JPH0767700A - 合成ペプチドを使用するhtlv試験 - Google Patents

合成ペプチドを使用するhtlv試験

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JPH0767700A
JPH0767700A JP6023616A JP2361694A JPH0767700A JP H0767700 A JPH0767700 A JP H0767700A JP 6023616 A JP6023616 A JP 6023616A JP 2361694 A JP2361694 A JP 2361694A JP H0767700 A JPH0767700 A JP H0767700A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 Cys−His−Glu−Val−Asp−
Lys−Asp−Ile−Ser−Gln−Leu−G
ly、Cys−Ala−Gln−Asn−Arg−Ar
g−Gly−Leu−Asp−Leu−Leu−Gl
y、Cys−Ile−Leu−Gln−Glu−Arg
−Pro−Pro−Leu−Glu−Asn−Gly、
天然に存在するヒト免疫グロブリンと反応する前述のい
ずれかの実際の決定因子の部分、および前記ペプチドの
組み合わせから成る群より選択されるペプチドを用い
て、患者の血清試料中のHTLV特異性抗体を検出する
方法。 【効果】 患者の血清試料中のHTLVを高感度で検出
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の分野】本発明は、合成ペプチドを利用する検定
に関し、さらに詳しくは、ヒトT細胞白血病ウイルスの
エンベロープに対して特異性の抗体を検出する検定に関
する。
【0002】
【発明の背景】HTLV IまたはヒトT細胞白血病ウ
イルスI型は、白血病の少なくともある形態に対する病
原性有機体として同定されてきた。このウイルスは多く
の研究の首題であり、そしてまた獲得免疫欠乏症候群
(Acquired Immune Deficien
cy Syndrome)(AIDS)に結びつけられ
てきた。細菌の研究によると、I型ウイルスはHTLV
III型ウイルスと密接に関係づけられ、多分ロバー
ト・ガロ(Robert Gallo)博士,ナショナ
ル・キャンサー・インスチチュート・ラボラトリー(N
ational Cancer Institute
Laboratory)の研究に基づいてAIDSにさ
らに一層関係づけられることが示された。III型ウイ
ルスはNCIと関連して研究しているパスツール研究所
(Pastuer Institute)における研究
グループにより同定されたLMVウイルスと多分同一で
ある;これを確証する研究は現在進行中である。
【0003】AIDSは破壊的病気であり、ここで個体
は免疫学的に非受容性(incompetent)とな
りそして、事実上すべての場合において、現在適切な治
療が存在しないので、予後は確実に死である。この病気
の発生はなお多くの推測の首題であるが、AIDSおよ
び同様なウイルス的に引き起こされる状態は感染した共
与体からの輸血により獲得されうる。AIDSに関係す
る病気の診断の複雑性は、これらの病気が症候が現われ
る前の関係のある潜伏期、一般に2年程度によりしばし
ば特徴づけらるという事実による。
【0004】本発明の目的は、このような病気を有する
かあるいは病原性有機体に免疫学的にさらされた人を、
症候的状態が現われるかなり前に同定および診断するこ
とができる、高度に診断的な試験を提供することであ
る。
【0005】これらのウイルスの有機体の不確かな見掛
上高度に効力のない性質のため、ウイルスを含有しかつ
そうでなければ健康である人への伝搬を防止するために
異常な手段を取る必要性により、研究はきびしく妨害さ
れてきた。事実、ウイルスのある部分を、その見掛けの
不活性化にかかわらず、用いる試験の研究または製作に
よろこんで加わる必要な度量をもつ人を発見することが
非常に困難でありかつしばしば不可能であるというスチ
グマ(stigma)により、この有機体は取囲まれて
いる。
【0006】本発明の関連する目的は、不活性化された
ウイルスに頼らず、したがって感染の脅威を付与しない
試験を提供することである。
