CN116425840B - 一种特异性多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及多肽技术领域，具体公开了一种特异性多肽及其应用。所述特异性多肽为：如SEQ ID No：1～6任一氨基酸序列所示的多肽。本申请基于CHIKV E2蛋白序列合成特异性多肽，制备多肽微阵列芯片，利用CHIKV急性期、DENV急性期和健康体检人群的血清样本，筛选特异性多肽，以特异性多肽作为包被抗原，建立CHIKV IgM抗体检测方法，有效提高了检测基孔肯雅病毒IgM抗体的灵敏度。

Description

一种特异性多肽及其应用
技术领域
本申请涉及多肽技术领域，尤其是涉及一种特异性多肽及其应用。
背景技术
基孔肯雅病毒(CHIKV)和登革热病毒(DENV)是一类引起人类发热性疾病的虫媒病毒，由于它们的传播媒介和地理分布相同，很难通过临床表现区分鉴别CHIKV感染与登革热出血热(DHF)。此前，曾多次报道有DENV和CHIKV合并感染的病例，若以发热作为诊断CHIKV感染的标志物，敏感性仅为84％，阳性预测值(PPV)为71％，阴性预测值(NPV)为83％，在DENV流行地区很难与其它发热性疾病鉴别。目前可用于检测CHIKV的诊断方法包括病毒分离、RT-PCR、实时环介导等温扩增(LAMP)和抗原捕获ELISA等。这些方法非常敏感，但只能在发病的第一周内使用。经典的血清学检测方法如IgM和IgG检测、免疫荧光、补体结合和血凝抑制法也已被报道，但它们缺乏足够的特异性，需要受过训练的专业人员进行操作。
抗体检测具有价格低廉、现场快速检测等优点。据世界卫生组织(WHO)指南提出，基于MAC-ELISA(IgM antibody-capture ELISA)检测IgM抗体是诊断CHIKV感染最广泛使用的血清学检测方法。用ELISA评估CHIKV血清中的IgM抗体，通常适用于CHIKV患者出现症状的第3～8天，在发病后3～5周内IgM抗体迅速上升并达到峰值，随后在1～3个月内回落并逐渐消退。由于IgM抗体在感染过程中产生的时间晚于抗原，在检测急性期样本时其灵敏度要低于恢复期样本，因此，疾病延迟诊断和管理有效成本升高风险显著增加。据既往研究报道，与恢复期样本(症状发作后≥7天，灵敏度达98.4％)相比，IgM抗体检测试验对急性期样本(症状发作后1～7天)的敏感性较低，约为4％～20％，且易于与其它甲病毒(罗斯河病毒、巴尔马森林病毒和辛德毕斯病毒)的交叉反应而导致假阳性。
制备合适的抗原是阻碍ELISA应用的因素之一。基于灭活的完整CHIKV颗粒或重组病毒样颗粒的Mac-ELISA在检测IgM抗体时表现出良好的诊断性能，但是，制备完整病毒抗原既困难又昂贵，且存在病毒灭活不彻底出现生物安全事故的危险。CHIKV E2蛋白是一种潜在的血清学诊断靶抗原，可以刺激感染机体的免疫反应，诱导产生高水平的特异性抗体。将其作为诊断抗原可以消除由外来抗体引起的潜在背景，减少非特异性反应发生的频率，同时也可以消除类风湿因子引起的假阳性反应。但是，利用原核系统表达重组亚单位E2蛋白，往往以包涵体的形式存在，难以还原空间构象，而真核表达系统成本高、表达量低，较难推广生产。
多肽在诊断病毒、细菌、寄生虫和自身免疫性疾病方面中的作用已被证明。合成多肽的优势在于既增强了抗原的特异性，同时通过避免与其它病毒之间的交叉序列来消除非特异性反应。传统鉴定多肽表位的方法包括多肽微阵列芯片、多肽ELISA、免疫印迹杂交技术、X射线衍射结晶学、噬菌体展示技术、核磁共振波谱及生物信息学技术等。多肽微阵列芯片是近年来发展起来的一种研究多肽-蛋白质相互作用的高通量多肽鉴定技术，其原理是将靶标蛋白分解成多个肽段固定在硅、玻璃基质等固相载体上组成密集的微点阵。目前已广泛应用于病原体鉴定、感染状态监测、辅助性诊断和药物敏感性测试等传染病领域。
因此，亟需一种检测灵敏度高、成本低的检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种特异性多肽及其应用，本申请拟通过多肽芯片技术确定CHIKV E2蛋白免疫优势肽段建立抗体检测方法，以提高现有检测方法的敏感性或灵敏度。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一目的，本申请提供了一种特异性多肽，所述特异性多肽包含：
如SEQ ID No：1～6任一氨基酸序列所示的多肽。
