JPH08337597A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙに関する。 【解決手段】 ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）
又は自然に生じたＨＴＬＶに対する免疫グロブリンの検
出に有用なペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、合成ペプチドを利
用する検定に関し、さらに詳しくは、ヒトＴ細胞白血病
ウイルスのエンベロープに対して特異性の抗体を検出す
る検定に関する。

【０００２】

【発明の背景】ＨＴＬＶ ＩまたはヒトＴ細胞白血病ウ
イルスＩ型は、白血病の少なくともある形態に対する病
原性有機体として同定されてきた。このウイルスは多く
の研究の首題であり、そしてまた獲得免疫欠乏症候群
（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＡＩＤＳ）に結びつけられ
てきた。細菌の研究によると、Ｉ型ウイルスはＨＴＬＶ
ＩＩＩ型ウイルスと密接に関係づけられ、多分ロバー
ト・ガロ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏ）博士，ナショナ
ル・キャンサー・インスチチュート・ラボラトリー（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の研究に基づいてＡＩＤＳにさ
らに一層関係づけられることが示された。ＩＩＩ型ウイ
ルスはＮＣＩと関連して研究しているパスツール研究所
（Ｐａｓｔｕｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）における研究
グループにより同定されたＬＭＶウイルスと多分同一で
ある；これを確証する研究は現在進行中である。

【０００３】ＡＩＤＳは破壊的病気であり、ここで個体
は免疫学的に非受容性（ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）とな
りそして、事実上すべての場合において、現在適切な治
療が存在しないので、予後は確実に死である。この病気
の発生はなお多くの推測の首題であるが、ＡＩＤＳおよ
び同様なウイルス的に引き起こされる状態は感染した共
与体からの輸血により獲得されうる。ＡＩＤＳに関係す
る病気の診断の複雑性は、これらの病気が症候が現われ
る前の関係のある潜伏期、一般に２年程度によりしばし
ば特徴づけらるという事実による。

【０００４】本発明の目的は、このような病気を有する
かあるいは病原性有機体に免疫学的にさらされた人を、
症候的状態が現われるかなり前に同定および診断するこ
とができる、高度に診断的な試験を提供することであ
る。

【０００５】これらのウイルスの有機体の不確かな見掛
上高度に効力のない性質のため、ウイルスを含有しかつ
そうでなければ健康である人への伝搬を防止するために
異常な手段を取る必要性により、研究はきびしく妨害さ
れてきた。事実、ウイルスのある部分を、その見掛けの
不活性化にかかわらず、用いる試験の研究または製作に
よろこんで加わる必要な度量をもつ人を発見することが
非常に困難でありかつしばしば不可能であるというスチ
グマ（ｓｔｉｇｍａ）により、この有機体は取囲まれて
いる。

【０００６】本発明の関連する目的は、不活性化された
ウイルスに頼らず、したがって感染の脅威を付与しない
試験を提供することである。

【０００７】同様に、不活性化されたウイルスを利用し
て開発された従来のワクチンは製作が困難であろう。い
ったん製作されると、理解できるボランティアの助けが
ないことにより試験は困難であろう。これらの困難は、
長い効力のない時間、病気の感染的性質、および前もっ
てさらされていない人または健康な「対照（ｃｏｎｔｒ
ｏｌ）」の同定の現在の不可能性と組み合って、必要な
市販の承認の獲得を効果的に妨害しあるいは不都合に遅
延している。

【０００８】本発明のなお他の関連する目的は、感染の
脅威を付与せず、それにもかかわらずワクチンとして有
用である物質を提供することである。

【０００９】

【発明の要約】本発明の原理および目的に従えば、個々
にあるいは組み合わせて、利用してＨＴＬＶ特異性免疫
グロブリンを含有する患者の流体試料を同定することが
できる合成ペプチドが提供される。ここで提供される合
成ペプチドは、ＨＴＬＶウイルスのエンベロープ（ｅｎ
ｖｅｌｏｐｅ）蛋白質の特異性の選択された部分によく
似ており、それゆえ感染の脅威を付与しうる遺伝情報を
含有しない。こうして、これらの合成ペプチドは、免疫
診断的にばかりでなく、かつまたＨＴＬＶエンベロープ
に対して特異性の抗体の発生のためのワクチンとして使
用することができる。こうして、ワクチン接種された個
体は、将来のＨＴＬＶにより脅かされる感染を処理する
ために免疫学的に一層受容性となる。

