CN102443051B - 一种检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，该编码基因序列中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。本发明还公开了该重组抗原蛋白的制备方法。另外，本发明公开的基孔肯雅病毒的检测试剂盒中包含包被有上述重组抗原蛋白的抗体检测板和ELISA反应液。本发明的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与基孔肯雅病毒抗体具有极高亲和力，能够快速、准确地检测基孔肯雅病毒抗体，从而诊断基孔肯雅病毒的感染情况。

Description

一种检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种诊断基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原的基孔肯雅病毒检测试剂盒。

背景技术

基孔肯雅病毒是一种重要的虫媒传播性传染病病原，随着人口流动性增强、生态环境改变等原因，其流行频率及流行范围在全球有日益扩大的趋势。2006年以来，基孔肯雅热席卷南亚的科摩多、毛里求斯、塞舌尔、马达加斯、马约特、法属留尼旺岛及印度，并迅速向欧洲、加拿大、加勒比海、南部美洲和美国扩散，导致数百万人染病，对公共卫生安全造成严重威胁。2010年9月底，我国东莞市暴发基孔肯雅热，并迅速导致数百人发病，这是我国首次出现的基孔肯雅流行，由于临近亚运会，作为一种新发传染病引起了媒体的广泛关注及民众的恐慌。我南方各省区地处热带、亚热带，气候炎热潮湿，媒介蚊虫种类繁多，广泛存在基孔肯雅病毒的宿主与传播媒介，随着全球范围内人员及经济往来的日益频繁，存在再次输入、暴发的可能。基孔肯雅病毒主要通过蚊虫叮咬在人群中传播，传播速度快，危害大，容易造成民众恐慌。因此，提前开展其快速检测技术的研究及产品储备，对公共卫生安全保障具有十分重要的意义。

目前用于病毒免疫学检测方法中，酶联免疫吸附试验(ELISA)方法速度快，对实验要求不高，并能自动化、高通量的检测大量样品，同时也具有灵敏度高、可靠性强的优势，并且已经在不同的病原体检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫人员熟练掌握，具有较高的应用价值。免疫胶体金快速诊断技术则是基于酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、免疫胶体金技术的新型技术，于1989年首次用于检测抗人类免疫缺陷病毒的抗体，其操作更为简便快速，只 需几分钟，阳性反应肉眼可见，不需特殊仪器，不受环境温度影响，试剂稳定易长期保存、特异性和敏感性均较高等优点，特别适用于野外以及实验条件不具备的场所使用，并已在多种病毒的检测中得到应用。在基层单位，以上两种方法有其他方法无法代替的优势，而其关键均在于特异性强、亲和力高抗原的制备，以提高特异性及检出率。

现有技术中，关于基孔肯雅病毒免疫学诊断方法的研究方面，国内也已经见过多篇报道，但由于不同虫媒病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种虫媒病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。同时，由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染也十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与基孔肯雅病毒抗体具有极高亲和力。

本发明的所解决的技术问题在于提供一种基孔肯雅病毒的检测试剂盒，利用所制备的重组抗原蛋白，建立基孔肯雅病毒抗体的ELISA快速检测技术。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该重组抗原蛋白是通过选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表答而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。

另一方面，本发明具体实施方式中还提供了一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

一、选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQID NO.1所示氨基酸序列。

优选地，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

正向引物：CGGGATCCCCGCTGGCAAATGTAACATG<SEQ ID NO.3>

反向引物：ACGCAAGCTTTTATTATGTACCGTTTGCAGATAACTG<SEQ ID NO.4>。

优选地，在本发明的一个具体实施例中所述原核表达载体选用pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。

对于本发明的重组抗原蛋白，其具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与基孔肯雅病毒抗体具有极高亲和力。在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，验证了本发明的重组抗原蛋白具有极高的特异性，并获取了能高效表达基孔肯雅病毒特异性重组抗原的基因工程菌株，同时结合采用了该重组抗原蛋白的基孔肯雅病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验和对具体临床标本的测试试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白在用于检测基孔肯雅病毒时表现出的高灵敏度、高特异性的优势。

对于本发明的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了基孔肯雅病毒蛋白中 呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠，同时结合上述方案中涉及的专用引物，有效地获取了该目的基因，同时结合该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表达效果。另外，在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，同时结合采用了该重组抗原蛋白的基孔肯雅病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验和对具体临床标本的测试试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白的制备方法在高效表达重组抗原蛋白、以及保证本发明重组抗原蛋白的高灵敏度、高特异性方面表现出的优势。

另外，本发明还提供了一种基孔肯雅病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，所述抗体检测板上包被有检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