本申请的发明人经过大量实验获得上述氨基酸序列的特异性多肽，本申请的特异性多肽具有高特异性和高灵敏度，将其作为包被抗原，可以提高检测基孔肯雅病毒IgM抗体的灵敏度，实现对现有血清学IgM抗体检测方法的有益补充。并且本申请的特异性多肽分子量小，化学结构简单，减少和避免与其它病原体交叉反应，特异性和灵敏度更高。
本申请的特异性多肽来源于病原体自身优势表位，结合位点单一，可以克服大蛋白存在空间位阻效应。
本申请基于CHIKV E2蛋白序列合成线性表位，制备多肽微阵列芯片，利用CHIKV急性期、DENV急性期和健康体检人群的血清样本，筛选本申请的特异性多肽，以特异性多肽作为包被抗原，建立CHIKV IgM抗体检测方法，为检测CHIKV IgM抗体提供有效的补充手段，克服了目前商业化IgM检测试剂盒存在灵敏度较低、价格昂贵等问题。
第二目的，本申请提供了一种特异性多肽的组合物，所述特异性多肽的组合物包括如SEQ ID No.1～6氨基酸序列所示的多肽中的至少两种。
作为本申请所述特异性多肽的组合物的优选实施方式，所述特异性多肽的组合物包括下述(a)和(b)；
(a)：如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：5任一氨基酸序列所示的多肽；
(b)如SEQ ID No：2、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6任一氨基酸序列所示的多肽；
(a)和(b)不能为相同多肽。
作为本申请所述特异性多肽的组合物的优选实施方式，所述(a)和(b)的质量比为1:1。(a)和(b)以同样的起始浓度按照1:100比例包被。
作为本申请所述特异性多肽的组合物的优选实施方式，所述特异性多肽的组合物还包括以下(1)～(6)的任意一种；
(1)如SEQ ID No：1氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：2氨基酸序列的所示多肽和如SEQ ID No：6氨基酸序列的所示多肽；
(2)如SEQ ID No：1氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：5氨基酸序列的所示多肽和如SEQ ID No：6氨基酸序列的所示多肽；
(3)如SEQ ID No：2氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：5氨基酸序列的所示多肽和如SEQ ID No：6氨基酸序列的所示多肽；
(4)如SEQ ID No：1氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：2氨基酸序列的所示多肽和如SEQ ID No：5氨基酸序列的所示多肽；
(5)如SEQ ID No：1氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：2氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：5氨基酸序列的所示多肽和如SEQ ID No：6氨基酸序列的所示多肽；
(6)如SEQ ID No：1氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：2氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：3氨基酸序列的所示多肽、如SEQ ID No：4氨基酸序列的所示多肽、如SEQID No：5氨基酸序列的所示多肽和如SEQ ID No：6氨基酸序列的所示多肽的组合。
当特异性多肽的组合物为上述组合时，分子量小，化学结构简单，减少和避免与其它病原体交叉反应，可以较好地提高检测基孔肯雅病毒IgM抗体的灵敏度。并且本申请的特异性多肽成分单纯且安全，批间批次差异小，适合长时间低温贮存，特异性多肽合成方便快捷、无感染性，成本低廉，最大程度上减少重组蛋白复杂的纯化程序。
第三目的，本申请提供了一种所述的特异性多肽的组合物的编码氨基酸。
第四目的，本申请提供了一种表达载体，所述表达载体是将所述的编码基因连接至基础载体上所获得。
第五目的，本申请提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白包含所述的特异性多肽。
第六目的，本申请提供了所述的特异性多肽或者所述的特异性多肽的组合物在作为检测基孔肯雅病毒IgM抗体的诊断抗原中的应用。
