JP2574224B2 - ペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、合成ペプチドを利用する検定に関し、さら
に詳しくは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスのエンベロープ
に対して特異性の抗体を検出する検定に関する。

発明の背景 HTLV ＩまたはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型は、白
血病の少なくともある形態に対する病原性有機体として
同定されてきた。このウイルスは多くの研究の首題であ
り、そしてまた獲得免疫欠乏症候群（Acquired Immune
Deficiency Syndrome）（AIDS）に結びつけられてき
た。細菌の研究によると、Ｉ型ウイルスはHTLV III型
ウイルスと密接に関係づけられ、多分ロバート・ガロ
（Robert Gallo）博士，ナショナル・キャンサー・イ
ンスチチュート・ラボラトリー（National Cancer In
stitute Laboratory）の研究に基づいてAIDSにさらに
一層関係づけられることが示された。III型ウイルサはN
CIと関連して研究しているパスツール研究所（Pastuer
Institute）における研究グループにより同定されたL
MVウイルスと多分同一である；これを確証する研究は現
在進行中である。

AIDSは破壊的病気であり、ここで個体は免疫学的に非
受容性（incompetent）となりそして、事実上すべての
場合において、現在適切な治療が存在しないので、予後
は確実に死である。この病気の発生はなお多くの推測の
首題であるが、AIDSおよび同様なウイルス的に引き起こ
される状態は感染した共与体からの輸血により獲得され
る。AIDSに関係する病気の診断の複雑性は、これらの病
気が症候が現われる前の関係のある潜伏期、一般に２年
程度によりしばしば特徴づけられるという事実による。

本発明の目的は、このような病気を有するかあるいは
病原性有機体に免疫学的にさらされた人を、症候的状態
が現われるかなり前に同定および診断することができ
る、高度に診断的な試験を提供することである。

これらのウイルスの有機体の不確かな見掛上高度に効
力のない性質のため、ウイルスを含有しかつそうでなけ
れば健康である人への伝搬を防止するために異常な手段
を取る必要性により、研究はきびしく妨害されてきた。
事実、ウイルスのある部分を、その見掛けの不活性化に
かかわらず、用いる試験の研究または製作によろこんで
加わる必要な度量をもつ人を発見することが非常に困難
でありかつしばしば不可能であるというスチグマ（stig
ma）により、この有機体は取囲まれている。

本発明の関連する目的は、不活性化されたウイルスに
頼らず、したがって感染の脅威を付与しない試験を提供
することである。

同様に、不活性化されたウイルスを利用して開発され
た従来のワクチンは製作が困難であろう。いったん製作
されると、理解できるボランティアの助けがないことに
より試験は困難であろう。これらの困難は、長い効力の
ない時間、病気の感染的性質、および前もってさらされ
ていない人または健康な「対照（control）」の同定の
現在の不可能性と組み合って、必要な市販の承認の獲得
を効果的に妨害しあるいは不都合に遅延している。

本発明のなお他の関連する目的は、感染の脅威を付与
せず、それにもかかわらずワクチンとして有用である物
質を提供することである。

発明の要約 本発明の原理および目的に従えば、個々にあるいは組
み合わせて、利用してHTLV特異性免疫グロブリンを含有
する患者の流体試料を同定することができる合成ペプチ
ドが提供される。ここで提供される合成ペプチドは、HT
LVウイルスのエンベロープ（envelope）蛋白質の特異性
の選択された部分によく似ており、それゆえ感染の脅威
を付与しうる遺伝情報を含有しない。こうして、これら
の合成ペプチドは、免疫診断的にばかりでなく、かつま
たHTLVエンベロープに対して特異性の抗体の発生のため
のワクチンとして使用することができる。こうして、ワ
クチン接種された個体は、将来のHTLVにより脅かされる
感染を処理するために免疫学的に一層受容性となる。

発明および最良の方法の詳細な説明 前もって決定した結合特異性および他の生物学的応
用、例えば、診断的検定などの抗体をレイズ（raise）
するための合成ペプチドの使用は、スクリップス研究所
（Scripps Institute）のリチャード・ラーナー（Rich
ard Lerner）によりネイチャー（Nature）299:592（19
82）により前に報告された。しかしながら、このような
方法は、従来妨害されてきており、合成ペプチドの動物
への注入によりレイズされた抗体は、合成ペプチドがま
ねようと案出された対応する抗原または有機体に対する
自然にレイズされた抗体に相当せず、前記抗体により遮
断されず、および／または前記抗体を遮断しない。した
がって、合成ペプチドの有用性は、今日まで、一般にき
びしく制限されてきた。なぜなら、自然に存在する抗体
および合成ペプチドでレイズされた抗体は多少異るよう
に反応するか、あるいは異る抗原決定因子を認識するか
らである。こうして、一方の抗体による反応性の存在
を、他方の抗体の存在を予測または検出するために使用
することはできないであろう。