【0007】同様に、不活性化されたウイルスを利用し
て開発された従来のワクチンは製作が困難であろう。い
ったん製作されると、理解できるボランティアの助けが
ないことにより試験は困難であろう。これらの困難は、
長い効力のない時間、病気の感染的性質、および前もっ
てさらされていない人または健康な「対照(contr
ol)」の同定の現在の不可能性と組み合って、必要な
市販の承認の獲得を効果的に妨害しあるいは不都合に遅
延している。
【0008】本発明のなお他の関連する目的は、感染の
脅威を付与せず、それにもかかわらずワクチンとして有
用である物質を提供することである。
【0009】
【発明の要約】本発明の原理および目的に従えば、個々
にあるいは組み合わせて、利用してHTLV特異性免疫
グロブリンを含有する患者の流体試料を同定することが
できる合成ペプチドが提供される。ここで提供される合
成ペプチドは、HTLVウイルスのエンベロープ(en
velope)蛋白質の特異性の選択された部分によく
似ており、それゆえ感染の脅威を付与しうる遺伝情報を
含有しない。こうして、これらの合成ペプチドは、免疫
診断的にばかりでなく、かつまたHTLVエンベロープ
に対して特異性の抗体の発生のためのワクチンとして使
用することができる。こうして、ワクチン接種された個
体は、将来のHTLVにより脅かされる感染を処理する
ために免疫学的に一層受容性となる。
【0010】
【発明および最良の方法の詳細な説明】前もって決定し
た結合特異性および他の生物学的応用、例えば、診断的
検定などの抗体をレイズ(raise)するための合成
ペプチドの使用は、スクリップス研究所(Scripp
s Institute)のリチャード・ラーナー(R
ichard Lerner)によりネイチャー(Na
ture)299:592(1982)により前に報告
された。しかしながら、このような方法は、従来妨害さ
れてきており、合成ペプチドの動物への注入によりレイ
ズされた抗体は、合成ペプチドがまねようと案出された
対応する抗原または有機体に対する自然にレイズされた
抗体に相当せず、前記抗体により遮断されず、および/
または前記抗体を遮断しない。したがって、合成ペプチ
ドの有用性は、今日まで、一般にきびしく制限されたき
た。なぜなら、自然に存在する抗体および合成ペプチド
でレイズされた抗体は多少異るように反応するか、ある
いは異る抗原決定因子を認識するからである。こうし
て、一方の抗体による反応性の存在を、他方の抗体の存
在を予測または検出するために使用することはできない
であろう。
【0011】ある選択したHTLVエンベロープの区
域、とくに本発明のポリペプチド配列をもつ区域では、
上の事実が適用されないことが、本発明者らにより驚く
べきことには発見された。
【0012】全体のHTLV I型ゲノム配列は、セイ
キ(Seiki)ら,プロシーディング・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Nat
l.Acad. Sci.)Vol.80:3618−
3622(June 1983)に記載された。このゲ
ノムの配列は、もちろん、完全な感染性ウイルスをつく
るために必要な情報のすべてを含有する。しかしなが
ら、本発明の以前まで、この配列のどの部分が免疫学的
に関連するエンベロープの抗体決定因子に相当するか、
あるいは合成ペプチドの作成の経るこのような決定因子
の発生が完全な感染性HTLV粒子に対して自然に発生
するものに匹敵する抗体を免疫学的にレイズするかどう
かに関する表示は存在しなかった。
【0013】本発明の好ましい配列は、次の手順の組み
合わせにより選択された。エンベロープのハイドロパシ
シティ(hydropathicity)は、ホップ
(Hopp)ら,「アミノ酸配列からの蛋白質抗原決定
因子の予測(Prediction of Prote
in Antigenic Determinants
From Amino Acid Sequence
s)」,プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ(Proc. Natl.Aca
d. Sci.)Vol.78(6):3824−38
28(June1981)に記載されているように、ホ
ップ(Hopp)およびウッド(Woods)らにより
供給される不足値(default value)を使