其中，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为基孔肯雅病毒抗体标准品，阴性对照为基孔肯雅病毒抗体阴性血清。

优选地，在本发明具体实施例中所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。

优选地，在本发明的一个具体实施例中，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤：

一、重组抗原蛋白的制备，包括如下步骤：

(1)、选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

(2)、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

(3)、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

(4)、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQID NO.1所示氨基酸序列；

二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4℃包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5％牛血清白蛋白溶液于37℃封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板。

再则，结合本发明的重组抗原蛋白用于基孔肯雅病毒的检测试剂盒的具体实施方式，充分说明了本发明的重组抗原蛋白在制备诊断基孔肯雅病毒试剂盒中的运用，能够保证基孔肯雅病毒诊断过程中的灵敏度和特异性。

还需要说明的是，本发明的研发单位为全军及广东省虫媒病毒专业实验室，收集了国内较为全面的虫媒病毒毒株，并制备了其标准血清，为重组抗原蛋白的特异性验证奠定了良好基础。结合实施例中揭示的实验内容可以看出，实验中在保证反应原性的基础上，尽量缩短了抗原片段长度，确保所筛选的原核表达抗原具备良好的特异性，与所测试的辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山、盖塔、登革1～4型、流行性乙型脑炎、黄热及西尼罗河病毒均无交叉反应。同时，所建立的制备方法及基孔肯雅病毒的检测试剂盒均具备较高灵敏度及检出范围，以基孔肯雅病毒小鼠免疫血清进行的实验表明，在血清1∶100～1∶12800倍稀释范围内，均可获得阳性结果，而且无非特异性结果。以基孔肯雅病毒患者血清进行的实验表明，在血清1∶100～1∶800倍稀释范围内，均可获得阳性结果，检测OD值在0.98以上，S/N比值在13以上。

附图说明

图1是本发明实施例1中基孔肯雅、西门利克病毒、罗斯河病毒多克隆抗体与原核表达抗原的western blot杂交结果；其中，A：SDS PAGE电泳图；B：基孔肯雅病毒病毒多克隆抗体Wester blot结果；C：西门利克病毒多克隆抗体Wester blot结果；D：罗斯河病毒病毒多克隆抗体Wester blot结果。M.蛋白分子量Marker；1.pMAL c2x；2.Chik p19+pMAL c2x；

图2是本发明实施例2中ELISA方法及其应用；其中，a：抗原包被浓度实验，A1～G1，A2～G2分别为重组抗原40ug/ml～0.00571ug/ml倍比稀释，H1、H2为未包被对照；b：ELISA特异性实验，A1，A2孔加基孔肯雅病毒抗体，B1，B2为辛德毕斯病毒，C1，C2为西门利克病毒，D1，D2为马雅罗病毒，E1，E2为罗斯河病毒，F1，F2为鹭山病毒，G1，G2为盖塔病毒H1，H2为登革1～4型病毒

A3，A4为流行性乙型脑炎病毒B3，B4为黄热病毒，C3，C4为西尼罗河病毒，D3，D4，E3，E4，F3，F4，G3，G4，H3，H4为阴性血清对照；c：ELISA敏感性实验，正交法法将鼠抗基孔肯雅病毒多克隆抗体进行稀释，测定ELISA方法敏感性；d：临床标本检测结果，A1～A4：20100216号患者血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果，B1～B4，20100217号患者血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果，C1～C4，20100218号患者血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果，D1～D4，20100219号患者血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果，E1～E4，20100220号患者血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果，F1～F4，G1～G4，阴性血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果，H1～H4，阳性血清100、200、400、800倍稀释后的检测结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

本发明的下列实施例中，选用的基孔肯雅病毒：WJ0601株，申请人实验室内有毒株样本；而实验中用的内切酶、连接酶、T载体购自大连TaKaRa公司。凝胶纯化回收及质粒快速提取试剂盒购自OMEGA公司。Trizol及反转录试剂购自Invitrogen公司。pET32a表达载体购自Novagen公司，pMAL-C2x表达载体购自New England Biolabs公司，Amylose Resin亲和层析试剂购自NEB公司， 表达宿主菌Rosetta(DE3)由本实验室传代保存。

实施例1、检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白的制备

按照如下步骤制备检测基孔肯雅病毒的重组抗原蛋白：

步骤一、选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

步骤二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

步骤三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

步骤四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

具体实现实现时，上述步骤一中，参考基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列，利用DNAstar及ANTHEPROT软件对其编码蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性进行详细分析，并参考Genbank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，初步筛选可能的抗原性片段25段。

