JP2779178B2 - 標的リガンド用アッセイの感度を高める方法 - Google Patents
標的リガンド用アッセイの感度を高める方法Info
- Publication number
- JP2779178B2 JP2779178B2 JP63255735A JP25573588A JP2779178B2 JP 2779178 B2 JP2779178 B2 JP 2779178B2 JP 63255735 A JP63255735 A JP 63255735A JP 25573588 A JP25573588 A JP 25573588A JP 2779178 B2 JP2779178 B2 JP 2779178B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ligand
- antigen
- binding
- antibody
- mucin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リガンドであるムチン抗原を処理して、免
疫学的結合性を増進する方法に関するものである。
疫学的結合性を増進する方法に関するものである。
（従来の技術） 免疫学的に結合するのに用いる興味ある物質の存在を
検出し、また定量するために様々なアッセイが開発され
ている。このようなアッセイは抗体を用いるものを包含
し、該抗体は抗原と抗体との特異的相互作用の原因とな
る、抗原性分子上の領域または“エピトープ”を認識す
る。特に興味あるものは、血液血清などの流体サンプル
中の物質、例えばある種の糖タンパクおよび糖脂質など
を検出し得るアッセイである。該糖タンパクおよび糖脂
質は腫瘍組織と関連していることがわかっており、その
結果腫瘍のマーカーとして機能し得る。最近、多量の炭
水化物を含み、ムチンとして知られる一群の高分子量糖
タンパクが腫瘍関連性であることが見出された。ムチン
抗原上のエピトープを検出し得るモノクローナル抗体も
開示されている。このようなモノクローナル抗体を用い
たイムノアッセイがヒトの癌の検出並びに監視を可能な
らしめることを示した。これらのムチンと反応性の抗体
はCA19−９〔コプロースキー（Koprowski）等、サイエ
ンス（Science）,1981,212,pp.53−54〕、CA50〔ホルム
グレン（Holmgren）等，ブリティッシュ メディカル
ジャーナル（Br.Med.J.）,1984,280,pp.1479−82〕、DU
PAN−２〔メッツガー（Metzger）等,PANAS,1984,81,pp.
5242−5246〕およびシアル酸をもつLexエピトープ〔カ
ンナギ（Kannagi）等，キャンサ リサーチ（Cancer Re
s.）,1986,46,pp.2619−2626〕を含む。
検出し、また定量するために様々なアッセイが開発され
ている。このようなアッセイは抗体を用いるものを包含
し、該抗体は抗原と抗体との特異的相互作用の原因とな
る、抗原性分子上の領域または“エピトープ”を認識す
る。特に興味あるものは、血液血清などの流体サンプル
中の物質、例えばある種の糖タンパクおよび糖脂質など
を検出し得るアッセイである。該糖タンパクおよび糖脂
質は腫瘍組織と関連していることがわかっており、その
結果腫瘍のマーカーとして機能し得る。最近、多量の炭
水化物を含み、ムチンとして知られる一群の高分子量糖
タンパクが腫瘍関連性であることが見出された。ムチン
抗原上のエピトープを検出し得るモノクローナル抗体も
開示されている。このようなモノクローナル抗体を用い
たイムノアッセイがヒトの癌の検出並びに監視を可能な
らしめることを示した。これらのムチンと反応性の抗体
はCA19−９〔コプロースキー（Koprowski）等、サイエ
ンス（Science）,1981,212,pp.53−54〕、CA50〔ホルム
グレン（Holmgren）等，ブリティッシュ メディカル
ジャーナル（Br.Med.J.）,1984,280,pp.1479−82〕、DU
PAN−２〔メッツガー（Metzger）等,PANAS,1984,81,pp.
5242−5246〕およびシアル酸をもつLexエピトープ〔カ
ンナギ（Kannagi）等，キャンサ リサーチ（Cancer Re
s.）,1986,46,pp.2619−2626〕を含む。
Ｎ−アセチルノイラミン酸（アミノ糖酸）のＯ−アセ
チル誘導体であるシアル酸は脂質、多糖およびムコタン
パクの構成成分としてヒト組織中に広く分布している。
シアル酸はアシル側鎖の異る様々な形で存在する。Ｏ−
アシル、Ｏ−メチルおよびＯ−グリコソル含有シアル酸
が記載されている。
チル誘導体であるシアル酸は脂質、多糖およびムコタン
パクの構成成分としてヒト組織中に広く分布している。
シアル酸はアシル側鎖の異る様々な形で存在する。Ｏ−
アシル、Ｏ−メチルおよびＯ−グリコソル含有シアル酸
が記載されている。
腫瘍細胞は比較的大量のシアル酸を含むことがわかっ
ており、かつ癌患者由来の血清中に存在するムチン抗原
はシアル酸を含んでいることが報告されている。酸素、
ノイラミニダーゼはシアル酸を除去する。いくつかの場
合には、通常抗体により認識されるムチン抗原上のエピ
トープとのモノクローナル抗体の結合能は、ノイラミニ
ダーゼを用いて該抗原を消化した後には減少することが
観測されている（上記カンナギ（Kannagi）等の文献参
照）。また、ノイラミニダーゼ処理が腫瘍関連糖タンパ
クを免疫学的により一層反応性とし得ることも観測され
ている（米国特許第4,146,603号参照）。これらの観察