用して計算した。これらの手順を使用して、次の値が誘
導された: A −.499 T −.399 Q .2
00 G 0 D 3.000 W −3.3
99 M −1.299 I −1.799 F −2.4
99 S .300 P 0 L −1.7
99 C −.999 V −1.499 R 3.0
00 H −.499 E 3.000 Y −2.2
99 N .200 K 3.000 ここで、HTLVエンベロープ遺伝子については次の通
りである: アミノ酸分布 名 称 数 % A=アラニン 30 6.1 C=システイン 18 3.7 D=アスパラギン酸 14 2.9 E=グルタミン酸 10 2.0 F=フエニルアラニン 17 3.5 G=グリシン 25 5.1 H=ヒスチジン 16 3.3 I=イソロイシン 22 4.5 K=リジン 16 3.3 L=ロイシン 73 14.9 M=メチオニン 3 .6 N=アスパラギン 20 4.1 P=プロリン 47 9.6 Q=グルタミン 23 4.7 R=アルギニン 16 3.3 S=セリン 54 10.0 T=スレオニン 26 5.3 V=バリン 26 5.3 W=トリプトフアン 13 2.7 Y=チロシン 19 3.9 このポリペプチドについての分子量=53954.73。
【0014】残基iにおけるハイドロパシシティの平均
はi−3を通りi+2を含む6残基を横切って計算し
た。ハイドロパシシティの最大は残基No.351にお
いて1.666667であった。次いで、アミノ酸配列
のハイドロパシシティを、インテリジェニティクス・イ
ンコーポレーテッド(IntelliGenetic
s,Inc.)からのインテリジェニティクスのソフト
ウェアーを使用して疎水性および親水性の区域を誘導し
て分析し、そして表1の値を誘導した。
【0015】
【表1】
【0016】
【表2】
【0017】
【表3】
【0018】
【表4】
【0019】
【表5】
【0020】
【表6】
【0021】
【表7】
【0022】
【表8】
【0023】
【表9】
【0024】
【表10】
【0025】残基の番号の後の“+”または“−”は帯
電した残基を示す。
【0026】残基“.”は平均のハイドロパシシテイ値
の計算に含められていない。
【0027】したがって、表Iにカッコで示されている
親水性区域が、次の主構造を有する合成ペプチドをつく
るために選択された: Cys−His−Glu−Val−Asp−Lys−Asp−Ile−Ser− Gln−Leu−Gly (i) Cys−Ala−Gln−Asn−Arg−Arg−Gly−Leu−Asp− Leu−Leu−Gly (ii) Cys−Ile−Leu−Gln−Gln−Arg−Pro−Pro−Leu− Glu−Asn−Gly (iii) HTLVエンペロープ遺伝子の二次構造を、チオウ(C
hou)およびフアスマン(Fasman)の方法[バ
イオケミトスリー(Biochemistry)13
(1974)222;アドバンス・イン・エンジモロジ
ー(Adv. Engymol(1978)47
5;アニユアル・リビユー・イン・バイオケミストリー
(Annu. Rev. Biochem.(197
8)47 251]を用いてまた計算した:
【0028】
【表11】
【0029】
【表12】
【0030】AAAAAA= アルフアらせん BBBBB = ベータ・シート TTTT = 回転(回転の頻度>=absTurn
Min) T?T? = 他の可能な回転(回転の頻度>) このアルゴリズムに通じている者には容易に理解される
ように、予測される二次構造は蛋白質内に極めて多い変
動が存在するので単なる表示である。さらに、二次構造
のアルゴリズムはなお高度に実験的である。しかしなが
ら、表1においてi、iiおよびiiiとして示す3つ
の選択した親水性部位における多数のA、BおよびTに
より証明されるような蛋白質の複雑な性質は、事実免疫
学的反応性の概念に相関関係をもつように思われる。
【0031】選択したペプチドをベックマン(Beck
man)990ペプチド合成器で合成し、そしてフッ化
水素HF装置を使用して樹脂から単離した。合成ペプチ
ドをゲルのカラムおよびHPLCにより分離および精製
し、そしてアミノ酸組成を逆相HPLC(構成能液体ク
ロマトグラフィー)によりペプチドの同定により検査し
た。これらの方法は最近の刊行物において当業者によく