ある選択したHTLVエンベロープの区域、とくに本発明
のポリペプチド配列をもつ区域では、上の事実が適用さ
れないことが、本発明者らにより驚くべきことには発見
された。

全体のHTLV Ｉ型ゲノム配列は、セイキ（Seiki）
ら，プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）Vol.80:3618−
3622（June 1983）に記載された。このゲノムの配列
は、もちろん、完全な感染性ウイルスをつくるために必
要な情報のすべてを含有する。しかしながら、本発明の
以前まで、この配列のどの部分が免疫学的に関連するエ
ンベロープの抗体決定因子に相当するか、あるいは合成
ペプチドの作成の経るこのような決定因子の発生が完全
な感染性HTLV粒子に対して自然に発生するものに匹敵す
る抗体を免疫学的にレイズするかどうかに関する表示は
存在しなかった。

本発明の好ましい配列は、次の手順の組み合わせによ
り選択された。エンベロープのハイドロパシシティ（hy
dropathicity）は、ホップ（Hopp）ら，「アミノ酸配列
からの蛋白質抗原決定因子の予測（Prediction of Pr
otein Antigenic Determinants From Amino Acid
Sequences）」，プロシーディング・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）Vol.78（６）:3824−3828（June 1981）に記載さ
れているように、ホップ（Hopp）およびウッド（Wood
s）らにより供給される不足値（default value）を使
用して計算した。これらの手順を使用して、次の値が誘
導された： Ａ −.499 Ｔ −.399 Ｑ .200 Ｇ ０ Ｄ 3.000 Ｗ −3.399 Ｍ −1.299 Ｉ −1.799 Ｆ −2.499 Ｓ .300 Ｐ ０ Ｌ −1.799 Ｃ −.999 Ｖ −1.499 Ｒ 3.000 Ｈ −.499 Ｅ 3.000 Ｙ −2.299 Ｎ .200 Ｋ 3.000 ここで、HTLVエンベロープ遺伝子については次の通り
である： 残基ｉにおけるハイドロパシシティの平均はｉ−３を
通りｉ＋２を含む６残基を横切って計算した。ハイドロ
パシシティの最大は残基No.351において1.666667であっ
た。次いで、アミノ酸配列のハイドロパシシティを、イ
ンテリジェニティクス・インコーポレーテッド（Intell
iGenetics,Inc.）からのインテリジェニティクスのソフ
トウェアーを使用して疎水性および親水性の区域を誘導
して分析し、そして表１の値を誘導した。

したがつて、表Ｉにカツコで示されている親水性区域
が、次の主構造を有する合成ペプチドをつくるために選
択された： Cys−His−Glu−Val−Asp−Lys−Asp−Ile−Ser−Gln−Leu−Gly （ｉ） Cys−Ala−Gln−Asn−Arg−Arg−Gly−Leu−Asp−Leu−Leu−Gly （ii） Cys−Ile−Leu−Gln−Gln−Arg−Pro−Pro−Leu−Glu−Asn−Gly （iii） HTLVエンペロープ遺伝子の二次構造を、チオウ（Cho
u）およびフアスマン（Fasman）の方法〔バイオケミス
トリー（Biochemistry）13（1974）222;アドバンス・イ
ン・エンジモロジー（Adv.Engymol（1978）47 45;アニ
ユアル・リビユー・イン・バイオケミストリー（Annu.R
ev.Biochem.（1978）47 251〕を用いてまた計算した： このアルゴリズムに通じている者には容易に理解され
るように、予測される二次構造は蛋白質内に極めて多い
変動が存在するので単なる表示である。さらに、二次構
造のアルゴリズムはなお高度に実験的である。しかしな
がら、表１においてｉ、iiおよびiiiとして示す３つの
選択した親水性部位における多数のＡ、ＢおよびＴによ
り証明されるような蛋白質の複雑な性質は、事実免疫学
的反応性の概念に相関関係をもつように思われる。