本申请的特异性多肽或者特异性多肽的组合物可以作为诊断抗原，表现出如下优势，(1)多肽成分单纯且安全，批间批次差异小，适合长时间低温贮存；(2)分子量小，化学结构简单，减少和避免与其它病原体交叉反应，特异性和灵敏度更高；(3)大多数多肽来源于病原体自身优势表位，结合位点单一，可以克服大蛋白存在空间位阻效应；(4)合成方便快捷、无感染性，成本低廉，最大程度上减少重组蛋白复杂的纯化程序。本申请筛选的特异性多肽或者多肽组合可作为诊断抗原快速建立间接ELISA检测方法，该法有效提高了IgM抗体的诊断价值，有效降低了生产成本，具有广阔的临床应用前景。
第七目的，本申请提供了一种基孔肯雅病毒IgM抗体的诊断抗原，所述诊断抗原包括所述的特异性多肽或者所述的特异性多肽的组合物。
第八目的，本申请提供了所述的特异性多肽或者所述的特异性多肽的组合物在制备检测基孔肯雅病毒IgM抗体的试剂盒或试纸条中的应用。
作为本申请所述应用的优选实施方式，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
第九目的，本申请提供了一种检测基孔肯雅病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包含所述的特异性多肽或者所述的特异性多肽的组合物。
作为本申请所述检测基孔肯雅病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的优选实施方式，所述ELISA试剂盒中，使用包被液稀释特异性多肽或特异性多肽组合，特异性多肽或特异性多肽组合稀释后的浓度为1.25～10μg/mL。
作为本申请所述检测基孔肯雅病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的优选实施方式，所述ELISA试剂盒还包括包被山羊抗人IgM抗体的酶标板、阳性对照物、阴性对照物、洗涤液、显色液和终止液。
所述洗涤液包括PBST缓冲液，不仅仅局限于此，还包括本领域中常规的洗涤液。
本申请提供的ELISA试剂盒检测可能存在潜在交叉反应的DENV和SARS-CoV-2阳性血清，CHIKV阳性血清和健康体检血清作为阳、阴性对照，DENV和SARS-CoV-2血清按照Cut-off值均被判定为阴性，无交叉反应，特异性较高。本申请建立的检测基孔肯雅病毒抗体的ELISA试剂盒具有较好的重复性和稳定性，相较于商品化试剂盒，检测基孔肯雅病毒抗体的ELISA试剂盒的敏感性更高。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请提供一种特异性多肽及检测基孔肯雅病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，本申请基于CHIKV E2蛋白序列合成线性表位，制备多肽微阵列芯片，利用CHIKV急性期、DENV急性期和健康体检人群的血清样本，筛选特异性线性表位序列(特异性多肽)，以特异性表位肽段作为包被抗原，建立CHIKV IgM抗体检测方法。所述特异性多肽分子量小，化学结构简单，减少和避免与其它病原体交叉反应，特异性和灵敏度更高，且来源于病原体自身优势表位，结合位点单一，可以克服大蛋白存在空间位阻效应，因此本申请的特异性多肽可以作为诊断抗原快速建立间接ELISA检测方法，该法有效提高了IgM抗体的诊断价值，有效降低了生产成本，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为多肽微阵列芯片血清学检测及分析流程图；
图2为实施例2中批内核批间重复试验之间IgM信号强度的相关性结果图(图2-A：批内重复性试验IgM信号强度相关性；图2-B：批间重复性IgM信号强度相关性)；
图3为比较CHIKV Group、Normal Group和DENV Group之间IgM抗体反应荧光信号强度结果图；
图4为本申请检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法检测CHIKV IgM抗体阴性的人血清标本的结果图；
图5为本申请检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法的灵敏度鉴定结果图；
图6为本申请检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法的特异性鉴定结果图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、特异性多肽的设计、合成及多肽微阵列芯片的制备