知られるようになったので、ここでは検討しない。
【0032】次いで、前記合成ペプチドを使用して標準
の免疫化技術によりウサギにおいてポリクロナル抗血清
を発生させた。また、コーラー(Kohler)および
マイルシュタイン(Milstein),ネイチャー
(Nature)225(1974)に実質的に記載さ
れるハイブリドーマ手順により、ネズミのモノクロナル
抗体を前記3種類の合成ペプチドに対してレイズした。
ポリクロナル抗体およびモノクロナル抗体の両者は、他
方のペプチドと交差反応しないで、それ自身のペプチド
の各々に対する特異的結合を立証した。
【0033】また、ポリクロナル抗体およびモノクロナ
ル抗体は、結合を崩壊させ、そしてHTLVに化学的に
固定し、次いで微小力価(microtiter)の板
[バイオテク・リサーチ・ラボラトリーズ(Biote
ch Research Laboratories)
から入手した]上へ被覆した。こうして、これらの抗体
またはそれらの断片を、また、多数のよく知られた免疫
検定のフォーマットのいずれにおいても診断的に使用す
ることができる。
【0034】本発明のペプチドからレイズした抗体は驚
くほどにかつ予期せざるほどに自然の完全なHTLVを
認識することができるので、AIDSまたは白血病の患
者中に天然に存在する抗体がまた前記ペプチドを認識で
きるであろうと思われた。
【0035】前記3種類のペプチドを混合し、そして微
小力価の板の上へ被覆し、ここでそれらをメタノールで
固定した。既知のAIDSおよびARCの患者から、
「正常者」からおよび「AIDS対照」からの血清試料
を、免疫学的反応を促す適当なかつ慣用の温度、時間お
よびpHの条件下に、それらと反応させた。未反応の成
分を除去し、そして反応した抗体を抗ヒトIgGとの反
応により直接標識付けた。前記抗ヒトIgGはそれへ取
り付けられたセイヨウワサビのペルオキシダーゼの酵素
標識を有した。基質のo−フェニレンジアミンを添加
し、そして生ずる色の発現を約490nmにおいて分光
測光的に監視した。結果を添付図面に示す。検定を最適
化することが明らかに必要せあるにもかかわらず、本発
明のペプチドの少なくとも1種またはそれらの組み合わ
せを使用して有用な試験を案出できることが明らかであ
る。現在、このデータを比較すべき標準または許容され
た値が存在しないことをまた認識しなくてはならない。
現在「正常」であると信じられている人は、事実平均の
人の代表であり、そしてほぼすべての人が、ある時また
は他の時に、AIDS病原性有機対のさらされたが、未
知の理由で、その病気に対してして首尾よく抵抗性であ
ったと信じられる。こうして、「正常」はAIDS病原
性有機体にさらされ、こうして免疫学的抵抗を発現して
いることがありうる。
【0036】エプステイン・バール・ニュークリアー抗
原(Epstein Barr nuclear an
tigen)類を除外して、これは自然に存在する抗体
を合成的にレイズさせたペプチドと反応させた最初であ
り、あるいはペプチドに対してレイズさせた抗体を完全
ウイルスと反応させた最初である。HTLV III型
およびHTLV I型はきわめて密接に類似するので、
本発明の好ましい合成ペプチドはこれらのウイルスのい
ずれかあるいは双方の検出に同等に適用することができ
るであろうことが予測される。多くて、2つのウイルス
のエンベロープ区域は1つまたは2つのアミノ酸が異る
だけであろう。本発明の合成ペプチドのこのような小さ
い変更は等しくここにおいて考えられ、そして同等であ
ると見なされる。さらに、臨界区域すなわち抗体により
実際に認識される区域はここに記載するペプチドの一部
分のみである可能性があり、そしてこれらはまた同等と
見なされるべきである。
【0037】しかしながら、ここに記載する3つのペプ
チドは、侵入性有機体に対して自然にレイズされた抗体
の異質性のために、別々に使用することができ、好まし
い実施態様は合成ペプチドの混合物、最も好ましい実施
態様にすべて3つを使用して、HTLVウイルスに対す
るすべての可能な自然の抗体の検出を最大とする。記載
する実施例において使用する相対的比率は各々のペプチ
ドの等量であったが、最適化は他の比率をより有利であ
ると示すことがあろう。最適化の手順は簡単でありかつ
熟練した研究者の知力の範囲内であろう。
【0038】当業者は容易に理解するように、本発明の