を基にして、ノイラミニダーゼ感度は種々の抗体により
認識されるエピトープの特徴付けを補助するのに用いら
れている。
ており、かつ癌患者由来の血清中に存在するムチン抗原
はシアル酸を含んでいることが報告されている。酸素、
ノイラミニダーゼはシアル酸を除去する。いくつかの場
合には、通常抗体により認識されるムチン抗原上のエピ
トープとのモノクローナル抗体の結合能は、ノイラミニ
ダーゼを用いて該抗原を消化した後には減少することが
観測されている（上記カンナギ（Kannagi）等の文献参
照）。また、ノイラミニダーゼ処理が腫瘍関連糖タンパ
クを免疫学的により一層反応性とし得ることも観測され
ている（米国特許第4,146,603号参照）。これらの観察
を基にして、ノイラミニダーゼ感度は種々の抗体により
認識されるエピトープの特徴付けを補助するのに用いら
れている。
“ノイラミニダーゼ感受性”抗体の、ノイラミニダー
ゼ処理したシアル酸をもつ抗原に対する結合能の結果と
みられた減少は、シアル酸がこれらの結合サイトの適当
な三次元構造を必要とすることを連想することによって
説明された 〔ジョンソン（Johnson）等、キャンサ リサーチ（Can
cer Res.）,1986,46,pp.850−857〕。他のシアル酸担持
腫瘍関連抗原はルイス式血液型抗原および癌胎児性抗原
（CEA）などを含む〔上記のカンナギ（Kannagi）等の文
献参照〕。
ゼ処理したシアル酸をもつ抗原に対する結合能の結果と
みられた減少は、シアル酸がこれらの結合サイトの適当
な三次元構造を必要とすることを連想することによって
説明された 〔ジョンソン（Johnson）等、キャンサ リサーチ（Can
cer Res.）,1986,46,pp.850−857〕。他のシアル酸担持
腫瘍関連抗原はルイス式血液型抗原および癌胎児性抗原
（CEA）などを含む〔上記のカンナギ（Kannagi）等の文
献参照〕。
シアル酸は、一般にオリゴ糖側鎖における末端基とし
て見出されるので、これはエピトープを遮断、即ち“隠
蔽”することもできる。例えば、胃腫瘍におけるレクチ
ン結合サイトはノイラミニダーゼを用いてシアル酸を除
去するのに伴って露出する〔マッカートニー（Macartne
y），ジャーナルオブ パソロジー（J.Pathol）,1986,1
50,pp.135−144〕。シアル酸の他に、他の周辺糖、例え
ばフコースも抗原などのリガンド上の免疫学的結合サイ
トを阻害する。このような周辺物質の除去により、そう
しなければ露出されない結合サイトを含むタンパク中の
“コア”炭水化物をあらわにできる〔フェイズ（Feiz
e）等，バイオケミカル ソサイアティ トランスアク
ション（Biochem.Soc.Trans.）,1984,12,pp.591−59
9〕。これらのコア構造は多くの起源からのオリゴ糖中
において共通であり、かつ一般のルイス式血液型抗原な
どの周辺オリゴ糖構造のような制限された組織分布を示
さない。
て見出されるので、これはエピトープを遮断、即ち“隠
蔽”することもできる。例えば、胃腫瘍におけるレクチ
ン結合サイトはノイラミニダーゼを用いてシアル酸を除
去するのに伴って露出する〔マッカートニー（Macartne
y），ジャーナルオブ パソロジー（J.Pathol）,1986,1
50,pp.135−144〕。シアル酸の他に、他の周辺糖、例え
ばフコースも抗原などのリガンド上の免疫学的結合サイ
トを阻害する。このような周辺物質の除去により、そう
しなければ露出されない結合サイトを含むタンパク中の
“コア”炭水化物をあらわにできる〔フェイズ（Feiz
e）等，バイオケミカル ソサイアティ トランスアク
ション（Biochem.Soc.Trans.）,1984,12,pp.591−59
9〕。これらのコア構造は多くの起源からのオリゴ糖中
において共通であり、かつ一般のルイス式血液型抗原な
どの周辺オリゴ糖構造のような制限された組織分布を示
さない。
タンパクから周辺糖を除去する従来の方法は処理前に
リガンドを精製する必要があった。
リガンドを精製する必要があった。
（発明が解決しようとする課題） 従って、リガンドであるムチン抗原から、予め精製す
ることなしに、物質を除去して、付随的な免疫学的結合
サイトを使用可能とし、改善された疾病または感染のマ
ーカーとして使用する方法を開発することは有益であ
る。
ることなしに、物質を除去して、付随的な免疫学的結合
サイトを使用可能とし、改善された疾病または感染のマ
ーカーとして使用する方法を開発することは有益であ
る。
（課題を解決するための手段相） 本発明は未精製リガンドを処理して、該リガンドへの
免疫学的結合を阻害する物質、例えばシアル酸を該リガ
ンドから除去する方法を提供する。本発明においてはリ
ガンドとしてムチン抗原を用いる（以下、同じ）。この
方法は酵素による消化または温和な酸に対する曝露を利
用して阻害物質を除き、追加の結合サイトを露出させ
る。ノイラミニダーゼはこのリガンドの処理にとって好
ましい酵素である。
免疫学的結合を阻害する物質、例えばシアル酸を該リガ
ンドから除去する方法を提供する。本発明においてはリ
ガンドとしてムチン抗原を用いる（以下、同じ）。この
方法は酵素による消化または温和な酸に対する曝露を利
用して阻害物質を除き、追加の結合サイトを露出させ
る。ノイラミニダーゼはこのリガンドの処理にとって好
ましい酵素である。
この処理されたリガンドを免疫アッセイで使用して、
リガンドに対する抗−リガンドの結合を検出する。ここ
では、標識抗−リガンドが処理されたリガンドと接触さ