選択したペプチドをベックマン（Beckman）990ペプチ
ド合成器で合成し、そしてフッ化水素HF装置を使用して
樹脂から単離した。合成ペプチドをゲルのカラムおよび
HPLCにより分離および精製し、そしてアミノ酸組成を逆
相HPLC（構成能液体クロマトグラフィー）によりペプチ
ドの同定により検査した。これらの方法は最近の刊行物
において当業者によく知られるようになったので、ここ
では検討しない。

次いで、前記合成ペプチドを使用して標準の免疫化技
術によりウサギにおいてポリクロナル抗血清を発生させ
た。また、コーラー（Kohler）およびマイルシュタイン
（Milstein），ネイチャー（Nature）225（1974）に実
質的に記載されるハイブリドーマ手順により、ネズミの
モノクロナル抗体を前記３種類の合成ペプチドに対して
レイズした。ポリクロナル抗体およびモノクロナル抗体
の両者は、他方のペプチドと交差反応しないで、それ自
身のペプチドの各々に対する特異的結合を立証した。

また、ポリクロナル抗体およびモノクロナル抗体は、
結合を崩壊させ、そしてHTLVに化学的に固定し、次いで
微小力価（microtiter）の板［バイオテク・リサーチ・
ラボラトリーズ（Biotech Research Laboratories）
から入手した］上へ被覆した。こうして、これらの抗体
またはそれらの断片を、また、多数のよく知られた免疫
検定のフォーマットのいずれにおいても診断的に使用す
ることができる。

本発明のペプチドからレイズした抗体は驚くほどにか
つ予期せざるほどに自然の完全なHTLVを認識することが
できるので、AIDSまたは白血病の患者中に天然に存在す
る抗体がまた前記ペプチドを認識できるであろうと思わ
れた。

前記３種類のペプチドを混合し、そして微小力価の板
の上へ被覆し、ここでそれらをメタノールで固定した。
既知のAIDSおよびARCの患者から、「正常者」からおよ
び「AIDS対照」からの血清試料を、免疫学的反応を促す
適当なかつ慣用の温度、時間およびpHの条件下に、それ
らと反応させた。未反応の成分を除去し、そして反応し
た抗体を抗ヒトIgGとの反応により直接標識付けた。前
記抗ヒトIgGはそれへ取り付けられたセイヨウワサビの
ペルオキシダーゼの酵素標識を有した。基質のｏ−フェ
ニレンジアミンを添加し、そして生ずる色の発現を約49
0nmにおいて分光測光的に監視した。結果を添付図面に
示す。検定を最適化することが明らかに必要せあるにも
かかわらず、本発明のペプチドの少なくとも１種または
それらの組み合わせを使用して有用な試験を案出できる
ことが明らかである。現在、このデータを比較すべき標
準または許容された値が存在しないことをまた認識しな
くてはならない。現在「正常」であると信じられている
人は、事実平均の人の代表であり、そしてほぼすべての
人が、ある時または他の時に、AIDS病原性有機体にさら
されたが、未知の理由で、その病気に対してして首尾よ
く抵抗性であったと信じられる。こうして、「正常」は
AIDS病原性有機体にさらされ、こうして免疫学的抵抗を
発現していることがありうる。

エプステイン・バール・ニュークリアー抗原（Epstei
n Barr nuclear antigen）類を除外して、これは自
然に存在する抗体を合成的にレイズさせたペプチドと反
応させた最初であり、あるいはペプチドに対してレイズ
させた抗体を完全ウイルスと反応させた最初である。HT
LV III型およびHTLV Ｉ型はきわめて密接に類似する
ので、本発明の好ましい合成ペプチドはこれらのウイル
スのいずれかあるいは双方の検出に同等に適用すること
ができるであろうことが予測される。多くて、２つのウ
イルスのエンベロープ区域は１つまたは２つのアミノ酸
が異るだけであろう。本発明の合成ペプチドのこのよう
な小さい変更は等しくここにおいて考えられ、そして同
等であると見なされる。さらに、臨界区域すなわち抗体
により実際に認識される区域はここに記載するペプチド
の一部分のみである可能性があり、そしてこれらはまた
同等と見なされるべきである。

しかしながら、ここに記載する３つのペプチドは、侵
入性有機体に対して自然にレイズされた抗体の異質性の
ために、別々に使用することができ、好ましい実施態様
は合成ペプチドの混合物、最も好ましい実施態様にすべ
て３つを使用して、HTLVウイルスに対するすべての可能
な自然の抗体の検出を最大とする。記載する実施例にお
いて使用する相対的比率は各々のペプチドの等量であっ
たが、最適化は他の比率をより有利であると示すことが
あろう。最適化の手順は簡単でありかつ熟練した研究者
の知力の範囲内であろう。