合成ペプチドは拮抗的(competitive)また
は非拮抗的特性を有する種々の異質および均質の免疫検
定フォーマットに配合をたてることができる。好ましい
実施態様は固相、例えば、微小力価のウェル(wel
l)の表面上に合成ペプチドを使用し、そしてその上で
患者の血清試料(または検出すべき抗体またはウルス粒
子を含有するこのような他の試料)を便利に反応させる
ことができる。HTLVウイルスに対して特異的の患者
の抗体は、存在する場合、次いで固定化された合成ペプ
チドと反応するであろう。(非拮抗的検定が記載される
場合、本発明はそのように限定されず、そして合成ペプ
チドについて拮抗的検定、例えば、試料のウイルス粒子
の存在下に供給される免疫グロブリンまたは免疫グロブ
リン断片が等しく考えられる。)次いで、血清試料の未
反応成分を好ましくは除去して、望まないバックグラウ
ンドおよび非特異的結合の他の源を除去する。その後、
ポリクロナルまたはモノクロナルの由来の標識抗ヒト免
疫グロブリンを使用して、患者の試料中に存在する場
合、合成ペプチドへここで取り付けられている抗HTL
Vヒト免疫グロブリンと反応させ、こうして標識付ける
ことができる。次いで、未反応の標識抗ヒト免疫グロブ
リン(水相)を除去し、そして固相または水相と関連す
る標識をよく知られた技術に従い測定する。このような
技術は、もちろん、使用する標識の性質に依存し、例え
ば、分光計または測色計を使用して、化学ルミネセンス
分子、蛍光分子、吸収性色素分子などにより発生された
蛍光、吸収などを検出することができる。例えば、いわ
ゆるELISA型方法に関連するように、ある反応成分
への酵素標識の活性からの生成物の発生および検出が等
しく考えられる。例えば、酵素、セイヨウワサビのペル
オキシダーゼを実施例において用いた。他の可能なマー
カーは、光散乱粒子、磁気粒子、アイソトープ、赤血
球、および合成および自然に存在する巨大および微小の
粒子を包含する。
【0039】発展中の研究の性質のため、およびAID
Sおよび他の関連する病気の完全な解釈は完全なものか
ら非常にはなれているという事実のため、本発明の検定
法は性質が定量的であり、すなわち、患者におけるHT
LV特異的抗体の存在はAIDSまたはAIDSに類似
する感染を指示しあるいは予後を物語る証拠であろうこ
とが容易に理解されるであろう。この理由は、現在、結
果を比較しかつ定量的分析を案出するための標準が存在
しないことにある。しかしながら、将来のある時点にお
いて、HTLV特異的抗体のあるレベルの存在は、病気
の差し迫った猛攻撃を必然的に示さないで、正常として
見なすことができることが予測される。このような時に
おいて、かつこのレベルが識別されたとき、本発明の合
成ペプチドおよび検定を定量的性質で用いることができ
る。
【0040】上の説明から当業者は容易に決定するよう
に、合成ペプチドまたはその抗体特異性の小さい変更、
ならびに合成ペプチドまたは抗体とともに使用するため
に入手可能な事実上種々の限定されない免疫検定のフォ
ーマットについての変更を、本発明の精神または範囲を
逸脱しないで、行うことができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の3種類のペプチドを混合し、そして微
小力価の板の上へ被覆し、ここでそれらをメタノールで
固定し、既知のAIDSおよびARCの患者から、「正
常者」からおよび「AIDS対照」からの血清試料を、
免疫学的反応を促す適当なかつ慣用の温度、時間および
pHの条件下に、それらと反応させ、未反応の成分を除
去し、そして反応した抗体を抗ヒトIgGとの反応によ
り直接標識付け、前記抗ヒトIgGがそれへ取り付けら
れたセイヨウワサビのペルオキシダーゼの酵素標識を有
し、基質のo−フェニレンジアミンを添加し、そして生
ずる色の発現を約490nmにおいて分光測光的に監視
して得られた結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 17/14 8318−4H G01N 33/53 D 33/574 C

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 工程: a)Cys−His−Glu−Val−Asp−Lys
    −Asp−Ile−Ser−Gln−Leu−Gly、
