JPS6347664A

JPS6347664A - 癌抗原測定法及びそのためのキツト

Info

Publication number: JPS6347664A
Application number: JP18964186A
Authority: JP
Inventors: Toyoji Hozumi; 穂積　豊治; Shuichi Matsuoka; 秀一松岡; Eikai Kiyo; 許　栄海; Eiichi Tawara; 田原　栄一; Atsushi Ochiai; 淳志落合
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-08-14
Filing date: 1986-08-14
Publication date: 1988-02-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は複数の器官に共通に存在する癌抗原の測定方法
、及びそのためのキットに関する。

〔従来の技術〕

抗原としてＴＭＫ−１細胞（ＳＣ−６ＪＣＫヌ一ドマウ
ス移植ヒト胃低分化腺癌由来細胞）によりマウスを免疫
感作し、このマウスの肺細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ
ることにより得られたハイブリドーマにより生産される
モノクローナル抗体が特開昭６１−１０３８３７号に開
示されている。このモノクローナル抗体は正常細胞には
実質上反応せず、種々の器官の癌細胞、例えば胃癌、肺
癌、苦痛、食道癌、十二指腸瘍、胆管癌、泌尿器癌、皮
膚癌、大腸癌、唾液腺癌等と反応し、特に胃癌について
は分化の程度に関係なく、広範囲の組織型に対して反応
すると言う特徴を有し、広範囲の癌の診断等に使用する
ことができると期待される。

しかしながら、上記のような抗体を用いて、１種類のモ
ノクローナル抗体により認識される、多数の癌に共通な
癌抗原を測定する方法を確立するためには、測定対象で
ある前記のような性質を有する抗原を単離し、その性質
をある程度解明しなければならない。

しかしながら、このような１種類のモノクローナル抗体
により認識される、多数の癌に共通に存在する癌抗原に
ついてはなんら解明がなされていなかった。本発明者等
は、種々検討の結果、このような癌抗原を培養癌細胞系
から（特願昭６ｌ−１５６２７９）　、及びヒト癌患者
の血漿から（昭和６１年８月８日出願の「ヒト癌抗原」
と称する特許出願）単離することに成功し、その性質を
解明した。

本発明の方法は、これらの知見に基き、初めて可能とな
ったものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、前記のようなモノクローナル抗体に
よって認識される複数の器官に共通する癌抗原を免疫化
学的に測定する方法及びそのためのキットを提供しよう
とするものである。

〔問題を解決するための手段〕

前記の目的は、複数の器官に共通に存在する癌抗原を免
疫化学的に測定するためのキットであって、（ａ）複数
の器官に共通に存在する癌抗原の抗原決定基と結合する
ことができる第１の抗体、及び（ｂ）前記複数の器官に
共通に存在する癌抗原の前記の抗原決定基以外の抗原決
定基と結合することができる第２の抗体又は該癌抗原と
結合することができる物質（これらの第２抗体又は物質
は標識されているか、又は標識された第３抗体と結合す
ることができる）を含んで成るキット；複数の器官に共
通に存在する癌抗原を免疫化学的に測定するためのキッ
トであって、（ａ）複数の器官に共通に存在する癌抗原
の抗原決定基と結合することができる第１の抗体を固定
化した固体支持体、及び（ｂ）前記複数の器官に共通に
存在する癌抗原の前記の抗原決定基以外の抗原決定基と
結合することができる第２の抗体又は該癌抗原と結合す
ることができる物質（これらの第２抗体又は物質は標識
されているか、又は標識された第３抗体と結合すること
ができる）を含んで成るキット；並びに、複数の器官に
共通に存在する癌抗原の免疫化学的測定法であって、（
１）複数の器官に共通に存在する癌抗原と結合すること
ができる第１の抗体を固定化した固体担体と測定対象試
料とを接触せしめる段階、（２）前記段階（１）と同一
段階として又は異る段階として、前記固体担体を前記複
数の器官に共通に存在する癌抗原の前記の抗原決定基以
外の抗原決定基と結合することができる標識された第２
の抗体又は該癌抗原と結合することができる標識された
物質と接触せしめるか、あるいは前記段階（１）と同一
の段階として又は異る段階として、前記固体担体を前記
複数の器官に共通に存在する癌抗原の前記の抗原決定基
以外の抗原決定基と結合することができる第２の抗体又
は咳癌抗原と結合することができる物質と接触せしめ、
さらに前記の段階と同一の段階又は異る段階として、該
第２抗体又は該物質と結合することができる標識された
第３抗体と接触せしめる段階、並びに（３）前記の固体
担体に固定化された標識、又は固定化されなかった標識
を測定する段階；を含んで成る方法により達成すること
ができる。

〔具体的な説明〕

貫走１六本発明の癌抗原の測定方法においては、種々の免疫測定
法を用いることができる。代表的な例として次の方式を
挙げることができる。

（１）■本発明の測定対象である複数の器官に共通に存
在する癌抗原と結合することができる第１の抗体を固体
担体に結合せしめ、これを測定対象試料液と接触せしめ
る。これにより試料液中の測定対象抗原が固体担体に結
合している抗体と結合して該抗原が固定化される。■さ
らに、前記測定対象抗原の前記の抗原決定基以外の抗原
決定基と結合する標識された第２抗体と接触せしめる。