当業者は容易に理解するように、本発明の合成ペプチ
ドは拮抗的（competitive）または非拮抗的特性を有す
る種々の異質および均質の免疫検定フォーマットに配合
をたてることができる。好ましい実施態様は固相、例え
ば、微小力価のウェル（well）の表面上に合成ペプチド
を使用し、そしてその上で患者の血清試料（または検出
すべき抗体またはウルス粒子を含有するこのような他の
試料）を便利に反応させることができる。HTLVウイルス
に対して特異的の患者の抗体は、存在する場合、次いで
固定化された合成ペプチドと反応するであろう。（非拮
抗的検定が記載される場合、本発明はそのように限定さ
れず、そして合成ペプチドについて拮抗的検定、例え
ば、試料のウイルス粒子の存在下に供給される免疫グロ
ブリンまたは免疫グロブリン断片が等しく考えられ
る。）次いで、血清試料の未反応成分を好ましくは除去
して、望まないバックグラウンドおよび非特異的結合の
他の源を除去する。その後、ポリクロナルまたはモノク
ロナルの由来の標識抗ヒト免疫グロブリンを使用して、
患者の試料中に存在する場合、合成ペプチドへここで取
り付けられている抗HTLVヒト免疫グロブリンと反応さ
せ、こうして標識付けることができる。次いで、未反応
の標識抗ヒト免疫グロブリン（水相）を除去し、そして
固相または水相と関連する標識をよく知られた技術に従
い測定する。このような技術は、もちろん、使用する標
識の性質に依存し、例えば、分光計または測色計を使用
して、化学ルミネセンス分子、蛍光分子、吸収性色素分
子などにより発生された蛍光、吸収などを検出すること
ができる。例えば、いわゆるELISA型方法に関連するよ
うに、ある反応成分への酵素標識の活性からの生成物の
発生および検出が等しく考えられる。例えば、酵素、セ
イヨウワサビのペルオキシダーゼを実施例において用い
た。他の可能なマーカーは、光散乱粒子、磁気粒子、ア
イソトープ、赤血球、および合成および自然に存在する
巨大および微小の粒子を包含する。

発展中の研究の性質のため、およびAIDSおよび他の関
連する病気の完全な解釈は完全なものから非常にはなれ
ているという事実のため、本発明の検定法は性質が定量
的であり、すなわち、患者におけるHTLV特異的抗体の存
在はAIDSまたはAIDSに類似する感染を指示しあるいは予
後を物語る証拠であろうことが容易に理解されるであろ
う。この理由は、現在、結果を比較しかつ定量的分析を
案出するための標準が存在しないことにある。しかしな
がら、将来のある時点において、HTLV特異的抗体のある
レベルの存在は、病気の差し迫った猛攻撃を必然的に示
さないで、正常として見なすことができることが予測さ
れる。このような時において、かつこのレベルが識別さ
れたとき、本発明の合成ペプチドおよび検定を定量的性
質で用いることができる。

上の説明から当業者は容易に決定するように、合成ペ
プチドまたはその抗体特異性の小さい変更、ならびに合
成ペプチドまたは抗体とともに使用するために入手可能
な事実上種々の限定されない免疫検定のフォーマットに
ついての変更を、本発明の精神または範囲を逸脱しない
で、行うことができるであろう。

【図面の簡単な説明】 図面は、本発明の３種類のペプチドを混合し、そして微
小力価の板の上へ被覆し、ここでそれらをメタノールで
固定し、既知のAIDSおよびARCの患者から、「正常者」
からおよび「AIDS対照」からの血清試料を、免疫学的反
応を促す適当なかつ慣用の温度、時間およびpHの条件下
に、それらと反応させ、未反応の成分を除去し、そして
反応した抗体を抗ヒトIgGとの反応により直接標識付
け、前記抗ヒトIgGがそれへ取り付けられたセイヨウワ
サビのペルオキシダーゼの酵素標識を有し、基質のｏ−
フェニレンジアミンを添加し、そして生ずる色の発現を
約490nmにおいて分光測光的に監視して得られた結果を
示す。

フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，80（12），3618− 3622（1983) Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，78（６），3824− 3828（1981)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Cys−Ala−Gln−Asn−Arg−Arg−Gly−Leu
   −Asp−Leu−Leu−Gly。