【００１０】

【発明および最良の方法の詳細な説明】前もって決定し
た結合特異性および他の生物学的応用、例えば、診断的
検定などの抗体をレイズ（ｒａｉｓｅ）するための合成
ペプチドの使用は、スクリップス研究所（Ｓｃｒｉｐｐ
ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のリチャード・ラーナー（Ｒ
ｉｃｈａｒｄ Ｌｅｒｎｅｒ）によりネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）２９９：５９２（１９８２）により前に報告
された。しかしながら、このような方法は、従来妨害さ
れてきており、合成ペプチドの動物への注入によりレイ
ズされた抗体は、合成ペプチドがまねようと案出された
対応する抗原または有機体に対する自然にレイズされた
抗体に相当せず、前記抗体により遮断されず、および／
または前記抗体を遮断しない。したがって、合成ペプチ
ドの有用性は、今日まで、一般にきびしく制限されたき
た。なぜなら、自然に存在する抗体および合成ペプチド
でレイズされた抗体は多少異るように反応するか、ある
いは異る抗原決定因子を認識するからである。こうし
て、一方の抗体による反応性の存在を、他方の抗体の存
在を予測または検出するために使用することはできない
であろう。

【００１１】ある選択したＨＴＬＶエンベロープの区
域、とくに本発明のポリペプチド配列をもつ区域では、
上の事実が適用されないことが、本発明者らにより驚く
べきことには発見された。

【００１２】全体のＨＴＬＶ Ｉ型ゲノム配列は、セイ
キ（Ｓｅｉｋｉ）ら，プロシーディング・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）Ｖｏｌ．８０：３６１８−
３６２２（Ｊｕｎｅ １９８３）に記載された。このゲ
ノムの配列は、もちろん、完全な感染性ウイルスをつく
るために必要な情報のすべてを含有する。しかしなが
ら、本発明の以前まで、この配列のどの部分が免疫学的
に関連するエンベロープの抗体決定因子に相当するか、
あるいは合成ペプチドの作成の経るこのような決定因子
の発生が完全な感染性ＨＴＬＶ粒子に対して自然に発生
するものに匹敵する抗体を免疫学的にレイズするかどう
かに関する表示は存在しなかった。

【００１３】本発明の好ましい配列は、次の手順の組み
合わせにより選択された。エンベロープのハイドロパシ
シティ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）は、ホップ
（Ｈｏｐｐ）ら，「アミノ酸配列からの蛋白質抗原決定
因子の予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ
Ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ）」，プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．）Ｖｏｌ．７８（６）：３８２４−３８
２８（Ｊｕｎｅ１９８１）に記載されているように、ホ
ップ（Ｈｏｐｐ）およびウッド（Ｗｏｏｄｓ）らにより
供給される不足値（ｄｅｆａｕｌｔ ｖａｌｕｅ）を使
用して計算した。これらの手順を使用して、次の値が誘
導された： Ａ −.４９９ Ｔ −.３９９ Ｑ .２００ Ｇ ０ Ｄ ３.０００ Ｗ −３.３９９ Ｍ −１.２９９ Ｉ −１.７９９ Ｆ −２.４９９ Ｓ .３００ Ｐ ０ Ｌ −１.７９９ Ｃ −.９９９ Ｖ −１.４９９ Ｒ ３.０００ Ｈ −.４９９ Ｅ ３.０００ Ｙ −２.２９９ Ｎ .２００ Ｋ ３.０００ ここで、ＨＴＬＶエンベロープ遺伝子については次の通
りである： アミノ酸分布 名 称 数 ％ Ａ＝アラニン ３０ ６．１ Ｃ＝システイン １８ ３．７ Ｄ＝アスパラギン酸 １４ ２．９ Ｅ＝グルタミン酸 １０ ２．０ Ｆ＝フエニルアラニン １７ ３．５ Ｇ＝グリシン ２５ ５．１ Ｈ＝ヒスチジン １６ ３．３ Ｉ＝イソロイシン ２２ ４．５ Ｋ＝リジン １６ ３．３ Ｌ＝ロイシン ７３ １４．９ Ｍ＝メチオニン ３ ．６ Ｎ＝アスパラギン ２０ ４．１ Ｐ＝プロリン ４７ ９．６ Ｑ＝グルタミン ２３ ４．７ Ｒ＝アルギニン １６ ３．３ Ｓ＝セリン ５４ １０．０ Ｔ＝スレオニン ２６ ５．３ Ｖ＝バリン ２６ ５．３ Ｗ＝トリプトフアン １３ ２．７ Ｙ＝チロシン １９ ３．９ このポリペプチドについての分子量＝５３９５４．７３。