■と■は同一段階として、又は別個の段階として行うこ
とができる。これにより標識された第２抗体が測定対象
抗原の量に依存して固体担体に固定化される。０次に、
固体担体に固定化された標識、又は固定化されなかった
標識をその標識の種類に依存して選ばれた方法により測
定する。

（２）前記（１）の方式の段階■を行った後、■前記の
第２抗体と同様の抗体であるが標識されていないものと
接触せしめ、さらに■この標識されていない第２抗体に
対する抗体（第３抗体）であって標識されているものと
接触せしめ、０次に固体抗体に固定化された標識又は固
定化されなかった標識を測定する。

（３）前記方式（１）の段階■を行った後、■前記測定
対象抗原と結合することができる、抗体以外の物質であ
って標識されているもの、例えば標識されたレクチンと
接触せしめる。０次に、固体担体と結合した標識又は結
合しなかった標識を測定する。本発明の方法の測定対象
である癌抗原は、コンカナバリンＡ等のレクチンと結合
することができるから、上記のごとき方式が可能である
。

（４）前記方式（３）の段階■の後、■前記測定対象抗
原と結合することができる、抗体以外の物質、例えばレ
クチンと接触せしめ、■次に該物質、例えばレクチンに
対する抗体（第３抗体）であって標識されているものと
接触せしめ、■そして最後に固定化された標識又は固定
化されていない標識を測定する。

■一体本発明の方法の第１の方式によれば第１抗体及び標識さ
れた第２抗体を用いる。これらは両者ともモノクローナ
ル抗体であることができ、あるいは一方がモノクローナ
ル抗体で他方がポリクローナル抗体であることができる
。これらは、測定対象である癌抗原の異る抗原決定基に
結合するものでなければならない。モノクローナル抗体
の製造方法、及びその性質は前記特開昭６１−１０３８
３７号に詳細に記載されており、具体的な抗体として例
えば９４３，９８９．２００１１　、２１Ａ４，６Ｄ３
．１）１８等と命名された抗体を挙げることができる。

また、本発明に係る癌抗原と反応するポリクローナル抗
体は公知の常法に従って調製することができる。例えば
、後で詳細に説明する、複類の器官に共通に存在する癌
抗原を免疫原として実験動物（マウス、ラット、ウサギ
等）に注射して生体内でその抗原に対する抗体を産生さ
せたのち採血し、この血液中の血球・フィブリンを除い
て、血清を得、さらに必要であればＤＥＡＥセルロース
カラムクロマトグラフィー等の常法に従って精製するこ
とにより、ポリクローナル抗体を得ることができる。

本発明の第２の方式によれば、前記の第１抗体及び第２
抗体のほかに、第２抗体に対する抗体（第３抗体）であ
って標識されているものを使用する。この第３抗体とし
ては、例えば第２抗体としてウサギ抗体を使用する場合
には、ヤギ抗ウサギ抗体を使用することができる、これ
は市販品を用いることができる。

本発明の第３の方式及び第４の方式において使用する第
１抗体及び第３抗体も、前記の第１抗体及び第３抗体と
同様である。

声　　に　入　ること（で　る　　ｐ　のこの物質とし
ては、例えば種々のレクチンを挙げることができる０本
発明の方法の測定対象である癌抗原はコンカナバリンＡ
と特によ（結合するため、コンカナバリンＡが特に好ま
しい。その他のレクチンとして、小麦胚芽レクチン、レ
ンズマメレクチン、ヒマレクチン等を挙げることができ
る。

パ　びその本発明においては、第２抗体、第３抗体及び癌抗原結合
性物質のいずれかを標識して使用する。

この標識としては、免疫化学的測定法において常用され
ている任意の標識を使用することができ、例えば放射性
同位元素、例えば１３１１　、　１３Ｊ。

＋４ｃ、３Ｈ等（ラジオイムノアッセイ；　ＲＩ　Ａ）
；酵素、例えばパーオキシダーゼ（例えば西洋ワサビパ
ーオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ等（エンザイムイムノアフセイ；ＥＩＡ）
；螢光物質、例えばフルオレフセインイソシアネート、
ローダミン等（フルオロイムノアッセイ、ＩＩＡ）等を
使用することができる。これらの標識を抗体等の蛋白質
に付加する一般的方法はすでに知られており〔例えば、
Ｊ、　Ｈｉｓｔｏ、　Ｃｈｅｎ＋、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
、、２２　、１０８４（１９７４）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｏｒｙ＋　　６　、４３（１９６３）　、　
１ｂｉｄ、　　８．８７Ｈ１９７１）　、Ｊ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、７８　、２３５（１９７５）　、および底
置ｒＦＩｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｊアカデミツク・プレス刊等を参照のこと〕
、それらの方法を本発明において使用することができる
。

また、これらの標識の検出方法としては、これらそれぞ
れの標識について常用されている検出方法を用いること
ができる。

例えば、標識として酵素を用いる場合、その基質として
、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼに対しては過酸化
水素、アルカリホスファターゼに対してはバラニトロフ
ェノール・リン酸やフェノール・リン酸、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼに対してはオルトニトロフェノール−β−
Ｄ−Ｘガラクトシドが考えられる。

