JPH06207941A - 非ａ非ｂ型肝炎の検査方法 - Google Patents
非ａ非ｂ型肝炎の検査方法Info
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- JPH06207941A JPH06207941A JP18023292A JP18023292A JPH06207941A JP H06207941 A JPH06207941 A JP H06207941A JP 18023292 A JP18023292 A JP 18023292A JP 18023292 A JP18023292 A JP 18023292A JP H06207941 A JPH06207941 A JP H06207941A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原あるいはそ
の同効物を用い、且つ化学発光を利用した検査方法を提
供する。 【構成】 非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と特異的に反応す
る抗原蛋白質を組み合わせ、且つ化学発光を利用した抗
体診断方法は、高感度な非Ａ非Ｂ型肝炎抗原に対する抗
体の検知法を提供する。
の同効物を用い、且つ化学発光を利用した検査方法を提
供する。 【構成】 非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と特異的に反応す
る抗原蛋白質を組み合わせ、且つ化学発光を利用した抗
体診断方法は、高感度な非Ａ非Ｂ型肝炎抗原に対する抗
体の検知法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
関連抗原あるいはその同効物を利用した化学発光検査方
法に関する。
関連抗原あるいはその同効物を利用した化学発光検査方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】米国のカイロン社は非Ａ非Ｂ型肝炎患者
の血清をチンパンジーに注射して、非Ａ非Ｂ型肝炎を起
したチンパンジーの血清に由来するＲＮＡを出発材料と
して、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）のｃＤＮＡをクロー
ニングした（Ｑ．Ｌ．クーら、サイエンス、２４４巻、
３５９頁（１９８９）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎ
ｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＃８８３１０９２２．
５）。この配列を基にして種々の抗原が検討されている
が、現在までのところＨＣＶ感染予防に有効とはいい難
い。この原因としては、この検査薬に使用されている抗
原がウイルス粒子の核内蛋白に相当すると見られる部分
を遺伝子工学的な手段で生産して使用していることが考
えられ、ＨＣＶ検査を確実に行うにはさらに複数種の抗
原を開発する必要があると言える。最近、カイロン社は
３種類の抗原蛋白を組み合わせた第２世代のＨＣＶ抗体
検査薬を開発し、抗体の検出感度は大幅に改善された。
の血清をチンパンジーに注射して、非Ａ非Ｂ型肝炎を起
したチンパンジーの血清に由来するＲＮＡを出発材料と
して、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）のｃＤＮＡをクロー
ニングした（Ｑ．Ｌ．クーら、サイエンス、２４４巻、
３５９頁（１９８９）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎ
ｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＃８８３１０９２２．
５）。この配列を基にして種々の抗原が検討されている
が、現在までのところＨＣＶ感染予防に有効とはいい難
い。この原因としては、この検査薬に使用されている抗
原がウイルス粒子の核内蛋白に相当すると見られる部分
を遺伝子工学的な手段で生産して使用していることが考
えられ、ＨＣＶ検査を確実に行うにはさらに複数種の抗
原を開発する必要があると言える。最近、カイロン社は
３種類の抗原蛋白を組み合わせた第２世代のＨＣＶ抗体
検査薬を開発し、抗体の検出感度は大幅に改善された。
【０００３】現存する非Ａ非Ｂ型肝炎に関する抗体診断
薬は、検出手段として発色を利用したＥＬＩＳＡが主流
になっている。しかし、発色を用いる診断薬は検出感度
が十分とは言えず、抗体の濃度が低い場合には偽陰性が
排除できない可能性もあり得る。発色よりも高い感度を
得る試みとしてラジオアイソトープを用いた例もある
が、ラジオアイソトープは取扱い上あるいは管理上特別
な配慮が必要になる。一方、化学発光による検出はラジ
オアイソトープと同程度に高感度であると期待され、実