【００１４】残基ｉにおけるハイドロパシシティの平均
はｉ−３を通りｉ＋２を含む６残基を横切って計算し
た。ハイドロパシシティの最大は残基Ｎｏ．３５１にお
いて１．６６６６６７であった。次いで、アミノ酸配列
のハイドロパシシティを、インテリジェニティクス・イ
ンコーポレーテッド（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ，Ｉｎｃ．）からのインテリジェニティクスのソフト
ウェアーを使用して疎水性および親水性の区域を誘導し
て分析し、そして表１の値を誘導した。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】

【表３】

【００１８】

【表４】

【００１９】

【表５】

【００２０】

【表６】

【００２１】

【表７】

【００２２】

【表８】

【００２３】

【表９】

【００２４】

【表１０】

【００２５】残基の番号の後の“＋”または“−”は帯
電した残基を示す。

【００２６】残基“．”は平均のハイドロパシシテイ値
の計算に含められていない。

【００２７】したがって、表Ｉにカッコで示されている
親水性区域が、次の主構造を有する合成ペプチドをつく
るために選択された： Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ− Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ （ｉ） Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ （ｉｉ） Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ （ｉｉｉ） ＨＴＬＶエンペロープ遺伝子の二次構造を、チオウ（Ｃ
ｈｏｕ）およびフアスマン（Ｆａｓｍａｎ）の方法［バ
イオケミトスリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１３
（１９７４）２２２；アドバンス・イン・エンジモロジ
ー（Ａｄｖ． Ｅｎｇｙｍｏｌ（１９７８）４７ ４
５；アニユアル・リビユー・イン・バイオケミストリー
（Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７
８）４７ ２５１］を用いてまた計算した：

【００２８】

【表１１】

【００２９】

【表１２】

【００３０】ＡＡＡＡＡＡ＝ アルフアらせん ＢＢＢＢＢ ＝ ベータ・シート ＴＴＴＴ ＝ 回転（回転の頻度＞＝ａｂｓＴｕｒｎ
Ｍｉｎ） Ｔ？Ｔ？ ＝ 他の可能な回転（回転の頻度＞） このアルゴリズムに通じている者には容易に理解される
ように、予測される二次構造は蛋白質内に極めて多い変
動が存在するので単なる表示である。さらに、二次構造
のアルゴリズムはなお高度に実験的である。しかしなが
ら、表１においてｉ、ｉｉおよびｉｉｉとして示す３つ
の選択した親水性部位における多数のＡ、ＢおよびＴに
より証明されるような蛋白質の複雑な性質は、事実免疫
学的反応性の概念に相関関係をもつように思われる。

【００３１】選択したペプチドをベックマン（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ）９９０ペプチド合成器で合成し、そしてフッ化
水素ＨＦ装置を使用して樹脂から単離した。合成ペプチ
ドをゲルのカラムおよびＨＰＬＣにより分離および精製
し、そしてアミノ酸組成を逆相ＨＰＬＣ（構成能液体ク
ロマトグラフィー）によりペプチドの同定により検査し
た。これらの方法は最近の刊行物において当業者によく
知られるようになったので、ここでは検討しない。

【００３２】次いで、前記合成ペプチドを使用して標準
の免疫化技術によりウサギにおいてポリクロナル抗血清
を発生させた。また、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）および
マイルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ），ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）２２５（１９７４）に実質的に記載さ
れるハイブリドーマ手順により、ネズミのモノクロナル
抗体を前記３種類の合成ペプチドに対してレイズした。
ポリクロナル抗体およびモノクロナル抗体の両者は、他
方のペプチドと交差反応しないで、それ自身のペプチド
の各々に対する特異的結合を立証した。