ｌす更生本発明においては、第１の抗体を固体担体に固定化して
使用する。このような固体担体として、免疫化学的測定
法において常用されている任意の材質及び形状の固体担
体を使用することができる。

材質としては例えばポリスチレン、ポリカーボネート、
アミノアルキルシリルガラス、シリコンゴム等があり、
形状としてはマイクロプレート、チューブ、キュベツト
、ビーズ、スティック、ロンド、ディスク等がある。

丈■他公成渠本発明においては、前記の各種の材料の他に種々の試薬
が使用される。例えば、第１抗体を固体担体にコートす
るためにコーティング緩衝液が使用され、この緩衝液と
しては、例えば炭酸緩衝液（ｐＨ９，７〜１０．０）　
、ＰＢＳ　（−）等を使用することができるが、これに
限定されない、また、分析サンプル中の癌抗原の濃度を
測定可能な範囲内にするために稀釈用緩衝液が使用され
、この緩衝液としてウシ胎児血清アルブミンを含有する
場合があるＰＢＳ（−）生理食塩水、トリス緩衝液等を
使用することができる。さらに、測定実施の各反応段階
において固体担体を洗浄するために洗浄液が使用され、
このために例えばＰＢＳ　（＝）−Ｔｗｅｅｎ　（Ｐ　
Ｂ　Ｓ　（−）にＴｗｅｅｎ　２０を０．０５％濃度に
溶解したもの〕を使用することができる。さらに、標識
として酵素を使用する場合、使用する酵素の種類に応じ
て基質溶液が使用される。この基質として例えば前記し
たものを使用することができる。基質溶液を調製するた
めの緩衝液としては、標識として使用する酵素の種類に
より異るが、例えば０．１　Ｍクエン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、等を使用することができる。

隻皿見本発明においては、免疫測定用の、例えば第２抗体とし
ての癌抗原に対する抗体を調製する際の免疫原として、
及び本発明による定量測定の際の標準試薬として、単離
された癌抗原を使用する。

この癌抗原としては、例えば株化癌細胞により産生され
る抗原、及び癌患者の血漿から単離される抗原を用いる
ことができる。前者は、例えば、（１）ヒト癌細胞で免
疫した動物のＢリンパ系細胞と腫瘍細胞との融合によっ
て得られるハイブリドーマにより生産される、正常細胞
とは実質上反応せず、複数の器官の癌細胞と特異的に反
応する抗ヒト癌モノクローナル抗体により認識され、（
２）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気詠動において分
子盟約１５，０００〜２００，０００万の複数のバンド
を示し、（３）コンカナバリンＡレクチンに対して親和
性を有し、小麦胚芽レクチン、レンズマメレクチン、及
びヒマレクチンに対して親和性を有する成分と親和性を
有しない成分とから成り、そして（４）少なくとも癌細
胞ＴＭＫ−１の培養上清中に放出されることを特徴とす
る癌抗原であり、特願昭６１−１５６２７９明細書に詳
細に記載されている。また後者は、例えば、（１）ヒト
癌細胞で免疫した動物のＢリンパ系細胞と腫瘍細胞との
融合によって得られるハイブリドーマにより生産される
、正常細胞とは実質上反応せず、複数の器官の癌細胞と
特異的に反応する抗ヒト癌モノクローナル抗体により認
識され、（２）少なくともヒト血漿中に存在し、（３）
　ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーおよび
コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィーで精
製することにより得られた両分が分子量約９万を示すを
存する癌抗原であって、昭和６１年８月８日出願の「ヒ
ト癌抗原」と称する特許出願明細書に詳細に記載されて
いる。なお、これらの抗原の製造方法を参考例として後
で記載する。

皿定■去施第１抗体を固体担体に固定化するためには公知の方法を
用いることができる。例えば、第１抗体を前記のコーテ
ィング緩衝液に０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度に溶解
し、これを固体担体に適用し、そしてＯ℃〜３７℃にて
０．５〜１６時間インキュベートする。次にコーティン
グ溶液を除去し前記の洗浄液で数回洗浄する。

測定に当っては、必要に応じて測定用サンプルを前記の
稀釈用緩衝液により稀釈する。本発明の方法の測定感度
はＬｏｎｇ〜５０μｇ　／　ｍ　１であるから、サンプ
ル中の癌抗原（例えばＣＡ９＾３）ン屈度が１〜１０μ
ｇ　／　ｍ　１となるように稀釈するのが好ましく、サ
ンプル中の癌抗原濃度が予測できない場合には複数段階
の稀釈液を調製し、これらを使用するのが好ましい。

次に、必要に応じて上記のように稀釈されたサンプルと
第１抗体が固定化されている固体担体と接触せしめ、イ
ンキュベートする（第１段階）。

このインキュベージジンは０℃〜３７℃にて３０〜１２
０分間行うのが好ましい０次にサンプルを除去し、前記
洗浄用液により固体担体を数回洗浄することにより固体
担体に非特異的に付着しているサンプルを除去する。次
に標識された第２抗体の溶液を前記洗浄された固体担体
と接触せしめることにより、第１段階において固定化さ
れた癌抗原の第２抗原決定基と第２抗体とを特異的に結
合せしめる。固体担体と接触せしめる第２抗体の溶液中
の第２抗体の量が固体担体に固定化された癌抗原の量に
比べて過剰となることを条件として、第２抗体溶液中の
第２抗体の）眉度及び該溶液の使用量は任意に選択する
ことができる。第２抗体溶液中の第２抗体の濃度は好ま
しくは０．５〜５μｇ／ｍｌである。