際に、定量を目的とした診断薬に利用されているが、Ｈ
ＣＶ抗体検査薬に化学発光を利用している例はない。
薬は、検出手段として発色を利用したＥＬＩＳＡが主流
になっている。しかし、発色を用いる診断薬は検出感度
が十分とは言えず、抗体の濃度が低い場合には偽陰性が
排除できない可能性もあり得る。発色よりも高い感度を
得る試みとしてラジオアイソトープを用いた例もある
が、ラジオアイソトープは取扱い上あるいは管理上特別
な配慮が必要になる。一方、化学発光による検出はラジ
オアイソトープと同程度に高感度であると期待され、実
際に、定量を目的とした診断薬に利用されているが、Ｈ
ＣＶ抗体検査薬に化学発光を利用している例はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
ＨＣＶ抗体検査においてより検出感度を高めるべく、Ｈ
ＣＶ抗原を公知のマイクロビーズに固定化し、化学発光
を利用した抗体検査方法を開発した。発色より高感度な
化学発光を用いることで偽陰性の数を減らし、非Ａ非Ｂ
型肝炎の明確な診断につながることが期待できる。
ＨＣＶ抗体検査においてより検出感度を高めるべく、Ｈ
ＣＶ抗原を公知のマイクロビーズに固定化し、化学発光
を利用した抗体検査方法を開発した。発色より高感度な
化学発光を用いることで偽陰性の数を減らし、非Ａ非Ｂ
型肝炎の明確な診断につながることが期待できる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、非Ａ
非Ｂ型肝炎患者の血清と特異的に反応する抗原蛋白質を
用い、且つ化学発光を利用した検査方法に関するもので
ある。本発明の検査方法としては、免疫学的検査方法、
ＤＮＡプローブ法等公知の方法が利用できるが、酵素標
識を特徴とする酵素免疫測定法が好ましく用いられる。
酵素免疫測定法を利用する場合には、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原蛋白質を適当な固相に結合させ、さらに血清
中のヒト抗体と結合する２次抗体（抗ヒト抗体）を酵素
標識する必要がある。固相としてはマイクロプレート、
チューブ、マイクロビーズ、磁性マイクロビーズなどが
使用でき、固相に結合した抗原と被検血清を反応させＢ
／Ｆ分離を行った後、抗原と結合した抗体を抗ヒト抗体
（２次抗体）で検出することによって血清中の抗体量を
検出することができる。固相としては、マイクロビー
ズ、特に磁性マイクロビーズが好ましく用いられる。マ
イクロビーズとしては、たとえば、ポリスチレンラテッ
クス、ポリエステルラテックス、塩化ビニル、ベントナ
イト、ガラスビーズなどの約１−１０μの粒子を使用す
ることができる。磁性マイクロビーズとしては、通常の
ものが用いられるが、例えば酸化鉄などの磁性金属酸化
物を含むマイクロビーズ等があげられる。本発明で好ま
しく用いられるＨＣＶ抗原蛋白をマイクロビーズに固定
化している例は他に無く、本発明の特徴の一つであるＨ
ＣＶ抗原蛋白として配列番号１および配列番号２の２種
類の蛋白を使用する場合は、２種類の抗原蛋白が互いに
異なるアミノ酸組成であるので、異なる固定化法で磁性
ビーズに結合せしめることが好ましい。ビーズには抗原
を直接結合させても良いが、あらかじめＢＳＡで表面を
覆っておくとＢＳＡ中のアミノ酸残基を結合の際に利用
できるので有利である。配列表１のＳ４抗原には、ＳＨ
基もアミノ基もあるので公知の固定化法でビーズに結合
することができる。この場合、ＥＭＣＳ、ＤＳＴなどの
架橋試薬は結合効率が悪いのに対し、ＥＤＣは良い効率
を与える。一方、配列表２のＳ２９抗原はアミノ基を利
用できるが、Ｎ末端にシステイン残基を付加して後その
ＳＨ基を利用すると効率が良い。本発明のＳ２９抗原の
ビーズへの固定化法の特に好ましい方法を実施例１に示
した。
非Ｂ型肝炎患者の血清と特異的に反応する抗原蛋白質を
用い、且つ化学発光を利用した検査方法に関するもので
ある。本発明の検査方法としては、免疫学的検査方法、
ＤＮＡプローブ法等公知の方法が利用できるが、酵素標
識を特徴とする酵素免疫測定法が好ましく用いられる。
酵素免疫測定法を利用する場合には、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原蛋白質を適当な固相に結合させ、さらに血清
中のヒト抗体と結合する２次抗体（抗ヒト抗体）を酵素
標識する必要がある。固相としてはマイクロプレート、
チューブ、マイクロビーズ、磁性マイクロビーズなどが
使用でき、固相に結合した抗原と被検血清を反応させＢ
／Ｆ分離を行った後、抗原と結合した抗体を抗ヒト抗体
（２次抗体）で検出することによって血清中の抗体量を
検出することができる。固相としては、マイクロビー
ズ、特に磁性マイクロビーズが好ましく用いられる。マ
イクロビーズとしては、たとえば、ポリスチレンラテッ
クス、ポリエステルラテックス、塩化ビニル、ベントナ
イト、ガラスビーズなどの約１−１０μの粒子を使用す