れ、かつ該結合抗−リガンドが検出される。この処理さ
れたリガンドも免疫原として用いて、モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。この
ような抗体は、ムチン抗原を含む、哺乳動物対象におけ
る疾病または感染症と関連したリガンドを検出するアッ
セイにおいて有用であり得る。
リガンドに対する抗−リガンドの結合を検出する。ここ
では、標識抗−リガンドが処理されたリガンドと接触さ
れ、かつ該結合抗−リガンドが検出される。この処理さ
れたリガンドも免疫原として用いて、モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。この
ような抗体は、ムチン抗原を含む、哺乳動物対象におけ
る疾病または感染症と関連したリガンドを検出するアッ
セイにおいて有用であり得る。
我々は、リガンドへの免疫学的結合性を、酵素消化に
よりリガンドを処理して物質を除きかつ該リガンド上の
結合サイトを露出させることにより増進し得ることを見
出した。これらの結果は、シアル酸が免疫学的結合に対
しいくつかの結合サイトまたは“エピトープ”を不活性
化もしくはさもなければこれらを免疫学的結合に利用し
得なくしていることを示唆している。
よりリガンドを処理して物質を除きかつ該リガンド上の
結合サイトを露出させることにより増進し得ることを見
出した。これらの結果は、シアル酸が免疫学的結合に対
しいくつかの結合サイトまたは“エピトープ”を不活性
化もしくはさもなければこれらを免疫学的結合に利用し
得なくしていることを示唆している。
本発明は、特にあるいくつかのリガンドがタンパクお
よび糖タンパクの複雑な混合物中、例えばヒト血液血清
中で低濃度にて未精製の形状で存在する場合の、該リガ
ンドに対する免疫学的結合を高める方法を記載する。こ
こで使用する“リガンド（Ligand）”なる用語は標的物
質を意味し、これは該リガンド上の結合サイトを認識す
る“抗−リガンド”との免疫学的結合に関与する反応性
結合サイトをもつ。抗原および抗体はリガンドおよび抗
−リガンドの周知の例である。この方法によれば、標的
リガンドは免疫学的結合を阻害する物質を除去すべく処
理され、かくして追加の結合サイトが露出される。例え
ば、ムチン抗原は酵素、例えばノイラミニダーゼで処理
することができ、該ノイラミニダーゼによればシアル酸
が除去される。この処理は該ムチン抗原に対するいくつ
かの抗体の結合を増進し、更にこれによって例えば全血
血清などの複雑なタンパク混合物においてさえ、低濃度
のリガンドを検知し得るより一層高感度のアッセイをも
たらす。更に，この方法は抗原上の付随的かつ新規な結
合サイト（“エピトープ”）を露呈させて、抗体のスク
リーニングに利用可能とし、あるいは新規なモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることを可能と
する。
よび糖タンパクの複雑な混合物中、例えばヒト血液血清
中で低濃度にて未精製の形状で存在する場合の、該リガ
ンドに対する免疫学的結合を高める方法を記載する。こ
こで使用する“リガンド（Ligand）”なる用語は標的物
質を意味し、これは該リガンド上の結合サイトを認識す
る“抗−リガンド”との免疫学的結合に関与する反応性
結合サイトをもつ。抗原および抗体はリガンドおよび抗
−リガンドの周知の例である。この方法によれば、標的
リガンドは免疫学的結合を阻害する物質を除去すべく処
理され、かくして追加の結合サイトが露出される。例え
ば、ムチン抗原は酵素、例えばノイラミニダーゼで処理
することができ、該ノイラミニダーゼによればシアル酸
が除去される。この処理は該ムチン抗原に対するいくつ
かの抗体の結合を増進し、更にこれによって例えば全血
血清などの複雑なタンパク混合物においてさえ、低濃度
のリガンドを検知し得るより一層高感度のアッセイをも
たらす。更に，この方法は抗原上の付随的かつ新規な結
合サイト（“エピトープ”）を露呈させて、抗体のスク
リーニングに利用可能とし、あるいは新規なモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることを可能と
する。
本発明のリガンドを処理して結合サイトから物質を除
去する方法がいくつかの抗−リガンドの高い結合をもた
らす機序は十分に理解されていない。前述のいくつかの
ムチン指向性（mucin−directed）抗体については、シ
アル酸などの物質の除去は抗原の抗体による認識を減
じ、これは結合サイトの構造の変更によるものと信じら
れていた。しかし、この説明に拘泥するつもりはない
が、リガンド、例えば腫瘍関連ムチン抗原上の、正常な
起源から得たリガンド上には表現されていない特異的結
合サイトがコアリガンド構造の一部を形成しているため
であるかも知れない。該構造は、抗−リガンド、例えば
抗体との結合に対して該結合サイトを使用可能なものと
するために、周辺糖を除くことにより露出する。また、
シアル酸の除去はリガンド分子の全体としての形状を変
えるかも知れない〔ラン（Lan）等、ジャーナル オブ
セルラーバイオケミストリ（J.Cellular Biochem.）
アブストラクツ（Abst.）,1987,309,pp.110:160〕。こ
れらの結合サイトは、例えば新規なもしくは希なエピト
ープであり得、該エピトープは疾病または感染症に関連
した抗原上に選択的に表現される。更に、これらのサイ
トは単一の抗−リガンドにより認識される“繰返し”、
即ち多糖結合サイトであってよい。