上記の方法に代えて、第１段階と第２段階とを同一段階
として実施することができる。この態様においては必要
に応じて稀釈されている場合があるサンプル溶液と上記
第２抗体溶液とを混合して固体担体に適用するか、又は
これらの溶液のそれぞれを同時に固体担体に適用するこ
とにより行うことができる。この場合、Ｏ℃〜３７℃に
て３０〜１２０分間インキュベートするのが好ましい。

次に、抗原に結合していない第２抗体等を除去するため
、前記の洗浄用液によって固体担体を洗浄する。

次に、固体担体上に固定化された標識を定性的又は定量
的に測定する。この測定方法は標識の種類によって異り
、常法に従って行うことができる。

例えば、標識が放射性同位元素である場合、液体シンチ
レーションカウンター、オートガンマ−カウンター等を
用いて放射能を測定する。また、標識が螢光物質である
場合、螢光量を分光光度計を用いて測定する。さらに、
標識が酵素である場合、その酵素の基質溶液を前記固体
担体と接触せしめる。例えば、標識として西洋ワサビパ
ーオキシダーゼを用いる場合、基質としての５ｍＭ過酸
化水素及び発色剤としての２．２′−アジノビス（３−
エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ
と略す）２．５ｍＭを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液を用
いるのが好ましい。

次に、例えば室温で５〜１５分間インキュベートするこ
とにより酵素反応と発色を行い、反応を停止した後発色
の程度を常法に従って測定する。

測定された標識活性から抗原濃度を知るには、常法に従
って予じめ標準抗原と最終段階での標識活性との関係か
ら検量線を作成しておき、この検量線と被検液の吸光度
とを照合すればよい。

なお、前記の標識された第２抗体の代りに、標識されて
いない第２抗体及び標識された第３抗体を用いることも
でき、あるいは第２抗体の代りに、癌抗原と結合するこ
とができる抗体以外の物質例えばレクチンを使用するこ
ともできる。

側１」トＬムΣ 本発明の第１の態様のキットは、（ａ）複数の器官に共
通に存在する癌抗原の抗原決定基と結合することができ
る第１の抗体、及び（ｂ）前記複数の器官に共通に存在
する癌抗原の前記の抗原決定基以外の抗原決定基と結合
することができる第２の抗体又は該癌抗原と結合するこ
とができる物質（これらの第２抗体又は物質は標識され
ているか、又は標識された第３抗体と結合することがで
きる）：を含んで成り；第２の態様のキットは、（ａ）
複数の器官に共通に存在する癌抗原の第１の抗原決定基
と結合することができる第１の抗体を固定化した固体支
持体、及び（ｂ）前記複数の器官に共通に存在する癌抗
原の前記の抗原決定基以外の抗原決定基と結合すること
ができる第２の抗体又は該癌抗原と結合することができ
る物質（これらの第２抗体又は物質は標識されているか
、又は標識された第３抗体と結合することができる）：
を含んで成る。第２の態様のキットは第１抗体が固定化
された固定担体を含むのに対して、第１の態様のキフト
は固定化されていない第１抗体を含み、第１抗体の固体
支持体への固定化はキットの使用者によって行われる。

これらのキットはさらに、標準試薬としての癌抗原標品
を含むことができる。さらに、第３抗体を含むことがで
きる。しかしながら第３抗体は市販品を使用することで
きるため、必ずしも本発明のキットに含める必要はない
、また、第１の態様のキットには固体担体を含めること
ができるが、これも常用の市販品を使用することができ
るから、本発明のキットに含める必要がない。

前記第１抗体（第１の態様の場合）、第２抗体、第３抗
体及び標準品癌抗原標品は、固体標品であってもよく、
すぐに使用することができる溶液の形であってもよく又
、測定に際して適当に稀釈して使用する濃厚溶液の形で
あってもよい、キットが、これらを溶液の形で含む場合
、この溶液には測定に悪影響を与えない防腐剤を加える
ことができる。

この発明のキットは、上記のものを含んで成るが、測定
の便宜のために前に記載した他の試薬、例えば稀釈用溶
液、コーティング緩衝液、洗浄用溶液、標識が酵素であ
る場合には酵素基質及び発色試薬等を含むことができる
。しかしながらこれらは、測定者において常法に従って
容易に調製することができ、又は入手することができる
ものである。従ってこれらを含まないキットも本発明の
範囲内のものである。

〔発明の効果〕

本発明は、複数の器官に共通に存在する癌抗原を測定す
る方法及びキットを提供するものである。

従って、本発明は癌の診断に使用することができる。

１明壁側」よ　ＴＭＫ−１か゛のＦ　　、ＣＡ９Ａ３の
一１＋造この参考例及び以下の実施例において、モノク
ローナル抗体９Ａ３と反応する本発明の癌抗原をＣＡ　
９　Ａ３と称する。