ることができる。磁性マイクロビーズとしては、通常の
ものが用いられるが、例えば酸化鉄などの磁性金属酸化
物を含むマイクロビーズ等があげられる。本発明で好ま
しく用いられるＨＣＶ抗原蛋白をマイクロビーズに固定
化している例は他に無く、本発明の特徴の一つであるＨ
ＣＶ抗原蛋白として配列番号１および配列番号２の２種
類の蛋白を使用する場合は、２種類の抗原蛋白が互いに
異なるアミノ酸組成であるので、異なる固定化法で磁性
ビーズに結合せしめることが好ましい。ビーズには抗原
を直接結合させても良いが、あらかじめＢＳＡで表面を
覆っておくとＢＳＡ中のアミノ酸残基を結合の際に利用
できるので有利である。配列表１のＳ４抗原には、ＳＨ
基もアミノ基もあるので公知の固定化法でビーズに結合
することができる。この場合、ＥＭＣＳ、ＤＳＴなどの
架橋試薬は結合効率が悪いのに対し、ＥＤＣは良い効率
を与える。一方、配列表２のＳ２９抗原はアミノ基を利
用できるが、Ｎ末端にシステイン残基を付加して後その
ＳＨ基を利用すると効率が良い。本発明のＳ２９抗原の
ビーズへの固定化法の特に好ましい方法を実施例１に示
した。
【０００６】マイクロビーズを用いた化学発光検査方法
は、公知の検査診断薬の測定方法に従って行われる。す
なわち、マイクロビーズの懸濁液に血清検査体を混ぜて
ビーズ表面の抗原に血清中の抗ＨＣＶ抗体を結合させ
る。次にＢ／Ｆ分離を行い洗浄した後に、西洋ワサビペ
ルオキシターゼ等で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を加え
る。過剰の抗ＩｇＧ抗体を洗浄により除いた後、ルミノ
ール等の化学発光物質と過酸化水素を加えて発光量を測
定する。この時に、エンハンサーを加えると、発光量を
増加させることができる。また標識酵素として、ほかに
グルコースオキシターゼやアルカリフォスファターゼな
ども用いることができる。本発明の化学発光によるＨＣ
Ｖ抗体検査薬の好ましい例を実施例２に示した。
は、公知の検査診断薬の測定方法に従って行われる。す
なわち、マイクロビーズの懸濁液に血清検査体を混ぜて
ビーズ表面の抗原に血清中の抗ＨＣＶ抗体を結合させ
る。次にＢ／Ｆ分離を行い洗浄した後に、西洋ワサビペ
ルオキシターゼ等で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を加え
る。過剰の抗ＩｇＧ抗体を洗浄により除いた後、ルミノ
ール等の化学発光物質と過酸化水素を加えて発光量を測
定する。この時に、エンハンサーを加えると、発光量を
増加させることができる。また標識酵素として、ほかに
グルコースオキシターゼやアルカリフォスファターゼな
ども用いることができる。本発明の化学発光によるＨＣ
Ｖ抗体検査薬の好ましい例を実施例２に示した。
【０００７】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明する。なお、略号は次のようなものである。 ＥＭＣＳ：Ｎ−（ε−マレイミドカプロイロキシ）コハ
ク酸イミド ＥＤＣ ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド 実施例１ （Ｓ４抗原の大腸菌内での発現）配列表のＳ４に関して
は、遺伝子組換え法により抗原を調製した。λファージ
ｃＩ８５７、ＰＲプロモーターを有し、β−ガラクトシ
ダーゼをコードするプラスミドｐＵＥＸ１のβ−ガラク
トシダーゼのＣ末端側に血液凝固因子ファクターＸａ
（ＦａｃｔｏｒＸａ）サイトをコードする配列を含むよ
うにＳ４遺伝子を挿入した（図１）。β−ガラクトシダ
ーゼとＳ４の間にＦａｃｔｏｒＸａサイトが存在してい
るので蛋白発現後ＦａｃｔｏｒＸａで消化することによ
り保護蛋白を含まないＳ４蛋白を得る事ができる。以
下、発現プラスミドの作製法を詳しく説明すると、まず
はじめにβ−ガラクトシダーゼのＣ末端側に存在するＳ
ｍａＩサイトにＫｐｎＩリンカー（５−ＧＧＧＴＡＣＣ
Ｃ−３ 宝酒造社製）を連結したプラスミドを作製した
（ｐＵＥＸＫ−１）。ＦａｃｔｏｒＸａサイトを含むＳ
４断片はＳ４断片をＥｃｏＲＩサイトに組み込んだｐＭ
ＡＬ−Ｃ（ニューイングランドバイオラボ社）よりＫｐ
ｎＩ及びＢａｍＨＩを用いて切り出した。この断片をｐ
ＵＥＸＫ−１のＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩに連結し、Ｆａ
ｃｔｏＸａサイトを含むβ−ガラクトシダーゼとＳ４の
融合蛋白産生可能なｐＵＥＸＳ４を作製した。
明する。なお、略号は次のようなものである。 ＥＭＣＳ：Ｎ−（ε−マレイミドカプロイロキシ）コハ
ク酸イミド ＥＤＣ ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド 実施例１ （Ｓ４抗原の大腸菌内での発現）配列表のＳ４に関して
は、遺伝子組換え法により抗原を調製した。λファージ
ｃＩ８５７、ＰＲプロモーターを有し、β−ガラクトシ