本申请利用在线网站https://www.novopro.cn/tools/peptide-library-design.html设计线性重叠多肽库，覆盖CHIKV/SL-CK1 E2(Ser326-Gln666)氨基酸全长序列(全长覆盖341个氨基酸)，序列以层叠式切割，每个多肽长度为10-mer，相邻多肽序列中有5个重叠的氨基酸残基，共生成68条多肽，以C1-C68命名。多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，纯度为90％。多肽以冻干粉形式贮存，DMSO或灭菌双蒸水溶解，制备多肽。将多肽固定在蛋白芯片表面，通过多肽上的羧基与芯片表面的氨基结合形成肽键，将多肽固定在蛋白芯片表面。使用Scienio AG点样仪制备定制多肽微阵列，点样方阵设计为14×10的形式，每张玻片由16个子阵列组成，子阵列的左上和右下两角为人源IgM阳性对照点，多肽分布于中央区，多肽固定后静置稳定一周。将制备好的多肽微阵列芯片干燥后，在4℃、真空下贮存备用。利用多肽微阵列芯片在CHIKV Group、DENV Group和Normal Group上鉴定和评估CHIKV抗原表位多肽诊断价值和诊断效能，最终确定能有效区分CHIKV与DENV的抗原多肽表位。本发明中多肽微阵列芯片血清学检测及分析流程如图1所示。
实施例2、基孔肯雅病毒IgM抗体的多肽微阵列芯片的血清学检测
为了评估微阵列数据的可重复性，随机选择了一例CHIKV急性期血清，在两个个独立的微阵列上进行相关性分析及评估同一血清样本在不同组别的数据可重复性。
将血清样品分别按照不同病种共设置为三组，即CHIKV Group(23例血清)、DENVGroup(20例血清)和Normal Group(20例血清)。所有血清样本稀释200倍后，取100μL血清加入多肽微阵列芯片(实施例1制备的多肽微阵列芯片)进行点样。每个孔中加100μL封闭液，室温摇床上孵育1h。弃去封闭液，加入100μL待检血清样品，于摇床4℃下孵育过夜。使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机按照标准程序清洗玻片。加入80μL Anti-IgM(1:5000稀释)抗体，于摇床上37℃下孵育2h。清洗玻片后，加入80μCy3偶联的链霉亲和素，于37℃摇床上避光孵育1h。使用InnoScan 300激光扫描仪记录荧光强度。扫描图像使用Genepix Pro7.0软件处理，在波长532nm处采集多肽和阳性对照荧光信号值及多肽芯片背景信号值。
如图2所示，结果发现整个子阵列平均荧光强度的Pearson相关系数r值为0.9873(图2-A)。此外，发现重复实验的总体荧光强度范围非常相似，基于微阵列IgM血清分析的重现性较好(图2-B)。
63例血清样本与多肽微阵列芯片孵育后，扫描获得荧光图像，减除数据背景，将归一化的荧光强度进行log2变换，分析CHIKV Group、Normal Group和DENV Group三组之间差异性多肽引起的IgM抗体反应。以Q值<0.05作为筛选差异性多肽标准，从CHIKV Group与Normal Group中共鉴定出59条差异性多肽，如图3所示。在此基础上，计算比较CHIKV Group与DENV Group血清中IgM抗体响应强度，发现25条多肽存在显著差异，且差异具有统计学意义(Q<0.05)。25条候选多肽诊断效能信息见表1。
表1应用ROC曲线筛选检测特异性多肽
注：ROC代表受试者工作特征曲线；CI代表可信区间。
根据平均荧光信号强度计算上述纳入的25条特异性多肽AUC值，以评估诊断效能，发现25条多肽的AUC值均在0.65以上。选择AUC≥0.8且P<0.05的多肽作为下一轮候选多肽，共纳入6条多肽，为C11、C26、C31、C32、C42和C51，其氨基酸序列分别为C11:SLQIGIKTDD(氨基酸序列如SEQ ID No：1所示)；C26:THPFHHDPPV(氨基酸序列如SEQ ID No：2所示)；C31:LPCSTYVQST(氨基酸序列如SEQ ID No：3所示)；C32:YVQSTAATTE(氨基酸序列如SEQ ID No：4所示)；C42:SNEGLTTTDK(氨基酸序列如SEQ ID No：5所示)；C51:RKGKIHIPFP(氨基酸序列如SEQ ID No：6所示)。6条多肽的灵敏度和特异度诊断模型见表2。
表2单多肽与联合多肽诊断模型在最佳诊断界值的灵敏度和特异度
综合考虑多肽C11、C26、C31、C32、C42和C51的诊断效能及P/N值，最终选择多肽C51作为建立IgM抗体检测方法的候选多肽。不同多肽及其组合的P/N值见表3。
表3不同多肽及组合
注：P代表阳性OD450测定值，N代表阴性OD450测定值。