（１）　ＮＰ−４ＱによるＣＡ　９　Ａ３の抽出ＴＭＫ
−１細胞５Ｘ１０７個に５ｍ６の抽出緩衝液（１０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，２）　　、０．１５
Ｍ　　ＮａＣ１。

０．０２％ＮａＮ３、及び０．５Ｖ／Ｖ％ノニデソトＰ
−４０（ＮＰ−４０）　）を加えた後、ポルテックスミ
キサーで撹拌し、次に１５分間氷冷した。このホモジネ
ートを２７，０ＯＯＸＧにて２０分間遠心して約５ｍ１
Ｏ上清を得、これをＣＡ　９　Ａ３抽出物とした。

同様にして５Ｃ−６−ＪＣＫ細胞からＣＡ　９　Ａ３抽
出物を調製した。

（２）　　３Ｍ　ＫＣＪによるＣＡ　９　Ａ３の抽出ｌ
Ｘｌ０’個のＴＣＯ細胞をＰＰＳ　（−）（ｐ）１７．
２）で洗浄し、遠心して得られた細胞ベレットを１０倍
容量のＰＢＳ　（−）中に懸濁した。

この懸濁液に、塩化カリウムをゆっくり加え、最終濃度
を３Ｍとした。５℃にて１６時間放置した後、１６５，
０ＯＯｘＧにて２時間遠心して上清を得た。この上清を
５００　ｍ　ｌの５０％シュークロース液に対して透析
し、次に５００　ｍ　ｉｔの０．１５ＭＮａＣ１に対し
て透析そして４０，０ＯＯＸＧにて３０分間遠心分離す
ることにより上清を得、これをＣＡ　９　Ａ３抽出物と
した。

ＴＭＫ−１細胞及びＨＬ６０細胞も、それぞれ上記のよ
うにして処理し、抽出物を得た。

上記（１）及び（２）で　得られた抽出物はいずれも９
Ａ３抗体との反応性を有していた。

（３）ＣＡ９Ａ３の精製前記（１）で得られたＣＡ　９　Ａ３抽出物を１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−Ｆ［Ｃ１と称する）
（ｐｌ＋７．２）に対して透析した。この透析物を、あ
らかじめＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，２）により平
衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ−５２）カラム（５
０ｍ７りに適用した。まず、２ベツド容量のＴｒｉｓ　
−ＨＣｆｌ（ｐｉ（７，２）をカラムに適用した後、Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣＡ（ｐＨ７，２）中０〜０．５　Ｍ　Ｎ
ａＣｊ！グラジェントにより１０ｍ１／時の流速で溶出
を行い、３ｍｌずつの両分を得、これらの両分について
９Ａ３を用いるドツトハイブリダイゼーションを行い、
口約とする抗原を含有する両分を選択した。こうして得
られた画分をＤＥＡＥ精製ＣＡ　９　Ａ３と称する。

ｆｊ■１に血漿交換療法を受けている食道癌患者の血漿１１を精製
蒸留水で３倍に希釈した。ついでこれに５　Ｑ　ｍｌ　
　（ｗｅｔ　ｖｏｌｕｍｎ）　のＤＥＡＥセルロース（
ＤＥ−５２；ｗｈａｔｍａｎ）を加えたのち、４℃で２
時間攪拌を行った。ついでグラスフィルター濾過により
ＤＥＡＥセルロースを濾取した。

回収したＤＥＡＥセルロースを１０ｍＭ１−リス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，２）　　（以下ｒＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　
Ｊと記す）１００ｍｌで洗浄したのち、０．５　Ｍ　Ｎ
ａＣＦ！含有Ｔｒｉｓ−ＨｔＪ　　１００ｍ１でさらに
洗浄することにより溶出を行い、この液を回収した。

ついでこの溶出液を１　ｍ　ＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ溶液
に対して３回（計５１）透析後、凍結乾燥したのち蒸留
水３Ｑｍｊ！に溶解した（ＤＥＡＥセルロース吸着精製
液）。

Ｄ　２．１１　Ｅセルロース吸着精製液３０ｍ１！をＤ
ＥＡＥセルロースカラム（φ２．５　ｃｍ　Ｘ　１０．
Ｏｃｍ　）に適用した。

まず、２ベツド容量の１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ２を
カラムに通した後、Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ中０〜０．５　
Ｍ　ＮａＣｌグラジェントにより３．０ｆｆｌ／時の流
速で溶出を行い、３ｍｊｉずつの両分を得、これらの両
分について９Ａ３を用いるドツトハイブリダイゼーショ
ンを行い、目的とする抗原を含有する百分を選択した。

こうして得られた画分をｏ　Ｅ　Ａ　Ｅ　精製癌抗原と
称する。

なお、上記のドツトハイブリダイゼーションは次のよう
にして行った。ニトロセルロース膜上にサンプル溶液１
μｌをスボ・ノドし、風乾した。次に３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有する、１　０　ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＡ　　　（ｐＨ７，０）　　＋０．１５Ｍ　　Ｎａ
ｃｅ　　ｉ容液（以下ＴＢＳと称する）で−夜処理した
。処理後ニトロセルロース膜をＴＢＳで洗浄し、この膜
を１％ＢＳＡ及び０．０５％トウィーン２０を含有する
ＴＢＳ中１μｇ／ｍｌの９Ａ３抗体含有液と２時間接触
せしめた。次にニトロセルロース膜をＴＢＳで洗浄し、
１％ＢＳＡ及び０．０５％トウィーン２０を含有するＴ
ＢＳ中に２０．０００倍希釈した西洋ワサビパーオキシ
ダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社製）に接触
せしめた。次に、ニトロセルロース膜をＴＢＳで洗浄し
、３■の４−クロロ−１−ナフトール、１ｍｊ＋のメタ
ノール、５ｍｌのＴＢＳ及び２μ２の３１％ＨｔＯｚを
含有する６ｍｌの発色液と３０分間接触せしめた後、２
ｍＭＮａＮ５溶液で洗浄し、風乾した。

