KR20110118176A - 치쿤군야의 검출을 위한 프로브 및 프라이머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 "올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)" 프로브를 채용함으로써 혈액/혈청/플라즈마 시료에서로 치쿤군야 바이러스 핵산의 존재를 측정하기 위한 방법의 상세한 설명을 제공한다. 지정된 "올리고뉴클레오티드" 프로브는 실시간 PCR을 채용함으로써 감염된 시료에서 치쿤군야 바이러스의 양적 또는 질적 검출을 하는데 사용될 수 있다.

Description

치쿤군야의 검출을 위한 프로브 및 프라이머{PROBES AND PRIMERS FOR DETECTION OF CHIKUNGUNYA}
본 발명은 "올리고뉴클레오티드" 프로브를 채용함으로써 혈액 시료로부터 분리된 핵산을 사용하여 치쿤군야 바이러스 감염의 검출 방법에 관한 것이다. 검출을 위해 여기에 채용되는 방법은 실시간 PCR이다.
치쿤군야 바이러스는 열대 아프리카 및 아시아에서 자생하였고, 이는 감염된 모기, 일반적으로 숲모기속(genus Aedes)에 물림으로써 인간에 전염되었다. 치쿤군야 바이러스는 토가 버대과(Toga virdae family)에서 알파-바이러스(alpha-virus)에 속한다. "아르보바이러스(Arbovirus)"(Ar-arthropod, bo-borne)이다. CHIK 열 전염병은 인간-모기-인간 전염에 의해 유지된다. "치쿤군야"는 질병과 연관되는 심각한 관절 통증으로 고통스러워하는 환자의 일그러진 자세의 지역적 방언에서의 설명으로부터 유도된 것으로 생각된다. 주요 바이러스 병원소(virus reservoirs)는 원숭이이지만, 인간을 포함하는, 다른 종도 영향받을 수 있다.
치쿤군야(마콘데족 언어 "밴드 업하는 것"(in the Makonde language "that which bends up")) 바이러스(CHIKV)는 바이러스를 옮기는 각다귀속 모기(Aedes mosquitoes)에 의해 인간에 전염되는, 알파 바이러스(Alphavirus ), 속(genus)의 곤충 전염성 바이러스(insect-borne virus)이다. 심각한 사망률과 연관되는 CHIKV가 최근 발생되어 왔다. CHIKV는 뎅기열과 유사한 증상을 갖는 질병을 야기한다. CHIKV는 2 내지 5일 지속되는 병의 급성 발열기를 나타낸 후, 사지의 관절에 영향을 주는 관절통 질병이 지속된다. 관절의 CHIKV 감염과 연관되는 통증은 몇 주 또는 몇 달 동안 지속된다.
치쿤군야 질병의 배양 기간은 2 내지 4일이다. 질병의 증상은 40℃(104℉)까지 열이 오르고, 몸통 및 가끔 팔다리의 점상 출혈(petechial) 또는 반점 구진성 발진(maculopapular rash), 및 다수의 관절에 영향을 주는 관절통(arthralgia) 또는 관절염(arthritis)을 포함한다. 다른 비특이적 증상으로는 두통, 결막 감염(conjunctival infection), 및 약한 수명(photophobia)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 열은 2일 동안 지속된 후 갑자기 끝난다. 그러나, 다른 증상, 즉 관절 통증, 강한 두통, 불면증 및 극도 피로(prostration)의 극한 정도가 다양한 기간; 일반적으로 약 5 내지 7일 동안 지속된다. 환자는 나이에 따라 더 긴 기간 동안 관절 통증을 호소한다. 치쿤군야의 일반적인 실험실 조사는 RT-PCR, 바이러스 분리 및 혈청학적 검사를 포함한다. 바이러스 분리는 가장 확정적인 진단을 제공하지만, 완료되는데 1-2주가 걸리고, 생물안전도 3 실험실(biosafety level 3 laboratories)에서 행해져야만 한다. 상기 기술은 전체 혈액의 시료에 특정 세포 라인을 노출시키는 단계 및 치쿤군야 바이러스 특이 반응을 식별하는 단계를 포함한다. 함유된 프라이머를 사용하는 RT-PCR은 전체 혈액으로부터 일부 치쿤군야 특이 유전자를 증폭시키기 위해 짝을 이룬다. 결과는 1-2일 내에 결정될 수 있다. 혈청학적 진단법(Serological diagnosis)은 다른 방법보다 많은 양의 혈액을 필요로 하고, 치쿤군야 특이 IgM 레벨(Chikungunya- specific IgM levels)을 측정하기 위한 ELISA 분석을 사용한다. 