ダーゼをコードするプラスミドｐＵＥＸ１のβ−ガラク
トシダーゼのＣ末端側に血液凝固因子ファクターＸａ
（ＦａｃｔｏｒＸａ）サイトをコードする配列を含むよ
うにＳ４遺伝子を挿入した（図１）。β−ガラクトシダ
ーゼとＳ４の間にＦａｃｔｏｒＸａサイトが存在してい
るので蛋白発現後ＦａｃｔｏｒＸａで消化することによ
り保護蛋白を含まないＳ４蛋白を得る事ができる。以
下、発現プラスミドの作製法を詳しく説明すると、まず
はじめにβ−ガラクトシダーゼのＣ末端側に存在するＳ
ｍａＩサイトにＫｐｎＩリンカー（５−ＧＧＧＴＡＣＣ
Ｃ−３ 宝酒造社製）を連結したプラスミドを作製した
（ｐＵＥＸＫ−１）。ＦａｃｔｏｒＸａサイトを含むＳ
４断片はＳ４断片をＥｃｏＲＩサイトに組み込んだｐＭ
ＡＬ−Ｃ（ニューイングランドバイオラボ社）よりＫｐ
ｎＩ及びＢａｍＨＩを用いて切り出した。この断片をｐ
ＵＥＸＫ−１のＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩに連結し、Ｆａ
ｃｔｏＸａサイトを含むβ−ガラクトシダーゼとＳ４の
融合蛋白産生可能なｐＵＥＸＳ４を作製した。
【０００８】この作製したｐＵＥＸＳ４を大腸菌ＨＢ１
０１に形質転換後、得られた株を５ｍｌのＬＢ培地（ト
リプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、Ｎａ
Ｃｌ０．５％ アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）に植菌
し３０℃で一晩前培養した。一晩培養後この培養した菌
をアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に２００μｌ
植え、３０℃で２時間振盪培養した。その後培養温度を
４２℃に上げ２時間振盪培養した。蛋白の発現は１ｍｌ
の培養液を遠心し集菌後１％ＳＤＳと２−メルカプトエ
タノールを加え溶菌させＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
Ｓ４とβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白は４２℃で培
養したときに特異的に観察されその蛋白量は全蛋白の１
５〜２０％に及んだ。得られた融合蛋白は不溶性顆粒体
を形成していたので、グアニジン溶液や４Ｍ尿素で洗浄
し、可溶性蛋白を取り除いた。その後８Ｍ尿素で可溶化
後ＦａｃｔｏｒＸａバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ＰＨ８，１００ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＣａＣｌ
２）に透析した。またＳ４とβ−ガラクトシダーゼとの
融合蛋白の抗原性については電気泳動後、蛋白質をニト
ロセルロースフィルターに転写し、Ｃ型肝炎患者血清と
の反応性をしらべ、発現蛋白が健常人血清とは反応せず
Ｃ型肝炎患者血清とのみ特異的に反応することを確認し
た。さらにＦａｃｔｏｒＸａで消化後、得られたＳ４蛋
白（２３Ｋｄ）についても同様にＣ型肝炎患者血清との
反応性をしらべ、発現蛋白が健常人血清とは反応せずＣ
型肝炎患者血清とのみ特異的に反応することを確認し
た。
０１に形質転換後、得られた株を５ｍｌのＬＢ培地（ト
リプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、Ｎａ
Ｃｌ０．５％ アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）に植菌
し３０℃で一晩前培養した。一晩培養後この培養した菌
をアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に２００μｌ
植え、３０℃で２時間振盪培養した。その後培養温度を
４２℃に上げ２時間振盪培養した。蛋白の発現は１ｍｌ
の培養液を遠心し集菌後１％ＳＤＳと２−メルカプトエ
タノールを加え溶菌させＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
Ｓ４とβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白は４２℃で培
養したときに特異的に観察されその蛋白量は全蛋白の１
５〜２０％に及んだ。得られた融合蛋白は不溶性顆粒体
を形成していたので、グアニジン溶液や４Ｍ尿素で洗浄
し、可溶性蛋白を取り除いた。その後８Ｍ尿素で可溶化
後ＦａｃｔｏｒＸａバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ＰＨ８，１００ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＣａＣｌ
２）に透析した。またＳ４とβ−ガラクトシダーゼとの