去する方法がいくつかの抗−リガンドの高い結合をもた
らす機序は十分に理解されていない。前述のいくつかの
ムチン指向性（mucin−directed）抗体については、シ
アル酸などの物質の除去は抗原の抗体による認識を減
じ、これは結合サイトの構造の変更によるものと信じら
れていた。しかし、この説明に拘泥するつもりはない
が、リガンド、例えば腫瘍関連ムチン抗原上の、正常な
起源から得たリガンド上には表現されていない特異的結
合サイトがコアリガンド構造の一部を形成しているため
であるかも知れない。該構造は、抗−リガンド、例えば
抗体との結合に対して該結合サイトを使用可能なものと
するために、周辺糖を除くことにより露出する。また、
シアル酸の除去はリガンド分子の全体としての形状を変
えるかも知れない〔ラン（Lan）等、ジャーナル オブ
セルラーバイオケミストリ（J.Cellular Biochem.）
アブストラクツ（Abst.）,1987,309,pp.110:160〕。こ
れらの結合サイトは、例えば新規なもしくは希なエピト
ープであり得、該エピトープは疾病または感染症に関連
した抗原上に選択的に表現される。更に、これらのサイ
トは単一の抗−リガンドにより認識される“繰返し”、
即ち多糖結合サイトであってよい。
比較的少ない異るコアおよび骨格Ｏ−結合炭水化物構
造を記載してきたので、これら構造は広く分布している
組織源からのオリゴ糖の共通成分であり、かつその結果
一般的組織マーカーとして機能できる。従って、本発明
の方法によって上記のように周辺糖を除去することによ
り、これらのコアおよび骨格オリゴ糖を免疫学的アッセ
イにおける標的として用いて、癌を含む様々な疾病並び
に感染症の形態を検知できる。
造を記載してきたので、これら構造は広く分布している
組織源からのオリゴ糖の共通成分であり、かつその結果
一般的組織マーカーとして機能できる。従って、本発明
の方法によって上記のように周辺糖を除去することによ
り、これらのコアおよび骨格オリゴ糖を免疫学的アッセ
イにおける標的として用いて、癌を含む様々な疾病並び
に感染症の形態を検知できる。
実施例ではムチン抗原、特に腫瘍源由来の抗原の処理
を記載するが、体液中に存在する任意のリガンドを処理
して、シアル酸などの物質を除去し、癌胎児性免疫結合
を促進できる。例えば、ムチン以外の抗原、例えば癌胎
児性抗原（CEA）およびヒトじゅう毛性々腺刺激ホルモ
ン（HCG）をノイラミニダーゼで、あるいは以下に記載
の他の手続きを利用して処理することができる。この方
法を用いると、リガンドは未精製、例えば全血々清、
痰、尿などの体液中に存在し得、あるいは癌患者からの
腹水滲出液および直接処理されかつアッセイで使われた
リガンドを含む流体として与えることができる。また、
リガンドは公知の精製法、即ち例えばEP 268,279−Ａ
（これを本発明の参考文献とする）に記載されたように
して、処理のために単離かつ精製してもよい。
を記載するが、体液中に存在する任意のリガンドを処理
して、シアル酸などの物質を除去し、癌胎児性免疫結合
を促進できる。例えば、ムチン以外の抗原、例えば癌胎
児性抗原（CEA）およびヒトじゅう毛性々腺刺激ホルモ
ン（HCG）をノイラミニダーゼで、あるいは以下に記載
の他の手続きを利用して処理することができる。この方
法を用いると、リガンドは未精製、例えば全血々清、
痰、尿などの体液中に存在し得、あるいは癌患者からの
腹水滲出液および直接処理されかつアッセイで使われた
リガンドを含む流体として与えることができる。また、
リガンドは公知の精製法、即ち例えばEP 268,279−Ａ
（これを本発明の参考文献とする）に記載されたように
して、処理のために単離かつ精製してもよい。
処理されたリガンドはイムノアッセイの感度（即ち、
該アッセイの低濃度で存在するリガンドを検出し得る能
力）を高めるために用いることができる。このようなア
ッセイは疾病または感染症に関連したリガンドの存在を
検出する能力を与えるか、あるいはスクリーニングテス
トとして機能して、処理リガンドに対する抗−リガンド
の結合を評価すること、例えばハイブリドーマ上澄また
は種々の源からのサンプル中に存在する抗体をスクリー
ニングすることを可能とする。
該アッセイの低濃度で存在するリガンドを検出し得る能
力）を高めるために用いることができる。このようなア
ッセイは疾病または感染症に関連したリガンドの存在を
検出する能力を与えるか、あるいはスクリーニングテス
トとして機能して、処理リガンドに対する抗−リガンド
の結合を評価すること、例えばハイブリドーマ上澄また
は種々の源からのサンプル中に存在する抗体をスクリー
ニングすることを可能とする。
全血中に存在するムチン抗原を処理するのに好ましい
酵素はノイラミニダーゼ酵素、例えばコレラ菌（Vibrio
cholerae:カルバイオケム ブランド バイオケミカル
ズ（CALBIOCHEM Brand Biochemicals），カルフォルニ
ア州、ラ ジョラ（La Jolla）より入手できる）から単
離したノイラミニダーゼである。この酵素を用いたリガ
ンドの消化は、好ましくは４〜37℃にて、酵素濃度0.1
〜6mU/希薄血清（μ）（希釈は0.15M NaCl、50mM酢酸
ナトリウム、pH5.5、0.1％CaCl2および0.1％NaN3を含む
バッファーで行う）にて行われる。消化は十分なインキ
ュベーションの後、pHを中性まで高めるか、あるいは短
時間55〜95℃の温度に加熱することにより停止する。
酵素はノイラミニダーゼ酵素、例えばコレラ菌（Vibrio
cholerae:カルバイオケム ブランド バイオケミカル