결과는 2-3일이 필요하고, 긍정 오류(false positives)는 오니 옹니옹 바이러스(O'nyong'nyong virus) 및 셈리키삼림열 바이러스(Semliki Forest Virus)와 같은 관련 바이러스를 통해 감염으로 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브; 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 콘쥬게이트되는 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브; 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID Nos. 1 및 2를 포함하는 군으로부터 선택된 프로브, SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6을 포함하는 군으로부터 선택된 대응하는 프라이머를 검출할 시료를 포함하는 치쿤군야의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물; (a) 핵산 증폭 시약, SEQ ID Nos. 1 및 2를 포함하는 군으로부터 선택된 프로브 및 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6을 포함하는 군으로부터 선택된 대응하는 프라이머를 검출할 시료를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 단계, (b) 타겟 시퀀스의 복제물을 얻기 위해 반응 혼합물에 PCR을 실행한 후, 치쿤군야 감염을 검출하기 위한 형광 신호의 증가를 측정하는 단계, 및 (c) 치쿤군야 감염을 수량화하기 위한 복제수를 얻기 위해 검출된 신호로부터 표준 곡선을 선택적으로 구성하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 감염을 검출하고 선택적으로 수량화하는 방법; 및 각각의 또는 조합의 SEQ ID Nos.1 및 2의 프로브; 각각의 또는 조합의 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머의 대응하는 짝 및 증폭 시약을 포함하는 치쿤군야 감염의 검출을 위한 키트에 관한 것이다.
도 1은 치쿤군야의 표준 곡선을 나타냈다.
본 발명은 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 상기 프로브는 치쿤군야의 검출을 위한 것이다.
본 발명은 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지(labels)와 콘쥬게이트된 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 프로브는 5' 말단에서 형광단(fluorophore), 3' 말단에서 퀀처(quencher)와 콘쥬게이트된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체 VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)(FAM), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine)[TAMRA], 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드, 테트라메틸로다민, 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 블랙홀 퀀처 염료(Black Hole Quencher dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 바람직한 형광단은 5' 말단에서 6-카르복시 플루오레세인[FAM]이고, 상기 바람직한 퀀처는 3' 말단에서 테트라 메틸 로다민[TAMRA]이다.
본 발명은 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos 3 및 4를 갖는 프라이머는 센스 프라이머이고, 상기 SEQ ID Nos 5 및 6을 갖는 프라이머는 안티-센스 프라이머이다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos 3 및 5를 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 1의 프로브에 대응하고, 상기 SEQ ID Nos 4 및 6을 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 2의 프로브에 대응한다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지(labels)와 선택적으로 콘쥬게이트된다.