実施炎上本発明の方法を行うにあたり、Ａ０分析用プレート、Ｂ
、酵素標識抗体、およびＣ９標準曲線を用意した。

Ａ、　　　　プレートのｔ、Ｔｌ９６ウエルのプレート　（ヌンク社）の各ウェルごとに
コーティング緩衝液（１００ｍ　Ｍ　ＮａＨＣＯｉ、５
０　ｍ　Ｍ　ＮａｚＣＯｚ　、ｐＨ９，７〜１０）に溶
解した抗体＜９Ａ３）（１０，！Ｊｇ／ｍｉ）を５０μ
！ずつ各ウェルに分注し、室温で２時間放置後ＰＢＳ　
（−）−７ｗｅｅｎで３回洗浄を行った。ついでＰＢＳ
　（−）〔１％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）含有
〕を加え２時間放置した後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）−Ｔｗ
ｅｅｎでさらに洗浄を行うことにより分析用プレートを
調製した。

ここでＰＢＳ　（−）は、塩化ナトリウム８．０ｇ、リ
ン酸二水素カリウム（無水）０．２ｇ、リン酸−水素ナ
トリウム（無水）　１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ
を混合し１０００　ｍ　１２にしたものである（ｐＨ７
，４）。

また、ＰＢＳ　（）−Ｔｗｅｅｎは、上記ＰＢＳ（−）
にＴｗｅｅｎ　２０　（０，５ｍ（１／　ｌ）を添加し
たものである。

Ｂ、酵素標識抗体の調製１、　　ＣＡ９Ａ３ウサキｔ”　　ノａｍ”ｉ）癌細胞
を抗原とする場合ＴＭＫ−１細胞Ｉ　Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／　０．５　ｍ
Ｒをフロイント完全アジュバント立５ｍＪと混和し、家
兎の皮下に注射した。この操作を２週間間隔で更に２回
行い、最後の感作より１１日目に採血したのち常法に従
って抗血清を調製した。

ｉｉ　）抽出精製抗原を抗原とする場合前記精製ＣＡ　
９　Ａ３抗原１０μｇを２５０μｇのＰＢＳ　（−）溶
液とし、これにフロイント完全アジュバント２５０μｌ
を加えよく混和したのち家兎の皮肉１０ケ所に注射した
。以下はｉ）と同様に抗血清を調製した。

２０１１．−−　の１゜＋１上記抗血清をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフ
ィーを用い常法に従ってＩｇＧ分画とした。そしてこの
ＩｇＧ分画１０■ｌ：ＰＢｓ　（−）ｌＱｍｊ２に溶解
〕に抗体の２倍モル比量の５ｐｏｐ（Ｎ−サクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート）のエ
タノール溶液（１２５μりを加えたのち室温で３０分反
応を行った。

ついでＰＢＳ（−）で２時間ずつ２回透析後、０．１Ｍ
酢酸緩衝液（０，１ＭＮａＣ１含有）（ｐＨ４，５）で
２時間透析を行った。透析後、５０ｍＭのＤＴＴ　（ジ
チオスレイトール）を加え２０分間反応を行った。つい
で０．１Ｍ酢酸緩衝液（上記）で２時間ずつ２回透析を
行ったのち、ＰＢＳ（−）で−晩透析を行った。

一方、ＨＰＯ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）１２．９
＋ｎｒ　（Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）　　１０　ｍｌに溶解）
に、ＨＰＯの２５倍モル比量の５ＰＤＰのエタノール溶
液（６２５μｌ）を加えたのち室温で３０分反応を行っ
た。ついでＰＢＳ　（−）で各々２時間ずつ計３回の透
析を行った。

ついで上記で調製した抗体とＨＰＯとを合せて室温で一
夜放置した。モしてセファクリルＳ−３００カラムを用
いて未反応ＨＰＯを除去することにより、ＨＰＯ結合抗
体を得た。

Ｃ，ＣＡ９Ａ３の測定上記分析プレートの各ウェルに、上記精製ＣＡ　９　Ａ
３を蛋白濃度で０．１．０．２５．０．５　、１　。

２．５　、５．１０．２５および５０μｇ／ｒｒｌ各々
を０．２％ＢＳＡに溶解した溶液５０μρずつを注入し
た。２時間室温で（以下同じ）放置後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−
Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄を行った。ついでＤＥＡＥ
セルロースカラム精製ウサギつＴＭＫ−１抗体を０．２
％ＢＳＡで３６　ｐ　ｇ　／ｍｌとしたもの５０μｌを
各ウェルに注入したのち、２時間放置後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　
−Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄を行った。

