JPS61286757A - 梅毒の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、梅毒の診断法に関し、更に詳細にはトレポネ
ーマ（Ｔｒｅｐｏｎ＠ｍｓ　）　　細菌病原体に対して
特異的なモノクローナル抗体を使用して梅毒を診断する
方法に関する。

ヒトの未治療梅毒は、しばしば診断することが極めて困
難であることがある重篤な慢性の非常に複雑な疾患であ
る。現在の診断具での限界およびワクチンの不在は、有
効なペニシリン療法を利用できる場合でさえ、梅毒を米
国単独で／年歯たシ約、！！０．０００の症例の概算頻
度で多発させている。

目下、初期梅毒の診断において、暗視野顕微鏡術が病変
浸出液（１＊５ｉｏｎ　＠ｘｕｄａｔｓｓ　）中の梅毒
トレボネ−１（Ｔｒ＠ｐｏｎ＠ｍｓ　ｐａｌｌｉｄｕｍ
　）を同定するのに使用されている。この方法は、特性
的スピロヘータ形態および運動性の観察に基づいている
。初期梅毒病変の臨床的多様性、他の性器潰瘍疾患を有
する患者の間で生ずることがあるものとの類似性、およ
び感染の一次段階で存在し得る血清学的反応性の欠如ま
たは確定しない性状は、診断においてこの技術に帰され
る重要性を示している。更に、これらの情況下での暗視
野顕微鏡術の結果は、治療および疫学的フォローアツプ
の必要を決定する。この手順が診断の誤シ、不適切な治
療、疫学的研究の誤った指示、および患者に対する不要
な徴候のプレースメントを生ずることがある厳しい生物
的制限および技術的制限を伴うことが不幸である。

梅毒トレポネーマに類似の形態および運動性を有する口
腔、生殖器および胃腸管中の宿主−常在非病原性トレポ
ネーマの潜在的存在は、暗視野顕微鏡術による明白な固
定を妨げる。更に、雰囲気酸素の存在下における運動性
の比較的迅速な損失は、典型的病原体の観察を保証する
ためにスライド試料の迅速な試験を必要とする。この不
安定性は、浸出液中の生物の正確な同定の機会を減少す
る。

更に、初期病変中の少数のトレポネーマの潜在的存在は
、生物の存在にも拘らず陰性の暗視野試験を生ずること
がある。この感度欠如は、驚異的ではない。浸出液／ｍ
ｌ当だｐｔｏ　　の生物を含有する梅毒トレポネーマ懸
濁液の暗視野試験は、校正顕微鏡を利用した時／、００
０高乾燥視野中の１つの生物に等しく、それ故容易には
検出できないであろう。更に、トレポネーマ生物がまれ
にしかいない時には、単一のスピロヘータ生物の検出は
、統計的に有意な事象であるが、これは、信頼性のある
臨床試験の見地からは依然として五皇二ｆｔｆｘ公結果
であろ５゜ 技術の限界は、暗視野顕微鏡の適当な使用を必要とする
かなシの訓練、経験および専門的技術によって更に倍加
される。

これらの複雑さの結果、暗視野試験は、行われないか、
しばしば不正確に行われるかのいずれかである。トレポ
ネーマ性感染症に対するザ・ワールド・ヘルス拳オルガ
ナイゼーシ璽ン・サイエンティフィック・グループは、
この診断空白を認めておシ、そして「最大の必要はトレ
ポネーマを同定スるためのヘルスケアユニットの性能を
改良することである」と述べている［Ｗ、Ｈｌｏ、　　
テクニカル・レポート・シリーズ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
　Ｒｅｐｏｒｔ８ａｒｉ＊ｓ　）　Ｎｎ　６７４ｋ　、
　　ｐ、　：ＬＡ（／りｒ２）〕。

ケロッグ、ヘルス・ラボラトリ−Ｓサイエンス（Ｈ＠ａ
ｌｔｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　５ｃｌｅｎｃａ　
　）　　７　　：３１Ａ−ＩＡＩ（ｌり７０）によって
提案されている迅速な直接螢光抗体暗視野（ＤＦＡ−Ｔ
Ｐ）技術は、暗視野顕微鏡手順よシも効率よい方法とし
ての約束を与えると思われる。しかしながら、データの
注意深い分析は、ポリクローナル抗体が一次螢光化抗体
複合体として利用された時に暗視野試験と比較して感度
、特異性、および再現性の欠如を示した。

無症候神経梅毒および症候神経梅毒の診断は、重大な謎
も示す。再度、中枢神経系統の他の疾患を有する患者の
間で生ずるものとの臨床的明示の類似性、患者の脳を髄
液中の梅毒トレポネーマを検出することができないこと
、および脳を髄液中の抗体を検出する感受性または特異
性非トレポネーマ性およびトレポネーマ性血清学的試験
の欠如は、特異の診断の不正確さをもたらす。

梅毒トレポネーマ抗原決定基と特異的に反応Ｕそして宿
主−常在非病原性トレポネーマ−７アゲデニス（Ｔｒ＠
ｐｏｎｅｍａ　ｐｈａｇｓｄｓｎｉｓ　）生物型ライタ
ー（Ｒａｆｔｅｒ　）またはウサギ宿主翠丸組織抗原と
は反応しないネズぐモノクローナル抗体の産生は、本発
明者らに係る米国特許第μ、！／μ、μりｒ最明縦書に
既述されている。この研究ｉマ、それぞれ初期梅毒およ
び神経梅毒を有する患者の病変浸出液または脳を髄液中
の梅毒トレポネーマまたはその構成抗原の同定の迅速性
、単純さ、コスト上の有効性、高感度、高い特異性、お
よび再現性の基準を満たす１以上の手順の開発へのアプ
ローチの意味のある新しい方法を提供する。モノクロー
ナル抗体も、新生児の先天性梅毒の診断において有用で
あることがある。

本願は、性器潰瘍として臨床上明示する他の性媒介疾患
の病因物質と相互作用せずに非常に少数の病原性トレポ
ネーマを検出する数種の抗梅毒トレポネーマ特異性モノ
クローナル抗体の能力を記載する。

本発明によれば、梅毒および他のトレポネーマ性感染症
、例えば苺腫およびビンタな診断する方法が、提供され
る。本法は、梅毒、苺腫またはビンタを有すると疑われ
る者からの生物学的試料、例えば病変浸出液、脳を髄液
、血清、尿、羊水、滑液または組織ホモジネートを、７
ランベシア（ｐ＠ｒｔｅｎｕｓ　）、エンデミカム（ｅ
ｎｄｅｍｌｃｕｍ　）、カラチウム（ｃａｒｓｔｅｕｍ
　）およびパリダム（ｐｍｌｌｌｄｕｍ　）を包含する
梅毒トレポネーマの有毒亜種の抗原に対して特異的であ
るモノクローナル抗体の試薬と一緒に混合することを包
含する。梅毒トレポネーマ、即ち梅毒の原因生物が存在
するならば、免疫学的特異性結合反応が、モノクローナ
ル抗体と梅毒トレポネーマ上の抗原部位との間で生ずる
であろ５゜陽性の免疫反応は、限定せずに各種の技術、
例えば直接試験法としての放射線免疫検定法、螢光免疫
検定法、酵素結合免疫吸着検定法、凝集反応法および補
体消費試験法並びに−次免疫学的反応の二次検定法とし
てのマウスモノクローナル１．のトレポネーマへの結合
を検出する多数の他の手順によって検出され得る。