본 발명은 치쿤군야의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)에 관한 것으로, 상기 혼합물은 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID Nos. 1 및 2를 포함하는 군으로부터 선택된 프로브, SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6을 포함하는 군으로부터 선택된 대응하는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos 3 및 5를 갖는 프라이머는 상기 SEQ ID No. 1의 프로브에 대응하고, SEQ ID Nos 4 및 6을 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 2의 프로브에 대응한다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 선택적으로 콘쥬게이트된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 치쿤군야 감염을 검출하고 선택적으로 수량화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(a) 핵산 증폭 시약, SEQ ID Nos. 1 및 2를 포함하는 군으로부터 선택된 프로브 및 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6을 포함하는 군으로부터 선택된 대응하는 프라이머를 검출할 시료를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 타겟 시퀀스의 복제물을 얻기 위해 반응 혼합물에 PCR을 실행한 후, 치쿤군야 감염을 검출하기 위한 형광 신호의 증가를 측정하는 단계; 및
(c) 치쿤군야 감염을 수량화하기 위한 복제수를 얻기 위해 검출된 신호로부터 표준 곡선을 선택적으로 구성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시형태에 있어서, SEQ ID Nos 3 및 4를 갖는 프라이머는 센스 프라이머이고, SEQ ID Nos 5 및 6을 갖는 프라이머는 안티-센스 프라이머이고, 상기 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos 3 및 5를 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 1의 프로브에 대응하고, 상기 SEQ ID Nos 4 및 6을 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 2의 프로브에 대응한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 콘쥬게이트되고, 상기 형광 신호는 5' 말단에서 형광단, 3' 말단에서 퀀처를 갖는 프로브에 의해 생성된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체 VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)(FAM), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine), 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 블랙홀 퀀처 염료(Black Hole Quencher dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 치쿤군야 감염의 검출을 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 각각의 또는 조합의 SEQ ID Nos.1 및 2의 프로브; 각각의 또는 조합의 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머의 대응하는 짝 및 증폭 시약을 포함한다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 선택적으로 콘쥬게이트된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 증폭 시약은 마그네슘 클로라이드, Taq 중합효소(polymerase) 및 증폭용 완충제(buffer)를 포함하는 조합(combination)이다.
본 발명의 주요 목적은 감염된 혈액 시료로부터 분리된 핵산을 사용하여 치쿤군야 바이러스 감염을 검출하는 것이다. 검출 형태는 형광단 및 퀀처로 표지된 "올리고뉴클레오티드" 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 채용함으로써 형광(fluorescence)의 증가를 모니터링(monitoring)하는 것에 의한다.
프로브 및 프로브 고안
SEQ ID No.1를 갖는 프로브와 SEQ ID Nos. 3 및 5를 갖는 프라이머는 치쿤군야의 비구조적 프로테인 nsP4 유전자(Nonstructural protein nsP4 gene of Chikungunya)로 고안된다. 마찬가지로, SEQ ID No. 2 프로브와 SEQ ID Nos. 4 및 6 프라이머는 치쿤군야의 구조적 프로테인 유전자(Structural protein gene of Chikungunya)로 고안된다.
본 발명은 치쿤군야 바이러스 감염의 검출을 위한, SEQ ID No. 1 프로브로 지정된 "올리고뉴클레오티드" 프로브와 SEQ ID Nos. 3 및 5로 지정된 프라이머에 관한 것으로, 상기 프라이머는 각각 센스 및 안티-센스 프라이머이고, 또한 본 발명은 치쿤군야 바이러스 감염의 검출을 위한 SEQ ID No. 2 프로브와 SEQ ID Nos. 4 및 6으로 지정된 프라이머에 관한 것으로, 상기 프라이머는 각각 센스 및 안티-센스 프라이머이다.
본 발명에 따라서, SEQ ID No. 1 프로브와 각각의 센스 및 안티-센스 프라이머는 치쿤군야의 비구조적 프로테인 nsP4 유전자(Nonstructural protein nsP4 gene of Chikungunya)로 고안된다. 마찬가지로, SEQ ID No. 2 프로브와 그것에 대응하는 센스 및 안티-센스 프라이머는 치쿤군야의 구조적 프로테인 유전자(Structural protein gene of Chikungunya)로 고안된다. 본 발명에 따라서, 상기 "올리고뉴클레오티드" 프로브는 5' 말단에 형광단 및 3' 말단에 퀀처를 갖는 검출가능한 표지와 콘쥬게이트된다. 상기 형광단은 플루오레세인, 플루오레세인 유도체 FAM, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 6-카르복시 플루오레세인, 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민 및 시아닌 염료를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 퀀처는 테트라메틸로다민, 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드, 테트라메틸로다민, 카르복시테트라메틸로다민 및 BHQ 염료를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 형광단은 6-카르복시 플루오레세인[FAM]이고, 상기 퀀처는 테트라 메틸 로다민[TAMRA]이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 검출은 사실상 질적 또는 양적이다.