【００３３】また、ポリクロナル抗体およびモノクロナ
ル抗体は、結合を崩壊させ、そしてＨＴＬＶに化学的に
固定し、次いで微小力価（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）の板
［バイオテク・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
から入手した］上へ被覆した。こうして、これらの抗体
またはそれらの断片を、また、多数のよく知られた免疫
検定のフォーマットのいずれにおいても診断的に使用す
ることができる。

【００３４】本発明のペプチドからレイズした抗体は驚
くほどにかつ予期せざるほどに自然の完全なＨＴＬＶを
認識することができるので、ＡＩＤＳまたは白血病の患
者中に天然に存在する抗体がまた前記ペプチドを認識で
きるであろうと思われた。

【００３５】前記３種類のペプチドを混合し、そして微
小力価の板の上へ被覆し、ここでそれらをメタノールで
固定した。既知のＡＩＤＳおよびＡＲＣの患者から、
「正常者」からおよび「ＡＩＤＳ対照」からの血清試料
を、免疫学的反応を促す適当なかつ慣用の温度、時間お
よびｐＨの条件下に、それらと反応させた。未反応の成
分を除去し、そして反応した抗体を抗ヒトＩｇＧとの反
応により直接標識付けた。前記抗ヒトＩｇＧはそれへ取
り付けられたセイヨウワサビのペルオキシダーゼの酵素
標識を有した。基質のｏ−フェニレンジアミンを添加
し、そして生ずる色の発現を約４９０ｎｍにおいて分光
測光的に監視した。結果を添付図面に示す。検定を最適
化することが明らかに必要せあるにもかかわらず、本発
明のペプチドの少なくとも１種またはそれらの組み合わ
せを使用して有用な試験を案出できることが明らかであ
る。現在、このデータを比較すべき標準または許容され
た値が存在しないことをまた認識しなくてはならない。
現在「正常」であると信じられている人は、事実平均の
人の代表であり、そしてほぼすべての人が、ある時また
は他の時に、ＡＩＤＳ病原性有機体にさらされたが、未
知の理由で、その病気に対してして首尾よく抵抗性であ
ったと信じられる。こうして、「正常」はＡＩＤＳ病原
性有機体にさらされ、こうして免疫学的抵抗を発現して
いることがありうる。

【００３６】エプステイン・バール・ニュークリアー抗
原（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎ
ｔｉｇｅｎ）類を除外して、これは自然に存在する抗体
を合成的にレイズさせたペプチドと反応させた最初であ
り、あるいはペプチドに対してレイズさせた抗体を完全
ウイルスと反応させた最初である。ＨＴＬＶ ＩＩＩ型
およびＨＴＬＶ Ｉ型はきわめて密接に類似するので、
本発明の好ましい合成ペプチドはこれらのウイルスのい
ずれかあるいは双方の検出に同等に適用することができ
るであろうことが予測される。多くて、２つのウイルス
のエンベロープ区域は１つまたは２つのアミノ酸が異る
だけであろう。本発明の合成ペプチドのこのような小さ
い変更は等しくここにおいて考えられ、そして同等であ
ると見なされる。さらに、臨界区域すなわち抗体により
実際に認識される区域はここに記載するペプチドの一部
分のみである可能性があり、そしてこれらはまた同等と
見なされるべきである。

【００３７】しかしながら、ここに記載する３つのペプ
チドは、侵入性有機体に対して自然にレイズされた抗体
の異質性のために、別々に使用することができ、好まし
い実施態様は合成ペプチドの混合物、最も好ましい実施
態様にすべて３つを使用して、ＨＴＬＶウイルスに対す
るすべての可能な自然の抗体の検出を最大とする。記載
する実施例において使用する相対的比率は各々のペプチ
ドの等量であったが、最適化は他の比率をより有利であ
ると示すことがあろう。最適化の手順は簡単でありかつ
熟練した研究者の知力の範囲内であろう。