以下の議論は、出願時におい【本発明者らに知られてい
る最良の形態を表わす本発明の好ましい態様についての
ものである。

材料および方法 人　細菌およびウィルス菌株および抗原梅毒トレポネー
マの有毒二コールズ（Ｎｉｃｈｏｌｇ　）菌株をこの研
究において代表的病原体として使用した。前記米国特許
第弘、！ＩＩＡ、４ｃ９１号明細書に記載のよ５に、そ
れを維持し、培養し、そして感染ウサギの翠丸から単離
した。トレポネーマ・ファゲデニス生物散ライター（ラ
イター・トレポネーマ）を代表的雑菌性非病原性トレポ
ネーマとして使用し、そして前記米国特許第弘、！ｌ弘
、弘りｒ最明縦書に記載のよ５に培養し、そして産生じ
た。滅菌スキムミルク中のへモフィルス・デュクレ−（
Ｈａｅｍｏｐｂｉｌｕａ　ｄｕｃｒ＠ｙｉ）の懸濁液は
、エリツクーハンセン（ダラスのザ・ユニバージティー
・オフ’−テキサスーヘルス・サイエンス・セ／ｐ−（
Ｔｂｅ　Ｕｎｌｖｅｒ８１ｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘｔｓ　Ｈ
ｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ　）によって
提供された。ダラス市のセクジュアリ−・トランスミク
チイツトｅデイジージズ０クリ３ツク（５ａｘｕｉｌｌ
ｙ　ＴｒａｎａｍＬｔｔｓｄＤｌｔ＠ａｓ＊ｓ　Ｃ１１
ｎｉｃ　）およびカントリー・ノくブリック、ヘルス・
デパートメント（ＣｏｕｎｔｒｙＰｕｂｌｉｃ　Ｈ＠ａ
ｌｔｈ　Ｄ＠ｐａｒｔｍ＠ｎｔ　）における患者から単
離された淋菌（Ｎｅ１ｓｓ＠ｒｌａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅｓｅ）は、ガリー―カートライトによって提供され、
そしてテイヤーーマーチン（Ｔｈａｙｖｒ　−Ｍａｒｔ
ｉｎ　）培地上に維持された。淋菌細胞をリン酸緩衝生
理的食塩水（ＰＢＸ）に懸濁した。スキムミルク中の単
純性庖疹ウィルスタイプ２（菌株／ム）は、ロビン・ロ
ビンソ／の贈物であった。

正常ウサギ畢丸の抽出液をコントロール試験用の正常な
ウサギ畢丸抗原源（組織抗原および血清抗原の両方を含
有）として使用した。梅毒トレポネーマの場合に米国特
許第≠、ｚｉ４ｃ、弘りを最明縦書に記載のように畢丸
を細かく切シ、そして血清−生理的食塩水培地中に抽出
したが、２！ＯＸ、ｇにおいて７分間１回だけ遠心分離
して濁った上澄みを調製した。タンパク質検定は、この
製剤１０μｌが全ウサギタンパク誓約／２０μ？を含有
すること、およびこの全タンパク質の９１が血清−生理
的食塩水抽出培地中の正常なウサギ血清によることを示
した。−９℃で２ケ月間まで貯蔵された製剤は、放射線
免疫検定法によって測定した時に同様の抗原反応性を保
有するらしかった。

ガラス接着を通して失われるトレポネーマの量を減少す
る試みにおいて、トルエン中の２係ジクロロジメチルシ
ランで処理されたシリコーン化カラス製試験管を使用し
て、梅毒トレポネーマ細胞の新鮮な懸濁液をＰＢＳに連
続希釈した。健全な梅毒トレポネーマ細胞の出発ストッ
ク懸濁液の量を暗視野顕微鏡術によって測定し、そして
これおよびそれぞれの希釈液の／μｍ部分なイムノプロ
ット（１ｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　）検定で使用する２紙上
にスポットした。

Ｂ、モノクローナル抗体 梅毒トレポネーマに向けられたモノクローナル抗体の産
生、維持および特性化並びに関係のある組織培養法は、
米国特許第弘、！ＩＩＬ、弘りｒ最明縦書に記載されて
いる。ここでｊＧｊ、４！Ｈ７、／３Ｃ６、／３Ｇ１０
．／Ｆ！、ＪＢｊ、ｒＧ２．２Ｂ／ｊ。

４ＡＡ１０−／、　１ＡＡ１０−７、ｊ　ＡＪ−２、／
３　Ｃｒ　。

およびＩ／Ｅｌと示されるモノクローナル抗体は、米国
特許第弘、！／ＩＡ、μりｊ最明縦書に詳細に記載され
ている。

Ｃ１抗梅毒トレボネ一マモノクローナル抗体を特徴づけ
るのに使用される梅毒の血清学的試験アフィニティー精
製されるか、ハイブリドーマクローン上澄み内に見出さ
れるかのいずれかのマウス抗梅毒トレポネーマモノクロ
ーナル抗体を、梅毒トレポネーマ固定化（ＴＰＩ）試験
において梅毒トレポネーマニコールズを固定化する能力
について試験した。ＴＰＩ検定をセンター・フォア・デ
ジーズ・コントロール、ｌりを弘、マニ具アル・オブΦ
テスツ・フォア・シフイリス、センター・フォア・デジ
ーズ幹コントロールＯラボラトリ−・マニュアル、Ｕ、
　Ｓ、デハートメン）−オブ・ヘルス、エデュケーシ冒
ン・エンド・ウェル７エア、パブリック、ヘルス、サー
ビス、センター−フォア・デジーズ・コントロール、ア
トランタ（Ｃａｎｔｅｒ　　ｆｏｒ　Ｄｉｓ＠ａｓｅ　
Ｃｏｎｔｒｏｌ、　／ＹＡＩＡ。

Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　Ｔｅ５ｔｓ　　ｆｏｒ　５ｙｐ
ｈｉｌｉｓ、　Ｃ＠ｎｔｅｒｆｏｒ　　Ｄｌｓｅａｓｅ
　　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ｍａ
ｎｕａｌ。

Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｈｅａｌｔ
ｈ、　　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ、
　　Ｐｕｂｌｔｃ　Ｈ＠ａｌｔｈ　Ｓ＠ｒｖｌｃａＣｅ
ｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｌｓｅａｓｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、
　　Ａｔ２ａｎｔａ　）に既述の方法で少し修正をして
行った。必要に応じて、ベニシリナーゼ（メリーランド
州コツキーズビルのＢＢＬマイクロバイオロジー−シス
テムズ）を試験手順に配合して、ハイブリドーマクロー
ン上澄み中の残留ペニシリンの可能性を排除した。

梅毒トレポネーマ抗体［インディアナ州エルグハードの
マイルスーラボラトリーズ・インコーボレーテクドのア
メス・ディビジ百ン製セラ・チク（５ｅｒａ　−Ｔ＠ｋ
　）　］のマイクロ赤血球凝集検定を、製造業者によシ
記載の方法によって、ハイブリドーマクローン上澄みお
よびタンパク質入−セファロース（Ａ−８ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　）アフィニティー精製抗梅毒トレポネーマモノク
ローナル抗体の両方について行った。

Ｄ、固相イムノプロット検定 最初はへとング等の特定の膜タンパク質の放射線免疫学
的篩分は法、Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｓｒｎ、り７：／
ｆ３−／ｊｔ７（／り７り）；およびレクツの膜脂質生
合成の酵素において欠損の大腸菌（Ｅｇｃｈｅｒｌｃｈ
ｉｍの手ｊ＠の修正から由来するコロニープロット放射
線免疫検定法の修正法を使用して、各種の抗原に対する
抗梅毒トレポネーマモノクローナル抗体の反応性を算定
した。

イムノプロット検定において、以下の抗原製剤の各々ｌ
μｌをワットマンＮｆｌ　ａｘ　Ｐ紙ストリップ上にス
ポットした：梅毒トレポネーマニコールズ、ＰＢＳ中／
　ｙ：、１０Ｂ−ｊ×ｔｏ’の細胞／ゴ（暗視野顕微鏡
術によって量を計る）；実験ウサギの細かく切られた一
次下前病変から収穫される梅毒トレポネーマニコールズ
、／×ＩＯの細胞／ｍｉ；）レボネーマ・７アゲデニス
生物型ライター、ＰＢＳ中の、２Ｘ／（７８の細胞／セ
；ヘモフィルスーデュクレイ、ＰＢＳ中のｓ×ｔｏ　　
ＣＦＵ／酩のスキムミルク懸濁液；淋菌、ＰＢＳ中の／
Ｘ１０　　の細胞／ゴ；単純性庖疹つイルスタイプコ、
ＰＢＳ中の／×１０ｆ！Ｐ　Ｆ　Ｕ　／ｍｌのスキムミ
ル′り懸濁液；および正常なウサギ畢丸抗原。