본 발명은 치쿤군야 바이러스 감염의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물에 관한 것으로, 상기 혼합물은 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID Nos. 1 및 2로 지정된 "올리고뉴클레오티드" 프로브와 SEQ ID Nos. 3 및 5 또는 SEQ ID Nos. 4 및 6으로 지정된 프라이머 및 혈액/혈청/플라즈마 시료로부터 분리된 치쿤군야 핵산(Chikungunya nucleic acid)으로 이루어진다.
본 발명은 치쿤군야 바이러스 감염을 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 핵산 증폭 시약으로 이루어진 PCR 혼합물에 있어서, SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2로 지정된 "올리고뉴클레오티드" 프로브와 대응하는 프라이머 및 시험 시료는 타겟 시퀀스의 복제물을 얻기 위해 실시간 PCR을 사용하여 증폭(amplification)을 실행한다. 상기 증폭은 형광 신호의 증가에 대해서 측정된다.
"올리고뉴클레오티드" 프로브는 20-26뉴클레오티드의 사이즈 범위를 갖는다. 고안된 프로브는 5' 말단에서 형광단 및 3' 말단에서 퀀처를 갖는다. 5' 말단에서 형광단은 6-카르복시 플루오레세인[FAM]이고, 퀀처는 3' 말단에 존재하는 경우에 테트라 메틸 로다민[TAMRA]이다. 본 발명은 혈액/혈청/플라즈마 시료에 존재하는 치쿤군야 바이러스 감염의 검출을 위해 사용된다. 검출에 사용되는 방법은 PCR 동안 플루오레세인의 증가를 모니터링하는 것에 의한다.
본 발명에 따라서, "올리고뉴클레오티드 프로브"는 데옥시리보핵산(DNA)의 짧은 시퀀스를 말한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 감염되지 않은 DNA에 비특이적 하이브리드(non-specific hydridisation)를 나타내지 않고 타겟 DNA에 특이적으로 하이브리드(specifically hybridise)할 수 있다.
여기에 채용되는 프로브는 타크만 화학의 원리(principles of Taqman chemistry)를 따른다. 또한, 이중-염료 올리고뉴클레오티드 또는 표지 프로브라고도 불리는 타크만 프로브(TaqMan probes)는 가장 널리 사용되는 프로브 형태이다.
따라서, 본 발명에 따른 "올리고뉴클레오티드" 프로브는 실시간 PCR에 의해 시험 시료 내에 치쿤군야 바이러스 시퀀스를 특이적으로 증폭하고 검출하는데 사용될 수 있는, 대응하는 센스 및 안티-센스 프라이머의 조합으로 제공된다. 또한, 표준 곡선으로부터 얻어지는 Ct에 기초한 바이러스의 양을 수량화할 수 있다.
SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브와 대응하는 프라이머는 표 1 & 표 2에 기재된 바와 같이 시퀀스를 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
SEQ ID No. 1 및 2는 이하에 나타낸 바와 같이 형광단 및 퀀처와 더 콘쥬게이트될 수 있다:
5'-형광단-TTCGATGCCATCATAGCCGCACACTT-퀀처-3'
5'-형광단-CCCTGCTCCCAGCCCCCTTG-퀀처-3'
본 발명은 이하 실시예 및 도면에 의해 더 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해해서는 안된다.
실시예 1
상기 발명의 이해를 돕기 위해서, SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 본 발명의 프로브를 갖는 혈액, 혈청 및 플라즈마로부터 수집된 감염 시료 및 확립된 시료판에 연구가 행해졌다. 포지티브 결과는 연구에서 얻어지고, 상기 결과는 이하와 같이 강조되었다:
10개의 치쿤군야 포지티브(Chikungunya positives)와 10개의 치쿤군야의 네가티브(Chikungunya negative) 시료로 이루어진 시료판을 SEQ ID Nos.1 및 2를 갖는 프로브와 대응하는 센스 및 안티-센스 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 행했다. PCR 믹스 조성과 반응 조건을 표 3&4에 나타냈다. 증폭(Amplification)은 PCR 반응 도중에 형광 신호의 증가에 대해 측정된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
얻어진 결과는 이하를 나타낸다;
비구조적 nsP4 유전자로 고안된 프로브, SEQ ID No. 1을 40 사이클 내에 10개의 소정의 포지티브 모두를 골라냈다(포지티브 시료(positive sample)를 제거함).