ズ（CALBIOCHEM Brand Biochemicals），カルフォルニ
ア州、ラ ジョラ（La Jolla）より入手できる）から単
離したノイラミニダーゼである。この酵素を用いたリガ
ンドの消化は、好ましくは４〜37℃にて、酵素濃度0.1
〜6mU/希薄血清（μ）（希釈は0.15M NaCl、50mM酢酸
ナトリウム、pH5.5、0.1％CaCl2および0.1％NaN3を含む
バッファーで行う）にて行われる。消化は十分なインキ
ュベーションの後、pHを中性まで高めるか、あるいは短
時間55〜95℃の温度に加熱することにより停止する。
この酵素消化工程は、免疫アッセイを用いる際の処理
の効果を測定することにより監視することが好ましい。
例えば、滴定曲線を、増大する濃度の酵素（500mU/μ
まで）を用いかつ得られる抗−リガンドの標的リガンド
への結合を記録することにより作成して使用すべき酵素
の正確な濃度を決めることができる。好ましい酵素濃度
は結合作用が最大となる値である。消化を監視するもう
一つの方法は標的リガンドを含む血清サンプル中に存在
する脱シアル酸トランスフェリン（血清の主要成分であ
るシアル酸担持糖タンパク）の割合を測定すること、即
ちSDSPAGE（ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）を利用して、ノイラミニダーゼで処
理することである。
の効果を測定することにより監視することが好ましい。
例えば、滴定曲線を、増大する濃度の酵素（500mU/μ
まで）を用いかつ得られる抗−リガンドの標的リガンド
への結合を記録することにより作成して使用すべき酵素
の正確な濃度を決めることができる。好ましい酵素濃度
は結合作用が最大となる値である。消化を監視するもう
一つの方法は標的リガンドを含む血清サンプル中に存在
する脱シアル酸トランスフェリン（血清の主要成分であ
るシアル酸担持糖タンパク）の割合を測定すること、即
ちSDSPAGE（ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）を利用して、ノイラミニダーゼで処
理することである。
酵素消化以外の他の化学的処理を利用して遮断周辺糖
をコアリガンド構造から除去することもでき、緩和な酸
の使用を含む。例えば、体液のサンプルを酸、例えば硫
酸（H2SO4）を、サンプル中に存在するリガンドに対す
る抗−リガンドの高い結合性を得るのに有効な量で用い
て、酸で処理することもできる。適当な酸の量は、酸処
理後に、糖タンパクまたは他のリガンドと抗−リガンド
との連続的または高い反応性につきテストすることによ
り予め決めることができる。
をコアリガンド構造から除去することもでき、緩和な酸
の使用を含む。例えば、体液のサンプルを酸、例えば硫
酸（H2SO4）を、サンプル中に存在するリガンドに対す
る抗−リガンドの高い結合性を得るのに有効な量で用い
て、酸で処理することもできる。適当な酸の量は、酸処
理後に、糖タンパクまたは他のリガンドと抗−リガンド
との連続的または高い反応性につきテストすることによ
り予め決めることができる。
リガンド／抗−リガンドイムノアッセイは、該リガン
ドの抗−リガンドによる検出可能性を決定することによ
り、ここに記載のようなリガンドの処理結果を評価する
のに利用することができる。この処理リガンドに対する
結合の評価のために選ばれたアッセイは、当分野で公知
の如く、競合的または非競合的、直接または間接的な形
式で、１または２つの抗−リガンドを用いることができ
る。上述のように、このリガンドは好ましくは流体サン
プル、例えば全血清として、単離並びに精製工程を必要
とすることなしに与えられる。このリガンドは、また細
胞、例えば癌細胞と結合した状態であってもよい。該流
体または細胞含有サンプル中に不純な形で存在するリガ
ンドが、例えば上記の如くノイラミニダーゼで処理され
る。
ドの抗−リガンドによる検出可能性を決定することによ
り、ここに記載のようなリガンドの処理結果を評価する
のに利用することができる。この処理リガンドに対する
結合の評価のために選ばれたアッセイは、当分野で公知
の如く、競合的または非競合的、直接または間接的な形
式で、１または２つの抗−リガンドを用いることができ
る。上述のように、このリガンドは好ましくは流体サン
プル、例えば全血清として、単離並びに精製工程を必要
とすることなしに与えられる。このリガンドは、また細
胞、例えば癌細胞と結合した状態であってもよい。該流
体または細胞含有サンプル中に不純な形で存在するリガ
ンドが、例えば上記の如くノイラミニダーゼで処理され
る。
次いで、イムノアッセイ手法を用いることができ、こ
こでは単一の抗−リガンド、例えばモノクローナル抗体
が固相に結合されており、また同じモノクローナル抗体
が流体サンプルに添加されるが、プローブとして使用す
るために標識される。この標識モノクローナル抗体は上
記の固相に結合されたモノクローナル抗体により認識さ
れるリガンド上の同一の結合サイトに結合するが、これ
はリガンド上で繰返される。また、このイムノアッセイ
は、夫々対象とするリガンド上の異る結合サイトに対し
て反応性の２種の抗−リガンドの組合せを利用して行う
ことも可能である。このようなアッセイはいずれかの抗
−リガンドを単独で用いたアッセイよりも良好な特異性
を与える可能性がある。上記アッセイ形式の一つを用い
たラジオイムノアッセイ、酵素アッセイおよび蛍光アッ
セイは公知である。これらアッセイにおいて、少なくと
も一つの抗−リガンドは、例えば放射性核種、発色酵