試料を３０分間風乾させることによって固定を達成した
。抗原を有するフィルターストリップを胎児ウシ血清μ
係（容量／容量）およびウシ血清アルブミン０．．２％
を含有するＰＢＳ（ミズーリ州セントルイスのシグマ・
ケミカル１カンパニー；放射線免疫検定等級）ＶｃｔＡ
℃で３０−１．０分間プレソーキングした。次いで、ス
トリップを、抗梅毒トレポネーマモノクローナル抗体を
含有する３〜４Ａ日齢のハイブリドーマクローン上置み
４Ｌｙｎｌと混合された新鮮なプレソーク緩衝液ｒゴま
たはアフィニティー精製抗梅毒トレポネーマモノクロー
ナル抗体ＸμＳ’／ｒＩＬｔ　で補足された新鮮なプレ
ソーク緩衝液ｔｏｍｌのいずれかを含有する管に移動す
ることによって、ストリップを一次モツクローナル抗体
にさらした。管を４’　”Ｃにおいて３時間揺動し、そ
してストリップをＰＢＳ＋胎児ウシ血つｓ４の連続的１
０ｖｔ部分中でμ回洗浄することＫよって未結合モノク
ローナル抗体を除去した（各洗浄に対して≠℃において
３０分間揺動）。

モノクローナル抗体のそれぞれの抗原への結合を精査す
るために、ストリップを１２５Ｉ　標識しだてのアフィ
ニティー精製ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ
）Ｃ重鎖および軽鎚特異性）（比活性約、２，２Ｘ１０
”　ＣＰＭ／ｆｉ９−）／　Ｘ１０’ＣＰＭ”Ｃ’補足
された／：２ｄのＰＢ８＋胎児ウシ血つｇ４を含有する
管に移動した。管を弘℃において一夜穏やかに揺動した
。ストリップをＰＢＳの７２ｍノ部分中で連続弘回洗浄
することによって、過剰の１２５エ　プローブを除去し
た（各洗浄に対してμ℃において３０分間）。次いで、
ストリップを除去し、風乾し板紙上に載せ、そして増大
スクリー／（コダックｅクロネックスーライト二ング伽
プラス）でフジＸ線フィルムにコ時間〜φ日間さらして
抗原とのモノクａ−ナル抗体の反応性をオートラジオグ
ラフィー分析した。

Ｅ、トレポネーマ性タンパク質のウェスターンプロット
（ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔｓ　）梅毒トレポネーマ
をハンフおよび同僚のバー；−ル（Ｐａｒｃｏｌｌ　）
密度勾配法によって精製した〔Ｐ、　Ａ、ハン７、Ｓ、
Ｊ、ノリス、Ｍ、　Ａ、ロベクト、およびＪ、　Ｎ、ミ
ラー、／／　　Ｓｅｘ、Ｔｒａｎｓ、　Ｄｉｓ。

２７！　−２ム、（／りｒｌＡ））。密度勾配遠心分ｍ
徽細胞をＰＢＳに懸濁した後、／３．！００×ｇで３分
間遠心分離することによって、トレボネ−７からパーコ
ールを洗浄し去った。この工程を数回繰シ返して、生物
がパーコールを含まないことを保証した。

トレポネーマをＰＢＳ／ｍｌに懸濁し、そしてミクロテ
ィップ（ｍ１ｅｒｏｔｉｐ　）でＳＯ係パルスにおいて
ブランソン（Ｂｒａｎａｏｎ　）モデル！、ｒＯソ二ケ
ーターでセツティングμ〜ｊにおいて氷上で／−７分間
音波処理した。音波処理物／ｒｎｌをトリス−塩酸塩０
．／ｌｒ７！　Ｍ　（ｐＨＡ、ｌｒ　）　、グリセａ−
ｙｖ３ｏ％ｃ容量／容量）、ドデシル硫酸ナトリウムを
係（重量／容量）およびトラッキング染料としてのブロ
モフェノールブルーｏ、２ｓ％＜重量／容量）からなる
消化緩衝液０．　ｚ　ｍｌで希釈した。修正リムリ（Ｌ
ａａｍｍｌ　ｉ　）手順として、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル上への装填、爾後の電気泳
動前に、コーメルカブトエタノールｊ％（容量／容量）
の存在下において！分間沸騰することによって、音波処
理懸濁液を可溶化し、そして減少させた。分子量マーカ
ーを有するゲルを固定し、そしてクマシーブリリアント
ブルー０．／％で色付けした。

トランス・プロット（ＴｒａｒＪｓ　−ｂｌｏｔ　）　
　装置（カリフォルニア州すッチモンドのバイオ拳ラッ
ド・ラホラトリーズ）を使用するウェスターン法の修正
ニよって、ニトロセルロース紙へのタンパク質の電気泳
動移動を行った。プロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ　
）緩衝液（トリスペースＸＩ　ｍ　Ｍ　、　　グリシン
／７７ｍＭ、および１％メタノール）中での３〜７０分
の平衡期間後、ポリアクリルアミドゲルを湿潤１紙（ワ
ットマンｌｆｉ／）上に置き、そしてニトロセルロース
のストリップ（バイオ・ラッド：０、≠よμｍ）を個々
のレーン上に加層した。ｒ紙の第二片をニトロセルロー
ス上に加層し、そしてこのサンドインチを支持体間に置
き、そしてニトロセルロースを陽極に面させながらトラ
ンス・プロット装置に装填した。室をプロッティング緩
衝液で充填し、そしてｒ＝１０Ｖ／ｃｍの電圧勾配な≠
℃において／を時間印加した。

一ン２ｏ（Ｔｗ＊＊ｎ　２０　）中Ｊμｔ／Ｒ１の−次
抗体（ネズミ抗梅毒トレポネーマモノクローナル抗体）
分間コ回洗浄した。結合モノクローナル抗体の検出のた
めに、ストリップをセイヨウワサビペルオキシダーゼ複
合ヤギ抗マウスＩｇＧの１０　　希釈液（ＲＨ濃度約−
μＰ／ｌ１ｌ）　　（ペンシルバニア州コヒランビレの
カッベル嗜うボラトリーズ）中におい４−ンＪ中におい
てμ回完全に洗浄することによって、過剰の抗体をスト
リップから除去した。ストリップを蒸留水中ですすぎ、
そして３部の塩化ナトリウム２００　ｍＭ　＋　）リス
−塩酸塩１０ｍＭ　（ｐＨ７，２）と混合されたメタノ
ール中の弘−クロロ−ｌ−す７トール（シグマ）の３■
／プ溶液１部で顔色した。過酸化水素を最終濃度ＱＯ／
　％に添加し、セしてス）　ＩＪツブをこの溶液に１０
分間浸漬した。

紫色のバンドが現われたら、ストリップをアジ化ナトリ
ウム０．／４の溶液に入れてペルオキシダーゼ反応を抑
制した。次いで、ストリップを乾燥し、そして装着した
。

例Ｉ 合計１７種の異なるモノクロナール抗体〔３Ｇ！、’Ａ
Ｈ７、ｌ３Ｃ４、／ＪＧ１０．／Ｆ４Ｌ、ＪＢｒ、ｒａ
λ、りＢ１０、≠Ａ／θ−／、μに１０−７および！Ａ
３−２〕を、減少量の梅毒トレボネーヤ細胞を検出する
能力について前記イムノプロット検定法によって欄べた
。試験されたすべての抗体は、トンポネーマ／Ｄ０，０
００および１０，０００を含有するス。