구조적 유전자로 고안된 프로브, SEQ ID No. 2를 40 사이클 내에 10개의 소정의 포지티브 모두를 골라냈다(포지티브 시료를 제거함). 이들은 네가티브 시료(negative samples)와 어떠한 거짓 증폭(false amplification)을 나타내지 않았다. SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브 모두는 모든 포지티브 시료를 골라내는데 100% 감도 및 특이성을 나타냈다. 표 5를 참조한다.
Figure pct00005
실시예 2
또한, 표준 곡선으로부터 얻어진 Ct 값을 비교함으로써, 혈액, 혈청 또는 플라즈마로부터 수집된 감염 시료로부터 기생생물 적재(parasite load)를 수량화할 수 있다.
용균반 검사에 의한 복제수의 산출 프로토콜( Protocol for calculation of copy number by plaque assay )
베로(Vero)의 합류 단분자막(Confluent monolayer)이 6웰 플레이트(well plate)에 제조되었다. 바이러스의 10배(fold) 희석물(101 내지 107 )은 냉장 보존 배지(1% 혈청을 갖는 MEM)에 제조되었다. 배양 배지가 제거되고, 바이러스 접종원(inoculums) 0.2ml가 첨가되어 최고 희석이 시작되었다(0.2ml of the virus inoculums was then added starting from the highest dilution.). 배지의 막이 세포 시트로 완전히 덮이는 것을 확실하게 하는데 주의한다(Care was taken to ensure that a film of medium completely covered the cell sheet.). 플레이트를 간헐적으로 흔들면서 1시간 동안 37℃에서 배양했다. 접종원을 피펫으로 제거한 후, 아가로오스로 오버레이(overlay) 배지(0.3% 아가로오스 및 2.5% FCS를 갖는 성장 배지) 1.5ml를 이것에 첨가했다. 오버레이 배지를 단분자막에 고르게 퍼뜨린 후, 이것을 10분 동안 실온에 두고, 그 후 37℃에서 배양하는 것을 확실하게 하는데 주의한다. 배양 이틀째부터 단분자막을 매일 관찰했다. 플라크(plaques)을 감염 후 4일째까지 현상시키면, 각 희석물(dilution)에서의 플라크(plaques)의 수가 계측된다. 아가로오스 오버레이가 제거되고, 단분자막을 PBS로 조심스럽게 세정하고 플레이트를 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액에 유지시키고, 플라크(plaques)를 다시 계측했다. 바이러스 역가(titre)를 적절한 희석물에서 플라크의 수를 계측함으로써 ml 당 플라크 생성 단위(pfu/ml)로서 추산했다. 예컨대: -
생성된 플라크의 수=9
바이러스의 희석도=1x105
접종원의 체적=0.2ml
바이러스 역가=9 x 1 x 105x 5 pfu/ml = 4.5 x 106
도 1에 나타낸 표준 곡선 및 Ct에 대한 표준 곡선 값은 표 6에 제공되었다.
Figure pct00006
결론
a) SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브 모두는 포지티브 시료 모두를 골라냈다(picked up). 이들은 네가티브 시료에 어떠한 거짓 증폭도 나타내지 않았다. 따라서, 100% 특이성 및 100% 감도를 보여준다.
b) 전체 평가 연구에 기초하여, SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 실시간 PCR에 기초한 치쿤군야 검출에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BIGTEC PRIVATE LIMITED <120> Probes and primers for detection of Chikungunya <130> IP11223 <140> 00439/CHE/2009 <141> 2009-02-25 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Chikungunya virus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(26) <400> 1 ttcgatgcca tcatagccgc acactt 26 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Chikungunya virus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(20) <400> 2 ccctgctccc agcccccttg 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Chikungunya virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <400> 3 cctcctaccc aatgtacata cactattt 28 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Chikungunya virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 4 cctgttggca aataccacgt t 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Chikungunya virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <400> 5 aggaggctat gtccgtttct aaaa 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Chikungunya virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <400> 6 tcatgacgtt gtcctcaagc at 22

Claims (23)