融合蛋白の抗原性については電気泳動後、蛋白質をニト
ロセルロースフィルターに転写し、Ｃ型肝炎患者血清と
の反応性をしらべ、発現蛋白が健常人血清とは反応せず
Ｃ型肝炎患者血清とのみ特異的に反応することを確認し
た。さらにＦａｃｔｏｒＸａで消化後、得られたＳ４蛋
白（２３Ｋｄ）についても同様にＣ型肝炎患者血清との
反応性をしらべ、発現蛋白が健常人血清とは反応せずＣ
型肝炎患者血清とのみ特異的に反応することを確認し
た。
【０００９】（Ｓ４抗原の精製）目的の融合蛋白を含む
大腸菌溶菌画分を２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ７．０）で５回、１．７５Ｍグアニジン−塩酸溶
液で３回、４．５Ｍ尿素溶液で３回、それぞれ洗浄した
後、８Ｍ尿素溶液に溶解した。次に、蛋白溶液をＣＡＰ
Ｓバッファー（ｐＨ１０．７）、トリス−塩酸バッファ
ー（ｐＨ７．５）、ＦａｃｔｏｒＸａバッファーでそれ
ぞれ透析した。透析後の蛋白溶液を、およそ１ｍｇ／ｍ
ｌになるようにＦａｃｔｏｒＸａバッファーで希釈し、
濃度比で１／１００量のＦａｃｔｏｒＸａを加えて、室
温で２時間半反応させた。消化物にエタノールとＤＴＴ
をそれぞれ２５％、２ｍＭになるように加えて遠心分離
し、上清を集めた。上清をエバポレータで濃縮しＳｅｐ
ｈａｄｅｘＧ−２５で脱塩した後、飽和硫安とＤＴＴを
それぞれ４５％、２ｍＭになるように加えた。遠心分離
後の沈殿をＰＢＳに溶解しＳ４溶液とした。精製した抗
原は電気泳動で精製度を確認し、さらにそれがＣ型肝炎
患者血清と特異的に反応することを確認した。
大腸菌溶菌画分を２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ７．０）で５回、１．７５Ｍグアニジン−塩酸溶
液で３回、４．５Ｍ尿素溶液で３回、それぞれ洗浄した
後、８Ｍ尿素溶液に溶解した。次に、蛋白溶液をＣＡＰ
Ｓバッファー（ｐＨ１０．７）、トリス−塩酸バッファ
ー（ｐＨ７．５）、ＦａｃｔｏｒＸａバッファーでそれ
ぞれ透析した。透析後の蛋白溶液を、およそ１ｍｇ／ｍ
ｌになるようにＦａｃｔｏｒＸａバッファーで希釈し、
濃度比で１／１００量のＦａｃｔｏｒＸａを加えて、室
温で２時間半反応させた。消化物にエタノールとＤＴＴ
をそれぞれ２５％、２ｍＭになるように加えて遠心分離
し、上清を集めた。上清をエバポレータで濃縮しＳｅｐ
ｈａｄｅｘＧ−２５で脱塩した後、飽和硫安とＤＴＴを
それぞれ４５％、２ｍＭになるように加えた。遠心分離
後の沈殿をＰＢＳに溶解しＳ４溶液とした。精製した抗
原は電気泳動で精製度を確認し、さらにそれがＣ型肝炎
患者血清と特異的に反応することを確認した。
【００１０】実施例２ 抗原を磁性マイクロビーズ（四酸化鉄を含むポリグリシ
ジルメタクリレートを主成分とするビーズ）に固定化す
るために、あらかじめＢＳＡでビーズを修飾し、ＢＳＡ
を介して抗原とビーズを結合させた。 （ＢＳＡの磁性マイクロビーズへの固定化）ジオキサン
に分散させた５％磁性マイクロビーズに，Ｎ，Ｎ’−カ
ルボニルジイミダゾールを１５％になるように加え、３
７℃で１時間反応させた。ジオキサンと水で２回ずつ洗
浄後、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッフ
ァー（ｐＨ９．０）に分散し、３７℃で２時間反応させ
た。１Ｍグリシンを加えて３７℃で３０分インキュベー
トした後、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で
３回洗浄し、同バッファーに分散した。
ジルメタクリレートを主成分とするビーズ）に固定化す
るために、あらかじめＢＳＡでビーズを修飾し、ＢＳＡ
を介して抗原とビーズを結合させた。 （ＢＳＡの磁性マイクロビーズへの固定化）ジオキサン
に分散させた５％磁性マイクロビーズに，Ｎ，Ｎ’−カ
ルボニルジイミダゾールを１５％になるように加え、３
７℃で１時間反応させた。ジオキサンと水で２回ずつ洗
浄後、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッフ
ァー（ｐＨ９．０）に分散し、３７℃で２時間反応させ
た。１Ｍグリシンを加えて３７℃で３０分インキュベー
トした後、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で
３回洗浄し、同バッファーに分散した。
【００１１】（Ｓ４抗原の磁性マイクロビーズへの固定
化）配列表１記載のＳ４抗原を架橋試薬を用いてＢＳＡ
−磁性マイクロビーズに固定化した。５０ｍｇのＢＳＡ
−磁性マイクロビーズを含む分散液１ｍｌを遠心し、ビ
ーズを集めてバッファーを除いた後、０．３５％になる
ようにＥＤＣ溶液を加え氷中で１５分反応させた。その
後、２００μｇのＳ４抗原を加えて２０℃で３時間反応
させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ、０．０５％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ４ｍｌに懸濁し、３７℃
で１．５時間インキュベートした。ＥＭＣＳとＥＤＣに
よる架橋効率の違いを、実際のアッセイで確認した。そ
の結果を表１に示す。
化）配列表１記載のＳ４抗原を架橋試薬を用いてＢＳＡ
−磁性マイクロビーズに固定化した。５０ｍｇのＢＳＡ
−磁性マイクロビーズを含む分散液１ｍｌを遠心し、ビ
ーズを集めてバッファーを除いた後、０．３５％になる
ようにＥＤＣ溶液を加え氷中で１５分反応させた。その
後、２００μｇのＳ４抗原を加えて２０℃で３時間反応
させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ、０．０５％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ４ｍｌに懸濁し、３７℃
で１．５時間インキュベートした。ＥＭＣＳとＥＤＣに
よる架橋効率の違いを、実際のアッセイで確認した。そ
の結果を表１に示す。
【００１２】（Ｓ２９抗原の磁性マイクロビーズへの固
定化）配列表２記載のＳ２９抗原を架橋試薬を用いてＢ
ＳＡ−磁性マイクロビーズに固定化した。ＳＨ基反応性
の架橋試薬を使えるように、Ｓ２９のＮ端をシステイン
で修飾したＣｙｓ−Ｓ２９を化学合成した。５ｍＭＥＤ
ＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中
で、５ｍｇ／ｍｌＣｙｓ−Ｓ２９を５ｍｇ／ｍｌメルカ
プトエタノールアミンで還元した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５で脱塩した。一方、５０ｍｇのＢＳＡ−マイク
ロビーズを含む分散液１ｍｌにＥＭＣＳのＤＭＦ溶液を
加えて３７℃で１時間反応させた。０．１Ｍリン酸バッ
ファー（ｐＨ７．０）で２回、０．１Ｍリン酸バッファ
ー（ｐＨ６．０）で１回洗浄した後、同バッファーに分
散した。これに、還元したＣｙｓ−Ｓ２９抗原を１００
μｇ加えて３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗
浄した後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに分散し室温で
３時間インキュベートした。さらに、ＭＥＡを加えて３
７℃で３０分インキュベートしてＰＢＳで３回洗浄後、
１％ＢＳＡ，０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ
４ｍｌに分散し、３７℃で１．５時間インキュベートし
た。Ｎ端をシステインで修飾することで架橋効率が上が
った様子を表１に示す。
定化）配列表２記載のＳ２９抗原を架橋試薬を用いてＢ
ＳＡ−磁性マイクロビーズに固定化した。ＳＨ基反応性
の架橋試薬を使えるように、Ｓ２９のＮ端をシステイン
で修飾したＣｙｓ−Ｓ２９を化学合成した。５ｍＭＥＤ
ＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中
で、５ｍｇ／ｍｌＣｙｓ−Ｓ２９を５ｍｇ／ｍｌメルカ
プトエタノールアミンで還元した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５で脱塩した。一方、５０ｍｇのＢＳＡ−マイク
ロビーズを含む分散液１ｍｌにＥＭＣＳのＤＭＦ溶液を
加えて３７℃で１時間反応させた。０．１Ｍリン酸バッ
ファー（ｐＨ７．０）で２回、０．１Ｍリン酸バッファ
ー（ｐＨ６．０）で１回洗浄した後、同バッファーに分
散した。これに、還元したＣｙｓ−Ｓ２９抗原を１００
μｇ加えて３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗
浄した後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに分散し室温で
３時間インキュベートした。さらに、ＭＥＡを加えて３
７℃で３０分インキュベートしてＰＢＳで３回洗浄後、
１％ＢＳＡ，０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ
４ｍｌに分散し、３７℃で１．５時間インキュベートし
た。Ｎ端をシステインで修飾することで架橋効率が上が
った様子を表１に示す。
【００１３】
【表１】 表１はＳ４をＥＭＣＳとＥＤＣで、システイン化したＳ
２９をＥＭＣＳで、それぞれ固定した磁性マイクロビー
ズを用いて実施例３の方法で血清を測定したときの発光
量を示す。測定は二種類の健常者血清とＣ型肝炎患者血
清で行った。Ｓ４において、ＥＤＣ固定化ビーズの患者
血清の発光量がＥＭＣＳの６−７倍になったことは、患
者血清に含まれる抗体をＥＤＣ固定化ビーズが６−７倍
多く結合すること、すなわちそれだけ多くの抗原がＥＤ