ポットを検出した。これらのクローンのｊつ、即ち、３
　Ｇ　ｊ−１Ｆ　Ｈ７、／、３Ｃ４、１３Ｇ１０．およ
びｒａλは、１０００程度の梅毒トレポネーマ細胞と反
応した。しかしながら、この特定の実験においてはモノ
クローナル抗体ｒＧ２は、試験された他の抗体よシも若
干多いフィルターに対するバックグラウンド結合水準の
反応性を生じた。

例■ 本例は、例Ｉで予め調べられた３種の最も高感受性ノ抗
体１７）５ち１−）（ｒＧＪ、／Ｆ４Ｌ、ｌ３Ｃ４、お
よび３Ｇりとモノクローナル抗体／／Ｅ３の感度試験を
比較する。スポット当たりの梅毒トンボネーマ細胞の出
発水準を１倍に増大した。イムノプロット検定法によっ
て試験されたすべての３種の抗体は、トレポネーマＪ″
ｏ　ｏ、　ｏ　ｏ　ｏおよびｔ　ｏ。

０００とよく反応し、そしてＰＢＳ負コントロールは、
明らかに陰性であった。これらのクローンのうち、抗体
／３Ｃ乙だけは、梅毒トレボネーヤ細胞ｔｏ、ｏｏｏ未
満と反応した。トレボネーヤ２００程度が、抗体／３ｃ
６によりて再現性をもって検出だけでありた。

例■ 試験された池のモノクローナル抗体に比較してぶを他の
所定のモノクローナル抗体との組み合わせで混合した。

七ツクローナル抗体の所定の組み合わせが一層少ないト
レポネーマの検出を有意に高めることができたかど５か
を算定する試みにおいて、抗体混合物を梅毒トレポネー
マ細胞と反応させた。モノクローナル抗体／３Ｃ４の反
応性は、抗体ｊｒＧ２、ｊＧＪ′、およびりＢ／？との
組み合わせで梅毒トレポネーマに対して反応された時に
有意には高められなかった。抗体／、７Ｃｊは、単独ま
たは組み合わせで使用された時に梅毒トレポネーマと本
質上反応性でありた。同様に、モノクローナル抗体ＷＢ
／２は、３Ｇｊとの組み合わせで使用された時に、その
自己のシグナル以上の増大を生じなかった。他の場合の
よ５に、ＰＢ８コントロールは、陰性であった。抗体／
、３Ｃ４による梅毒トンボネー！細胞ｊ００程度の検出
は、再現可能であった。

例■ 例Ｉ、Ｉｆおよび■に実証される反応性に基づいて選択
されたモノクローナル抗体を使用する追加のイムノプロ
ット検定法を、若干更に選択的な希列 釈系例のトレポネーマの場合に行った。注意深く希釈さ
れたトレポネーマを使用して各種のモノクローナル抗体
に対する感度の限界を正確に測定するイムノプロット検
定法は、モノクローナル抗体／／Ｅｌがフィルターへの
若干のバックグラウンド結合の存在下においてさえ梅毒
トレポネーマ細胞ｉ、ｏｏｏ−２ｚｏｏを検知できるこ
とを示した。モノクローナル抗体１０コは、わずか１０
００のトレホネーマと反応した。モノクローナル抗体／
３Ｃ４の検出特性は、モノクローナル抗体ｒａ、ｚの検
出特性と同様であった。前の例で見出されたように、オ
ートラジオダラムの長期露出は、／３Ｃ＆がこの検定法
において２００程度のトレボネーＶを検出できることを
示した。オートラジオグラフィーの場合のこのよ５な長
期のインキエベーシ１ンは、バックグラウンドを有意に
は増大せず、それによりて梅毒トレポネーマ検出をこの
低水準において可能にする。このよ５に、試験検定系内
のバックグラウンドが最小に保持できるならば、モノク
ローナル抗体ｔ／ｗ　３．　ｔｙｃ　６　、　オ！Ｕｒ
　ａ　２ハ、ｚｏｏ−７ｏｏＯ穆度のトレポネーマを検
出する能力において極端な感度を示す。試験された残シ
の抗体、即ちＪＧｊ、！）Ｉ７、／３Ｃｒ、／ＪＧ１０
．およびＰＨ１０は、すべて、２．ｚｏｏの梅毒トレポ
ネーマ細胞の存在を明らかにした・これは、り０−ン／
／Ｅ　Ｊ　、　／ＪＣ４およびｒＧ２によって示される
感度かられずかに減少された。

例Ｖ 梅毒トレポネーマ検出に対する高感度に基づいて予選択
された数種のモノクローナル抗体をクエスターンプロッ
ト検定法において使用して梅毒トレボネムマ抗原へのそ
れらのそれぞれの結合を測定した。抗体４ｔＨ７，ｒＧ
２、／／Ｅｌ、ｊＧｊ。

／３Ｃ６％／３Ｃり、ＹＢ／２および／３　Ｇ　１０は
、見掛分子ｔ≠’１０００（主バンド）〜弘シｏｏｏ＜
副バンド）を有する類似の抗原に結合した。クエスター
ンプロフト法または他の免疫検定法において当量のトレ
ポネーマ・ファゲデニス生物型ライター細胞で試験され
る時、これらのモノクローナル抗体のどれも、ライター
抗原に結合しなかった。本発明者らによる他の研究は、
梅毒トンポネーマの≠７．　。

？ ｏｏｏ−４Ｌ惣０００ダルトン抗原が数種の病原性トレ
ポネーマ亜種に共通であるが非病原体トレポネーマ・フ
ァゲデニス生物型ライターには不在である生物の豊富な
表面露出免疫原であることを示している〔マルチット等
、病原性梅毒トレポネーマ亜穏の５ち特異性抗原類似体
のモノクローナル抗体分析、Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍ
ｕｎ、弘ｔ　：　ｔｔｏ−ｔｔす（ｌりｒμ）；および
ジ璽−ンズ等、赤血球凝集、固定化、および中和活性を
有するモノクローナル抗体は梅毒トレポネーマの免疫優
性の分子ｆＬ４’Ｚ０００の表面露出免疫原を定義にコ
ールズ）、Ｊ、　Ｅ３ＣＰ、　　Ｍ＠ｄ、　　／　ｔ　
Ｏ：　／弘ｏｕ　−／ａｘｏ（／ｙｒｐ））、梅毒トレ
ポネーマの≠’ｙ、ｏｏｏ、−弘ｒ、ｏｏｏ　ダルトン
表面免疫原に対して向けられる抗梅毒トレポネーマモノ
クローナル抗体は、梅毒トレポネーマ細胞および抗原の
検出に対して最高の感度を有することを証している。こ
のことは、梅毒トレポネーマの≠７０００−≠ｒ、ｏｏ
ｏダルトン免疫原が有毒トレボネー１性生物の表面上の
最も豊富な免疫優性抗原の１つであることができるとい
５以前の結論と一致する（Ｉｂｌｄ、）。