【００３８】当業者は容易に理解するように、本発明の
合成ペプチドは拮抗的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）また
は非拮抗的特性を有する種々の異質および均質の免疫検
定フォーマットに配合をたてることができる。好ましい
実施態様は固相、例えば、微小力価のウェル（ｗｅｌ
ｌ）の表面上に合成ペプチドを使用し、そしてその上で
患者の血清試料（または検出すべき抗体またはウルス粒
子を含有するこのような他の試料）を便利に反応させる
ことができる。ＨＴＬＶウイルスに対して特異的の患者
の抗体は、存在する場合、次いで固定化された合成ペプ
チドと反応するであろう。（非拮抗的検定が記載される
場合、本発明はそのように限定されず、そして合成ペプ
チドについて拮抗的検定、例えば、試料のウイルス粒子
の存在下に供給される免疫グロブリンまたは免疫グロブ
リン断片が等しく考えられる。）次いで、血清試料の未
反応成分を好ましくは除去して、望まないバックグラウ
ンドおよび非特異的結合の他の源を除去する。その後、
ポリクロナルまたはモノクロナルの由来の標識抗ヒト免
疫グロブリンを使用して、患者の試料中に存在する場
合、合成ペプチドへここで取り付けられている抗ＨＴＬ
Ｖヒト免疫グロブリンと反応させ、こうして標識付ける
ことができる。次いで、未反応の標識抗ヒト免疫グロブ
リン（水相）を除去し、そして固相または水相と関連す
る標識をよく知られた技術に従い測定する。このような
技術は、もちろん、使用する標識の性質に依存し、例え
ば、分光計または測色計を使用して、化学ルミネセンス
分子、蛍光分子、吸収性色素分子などにより発生された
蛍光、吸収などを検出することができる。例えば、いわ
ゆるＥＬＩＳＡ型方法に関連するように、ある反応成分
への酵素標識の活性からの生成物の発生および検出が等
しく考えられる。例えば、酵素、セイヨウワサビのペル
オキシダーゼを実施例において用いた。他の可能なマー
カーは、光散乱粒子、磁気粒子、アイソトープ、赤血
球、および合成および自然に存在する巨大および微小の
粒子を包含する。

【００３９】発展中の研究の性質のため、およびＡＩＤ
Ｓおよび他の関連する病気の完全な解釈は完全なものか
ら非常にはなれているという事実のため、本発明の検定
法は性質が定量的であり、すなわち、患者におけるＨＴ
ＬＶ特異的抗体の存在はＡＩＤＳまたはＡＩＤＳに類似
する感染を指示しあるいは予後を物語る証拠であろうこ
とが容易に理解されるであろう。この理由は、現在、結
果を比較しかつ定量的分析を案出するための標準が存在
しないことにある。しかしながら、将来のある時点にお
いて、ＨＴＬＶ特異的抗体のあるレベルの存在は、病気
の差し迫った猛攻撃を必然的に示さないで、正常として
見なすことができることが予測される。このような時に
おいて、かつこのレベルが識別されたとき、本発明の合
成ペプチドおよび検定を定量的性質で用いることができ
る。

【００４０】上の説明から当業者は容易に決定するよう
に、合成ペプチドまたはその抗体特異性の小さい変更、
ならびに合成ペプチドまたは抗体とともに使用するため
に入手可能な事実上種々の限定されない免疫検定のフォ
ーマットについての変更を、本発明の精神または範囲を
逸脱しないで、行うことができるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の３種類のペプチドを混合し、そして微
小力価の板の上へ被覆し、ここでそれらをメタノールで
固定し、既知のＡＩＤＳおよびＡＲＣの患者から、「正
常者」からおよび「ＡＩＤＳ対照」からの血清試料を、
免疫学的反応を促す適当なかつ慣用の温度、時間および
ｐＨの条件下に、それらと反応させ、未反応の成分を除
去し、そして反応した抗体を抗ヒトＩｇＧとの反応によ
り直接標識付け、前記抗ヒトＩｇＧがそれへ取り付けら
れたセイヨウワサビのペルオキシダーゼの酵素標識を有
し、基質のｏ−フェニレンジアミンを添加し、そして生
ずる色の発現を約４９０ｎｍにおいて分光測光的に監視
して得られた結果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓ
   ｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
   −Ｇｌｙ。