할 수 있을 뿐만 아니라 오류도 줄일 수 있다. 반응 혼합액에 Uracil-Nglycosylase(UNG)를 포함시킴으로써 PCR 반응 사이의 오염을 방지할 수 있다. UNG는 원래의 PCR에서 deoxyuridine triphosphate(dUTP)를 포함하는 PCR 반응으로부터의 이월을 방지하는 기능이 있다. 지카바이러스를 측정하는 형광 물질은 SyBr green이 사용될 수 있다.

융합 곡선(Melting curve)은 증폭된 제품의 특이성을 검사하기 위해 사용되는데, 온도가 서서히 증가하면 생성물이 변성됨에 따라 SYBR 녹색 형광이 급격하게 감소한다. 특정 제품은 용융 온도의 차이로 비특정 제품과 구별될 수 있다.

융합 곡선은 dsDNA에 결합하는 형광염료가 고온에서 dsDNA가 변성되어 ssDNA에는 결합하고 있지 않다가, 온도를 점차적으로 내려줌으로써 ssDNA가 dsDNA로 결합되어 형광염료가 형광신호의 변화를 보여주게 되는데, 이를 그래프로 나타내주는 것이다. 증폭 실험이 끝난 이후의 융합 곡선의 분석은 간단하면서도 바로 실시간 PCR 반응이 잘 이루어졌는지, 프라이머 다이머(primer dimer)가 생겼는지, 반응이 특이적으로 잘 이루어졌는지 등을 파악할 수 있도록 한다. 즉 용합 곡선은 잘못된 결합이 일어나는 경우이거나, 다른 PCR 산물이 만들어진 경우 등을 확인할 수 있도록 해준다. 이러한 융합 곡선의 분석은 프라이머 다이머(primer dimer)나 다른 PCR 산물을 확인하기 위한 전기영동 실험 과정을 생략할 수 있도록 하며, 보다 쉽게 PCR 산물의 특징 등을 확인할 수 있도록 해준다.

PCR 반응의 초기에는 형광 신호의 변화는 크게 나타나지 않는다. 반응이 진행될수록 형광 신호가 각 사이클마다 증가하게 된다. 이 반응의 문턱값(threshold)은 문턱값 사이클(threshold cycle) 혹은 Ct 값을 정하는데 사용된다. 이미 정량된 샘플을 희석하여 진행된 실험의 Ct 값은 스탠다드 커브(standard curve)를 만드는데 사용될 수 있다. 이미 알려진 샘플의 스탠다드 커브(standard curve)의 Ct 값을 이용하여 알고자 하는 샘플의 정량이 가능하며, 혹은 상대 정량을 통해 서로의 양을 비교할 수 있으며, 스탠다드 커브(standard curve)를 통해 PCR의 효율을 체크 할 수 있다. Ct값은 기본적으로 최초의 템플레이트(template)의 양과 밀접한 연관이 있으며, 반응에 최초 템플레이트 양이 많을 경우 Ct 값이 감소하는 것을 볼 수 있다.

스탠다드 커브의 중요성은 이미 농도를 알고 있는 템플레이트는 스탠다드 커브를 만드는데 사용할 수 있다. 도 4에서와 같이, 이러한 스탠다드 커브를 만들게 됨으로써 농도를 모르는 템플레이트의 농도나 양을 알 수 있다. 여기서, 로그그래프의 X축은 희석 배수이며, Y축은 Ct값이다 이러한 스탠다드 커브를 통해 반응이 잘 이루어졌는지와 그리고 다른 반응에 영향을 미치는 파라미터들(곡선의 기울기 Y 절편 상관 계수)을 알 수 있다. 또한 스탠다드 커브를 만들 때 예상되는 농도의 범위까지 포함하여야 한다.

동적 범위(Dynamic range)는 최초의 템플레이트 양을 늘렸을 때, 산물의 양이 같이 증가되는 범위이다. 이상적으로 플라스미드 DNA는 7-8 정도이며 cDNA나 genomic DNA는 3-4 정도이어야 한다. 도 5를 참조하면, 감지 범위는 24~36 사이클까지이다.

도 6을 참조하면, 3개의 샘플은 각각 하나의 피크가 생성되었다. 이는 2개의 양성 샘플(Positive sample)과 하나의 내부 대조군(Internal control)에 관한 것이다. 왼쪽 2개는 지카바이러스 밴드이고, 맨 오른쪽은 내부 대조군이다.