例■ サーベイ（ａｕｒマ・ｙ）実験において、ｌ／Ｗｉの梅
トレポネーマ特異性モノクロナール抗体を各種の性器潰
瘍形成性媒介病原体と反応させて、これらの生物との交
差反応性を調べた。この時点で、クローンｌｌＡ１０−
７は、モノクローナル抗体の産生を停止し、それ故ＰＢ
Ｓのコントロールと一緒に負コントロールとして役立っ
た。試験されたすべてのモノクローナル抗体〔３Ｇ！、
４ＡＨ７、／３Ｃｒ　、　７３Ｇ１０．　／　Ｆ　４！
、ｊＢｊ、ｒＧ２、ＦＢ／２、’Ｉ−に１０−／、ｊＡ
ｊ−コ〕は、Ｎ製梅毒トレボネに悪濁された梅毒トレポ
ネーマ細胞も、陽性シグナルを生じた。試験されたすべ
ての抗体は、非病原性ライタートＶボネーマ、即ちヘモ
フィルス・デユークレイの臨床的単離物、並びに正常な
ウサギ翠丸物質の抽出液と反応しなかった。爾後のイム
ノプロット実験も、これらのモノクローナル抗体が他の
非病原性トレポネーマ、即ちトンポネーマ・ピンセンチ
−（Ｔ、　ｖｌｎａａｎｔ目）、トレポネーマ・デンチ
コラ（Ｔ、　ｄｅｎｔｉａｏｌｍ　）　、）レポネーマ
・レフリンゲンズ（Ｔ、　ｒａｆｒｌｎｇｅｎ、ｓ　）
　、およびトレポネーマ・スコリオドンタム（Ｔ、５ａ
ｏｌｌｏ−ｄｏｎｔ　、ｍ　）と反応しないことを示し
ている。モノクローナル抗体／３Ｃｒの若干例を除いて
、抗体の各々も、単純性庖疹ウイルスタイブコおよび淋
菌と反応しなかった。これらの結果は、梅毒トレポネー
マに対するモノクローナル抗体の高度の特異性を示した
。

例■ モノクローナル抗体／３Ｃ４を同様の検定法においてこ
れらの性媒介病原体との反応性について試験した時、淋
菌および正常なウサギ組織製剤との少ない交差反応性が
、観察された。

モノクローナル抗体の寄託 本発明において３ｃｊ（ＴＰＩ反応性）およびｒＧ２　
（ＭＨＡ−ＴＰ反応性）と同定されたモノクローナル抗
体を産生ずる雑種細胞系統の寄託は、アメリカン・タイ
プ・カルチア−・コレクシ覆ン（Ａｍｅｒｌａａｎ　　
Ｔｙｐ＠Ｃｕ１ｔｕｒ＠Ｃｏ１１ｅｏｔｉｏｎ　　）に
おいて寄託されておシ、それぞれＡＴＣＣＮｏ。

ＨＢ　ｒ／ＪＪおよびＨＢｒ／３μを指定されている。

別の免疫検定法 ここに記載のイムノプロット検定法は、操作可能であシ
かつ良好な結果を与えるが、放射性同位元素プローブを
使用するこの方法は、臨床的セツティングにおいて慣例
の診断手順の選択法を反映しない。放射性プローブに関
連する問題、例えば環境安全上の危険および処分問題は
、その全体の有用性を排除する。

抗梅毒トレポネーマモノクローナル抗体は、診断試験と
して他の多くの方法の１以上において使用され得る。特
に、モノクローナル抗体は、放射性同位元素、螢光標識
、または酵素などのトレーサーでの常法によってＮＲさ
れ得る。このような標識抗体は、診断試験において極め
て有用である。

Ｍ接免疫検定法および間接免疫検定法の両方を包含する
各種のアプローチが、利用され得る。一般的免疫検定テ
ーマについての変化は、放射線免疫検定法（直接または
間接）、螢光抗体法（直接または間接）、溝素結合免疫
吸着検定法（ＫＬｒＳＡ’ｓ）、溶血阻害検定法、凝集
阻害試験法、凝集反応（抗体−配位子媒介）、および（
または）補体消費試験法を包含する。７以上の抗梅毒ト
レボネーアモノクローナル抗体をこのような系で使用す
ることは、モノクローナル抗体が梅毒トレポネーマに対
すして特異的であシかっ非常に高感受性の種類の免疫検
定法で使用できるので、初期−次梅毒の診断用に重要な
新しい有用な試験を構成する。このよ５な感受性検定法
は、先天性梅毒性病変中または神経梅毒の脳を髄液中の
梅毒トレポネーマ細胞または抗原（細胞または寸断物の
片）の検出を通して先天性梅毒または神経梅毒の診断に
おいても有用である。

以下のものは、梅毒トレポネーマに対して免疫学的に特
異的な検定法を組み立てる際にモノクローナル抗体の場
合に利用できる手順を総括する。

テクノロジーのスペクトルは、モノクローナル抗体とそ
れに親和力を有する抗原〔エピトープ含有エンテイテイ
ー（ｅｎｔｌｔｙ　）　　）との間の特異的相互作用の
存在を決定するのに使用できる有視件の幅を指摘するた
めにン提示される（［リボ−ディング（ｒｅｐｏｒｔｉ
ｎｇ　）　Ｊ手順）・■、−次検定法：分配をベースと
する方法／、放射能 外因的に標識された抗体 内因的に標識された抗体 ２６　　螢光、視覚走査、パターン法 ３、凝集 也　補体結合 ！、酵素増大法（ｅｎｚｙｍｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐ
ｒｏａｓ−ｄｕｒｅ［３ ■、二次または間接検定法また、分酸をベースとする方
法 ／、抗軽鎖および重鎖 コ、抗イディオタイプ ３、ハブテンをベースとする方法 ≠、他のレクチンをベースとする方法 タ、アビジン／ビオチン 八　放射能 コ、酵素をベース／比色定量 ３、外来法（＊ｘｏｔｌａ　ｍｅｔｈｏｄ　）ａ、化学
ルミネッセンス ｂ、ＦＡＤ−抗原 Ｃ１電気化学 ｄ、金属免疫検定 分配の重要性 感度の大抵の検定手順は、（１）抗原（Ａｇ）と抗体（
Ａｂ）との会合、（２）反応物質と未反応物質との間の
爾後の分配、および（３）　Ａｂ　−Ａｇ複合体または
遊離Ａｇの損失または遊離Ａｂの損失（それらの７つが
成る方法で「標識」される）の最終測定に頼る。この分
配法は、単純であることができ、例えば抗原を含有する
表面への抗体の結合（液相から固相に転移した後、状態
および濃度を変化させる）であることができる。更に複
雑な手順は、抗体を未反応抗原から分配する追加の物理
的処理（例えば、抗体の「塩析」、シかし可溶性抗原を
塩析せず）を必要とする。すべての戦略が同等に有効で
性質および化学的性質を注意しかつ顧慮して選択されな
ければならない。

トレポネーマの検出の特定のセツティングにおいては、
小粒子を検出しよりとしている。このように、均質溶液
または分配液が遠心分離による洗浄のような単純な手順
によってあたかも゛影響され〉も 得るよ５に、ｓ−ｍ液が処理され得る。この微生物は視
覚化させるのに十分な大きさを有するので、更に別の利
点は明白であシ、そして生物の変った「栓抜き」形状の
ため、視覚的識別が追加の手順として使用され得る。例
えば、視覚螢光が検出法として使用されるならば、検出
は、所定の色の光を放出する物質の閾値量に基づくであ
ろうだけではなく、その光を放出する物質の分布のパタ
ーンは、真正の梅毒トレポネーマ生物の存在の決定に有
用なガイドとして役立つであろう。

■、−次検定検 定法ノロジーのため、抗体は、放射性元素、例えば１１
２う、■１２９、Ｈ５、Ｃ１’ｌ、またはＳ５５での化
学的修飾用に多量に入手できる。これらの修飾は、直接
（例えば、チロシン残基のヨウ素化）または間接〔例え
ば活性分子（例えば、放射性元素Ｓ５５、Ｈ５、または
Ｃ１４を含有するスルホニルクロリド誘導体）によるア
ミノ基の化学的修飾〕であることができる。

抗原と放射性抗体との間での分配後、抗原含有分画は、
標識の保持について試験される。異なる感度の数種の方
法が使用され得る。ラジオオートグラフィーは、前記同
位元素のすべてを検出するであろ５゜これは、感受性の
方法であるが、かなシの時間を必要とする。

固相結晶でのシンチンーシ覆ンｔｔａは、１１２５■１
２９の場合に有用であるが、Ｃ１４、Ｃ３またはＳ５５
の場合には有用ではない。これらの後者の元素は、液体
シンデレーシ１ン計数を使用して最良に検出される。