素、またはフルオロフォアで、公知の方法を用いて標識
される。標準的手法で標識された抗−リガンドは、次に
処理されたリガンド、例えばノイラミニダーゼで消化さ
れたリガンドと接触され、かつ該抗リガンドの結合にお
ける効果を、該標識の検出により知ることができる。
こでは単一の抗−リガンド、例えばモノクローナル抗体
が固相に結合されており、また同じモノクローナル抗体
が流体サンプルに添加されるが、プローブとして使用す
るために標識される。この標識モノクローナル抗体は上
記の固相に結合されたモノクローナル抗体により認識さ
れるリガンド上の同一の結合サイトに結合するが、これ
はリガンド上で繰返される。また、このイムノアッセイ
は、夫々対象とするリガンド上の異る結合サイトに対し
て反応性の２種の抗−リガンドの組合せを利用して行う
ことも可能である。このようなアッセイはいずれかの抗
−リガンドを単独で用いたアッセイよりも良好な特異性
を与える可能性がある。上記アッセイ形式の一つを用い
たラジオイムノアッセイ、酵素アッセイおよび蛍光アッ
セイは公知である。これらアッセイにおいて、少なくと
も一つの抗−リガンドは、例えば放射性核種、発色酵
素、またはフルオロフォアで、公知の方法を用いて標識
される。標準的手法で標識された抗−リガンドは、次に
処理されたリガンド、例えばノイラミニダーゼで消化さ
れたリガンドと接触され、かつ該抗リガンドの結合にお
ける効果を、該標識の検出により知ることができる。
特に有用なアッセイおよび本発明の方法で用いるのに
好ましいアッセイは“二重決定基イムノアッセイ（doub
le determinant immunoassay）”即ち“DDIA"、直接ア
ッセイであり、ブラウン（Brown）等の、クリニカルケ
ミストリ（Clin.Chem.）,1981,27,pp.1592−1596および
リンスレー（Linsley）等のキャンサ リサーチ（Cance
r Res.）,1986,46,pp.5444−5450（これらは本発明の参
考文献とする）に記載されている。このアッセイにおい
て、適当な基質は特定の抗原と反応性であることが既知
のモノクローナル抗体の溶液で被覆されている。例え
ば、ここに記載の方法を用いて、癌などの疾病にかかっ
ている可能性のあるヒト患者からの全血々清中に存在す
る腫瘍関連ムチン抗原はノイラミニダーゼ酵素で消化さ
れ、かつ固定化抗体との反応に付される。該固定化抗体
と同一でも異っていてもよい第２の抗体は125Iで放射性
標識され、次いで基質に添加され、結合された標識抗体
の放射能を、これを検出するための器具、例えばガンマ
計数器で測定する。また、この抗体はセイヨウワサビの
パーオキシダーゼ（HRP）で標識してもよく、これは分
光々度計を用いて、このHRPがその基質、例えばＯ−フ
ェニレンジアミン（OPD）と反応した際に発現する色
（黄色）の強度を測定することにより決定できる。
好ましいアッセイは“二重決定基イムノアッセイ（doub
le determinant immunoassay）”即ち“DDIA"、直接ア
ッセイであり、ブラウン（Brown）等の、クリニカルケ
ミストリ（Clin.Chem.）,1981,27,pp.1592−1596および
リンスレー（Linsley）等のキャンサ リサーチ（Cance
r Res.）,1986,46,pp.5444−5450（これらは本発明の参
考文献とする）に記載されている。このアッセイにおい
て、適当な基質は特定の抗原と反応性であることが既知
のモノクローナル抗体の溶液で被覆されている。例え
ば、ここに記載の方法を用いて、癌などの疾病にかかっ
ている可能性のあるヒト患者からの全血々清中に存在す
る腫瘍関連ムチン抗原はノイラミニダーゼ酵素で消化さ
れ、かつ固定化抗体との反応に付される。該固定化抗体
と同一でも異っていてもよい第２の抗体は125Iで放射性
標識され、次いで基質に添加され、結合された標識抗体
の放射能を、これを検出するための器具、例えばガンマ
計数器で測定する。また、この抗体はセイヨウワサビの
パーオキシダーゼ（HRP）で標識してもよく、これは分
光々度計を用いて、このHRPがその基質、例えばＯ−フ
ェニレンジアミン（OPD）と反応した際に発現する色
（黄色）の強度を測定することにより決定できる。
組織学的手法を用いて、対象から採取した細胞からな
るサンプルにつき、処理リガンドに対する抗体結合を評
価できる。抗体結合はHRP−複合抗体および該抗体上の
蛍光性標識、例えばフルオロセインイソチオシアネート
を用いて、 リンスレー（Linsley）等〔キャンサ リサーチ（Cance
r Res.）,1986,46,pp.6380−6386:これを本発明の参考
文献とする〕により記載されているように、得られる蛍
光パターンを観測することにより決定できる。
るサンプルにつき、処理リガンドに対する抗体結合を評
価できる。抗体結合はHRP−複合抗体および該抗体上の
蛍光性標識、例えばフルオロセインイソチオシアネート
を用いて、 リンスレー（Linsley）等〔キャンサ リサーチ（Cance
r Res.）,1986,46,pp.6380−6386:これを本発明の参考
文献とする〕により記載されているように、得られる蛍
光パターンを観測することにより決定できる。
上記のようなイムノアッセイをここに記載の方法で処
理したリガンドと共に利用して、該処理リガンド好まし
くは哺乳動物中の疾病または感染症の存在と関連したリ
ガンドと結合し得る抗−リガンドの選択法を提供でき
る。このような用途に対して、リガンドは本明細書記載