    Cys−Ala−Gln−Asn−Arg−Arg−G
    ly−Leu−Asp−Leu−Leu−Gly、Cy
    s−Ile−Leu−Gln−Glu−Arg−Pro
    −Pro−Leu−Glu−Asn−Gly、天然に存
    在するヒト免疫グロブリンと反応する前述のいずれかの
    実際の決定因子の部分、および前記ペプチドの組み合わ
    せから成る群より選択されるペプチドを準備し、 b)前記合成ペプチドを患者の試料とそれらの間の免疫
    学的反応を許す条件下に接触させ、そして c)前記免疫学的反応の発生を検出する、ことからなる
    ことを特徴とする患者の血清試料中に存在するHTLV
    特異性抗体の検出方法。
  2. 【請求項2】 前記合成ペプチドを固相上に固定化し、
    そして前記検出工程は前記合成ペプチドおよび前記患者
    の免疫グロブリンを接触させる工程をさらに含み、前記
    患者の免疫グロブリンは標識結合相手と反応しており、
    そして前記標識結合相手は前記合成ペプチドと反応した
    前記患者の免疫グロブリンに対して特異性である請求項
    1の方法。
  3. 【請求項3】 標識免疫グロブリンとの接触工程前に、
    未反応の血清試料の成分の実質的にすべてを除去する工
    程をさらに含む請求項2の方法。
  4. 【請求項4】 未反応の標識免疫グロブリンを除去する
    工程をさらに含み、そして前記検出工程は前記固相とあ
    るいは前記除去された未反応の免疫グロブリンと関連す
    る標識を検出することをさらに含む請求項3の方法。
  5. 【請求項5】 前記標識が蛍光分子、化学ルミネセンス
    分子、リン光分子、アイソトープ、酵素、光散乱粒子、
    磁気粒子、赤血球、巨大分子および微小粒子から成る群
    より選択される請求項4の方法。
  6. 【請求項6】 前記HTLVがI型ウイルスである請求
    項5の方法。
  7. 【請求項7】 前記HTLVがIII型ウイルスである
    請求項5の方法。
  8. 【請求項8】 Cys−His−Glu−Val−As
    p−Lys−Asp−Ile−Ser−Gln−Leu
    −Glyを認識する抗体。
  9. 【請求項9】 Cys−Ala−Gln−Asn−Ar
    g−Arg−Gly−Leu−Asp−Leu−Leu
    −Glyを認識する抗体。
  10. 【請求項10】 Cys−Ile−Leu−Gln−G
    lu−Arg−Pro−Pro−Leu−Glu−As
    n−Glyを認識する抗体。
  11. 【請求項11】 Cys−His−Glu−Val−A
    sp−Lys−Asp−Ile−Ser−Gln−Le
    u−Gly、Cys−Ala−Gln−Asn−Arg
    −Arg−Gly−Leu−Asp−Leu−Leu−
    Gly、Cys−Ile−Leu−Gln−Glu−A
    rg−Pro−Pro−Leu−Glu−Asn−Gl
    y、または天然に存在するヒト免疫グロブリンと反応す
    る前述のいずれかの実際の決定因子の部分を認識する抗
    体。
  12. 【請求項12】 Cys−His−Glu−Val−A
    sp−Lys−Asp−Ile−Ser−Gln−Le
    u−GlyおよびCys−Ala−Gln−Asn−A
    rg−Arg−Gly−Leu−Asp−Leu−Le
    u−GlyおよびCys−Ile−Leu−Gln−G
    lu−Arg−Pro−Pro−Leu−Glu−As
    n−Glyのうちの少なくとも2種よりなる組成物。
  13. 【請求項13】 Cys−His−Glu−Val−A
    sp−Lys−Asp−Ile−Ser−Gln−Le
    u−Gly、Cys−Ala−Gln−Asn−Arg
    −Arg−Gly−Leu−Asp−Leu−Leu−
    Gly、Cys−Ile−Leu−Gln−Glu−A
    rg−Pro−Pro−Leu−Glu−Asn−Gl
    y、および天然に存在するヒト免疫グロブリンと反応す
    る前述のいずれかの実際の決定因子の部分。
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