これにＨＰＯ標識ヤギ抗ウサギ抗体（カベル社；０．２
％ＢＳＡで２万倍希釈したもの）を５０μｌ／ウエルず
つ分注後２時間放置した。

ついでＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄を行
ったのち、０．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，２）に
ＡＢＴＳ（２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチ
アゾリン）−６−スルホン酸）２．５ｍＭと過酸化水素
５ｍＭとを溶解したものを各ウェルに分注後、２０分間
放置した。２　ｍＭ　ＮａＮ３１００＃　１／ウエルを
加え反応を止めたのち吸光度（ＯＤイ。、）を測定した
。このときに得られた標準曲線を第２図に示す。

１ｉ）ＨＰＯ標識第２抗体を用いる場合上記ｉ）におい
てウサギ抗ＴＭＫ−１抗体およびＨＰＯ標識ヤギ抗ウサ
ギ抗体の代わりにＨＰＯ標識抗ＴＭＫ−１抗体（０，２
％ＢＳＡで１０００倍希釈したもの）を用いたこと以外
は上記と同様に行った。そのときの結果を第３図に示す
。

１ｉｉ）ＨＰＯ標識コンカナバリンＡレクチンを用いる
場合上記ｉ）においてウサギ抗ＴＭＫ−１抗体およびＨＰＯ
標識ヤギ抗ウサギ抗体の代わりにＨＰＯ標識コンカナバ
リンＡレクチン（０，２％ＢＳＡで２０００倍希釈した
もの）を用いたこと以外は上記ｉ）と同様に行った。そ
のときの結果を第４図に示す。

大斑桝ｌ健常者および胃癌患者の血清中のＣＡ　９　Ａ３の測定
を行った。測定法は、実施例１のＣ，ｉ）の方法に従っ
て行った。測定検体は、健常者の血清（男性および、女
性計２１９名で消化器系疾患の保有していない者の血清
）および胃癌患者の血清（手術後病理学的に胃癌と診断
された男性および女性計３１名の手術前の血清）を用い
た。一方、現在市販されている隔測定用キット：　ＣＥ
Ａ測定キット（ダイナポット社）　、ＣＡ１９−９測定
キツト（セントコア社）、β２マイクログロブリン（β
２　ｍ　）測定キット（第１ＲＥ）およびフェリチン（
Ｆｅｒｒ）測定キット（日本トラベノール社）各々を用
い、同じ検体中の癌抗原を測定した。そのときの結果を
第５図に示す、この図は、各キットで癌抗原を測定した
ときの測定値を、各測定キットで使用されるカットオフ
値で割った値を用いて作成したものである。なお、各癌
抗原測定用キットのカットオフ値は各々、ＣＥＡ　（２
，５）　、ＣＡ１９−９（３７）、β！ｍ　（２，４）
　、Ｆｅｒｒ　（男性２５０、女性１２０）を用いた。

また、本発明のキットでは健常者の平均＋２３Ｄをカッ
トオフ値として計算すると１２．９ｕｎｉｔ（１ｕｎｉ
ｔ＝　１　μｇ　／　ｍｌ　）となり、この値以上のも
のを陽性と判定した。同図中、陽性率とは、下式で算出
されたものである。

次の要素からなるキットを作成した。

キットＡ（ａ）複数の器官に共通に存在する癌抗原（以下単に「
癌抗原」とする。）の第１モノクローナル抗体５０μｇ
＝凍結乾燥物／１プレート分。

（ｂ）上記癌抗原の第２の抗原決定基と結合することが
できる抗体１．５■を１．５　ｍｇの西洋ワサビパーオ
キシダーゼで標識した抗体１０μｌを凍結乾燥したちの
／１プレート分（使用時に０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ　（
−）で溶解し、４ｍｌとする）。

その他の試薬（場合によってはキットに含める。）（ｃ
）前記第１モノクローナル抗体を固定化することができ
る９６Ｆヌンク一イムノプレート１枚。

（ｄ）標準品として精製された癌抗原１■／ｍｅ（１％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−））　１００μｌの凍結乾燥物
（癌抗原０．１μｇ）（使用時この全量を１ｍｌの水で
溶解しく１００μｇ　／　ｍｌ　）この液を０．２％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ　（−）で希釈して標準液とする〕。そ
の他の試薬（場合によってはキットに含める）（ｅ）第１モノクローナル抗体プレートへの固定化液：
　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ，，５０ｍＭ　ＮａｚＣＯ
ｔ（ｐＨ９，７〜１０．０）　　５　ｍｌ。

＜ｆ）第２抗体の希釈液及びサンプル希釈液：０、２％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−＞２０ｍ１の凍結乾燥物（使用
時に蒸留水２Ｑｒｒｌで溶かして使用）。

（ｇ）発色基質：　１０　ｍｇＡＢＴＳ　（粉末）／１
プレート分（ｈ）発色基質溶解液：　　（ｐＨ４，４）　１０ｍｌ
の凍結乾燥物（使用時に１０ｍ１の蒸留水で溶かし使用
する）。

（ｉ）反応停止液：２ｍＭアジ化ナトリウム液１０ｍ１
゜（ｊ）ブロッキング液：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（）３０
ｒｌ！を凍結乾燥したもの（使用時に蒸留水３Ｑｍｌで
溶かして使用）。