实施例3、一种检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法(间接ELISA法)
将单条多肽和多肽组合按照1:100倍稀释预先涂布于96孔ELISA板，37℃孵育1h。弃包被液，0.05％ PBST缓冲液洗板3次，加入1:100倍预先稀释的CHIKV和DENV阳性血清，37℃下孵育45min。0.05％ PBST缓冲液洗板3次，每孔加入1:2000稀释的HRP-山羊抗体IgM抗体，37℃下孵育45min，0.05％ PBST缓冲液洗板5次。TMB避光显色10min，1M HCl终止反应，在450nm波长处测定吸光度。
通过方阵法优化多肽最适包被浓度和血清最适稀释度。用包被液(pH9.6)将包被的多肽稀释为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，每孔100μL，37℃孵育1h。弃包被液，0.05％ PBST缓冲液洗板3次，加入100μL预稀释的CHIKV和DENV阳性血清，其稀释度设置为1:100、1:200、1:400、1:500，37℃下孵育45min。0.05％PBST缓冲液洗板5次，每孔加入100μLTMB显色液，室温下避光反应10min，显色后加入50μL 2M H2SO4终止反应。用酶标仪在450nm波长处记录吸光度。结果判定：当阳性对照OD450测定值(P)与阴性对照OD450测定值(N)的比值(P/N)最大时，判定为包被多肽与血清的最优工作浓度。
以上述实验确定的多肽和血清最适工作浓度为基础，建立IgM抗体间接ELISA法，优化封闭液的成分、封闭时间、血清孵育时间、酶标山羊抗人IgM抗体稀释浓度和孵育时间及TMB显色时间。其中，选择BSA(浓度为3％或5％)或脱脂牛奶(3％或5％)作为封闭液，IgM抗体稀释度设为1:1000、1:2000、1:4000、1:5000。封闭时间、血清和IgM抗体孵育时间均设置为30min、45min、60min和90min，TMB显色时间设置为5min、10min、15min和20min。其余参数和流程参述上述实验实施。
对上述工作条件进行探索后，最终设置多肽间接ELISA法的最适工作条件如下：5μg/mL多肽包被ELISA板，每孔100μL，37℃孵育1h。弃包被液，0.05％ PBST缓冲液洗板3次，加入200μL 5％BSA封闭液，37℃封闭60min。0.05％ PBST缓冲液洗板3次，加入待检血清，37℃孵育60min。0.05％ PBST缓冲液洗板5次，加入100μL1:200预稀释的酶标IgM抗体，37℃下孵育60min。0.05％ PBST缓冲液洗板5次，每孔加入100μL TMB显色液，室温下避光反应20min，显色后加入50μL 2M H2SO4终止反应。多肽间接ELISA法的工作条件及参数见表4。
表4间接ELISA最佳反应条件
注：P代表阳性OD450测定值，N代表阴性OD450测定值。
上述间接ELISA法阴阳性临界值判定标准：
利用上述最终优化的工作条件(实施例3)，建立间接ELISA法，检测30份CHIKV IgM抗体阴性的人血清标本。设定该方法的Cut-off值。结果判定：统计阴性样品OD450值的平均值和标准差，即当样品OD450值>平均值+3×标准差时，判定为阳性；样品OD450值<平均值+2×标准差，判定为阴性；平均值+2×标准差≤样品OD450值≤平均值+3×标准差，判定为疑似。
结果如图4所示，30份CHIKV阴性血清样本的OD450平均值为0.170，3×标准差值为0.182，即通过本研究建立的多肽间接ELISA法Cut-off值为0.352。判定标准如下：当待测样品OD450值≥0.352时，判定为CHIKV阳性样品；样品OD450值<0.352时，判定为CHIKV阴性样品。
实施例4、本申请检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法的敏感性、特异度和重复性评估
(1)多肽间接ELISA法敏感性试验
将CHIKV和DENV阳性血清按照1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、12800二倍梯度稀释。利用优化后的特异性多肽间接ELISA法，测定CHIKV阳性血清OD450测定值，当最高稀释倍数的OD450测定值高于Cut-off阈值时，即为多肽间接ELISA法的灵敏度。
结果如图5所示，当CHIKV阳性血清稀释至1:800时，OD450测定值仍高于Cut-off值，判断为阳性，说明多肽间接ELISA法灵敏度较高。