のように処理されて、予め未露出結合サイトが利用可能
とされる。次いで、この処理リガンドを系統的に種々の
抗−リガンドに曝露し、結合サイトに結合し得る抗−リ
ガンドを検出することができる。かくして、未処理リガ
ンドと反応しなかった予め知られていた抗−リガンドが
同定され、かつリガンド、特に疾病または感染に関連す
るリガンドの検出に有用なものとされる。
理したリガンドと共に利用して、該処理リガンド好まし
くは哺乳動物中の疾病または感染症の存在と関連したリ
ガンドと結合し得る抗−リガンドの選択法を提供でき
る。このような用途に対して、リガンドは本明細書記載
のように処理されて、予め未露出結合サイトが利用可能
とされる。次いで、この処理リガンドを系統的に種々の
抗−リガンドに曝露し、結合サイトに結合し得る抗−リ
ガンドを検出することができる。かくして、未処理リガ
ンドと反応しなかった予め知られていた抗−リガンドが
同定され、かつリガンド、特に疾病または感染に関連す
るリガンドの検出に有用なものとされる。
本発明の方法は、また処理リガンドを免疫原として用
いることにより、新規なモノクローナル抗体を産生でき
るハイブリドーマを得るのに利用できる。このような抗
体は該抗原の疾病または感染関連形に表現された結合サ
イトと選択的に反応するものを包含し得る。このような
ハイブリドーマを作るために、コーラーおよびミルシュ
タイン（Kohler ＆ Milstein）〔ネイチャー（Natur
e）,1975,256,495〕により記載されたハイブリッド技術
を変更して使用する。適当な宿主哺乳動物、例えばマウ
スを精製抗原で、例えば腫瘍源由来のムチン抗原で、EP
268,279−Ａに記載のように免疫する。この抗原は免疫
前に、例えばノイラミニザーゼ酵素で消化することによ
り処理される。マウスは精製かつノイラミニダーゼ処理
した抗原で腹腔内経由で接種され、引き続き同様な量の
精製抗原を用いて、典型的には最後の免疫注射後数日経
過後に追加免疫される。最後の追加免疫から数日後に、
該免疫宿主から脾臓を採取し、脾細胞を融合のために分
離する。不死化セルライン、例えばミエローマセルライ
ン、即ち細胞培養で実際的目的のために永続的に維持で
きるかつ融合した際には非形質転換セルラインに、その
不死特性を授与し得るセルラインをこの脾細胞との融合
に使用できる。この不死化細胞および脾細胞を融合し、
細胞を融合培地から分離し、育生培地で例えばHAT培地
で育生して、バイブリッド化されなかった親細胞を除
く。得られる融合細胞、即ちハイブリドーマは数を増す
ことができ、ハイブリドーマの上澄を次に例えば腫瘍関
連ムチン抗原との反応性に対するアッセイに付す（即
ち、スクリーニング）。
いることにより、新規なモノクローナル抗体を産生でき
るハイブリドーマを得るのに利用できる。このような抗
体は該抗原の疾病または感染関連形に表現された結合サ
イトと選択的に反応するものを包含し得る。このような
ハイブリドーマを作るために、コーラーおよびミルシュ
タイン（Kohler ＆ Milstein）〔ネイチャー（Natur
e）,1975,256,495〕により記載されたハイブリッド技術
を変更して使用する。適当な宿主哺乳動物、例えばマウ
スを精製抗原で、例えば腫瘍源由来のムチン抗原で、EP
268,279−Ａに記載のように免疫する。この抗原は免疫
前に、例えばノイラミニザーゼ酵素で消化することによ
り処理される。マウスは精製かつノイラミニダーゼ処理
した抗原で腹腔内経由で接種され、引き続き同様な量の
精製抗原を用いて、典型的には最後の免疫注射後数日経
過後に追加免疫される。最後の追加免疫から数日後に、
該免疫宿主から脾臓を採取し、脾細胞を融合のために分
離する。不死化セルライン、例えばミエローマセルライ
ン、即ち細胞培養で実際的目的のために永続的に維持で
きるかつ融合した際には非形質転換セルラインに、その
不死特性を授与し得るセルラインをこの脾細胞との融合
に使用できる。この不死化細胞および脾細胞を融合し、
細胞を融合培地から分離し、育生培地で例えばHAT培地
で育生して、バイブリッド化されなかった親細胞を除
く。得られる融合細胞、即ちハイブリドーマは数を増す
ことができ、ハイブリドーマの上澄を次に例えば腫瘍関
連ムチン抗原との反応性に対するアッセイに付す（即
ち、スクリーニング）。
上述の手法を用いて、ノイラミニダーゼで予め処理さ
れ、種々の抗体との低い結合性を生ずる抗原が、新たな
結合サイトに対する抗体を生成する試みに免疫原として
使用できることが予想される。該新規な結合サイトはこ
のような処理の結果として結合に利用できるようにな
り、しかも疾病または感染を受けた組織に対する有用な
マーカーとなり得るこれら抗原の認識可能性を高める。
れ、種々の抗体との低い結合性を生ずる抗原が、新たな
結合サイトに対する抗体を生成する試みに免疫原として
使用できることが予想される。該新規な結合サイトはこ
のような処理の結果として結合に利用できるようにな
り、しかも疾病または感染を受けた組織に対する有用な
マーカーとなり得るこれら抗原の認識可能性を高める。
上記アッセイ並びに組織学的手法は疾病の性質および
程度を確認し、あるいは該疾病の進行の追跡を行うため
に利用でき、これは疾病関リガンドの存在の検出によっ
て可能となる。例えば、癌の検出のためには、本発明を
利用して検出された腫瘍関連抗原の量を、正常な組織由
来のサンプル中に典型的にみられる抗原の量と比較する
ことができる。経時で検出した抗原の量の増加は腫瘍塊
の増大を意味し、一方その減少は腫瘍塊の縮小を意味す