（ｋ）洗浄液：　Ｏ，ＯＳ％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢ
Ｓ　（−）１４０ｍＪ　。

注）Ｈ２０□：現地調達。

キットＢ（ａ）癌抗原の第１の抗原結定基と結合することができ
る第１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌコーティン
グ緩衝液）を５０μβづつ９６Ｆヌンクーイムノプレー
トの各ウェルに分注し、室温で２時間反応させた後、洗
浄液で３回洗浄し、１％ＢＡＳ含有ＰＢＳ　（−）３０
０μ！！／ウエルで分注して、室温で２時間反応させた
後、再度洗浄液で３回洗浄したもの。

（ｂ）キットＡの（ｂ）　と同様。

その他の試薬（場合によってはキットに含める。）（ｃ
）キットＡの（ｄ）　と同様。

（ｄ）キットＡの（ｅ）　と同様。

（ｅ）キットＡの（ｆ）　と同様。

（ｆ）キットＡの（ｇ）　と同様。

（ｇ）キットＡの（ｈ）　　と同様。

（ｈ）キットＡの（ｉ）　と同様。

（ｉ）キットＡの（ｊ）　　と同様。

（ｊ）キットＡの（ｋ）　と同様。

注）Ｈ２０□：現地調達

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の癌抗原の測定法の模式図の一例である
。第２〜４図は、本発明の癌抗原の測定のための標準曲線
の例である。第５図は、健常者の血清中ＯＣＡ　９　Ａ３の存在の分
布と胃癌患者血清中の各種癌抗原の存在の分布および相
対的陽性率を図示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１、複数の器官に共通に存在する癌抗原を免疫化学的に
測定するためのキットであって、（ａ）複数の器官に共通に存在する癌抗原の抗原決定基
と結合することができる第１の抗体：及び（ｂ）前記複
数の器官に共通に存在する癌抗原の前記の抗原決定基以
外の抗原決定基と結合することができる第２の抗体又は
該癌抗原と結合することができる物質（これらの第２抗
体又は物質は標識されているか、又は標識された第３抗
体と結合することができる）；を含んで成るキット。２、前記第１の抗体を固定することができる固体支持体
をさらに含んで成る特許請求の範囲第１項に記載のキッ
ト。３、標準品としての精製された、複数の器官に共通に存
在する癌抗原をさらに含んで成る特許請求の範囲第１項
に記載のキット。４、前記癌抗原と結合することができる物質が標識され
たレクチンである特許請求の範囲第１項に記載のキット
。５、前記第１抗体及び第２抗体の両者がモノクローナル
抗体であるか、又はいずれか一方がモノクローナル抗体
であり他方がポリクローナル抗体である特許請求の範囲
第１項に記載のキット。６、複数の器官に共通に存在する癌抗原を免疫化学的に
測定するためのキットであって、（ａ）複数の器官に共通に存在する癌抗原の第１の抗原
決定基と結合することができる第１の抗体を固定化した
固体支持体；及び（ｂ）前記複数の器官に共通に存在する癌抗原の前記の
抗原決定基以外の抗原決定基と結合することができる第
２の抗体又は該癌抗原と結合することができる物質（こ
れらの第２抗体又は物質は標識されているか、又は標識
された第３抗体と結合することができる）；を含んで成るキット。７、標準品としての精製された、複数の器官に共通に存
在する癌抗原をさらに含んで成る特許請求の範囲第６項
に記載のキット。８、前記癌抗原と結合することができる物質が標識され
たレクチンである特許請求の範囲第６項に記載のキット
。９、前記第１抗体及び第２抗体の両者がモノクローナル
抗体であるか、又はいずれか一方がモノクローナル抗体
であり他方がポリクローナル抗体である特許請求の範囲
第６項に記載のキット。１０、複数の器官に共通に存在する癌抗原の免疫化学的
測定法であって、（１）複数の器官に共通に存在する癌抗原と結合するこ
とができる第１の抗体を固定化した固体担体と測定対象
試料とを接触せしめる段階；（２）前記段階（１）と同一段階として又は異る段階と
して、前記固体担体を前記複数の器官に共通に存在する
癌抗原の前記の抗原決定基以外の抗原決定基と結合する
ことができる標識された第２の抗体又は該癌抗原と結合
することができる標識された物質と接触せしめるか；あ
るいは前記段階（１）と同一の段階として又は異る段階
として、前記固体担体を前記複数の器官に共通に存在す
る癌抗原の前記の抗原決定基以外の抗原決定基と結合す
ることができる第２の抗体又は該癌抗原と結合すること
ができる物質と接触せしめ、さらに前記の段階と同一の
段階又は異る段階として、該第２抗体又は該物質と結合
することができる標識された第３抗体と接触せしめる段
階；並びに、（３）前記の固体担体に固定化された標識、又は固定化
されなかった標識を測定する段階；を含んで成る方法。１１、前記癌抗原と結合することができる物質が標識さ
れたレクチンである特許請求の範囲第１０項に記載の方
法。１２、前記第１抗体及び第２抗体の両者がモノクローナ
ル抗体であるか、又はいずれか一方がモノクローナル抗
体であり他方がポリクローナル抗体である特許請求の範
囲第１０項に記載の方法。