(2)多肽间接ELISA法特异性试验
选取DENV和SARS-CoV-2血清各5份作为待检样本(1:200稀释)，利用优化后的特异性多肽间接ELISA法检测样本，设置CHIKV阳性血清和健康体检血清作为阳、阴性对照，根据测定的OD450值和临界值评价其特异性。
结果如图6所示，DENV和SARS-CoV-2血清按照Cut-off值均被判定为阴性，无交叉反应，特异性较高。
(3)多肽间接ELISA法重复性试验
批内重复性试验，将CHIKV阳性血清分别按照100倍、200倍和400倍稀释，取同一批次预先制备的ELISA板，用优化后的特异性多肽间接ELISA法检测3个稀释倍数的血清样本(E2蛋白)，设置4个生物学重复，计算批内OD450值的变异系数(CV)，评价其批内重复性。
批间重复性试验，将CHIKV阳性血清分别按照100倍、200倍和400倍稀释稀，取不同批次预先制备的ELISA板，用优化后的特异性多肽间接ELISA法检测3个稀释倍数的血清样本，设置4个生物学重复，计算批间OD450值的变异系数(CV)，评价批间重复性。每个稀释度分别在同一批次和不同批次的ELISA板中重复4次，结果如表5所示，批内和批间重复性试验的CV范围分别为1.658％～6.132％和2.299％～9.744％，CV均小于10％，表明建立的多肽间接ELISA法具有较好的重复性和稳定性。
表5多肽间接ELISA法准确性检测
注：CV代表变异系数。
实施例5、本申请检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法的初步应用
准备20份RT-PCR法检测CHIKV呈阳性的人血清样品，20份qRT-PCR法检测DENV呈阳性的人血清样品，利用本申请建立的检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法和商品化ELISA试剂盒(新赛美试剂盒)检测血清样本，评价诊断价值。
按照新赛美试剂盒的说明书操作。室温平衡试剂盒20min，设置阴、阳性对照孔，各加入阴、阳性对照品50μL。待检样品孔先加入血清样本10μL，再加入样本稀释液40μL。随后向阴、阳性对照孔和样品孔中加入100μL HRP标记的抗体检测液，板膜封孔，37℃恒温培养箱孵育60min。弃去孔内液体，每孔加入350μL 1×洗涤液，静置1min，弃去洗涤液，吸水纸拍干，重复洗板5次。每孔加入新赛美试剂盒的底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入50μL终止液，在450nm波长处测定吸光度。结果判定：统计阴性对照OD450值的平均值，即当待检样品OD450值>平均值+0.15时，判定为阳性；待检样品OD450值<平均值+0.15，判定为阴性。
利用本申请建立的检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法分别检测20份CHIKV和20份DENV核酸检测阳性样品，结果如表6所示，在20份CHIKV阳性样本中，多肽间接ELISA法共检出16份阳性样本，检出率80.00％(95％CI＝55.73％～93.39％)，而商业化试剂盒(新赛美试剂盒)阳性共检出3份阳性样本，检出率仅为15.00％(95％CI＝3.96％～38.86％)。相较于商品化试剂盒，多肽间接ELISA法敏感性更高。
表6间接ELISA法与新赛美商品化试剂盒检测IgM抗体对CHIKV感染的诊断价值
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.特异性多肽在作为检测基孔肯雅病毒IgM抗体的诊断抗原中的应用，其特征在于，所述特异性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No：6所示。
2.特异性多肽在制备检测基孔肯雅病毒IgM抗体的试剂盒或试纸条中的应用，其特征在于，所述特异性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No：6所示。
3.一种检测基孔肯雅病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包含特异性多肽，所述特异性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No：6所示。
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