步骤二中，根据步骤一种所选的抗原性片段，并结合多肽结构中需要的延伸区段，并通过优化设计与各区段对应的引物，通过PCR扩增相应的目的基因片段，从而使由延伸区段编码柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。为此，在本步骤的优选过程中，设计PCR扩增引物25对，如表一所示：

表一抗原片段克隆所用引物序列

其中，引物设计过程为根据抗原性分析结果设计表一中所述的引物25对，并分别于引物5’末端及3’末端导入BamH I及Hind III酶切位点。

作为获取目的基因片度的预先步骤，还需反转录基孔肯雅病毒的基因组，该反转录过程为：基孔肯雅病毒WJ0601株经C6/36细胞培养传代培养，采用Invitrogen的Trizol试剂提取病毒RNA，采用常规方法进行反转录获得其cDNA。

而后按如下条件进行PCR：

取cDNA2μl，10×PCR缓冲液5μl，正向引物、反向引物各2μl、dNTP 8μl、Taq 2U，补水至总体积50μl进行PCR扩增。反应参数为：95℃5min，然后94℃30s，55℃40s，72℃60s，共32次循环，最后一次循环后72℃延伸7min，扩增片段经纯化、回收后，-20℃保存备用。

步骤三中、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有目的基因片段的重组表达质粒。在本发明实施例中，所述原核 表达载体为pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。本步骤具体如下：

酶切：各取10ul经纯化的扩增产物，分别加入Buffer K 3ul，BamH I及Hind III各1ul(10U)，灭菌去离子水15ul，37℃酶切过夜。另取pMAL c2x表达载体质粒2ug，加入BufferK 3ul，BamH I及Hind III各1ul(10U)，灭菌去离子水补至30ul，37℃酶切过夜。酶切产物分别用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒纯化回收。

连接：取2ul经以上处理的pMAL c2x载体(约130ng)，5ul酶切目的片段(约40ng)，45℃加热5min，以使退火的粘端解链，立即冰浴10sec，加入T4DNA连接酶0.5U，连接酶Buffer 1ul，用灭菌四馏水补至10ul，16℃连接过夜。取重组质粒5ul转化感受态菌DH5a，加入无抗生素的LB液体培养基300ul，37℃复苏45min后，取100ul涂氨苄青霉素(100ug/ml)平皿，37℃培养18h。

重组子鉴定：挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定，PCR反应体：10×PCR缓冲液2μl，正向引物、反向引物各1μl、dNTP 0.4μl、Taq 2U，补水至总体积20μl进行PCR扩增。PCR反应条件同步骤二，阳性克隆送生物工程(上海)有限公司测序确认。经测序确认获正确重组表达质粒25组，并提取质粒，并-20℃保存备用。

步骤四中、将重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养表达宿主细胞，并检测其重组蛋白表达情况，在本实施例中本步骤具体为：挑经转化重组表达载体的表达宿主菌单菌落分别接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养4h，当OD值达0.6时，吸取未诱导对照菌1ml，并向剩余菌中加入诱导物IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，于37℃振荡培养4h，冰浴5min后，4℃、12000g离心2min收菌，并进行SDS-PAGE检测，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，考马斯亮蓝染色，验证重组蛋白表达情况。经本步实验，所构建的25个重组表达载体中11个获高效表达。

而后、对所获重组表达抗原进行western blot分析，以验证其免疫反应原性 及免疫学反应的特异性，在本实施例中本步骤具体为：SDS-PAGE电泳同步骤四，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，基孔肯雅、辛德毕斯、罗斯河病毒多克隆抗体1∶5000稀释，进行蛋白质印迹(western-blot)，验证表达抗原的反应特异性。获得能高效表达基孔肯雅病毒特异性重组抗原的基因工程菌株一株：E.coli-CHIK19。因此，在本发明实施例中，最终优化得到的目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，而重组抗原蛋白则具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，与之对应的，在步骤二中，所选择采用的PCR扩增引物序列如下：

正向引物：CGGGATCCCCGCTGGCAAATGTAACATG<SEQ ID NO.3>

反向引物：ACGCAAGCTTTTATTATGTACCGTTTGCAGATAACTG<SEQ ID NO.4>。

即对应表一中chik-p19-1和chik-p19-2。

另外，通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用于ELISA实验的重组抗原蛋白，本实施例中本步骤具体为：E.coli-CHIK19菌过夜培养物10ml接种1L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡培养2～3小时，待OD值达0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续37℃振荡培养4小时后，离心收获细菌，并用PBS洗涤两次，50mlPBS重悬，超声波破碎细菌后，采用NEB公司Amylose Resin亲和层析柱纯化纯化重组蛋白，核酸蛋白分析仪测定其浓度为9627ug/ml。