よって産生されるので、抗体゛を生合成的に標識するこ
とが可能である。細胞系統は、メチオニンを有していな
い組織培養培地中で成長され、そして培地は、非常に高
い比活性の（Ｓ）Ｌ−メチオニンで補足される。産生さ
れた抗体は、このように固有に標識される。この手順は
、化学的修飾を行５必要がなく、従りて免疫学的活性の
損失が予期されないとい５利点を有する。

検出または結合は、前記の通シである。固有標識の場合
には、１１２５または１１２９を使用することは可能で
はない。

性力法の全　の　用 利　点　　非常に「熱い」分子が、生成され、そして非
常に高感受性のテクノロジーが作られ得る。

欠　点　（１）　　抗体が化学的に修飾される時の生物
学的活性の潜在的損失、（２）放射性同位元素での作動
、例えば電離性放射線への露出に関連する危険。

例として示唆される典型的（可能な）手順１、試料を物
理的結合によシ、またはモノクローナル「Ｍ獲Ｊ手順の
使用にょシガラススライド上に「固定」する。

ユ　固有に標識された抗体なｓ３５メチオニンにさらす
。

Ｊ　未結合抗体を洗い流す（分配）。

仏　写真乳剤へのスライドの「浸漬」。

よ　露出の蓄積（７〜３日）。

４　以下のことを３求めるためのスライドの現像および
走査 ａ、銀粒子の蓄積 す、線状であシかっ栓抜き様であるべきである銀粒子の
パターン （２）螢光法 これらの方法においては、抗体は、低波長の光への露光
後に特殊な波長の光を放出する薬剤と結合される１例え
ば、青色光への露光時に緑色を螢光するしばしば使用さ
れるフルオレセイン・この方法も、視覚観察が使用され
る時にスピロヘータの形状が役立つ同定物であるという
利点を有する。不利な点は、抗体分子の化学的修飾が必
要であることである。感度は、螢光体の性状に応じて変
化し、フイコエリトリンが最も高感受性である。視覚走
査のテクノロジーは、フルオレセインに対して広く利用
でき、外来螢光体、例えばテキサスレッドに対しては次
善に容易に利用できる。

この後者の外来染料は、異なる色の光を放出する螢光体
を有する第二試薬と併用される時に有用でアル。このよ
５に、ｌよシも多〜・エピトープの存在は、同時に確認
され得る。化学的修飾テクノロジーは、広く利用できる
。抗トレポネーマモノクローナルのフルオレセイン誘導
体が生成されておシ、梅毒トレポネーマを検出する際の
それらの実用性が報告されている（　ｓ、　Ａ、ルヶハ
ート等、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　／３１Ａ　　：　
ｓｒ！−！９２　　（／９１ｓ　））　　　、　　再度
、提案された手順は、次の通りであろう。

ｔ　抗原の固定（アセトンスライド）（各種の手順を使
用できた）。

ユ　螢光体−抗体複合体への露出。

３、過剰の未反応グローブの洗浄除去（分配）。

仏　適当な大きさおよび形状の緑色放出性生物の場合に
は螢光顕微鏡での視覚観察。

（３）凝集 七ツクローナル抗体は、「捕獲」系をセツティングする
ことによって粒子を凝集するのに最も容易に使用され得
る。このような検定法が有効であるためには、梅毒トレ
ポネーマの２つの異なるエピトープと反応する２つのモ
ノクローナル抗体が必要である。「捕獲」抗体は、化学
的手段によって粒子（例えば、ラテックス）上に置かれ
る。抗体装填粒子は抗原含有物質／培地と混合され、抗
原は粒子の表面に結合され、洗浄されて過剰または無関
連の物質を含まないよ５にする。粒子−Ａｂ−Ａｇ複合
体は、今や粒子と一緒に結合する第二特異性の遊離抗体
分子と反応される。粒子の集合体は、陽性反応と読まれ
る。梅毒トレポネーマ生物は、生物当たυエピトープの
非常に高い密度および少数の生物を有するであろ５から
、抗原の濃度は、全く低いことがある。抗原の人手性を
高めるために、　Ａｂ　−Ａｇ反応を遮断しないであろ
うが抗原含有分子を有効に「可溶化」して全体に濃度を
大幅に増大するであろう温和な清浄剤（ｄｏｔｅｒｒｇ
ｅｎｔ　）を試料に添加できよう。

凝集検定法における抗体の利用への前記の立証されない
が論理的なアプローチのため、手順は比較的低いズライ
オリティ−（ｐｒｉｏｒｉｔｙ　）を有する。このよう
な手順のために、検定法の読み取υ系の極端な単純さ並
びに手順の匹敵可能な安全性および未熟練労働者への接
近性がある。

（４）補体結合 一般原則として、この手順は、反応混合物に添加された
補体を消費する如何なる抗体−抗原反応も検出できる。

モノクローナル抗体を有する臨床的試料用用途の場合に
は、この手順が好ましい態様であるであろう機会は、以
下の理由のため、わずかである。

（、）　　補体結合は、補体な高効率で固定する適当な
りラスの抗体を必要とする（パネルにおける抗体の若干
は満足であるが、他の抗体は満足ではない）。

（ｂ）　　効率良い補体結合のためには、適当なりラス
の２つの抗体が、隣接していなければならない。

しかし、モノクローナル抗体は、抗原の１分子当たυム
個だけのエピトープに対して特異性であると予想され、
従って、被測定エンティテづ−が多数の近接位置した決
定基と高度に多価でなければ近くの相互作用は、予想さ
れない。成るモノクローナル抗体は補体な固定するので
、このことは梅毒トレポネーマの弘７〜！＃に抗原の場
合に真実であシ得る。このように、このことは、全トレ
ポネーマ生物またはフラグメントの検出の場合には真実
であるかも知れないが、不確実性、がある。

（ｅ）　　消費された補体は、生ずる抗体−抗原反応の
数に関連し、補体検出は感受性方法ではないので、「消
費」された少量の補体が検定されなければならない。こ
のよ５な測定は、困難であシ、人為結果を受けやすい。

（ｄ）　　補体測定は、時間がかかシ、臨床的実験室セ
ツティングで予想される条件範囲下で定量的信頼性のあ
る方法で行うことが困難である。

この一連のアプローチは、低分子量基質と反応して着色
生成物（可溶性または不溶性のいずれか）、または可溶
性螢光分子を生成するモノクローナル抗体と酵素との構
成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　）を使用する。再度、手
順は、酵素活性が抗体の存在を標識するよ５に抗体−酵
素からの抗原−抗体−酵素複合体の分配に依存する。

可能な態様は多い。捕獲法に結合される時、検出手順と
分配手順との多数の可能な組み合わせを作ることができ
る。−例として、捕獲モノクローナル抗体を固体マトリ
ックス（２紙）上に置く。

抗原を含有する流体を、２紙とともに置き、そして抗原
は紙に結合する。次いで、未結合物質を洗い流す。次い
で、酵素複合モノクローナル抗体（同−抗厘上の異なる
エピトープと反応する）を添加し、そしてインキ−ベー
ジ震ンする。今や、酵素−Ａｂ複合体は、ｒ紙に結合さ
れるよ５になシ、そして如何なる過剰物も洗い流す。最
後に、基質の溶液（酵素用）を添加し、そして反応を進
行させる。インキュベーシッン期間が長ければ長い程、
検出は高感度である（シグナル対ノイズ比が十分である
ならば）。反応の終シに、流体を除去し、測定するか反
応器において測定する。生成物が着色しておυ、かつ不
溶性であるならば（ホルマザン）、隣性反応は、着色ス
ポットとして見えるであろう。反応生成物が着色してお
り、かつ可溶性であるならば、吸収測定を行う。生成物
が螢光であるならば、螢光測定を行う。最も感度のよい
方法は、後者であり、そして最も感度の低い方法は、第
一の方法である。成功は、反応の特異性（モノクローナ
ル）、存在する非特異性相互作用（シグナル対ノイズ）
および生成物を検出する能力に依存する。