Ｃによってビーズに固定化されたことを示している。 実施例３ （抗原固定化磁性マイクロビーズを用いた陽性、陰性コ
ントロール血清のアッセイ）実施例２記載の抗原固定化
磁性マイクロビーズ４ｍｌずつを混合した後、遠心して
バッファーを除き、１６ｍｌのビーズ分散液に分散し
た。ガラスキュベットに分散ビーズ１００μｌおよびサ
ンプル血清５０μｌ加え３７℃で１０分反応させた。ビ
ーズを洗浄後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇ
Ｇモノクローナル抗体（ザイメド社製）１５０μｌを加
えて３７℃で１５分反応させた。さらにビーズを洗浄
し、ルミノールを含む発光試薬を加えた後、過酸化水素
をふくむ基質溶液を加えて３７℃で反応させ１分後の発
光強度を測定した。その結果を表２に示す。血清サンプ
ル２６例中２０例を陽性と判定でき、現段階で発色を用
いた診断薬と少なくとも同等の性能があることが確認で
きた。
２９をＥＭＣＳで、それぞれ固定した磁性マイクロビー
ズを用いて実施例３の方法で血清を測定したときの発光
量を示す。測定は二種類の健常者血清とＣ型肝炎患者血
清で行った。Ｓ４において、ＥＤＣ固定化ビーズの患者
血清の発光量がＥＭＣＳの６−７倍になったことは、患
者血清に含まれる抗体をＥＤＣ固定化ビーズが６−７倍
多く結合すること、すなわちそれだけ多くの抗原がＥＤ
Ｃによってビーズに固定化されたことを示している。 実施例３ （抗原固定化磁性マイクロビーズを用いた陽性、陰性コ
ントロール血清のアッセイ）実施例２記載の抗原固定化
磁性マイクロビーズ４ｍｌずつを混合した後、遠心して
バッファーを除き、１６ｍｌのビーズ分散液に分散し
た。ガラスキュベットに分散ビーズ１００μｌおよびサ
ンプル血清５０μｌ加え３７℃で１０分反応させた。ビ
ーズを洗浄後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇ
Ｇモノクローナル抗体（ザイメド社製）１５０μｌを加
えて３７℃で１５分反応させた。さらにビーズを洗浄
し、ルミノールを含む発光試薬を加えた後、過酸化水素
をふくむ基質溶液を加えて３７℃で反応させ１分後の発
光強度を測定した。その結果を表２に示す。血清サンプ
ル２６例中２０例を陽性と判定でき、現段階で発色を用
いた診断薬と少なくとも同等の性能があることが確認で
きた。
【００１４】
【表２】 表２はＳ４、Ｓ２９を抗原とした化学発光検査法と発色
を用いたＥＬＩＳＡ（固相としてマイクロプレートを用
いた）で複数の血清を実施例３の方法に従い測定した結
果を示す。表中のサンプル番号１から２０までがＣ型肝
炎患者血清、２１から２６までが健常人血清を測定した
結果である。数値は発光量を示す。化学発光検査法にお
いて、患者血清を測定した場合には、健常人血清を用い
た場合に比べ、１０倍以上の発光量が得られたので、閾
値を適当に定めれば陽性・陰性を識別できる。
を用いたＥＬＩＳＡ（固相としてマイクロプレートを用
いた）で複数の血清を実施例３の方法に従い測定した結
果を示す。表中のサンプル番号１から２０までがＣ型肝
炎患者血清、２１から２６までが健常人血清を測定した
結果である。数値は発光量を示す。化学発光検査法にお
いて、患者血清を測定した場合には、健常人血清を用い
た場合に比べ、１０倍以上の発光量が得られたので、閾
値を適当に定めれば陽性・陰性を識別できる。
【００１５】
【発明の効果】本発明において、２種類のＨＣＶ抗原ペ
プチドを効率良く公知の磁性マイクロビーズに結合し、
公知の化学発光反応を利用することにより、Ｃ型肝炎患
者の血清中の抗ＨＣＶ抗体が化学発光で検出できるよう
になった。
プチドを効率良く公知の磁性マイクロビーズに結合し、
公知の化学発光反応を利用することにより、Ｃ型肝炎患
者の血清中の抗ＨＣＶ抗体が化学発光で検出できるよう
になった。
【図１】ｐＵＥＸＳ４の構築過程を示す。
【配列表】
【配列表】
Claims (7)
- 【請求項１】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を用
い非Ａ非Ｂ型肝炎を検査する際に、化学発光により検出
することを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎の検査方法。 - 【請求項２】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質が、
配列番号１および／または２に示したアミノ酸配列ある
いはその同効物である請求項１記載の非Ａ非Ｂ型肝炎の
検査方法。 - 【請求項３】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を用
い、酵素免疫測定法により検査することを特徴とする請
求項１または２記載の非Ａ非Ｂ型肝炎の検査方法。 - 【請求項４】 酵素免疫測定法の固相として、マイクロ
ビーズを用いることを特徴とする請求項３記載の非Ａ非