도 7을 참조하면, 스탠다드 커브의 중요성은 이미 농도를 알고 있는 템플레이트가 스탠다드 커브를 만드는데 사용할 수 있다. 여기서 스탠다드 커브를 만들기 위해 사용한 백본 플라스미드(backbone plasmid)는 pET28a를 사용했고, 인서트는 외피와 NS12의 전체 염기를 사용해서 클로닝했다.

동적 범위는 최초의 템플레이트 양을 늘렸을 때 산물의 양이 같이 증가되는 범위를 나타내는 것인데, 도 8에서와 같이, 동적 범위가 12사이클에서 34사이클까지이다.

이와 같은 본 발명에 따른 지카바이러스 2중 진단키트 및 진단방법에 따르면, 지카바이러스의 서로 다른 2개의 도메인(domain; NS12와 envelop)에서 동시에 PCR을 일으켜서 2곳에서 동시에 반응이 발생할 경우 양성으로 판단하도록 함으로써, 위양성을 최소화할 뿐만 아니라, 감염 진단을 보다 더 정확하게 할 수 있다.

또한 본 발명에 따르면, PCR의 진행 상태에 해당하는 실시간 발생하는 반응의 모니터링을 가능하도록 하며, 출발 물질의 샘플에서 매우 정확한 정량화를 통해서 각 사이클에서 증폭물의 양을 정확하게 측정할 수 있고, 동적 범위(dynamic range)의 감지가 향상될 수 있으며, 증폭 및 검출이 단일 튜브로도 가능하고, PCR 후 조작 제거가 가능하도록 한다.

이와 같이 본 발명에 대해서 첨부된 도면을 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시례에 한정되어서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이러한 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims

염기서열이 "GGGATCCGCGTTCACAT"인 외피 A(Envelop A), 염기서열이 "GTCCCGTGCAGTGTTTCAG"인 외피 B(Envelop B), 염기서열이 "GACACACTGAAGGAATGCC"인 NS12 A 및 염기서열이 "GATCCTCCACAAGAAAGCTG"인 NS12 B, 그리고, 랜덤 핵사머(Random Hexamer)를 포함하는 프라이머 혼합물(Primer mix)을 포함하는, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트.
청구항 1에 있어서,
RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)에 의해 진단이 수행되도록 하는, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트.
청구항 2에 있어서,
Onestep RT-PCR에 의해 진단이 수행되도록 하는, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
효소의 작용을 돕는 버퍼에 해당하는 10X 효소 혼합물(Enzyme mix), RT-PCR용 효소들에 해당하는 RT-PCR 효소 혼합물, 뉴클레아제 프리 워터(Nuclease free water), RT-PCR에 사용되는 내부 대조군(Internal control) 및 진단을 확인하기 위한 양성 대조군(Positive control)을 더 포함하는, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트.
청구항 4에 있어서,
상기 내부 대조군은,
포워드 프라이머의 염기서열이 "GCA CCA CAC CTT CTA CAA TG"이고, 리버스 프라이머의 염기서열이 "TGC TTG CTG ATC CAC ATC TG"인 β-액틴 프라이머(Beta-actin primer)로 이루어지는, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트.
청구항 4에 있어서,
상기 양성 대조군은,
지카바이러스의 여러 도메인 중에서 외피(envelop)와 NS1, NS2a, NS2b의 염기를 2개의 pET28a 플라스미드에 각각 인서트(insertion)해서 제작한, 지카 바이러스 2중 진단지카바이러스 2중 진단키트.
단일 가닥인 RNA를 이중 나선 구조인 cDNA로 만드는 역전사(Reverse transcription) 단계;
상기 역전사 단계에서 cDNA를 만들 때 사용한 효소인 역전사효소와 리보뉴클라아제 억제제(RNase inhibitor)를 무력화시키고, DNA를 증폭시키는 Taq 중합효소(Taq polymerase)를 활성화시키는 효소 활성화(Enzyme activation) 단계;
상기 cDNA가 열에 의해 단일 나선 구조가 되도록 하는 변성(Denaturation) 단계;
상기 변성된 단일 나선 구조의 DNA에 프라이머가 붙도록 하는 어닐링(Annealing) 단계; 및
상기 어닐링을 마친 DNA에 붙은 프라이머를 이용하여 원하는 부분(Target sequence)의 염기를 증폭하는 DNA 합성(Synthesis) 단계;
를 포함하는, 지카바이러스 2중 진단방법.