よシ単純な分配法は、スライドへの臨床的物質の固定お
よび顕微鏡検査による酵素生成物の検出を包含するかも
知れない。固体支持体は、反応器壁または反応器に添加
された粒子であることもできた。

このような手順の場合に今まで使用されてきた酵素は、
市販の複合体として ｔ　ペルオキシダーゼ ２　アルカリ性ホスファターゼ ３、　β−ガラクトシダーゼ 弘　グルコースオキシダーゼ よ　アセチルコリンエステラーゼ を包含する。

これらの酵素の若干は、よシ高い回転数を有していてよ
υ多い反応生成物／結合分子／時間の単位を生成するの
で、よシ高感度である。池のものは、活性が哺乳動物的
（例えば、グルコースオキシダーゼ）ではなく、よって
、臨床的試料に存在しないであろうと〜・・う利点を有
する。このこと＆叡検定手順における可能な誤差源を少
なくするであろう。

反応生成物は、不溶性物質〔ホースラディクシｚ　（ｈ
ｏｒｇｅｒａｄｌｓｂ　）ペルオキシダーゼ〕、螢光生
成物（β−ガラクトシダーゼ）および可溶性着色生成物
（アルカリ性ホスファターゼ）を包含する。

これらの可能な系の範囲内において、抗原検出の最良の
方法が得られると考えられる。最も便利な方法は、紙上
の着色スポットであるであろう。

しかしながら、比色検出法は、同等に有用であるが、更
に池の装置を必要とするであろ５゜螢光生成物の検出に
基づく方法は、最良であるが、装置コストの点から最も
問題であろう。

■、二次または間接検定法 抗原が固定相である抗体−抗原系の分配は、新しい戦略
の導入を可能にする。固相抗原に結合された第一抗体は
、新しい分子を導入する。抗原に対してのその特異性の
ため、抗体の数は、抗原の量に正比例し、そして第一抗
体の測定は、抗原の測定と少なくとも同程度の感度であ
ろ５゜若干の価値を有するらしい第二法は、分配後反応
混合物において独特なエンテイテイーとして使用される
第一抗体を検出する方法である。この戦略を使用できる
場合を以下記載する。

／）抗マウス軽鎖 系は、固相抗原（梅毒トレポネーマ）に結合されたネズ
ミモノクローナル抗体からなることができる。免疫グロ
ブリンのネズミ軽釦に対して特異性であシ、かつ免疫グ
ロブリンのヒト軽鎖と反応性ではない通常型またはモノ
クローナルの抗体（気マウス抗体を検出し、従って梅毒
トレポネーマを検出するのに「第二」抗体として使用さ
れ得る。

この第二抗体は、通常の適当な警告（ｃａｖａａｔ８　
）で−次検出系によって使用される検出系のいずれとも
併用され得る。通常抗マウスカッパーと記載されるこの
抗軽鎖試薬は、はとんど常時カッパー型の軽鎖を有する
ので、はとんど如何なるネズミモノクローナル抗体とも
併用され得る。

有用であろう類似の試薬は、ネズミ抗体のクラスと反応
性であシ、ヒト免疫グロブリンとは反応性ではなかった
通常またはモノクローナルの抗体である。−次試薬がネ
ズミＩｇＧの数種のサブクラスのいずれかであシ得るか
、または異な−るクラス、例えばＩｇＭまたはＩｇＡで
あ！ｌｌ得るので、この種の試薬は、次善に有用であろ
う。このよ５に、成る二次血清および一次モツクローナ
ル抗体だけが、−緒に使用できた。再度、検出系は、セ
クシ璽ンエに記載の範囲に及ぶ。

２）抗イデイオタイプ 潜在的に非常に有用な試薬は、−次物質として使用され
た特定のモノクローナル抗体とだけ反応した二次物質で
あろう。このような二次物質は、−次物質の特異性に基
づくことができ、そして［抗イデイオタイプ」試薬であ
ろう。このような試薬を培養することが可能であり、そ
してモノクローナル抗体さえ産生されている。このよう
な二次物質の潜在的欠点は、抗原と反応する免疫グロブ
リンの同一部分、即ち「活性部位」とのそれらの反応性
である。抗原と競合する抗イデイオタイプは、有用では
ない。しかしながら、ジアーンのネットワーク理論によ
れば、他のイディオトーブは、抗体上に存在し、そして
抗原結合部位には存在しない。このような部位は、「イ
ディオタイプ的」であるが、抗原結合性ではない。これ
らの「イディオトープ」に向けられる抗イデイオタイプ
は、理想的二次試薬であろう。このよ５な抗イデイオタ
イプは、記載されているが、抗原用試験において二次試
薬としては使用されていない。しかしながら、既知のも
のは、理想に近い二次試薬としてのそれらの用途を排除
しない。

３）ハブテン修飾法 反応混合物に独特の一次試薬を同定する別の方法は、新
しい抗原性エピトープを導入することＫによって一次試
薬を化学的に修飾する方法である・このことは、通常、
アゾベンゼンアルソネート（ＡＲ８）またはコ、弘、乙
−トリニトロフェニル−（ＴＮＰ）または数種の池のエ
ピトープの１つを導入することによって達成される。こ
のような化学種は、反応混合物において偶発的（ａｄｖ
ｅｎｔｉｔｌｏｕｓ）ではないらしく、それ故独特に−
次試薬を標識する。これらの新しい化学種は、その基と
反応性である二次抗体との反応によって同定され、例え
ばＡＲ８修飾−次試薬は、前記検出系のいずれかで標識
されたモノクローナル（または通常の）抗ＡＲ８抗体と
分配後に反応される。

このような抗ハプテンモノクローナル抗体は、容易かつ
自由に人手でき、本発明者らは数種を生成している〔ロ
バートソン等、Ｆａｄ＠ｒａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇ　　　ｔＡ／　　（り）　　：　　２ｔｏ２−２ｚ
ｏ６　（１ｙｒｓ　）〕。このテクノロジーは、化学修
飾−次試薬だけが反応系にお〜・て測定または検出され
、二次試薬（この場合、抗ＡＲ８）は如何なる一次試薬
（そのよ５に化学的に修飾されである）とも併用できる
が、池方抗イディオタイプは特異性である７つのモノク
ローナル抗体とともにだけ使用できるという点において
前記抗イデイオタイプ戦略よシも優れている。この融通
性は、便利である。

弘）レクチ／修飾 植物レクチンに特異的に結合する新しい分子を一次試薬
に導入する化学的修飾法は、前記・・ブテン法に類似し
ている。植物レクチンは、次いで化学的に修飾されて検
出される。このよ５な手順は、提案されており、そして
今までは、めったに使用されない。１つの潜在的欠点は
、使用されるレクチンが分配後反応混合物に存在する如
何なる池の分子とも結合しないであろうことである。−
次試薬上に導入された炭水化物基の場合には、条件は満
されるかもあるいは満されないかもしれず、臨床的試験
のみが検出すべきレクチン「エピトープ」が臨床におい
て見出される物質の範囲内に見出されるならば確認でき
、そしてそうであるなら＆ｉ余シにも多い多数の偽陽性
（ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｌｔｌｖａａ）を導入するであろ
う。

ｊ）ビオチン−アビジン 多くの経験が化学技術と同様によく入手できる配位子と
して広く使用される１つの分子がある。

ビオチンは、−次モツクローナル抗体上に導入されて、
アビジンまたはストレプトアビジンと反応性の独特なエ
ンテイテイーを生成できる。系は、広い許容性および実
用性を見出しておシ、そしてこの系は、この手順を使用
するために修飾され得る。アビジンは、Ｉに記載の一次
モツクローナル抗体のように、修飾されて検出される。