Ｂ型肝炎の検査方法。 - 【請求項５】 マイクロビーズに非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス抗原蛋白質を固定化してなる固定化非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原蛋白質。 - 【請求項６】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質が、
配列番号１および／または２に示したアミノ酸配列ある
いはその同効物である請求項５記載の固定化非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗原蛋白質。 - 【請求項７】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をシ
スティンで修飾し、マイクロビーズに固定化することを
特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の固定化
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18023292A JPH06207941A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 非ａ非ｂ型肝炎の検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18023292A JPH06207941A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 非ａ非ｂ型肝炎の検査方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06207941A true JPH06207941A (ja) | 1994-07-26 |
Family
ID=16079689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18023292A Pending JPH06207941A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 非ａ非ｂ型肝炎の検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06207941A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997037007A1 (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-09 | Genencor International, Inc. | Enzyme multimer and process of producing same |
| CN108196069A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-06-22 | 周珂 | 一种包含重组融合抗原a和b的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原a和b |
-
1992
- 1992-05-29 JP JP18023292A patent/JPH06207941A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997037007A1 (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-09 | Genencor International, Inc. | Enzyme multimer and process of producing same |
| US6946280B1 (en) * | 1996-03-29 | 2005-09-20 | Genencor International, Inc. | Enzyme multimer and process of producing same |
| CN108196069A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-06-22 | 周珂 | 一种包含重组融合抗原a和b的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原a和b |
| CN108196069B (zh) * | 2018-02-01 | 2020-06-09 | 深圳德睿生物科技有限公司 | 一种包含重组融合抗原a和b的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原a和b |
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