如图1所示，进行SDS-PAGE实验和蛋白质印迹，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，基孔肯雅、辛德毕斯、罗斯河病毒多克隆抗体1∶5000稀释，进行蛋白质印迹(western-blot)，验证表达抗原的反应特异性，并获得能高效表达基孔肯雅病毒特异性重组抗原的基因工程菌株。而后通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用于ELISA实验的重组抗原蛋白。

实施例2、重组抗原蛋白的包被实验

在本实施例中需要对本发明的重组抗原蛋白的包被条件和浓度进行优化；为了达到此目的还需要先对试剂盒中ELISA反应液成分进行说明：

酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG多克隆抗体；

阳性对照：基孔肯雅热患者血清。

阴性对照：基孔肯雅病毒抗体阴性人血清。

样品稀释液：10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；

浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

显色液A：0.02％H2O2；用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠，PH4.5～5.0稀释。

显色液B：0.4‰TMB-HCl：用50mM柠檬酸钠，浓HCl调PH值为2.8的溶液溶解。

终止液：2M H₂SO₄

将上述实施例1中获取的纯化重组抗原蛋白抗原分别以40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.07534ug/ml浓度包被酶联板，每孔用量100ul，4℃包被过夜，PBST洗涤3分钟，拍干，5％BSA 37℃封闭2小时，鼠抗基孔肯雅病毒多克隆抗体1∶5000倍稀释后取100ul加入反应孔，37℃反应1小时，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，HRP标记抗鼠二抗1∶10000倍稀释后，每孔加入100ul，37℃反应40分钟，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，每孔加入TMB底物溶液100ul，37℃反应15分钟，加入50ul 2M H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，如表二所示，结果显示在包被浓度1.25～20ug/ml范围内，实验OD值无明显差别，最终选择抗原包被浓度为5ug/ml。

表二抗原包被浓度实验

实施例3、ELISA反应条件优化

对抗原包被条件及ELISA反应条件进行系统优化，最终确定最佳ELISA反应条件为：重组抗原100ul(浓度为10ug/ml)4℃包被过夜，PBST洗涤3分钟，拍干，5％BSA 37℃封闭2小时，待检血清1∶100倍稀释后取100ul加入反应孔，37℃反应1小时，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，HRP标记二抗1∶10000倍稀释后，每孔加入100ul，37℃反应40分钟，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，每孔加入TMB底物溶液100ul，37℃反应15分钟，加入50ul 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

实施例4、试剂盒的特异性实验

采用实施例3中的优化条件进行ELISA实验，选择含有辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山、盖塔、登革1～4型、流行性乙型脑炎、黄热及西尼罗河病毒的样品作为特异性实验参考样品，如表二所示，本发明的基孔肯雅病毒的检测试剂盒及其采用的重组抗原蛋白具有良好的特异性，与上述参考样品均无交叉反应。

表三基孔肯雅病毒ELISA检测方法特异性实验

实施例5、试剂盒的灵敏度实验

将实施例1中获取的纯化重组抗原蛋白以10ug/ml包被酶联板，通过正交法法对鼠抗基孔肯雅病毒多克隆抗体进行稀释，采用实施3中的优化条件进行 ELISA实验，如表三所示，测定其检出范围为1∶100～1∶12800。

表三基孔肯雅病毒ELISA检测方法敏感性实验

实施例5、试剂盒的临床标本检测实验

利用本发明实施例2和3中公开的试剂盒及实验方法进行ELISA实验，对5份2010年东莞市基孔肯雅病毒患者血清进行检测，检测结果见表四所示，在患者血清1∶100～1∶800倍稀释范围内，阳性血清ELISA反应OD值在0.98以上，S/N比值均在20以上。

表四临床标本检测情况

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离 本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

正向引物：CGGGATCCCCGCTGGCAAATGTAACATG<SEQ ID NO.3>

反向引物：ACGCAAGCTTTTATTATGTACCGTTTGCAGATAACTG<SEQ ID NO.4>。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达载体为pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。

6.一种基孔肯雅病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于：所述抗体检测板上包被有检测基孔肯雅病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为基孔肯雅病毒抗体标准品，阴性对照为基孔肯雅病毒抗体阴性血清。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于:所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。

9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤：

一、重组抗原蛋白的制备，包括如下步骤：

(1)、选择基孔肯雅病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

(2)、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

(3)、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

(4)、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白氨基酸序列如SEQID NO.1所示；

二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4℃包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5％牛血清白蛋白溶液于37℃封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板。

10.如权利要求1或2所述的重组抗原蛋白在制备诊断基孔肯雅病毒试剂盒中的运用。