■、放射線免疫検定法：置換または競合法直接測定また
は検出系に加えて、間接置換法は、正確な測定が望まし
い生物学的物質の測定のために広く使用される。このよ
うな場合には、抗原（気マーカーで標識され、そして抗
原のエピトープに対して向けられている抗体と限定量で
反応される。

この系は、平ＷｉＫ達するようにされ、次いで分配され
ろ。抗原の結合量は、マーカーを測定することによって
測定される。未知物質に対して使用されるためには、系
は、未標識抗原の既知量の添加によって標準化される。

次いで、導入された物質は、抗体結合部位に対して標識
物質と競合する。

抗体の量は固定されるので、標識抗原は、有利に希釈さ
れ、セしてよシ少ないマーカーが分配抗体−抗原複合体
に存在する。このように、標準曲線は、導入された未標
識抗原の量および抗体とともに見出される標識抗原の損
失に基づいて作製される。

梅毒トレポネーマ抗原の存在の検出の文脈においては、
病原性トレポネーマに対して特異性である精製抗原は、
後述の方法の１つによって標識されるであろう。プラス
チック表面（プラスチック製反応器の側）に固定された
モノクローナル抗体、標識抗原、並びに未標識抗原を使
用して、滴定曲線が作製されるであろう。このことは、
方法の感度を確立するであろう。臨床的試料は、反応器
に導入され、そして壁に固定されたモノクローナル抗体
に結合して抗体部位を占めるであろ５゜過剰の物質を洗
い流した後、標識抗原は、今や導入され、そして反応さ
れるであろう。再度、系は、分配されるであろう。最後
に、容器壁に粘着されて存在するマーカーの量は、後述
の方法によって測定されるであろう。

方法は、感受性であシ、かつ特異性であシ、そしてキラ
）　（ｋｉｔ　）手順に容易に適合すべきである。抗原
は、今や標識され、かつ抗体よυもむしろ測定されるの
で、製作戦略は、前記方法とは異なる。親和力の外、抗
体の性質は重要ではない。

このことは、抗体の性質が系の生物学的特異性の起源と
同様に必須であったＩおよび■に記載の方法とは異なる
。

更に、抗体によって認識されるエピトープの順序を決定
することが可能であるので（組換えＤＮＡ７″クノロジ
ー、遺伝子クローニング、および配列分析並びに通常の
分析手順によシ）、これらの系で標識抗原用に使用され
るプローブを合成することが可能であ夛得る。

抗原は標識され、よって合理的な量で入手できなければ
ならないことが明らかである。トレポネーマ上への非常
に豊富な関連抗原の免疫沈降は可能であるので、適量の
抗原は、常法並びに前記組換えテクノロジーによって入
手できるであろう。

抗原の標識 抗原は、全分子、例えば梅毒トレポネーマの主膜タンパ
ク質、または合理的種度で（完全反応性は必須ではない
）で抗体と反応する単離または合成された若干の７ラグ
メントであることができよ５゜ ｌ）放射能 工１２５、工１２９、Ｈ５、ＣＩ’！またはＳ５５は、
単離物質の化学的修飾または関連分子（ポリペプチド）
の合成時の「ビルトイン（ｂｕｉｌｔ　　ｌｎ　）　Ｊ
によって導入されるであろう。検出は、同位元素および
検定の所望感度に依存するであろ５゜多分、シンチレー
シヨンまたは液体シンチレーシ菖ン計数は、好ましいも
のであろう。このテクノロジーの特質は、既述の通シで
ある。

コ）酵素結合法 前に詳述のように、酵素への抗原の結合は、使用される
酵素および基質の性質に応じて多種多様の異なる検定法
を可能にする。このよ５な方法は、特に便利であるが、
反応生成物の何らかの定量測定に依存するであろうし、
各一連の測定は、反応生成物の減少量の適当な解釈が得
られるよ５に内部コントロールを組み込むことを必要と
するであろう。

３）外来法 数種の外来法が、抗原測定のこのアプローチと併用され
ている。これらは、ルシフェリナーゼへ抗原を結合する
ことを包含する。この検定法の場合、酵素と基質との反
応時に放出される光の量は、シンチレーシヨンによって
測定される。「装置集約的」であるが、方法は、電離性
放射線の危険を回避する。

別の外来法は、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチ
ド）結合抗原を使用する。この方法においては、抗体に
結合されない抗！（例えば、遊離抗原によって置換）は
、グルコースオキシダーゼによシコファクターとして使
用される。基質の存在下において、グルコースオキシダ
ーゼ（ｆ換ＦＡＢ−抗原によりて活性にされる）は、過
酸化物を生成する。このことは、グルコースオキシダー
ゼによって生成される過酸化物を消費しながら最終測定
エンテイテイーである着色生成物を生成する酵素ペルオ
キシダーゼによって検出される。

他の外来法は、基本的に、通常の１！類の方法であシ、
電気化学的に減少されかつ検出され得るニトロ基含有分
子に結合された抗原を使用する。更に、金属含有抗原複
合体が生成され、結合金属イオンが感受性原子吸光法に
よりて検出された。

これらの外来法のすべては、少量の物質の正確な測定を
高度に特定の方法で可能にする新しいテクノロジーを使
用しよ５と試みている。多分、これらのゴールを達成す
る多くの他の方法がある。

これらの方法のすべては、抗原の同定、本発明者等によ
って産生されかつ寄託されている特定の抗体（ここでは
モノクローナル）との反応に依存する。更に、抗原は、
前記モノクローナル抗体との免疫学的反応性の排除なし
に修飾され、かつ標識されなければならない。最後に、
標識分子の感受性検出法は、分配法または手順の使用後
に使用されなければならない。分配用には数種のとのよ
５な可能性がある。本発明者等は、限定しないが、溶液
から最終測定を包含する全手順用に使用されるであろ５
反応器の壁などの固体表面への「相変化」を好む。

本発明の前記説明は、説明および例示の目的で特定の態
様に向けられている。しかしながら、本発明の本質から
逸脱せずに、記載の態様を行いかつ実施する方法におい
て多くの修正および変更を施すことができることは、当
業者に明らかであろ５゜特許請求の範囲において、本発
明の範囲内に入るようなすべての均等の修正および変形
をカバーすることが本発明者等の意図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）患者から得られる生物学的試料を用意Ｌ（ｂ
   ）この生物学的試料を梅毒トレポネーマの有毒亜種の抗
   原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体の一次
   免疫試薬と混合し（前記抗体は、ネズミ骨髄腫細胞を、
   梅毒トレポネーマ抗原の有毒亜種に対して免疫された分
   化ネズミリンパ様細胞と融合することによって形成され
   た連続ネズミ雑種細胞系統から産生される）、そして（
   ｃ）梅毒トレポネーマの有毒亜種、即ち梅毒およびトレ
   ポネーマ症の原因物の存在を示す陽性の免疫結合反応を
   検出する ことを特徴とする梅毒を有すると疑われる患者における
   梅毒およびトレポネーマ感染症の診断法。 ２、生物学的試料が、病変浸出液、脳脊髄液、血清、尿
   、羊水、滑液、または組織ホモジネートからなる、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、一次免疫試薬が、本質上梅毒トレポネーマの４７，
   ０００〜４８，０００ダルトン表面露出抗原に対して向
   けられたモノクローナル抗体からなる、特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ４、免疫試薬が、本質上ＡＴＣＣ寄託ＨＢ８１／３３ま
   たはＨＢ８１３４と同定された雑種細胞系統から産生さ
   れたモノクローナル抗体からなる、特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ５、陽性の免疫反応を直接または間接放射線免疫検定法
   、直接または間接螢光標識抗体法、直接または間接酵素
   結合免疫吸着検定法、溶血阻害検定法、凝集阻害検定法
   、凝集反応法、または補体消費検定法によって検出する
   、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、モノクローナル抗体を放射性同位元素、螢光標識、
   または酵素で標識する、特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。