  1. SEQ ID Nos.1 및 2를 갖는 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 치쿤군야의 검출을 위한 것인, 프로브.
  3. 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지(labels)와 콘쥬게이트되는, SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 프로브는 5' 말단에서 형광단(fluorophore), 3' 말단에서 퀀처(quencher)와 콘쥬게이트되는, 프로브.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체 VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)(FAM), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 프로브.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine)[TAMRA], 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4'-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 블랙홀 퀀처 염료(Black Hole Quencher dyes)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 프로브.
  7. 제5항 및 제6항에 있어서,
    상기 바람직한 형광단은 5' 말단에서 6-카르복시 플루오레세인[FAM]이고, 상기 바람직한 퀀처는 3' 말단에서 테트라 메틸 로다민[TAMRA]인, 프로브.
  8. SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos 3 및 4를 갖는 프라이머는 센스 프라이머이고, 상기 SEQ ID Nos 5 및 6을 갖는 프라이머는 안티-센스 프라이머인, 프라이머.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos 3 및 5를 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 1의 프로브에 대응하고, 상기 SEQ ID Nos 4 및 6을 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 2의 프로브에 대응하는, 프라이머.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지(labels)와 선택적으로 콘쥬게이트되는, 프라이머.
  12. 치쿤군야의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)로서:
    상기 혼합물은 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID Nos. 1 및 2를 포함하는 군으로부터 선택된 프로브, SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6을 포함하는 군으로부터 선택된 대응하는 프라이머를 포함하는, PCR 반응 혼합물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos 3 및 5를 갖는 프라이머는 상기 SEQ ID No. 1의 프로브에 대응하고, SEQ ID Nos 4 및 6을 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 2의 프로브에 대응하는, 반응 혼합물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 선택적으로 콘쥬게이트되는, 반응 혼합물.
  15. 제12항에 있어서,
    시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택되는, 반응 혼합물.
  16. 이하 단계를 포함하는, 치쿤군야 감염을 검출하고 선택적으로 수량화하는 방법으로:
    (a) 핵산 증폭 시약, SEQ ID Nos. 1 및 2를 포함하는 군으로부터 선택된 프로브 및 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6을 포함하는 군으로부터 선택된 대응하는 프라이머를 검출할 시료를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 타겟 시퀀스의 복제물을 얻기 위해 반응 혼합물에 PCR을 실행한 후, 치쿤군야 감염을 검출하기 위한 형광 신호의 증가를 측정하는 단계; 및
    (c) 치쿤군야 감염을 수량화하기 위한 복제수를 얻기 위해 검출된 신호로부터 표준 곡선을 선택적으로 구성하는 단계.
  17. 제16항에 있어서,
    SEQ ID Nos 3 및 4를 갖는 프라이머는 센스 프라이머이고, SEQ ID Nos 5 및 6을 갖는 프라이머는 안티-센스 프라이머이고, 상기 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos 3 및 5를 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 1의 프로브에 대응하고, 상기 SEQ ID Nos 4 및 6을 갖는 프라이머는 SEQ ID No. 2의 프로브에 대응하는, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 콘쥬게이트되고, 상기 형광 신호는 5' 말단에서 형광단, 3' 말단에서 퀀처를 갖는 프로브에 의해 생성되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체 VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)(FAM), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine)[TAMRA], 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 블랙홀 퀀처 염료(Black Hole Quencher dyes)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 치쿤군야 감염의 검출을 위한 키트로서:
    상기 키트는 각각의 또는 조합의 SEQ ID Nos.1 및 2의 프로브; 각각의 또는 조합의 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머의 대응하는 짝 및 증폭 시약을 포함하는, 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 SEQ ID Nos. 1 및 2를 갖는 프로브는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 둘다에서 검출가능한 표지와 선택적으로 콘쥬게이트되는, 키트.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 증폭 시약은 마그네슘 클로라이드, Taq 중합효소(polymerase) 및 증폭용 완충제(buffer)를 포함하는 조합인, 방법.
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