るものと考えることができる。疾病の段階を評価するた
めには、検出された抗原の量を、種々の疾病の状態の典
型であることがわかっている量と比較する。疾病の進行
を追跡するためには、血清などのサンプルは周期的（期
間の長さは患者の病歴および治療に依存するであろう）
に採取して抗原の量を比較することができる。
程度を確認し、あるいは該疾病の進行の追跡を行うため
に利用でき、これは疾病関リガンドの存在の検出によっ
て可能となる。例えば、癌の検出のためには、本発明を
利用して検出された腫瘍関連抗原の量を、正常な組織由
来のサンプル中に典型的にみられる抗原の量と比較する
ことができる。経時で検出した抗原の量の増加は腫瘍塊
の増大を意味し、一方その減少は腫瘍塊の縮小を意味す
るものと考えることができる。疾病の段階を評価するた
めには、検出された抗原の量を、種々の疾病の状態の典
型であることがわかっている量と比較する。疾病の進行
を追跡するためには、血清などのサンプルは周期的（期
間の長さは患者の病歴および治療に依存するであろう）
に採取して抗原の量を比較することができる。
かくして、本発明の方法は、改良された、即ちより高
感度かつより高特異性の、ヒトにおける疾病または感染
の存在を検出するためのイムノアッセイを提供できる。
このアッセイは、処理されたリガンド、例えば抗−リガ
ンド（例えば該抗原（リガンド）上のコア構造結合サイ
ト（エピトープ）指向性の抗体）に結合する抗原上に追
加の結合サイトを露出させた結果として改良できる。追
加の結合サイトの利用可能性は、免疫アッセイで検出す
べき血清サンプル中に存在する疾病関連リガンドのより
低い濃度での検出を可能とする。かくして、癌などの疾
病は、より少ない疾病関連リガンドが生成されているよ
り初期的段階での検出かつ診断が可能となる。
感度かつより高特異性の、ヒトにおける疾病または感染
の存在を検出するためのイムノアッセイを提供できる。
このアッセイは、処理されたリガンド、例えば抗−リガ
ンド（例えば該抗原（リガンド）上のコア構造結合サイ
ト（エピトープ）指向性の抗体）に結合する抗原上に追
加の結合サイトを露出させた結果として改良できる。追
加の結合サイトの利用可能性は、免疫アッセイで検出す
べき血清サンプル中に存在する疾病関連リガンドのより
低い濃度での検出を可能とする。かくして、癌などの疾
病は、より少ない疾病関連リガンドが生成されているよ
り初期的段階での検出かつ診断が可能となる。
処理抗原を免疫原として用いて作製した新規なモノク
ローナル抗体の使用も、該処理抗原に対する抗体のより
高い特異性に基き、抗原を検出するのに抗体を用いるア
ッセイを改善できる。処理によって露出するエピトープ
はまれであり、例えば正常な源由来の抗原上ではなく、
腫瘍関連抗原上に存在する場合には、ノイラミニザーゼ
で処理したサンプルを用いて腫瘍関連抗原を検出するイ
ムノアッセイを、該抗原の検出に対しより一層高特異性
のものとすることができる。これは、該処理抗原に対す
る抗体の改善された結合が、該アッセイをして、腫瘍関
連抗原の存在と、癌にかかっていない患者の正常な抗原
の存在との間の区別を可能ならしめるからである。この
ことは、アッセイにおけるいわゆる“誤った正の結果
（false positive results）”の出現を減じる。即ち、
該誤った正の結果では、癌の存在が、正常な患者からの
サンプル中に存在するムチン抗原に抗体が結合し得るた
めに、誤って示される。
ローナル抗体の使用も、該処理抗原に対する抗体のより
高い特異性に基き、抗原を検出するのに抗体を用いるア
ッセイを改善できる。処理によって露出するエピトープ
はまれであり、例えば正常な源由来の抗原上ではなく、
腫瘍関連抗原上に存在する場合には、ノイラミニザーゼ
で処理したサンプルを用いて腫瘍関連抗原を検出するイ
ムノアッセイを、該抗原の検出に対しより一層高特異性
のものとすることができる。これは、該処理抗原に対す
る抗体の改善された結合が、該アッセイをして、腫瘍関
連抗原の存在と、癌にかかっていない患者の正常な抗原
の存在との間の区別を可能ならしめるからである。この
ことは、アッセイにおけるいわゆる“誤った正の結果
（false positive results）”の出現を減じる。即ち、
該誤った正の結果では、癌の存在が、正常な患者からの
サンプル中に存在するムチン抗原に抗体が結合し得るた
めに、誤って示される。
更に、ここに示した方法は対象から採取した体液サン
プルをアッセイするのに便利な手法を提供する。という
のは、該サンプル中のリガンドが、めんどうな、時間の
かかるタンパク精製工程を必要とすることなしに、直接
処理できるからである。かくして、サンプルは、リガン
ド上の結合サイトを露出させ、かつ該露出サイトに結合
する抗−リガンドのアッセイを行うために同時に処理で
きる。
プルをアッセイするのに便利な手法を提供する。という
のは、該サンプル中のリガンドが、めんどうな、時間の
かかるタンパク精製工程を必要とすることなしに、直接
処理できるからである。かくして、サンプルは、リガン
ド上の結合サイトを露出させ、かつ該露出サイトに結合
する抗−リガンドのアッセイを行うために同時に処理で
きる。
本発明の方法は、ヒトからのサンプルを特定のリガン
ドの存在に対してアッセイするための診断用テストキッ
トとして提供することもできる。このようなキットは腫
瘍ムチン抗原上のエピトープと反応性の−または複数の
モノクローナル抗体、例えばハイブリドーマATCC HB92
09により産生される抗体と、リガンドを処理するための
酵素、例えばノイラミニダーゼ酵素を含むことができ
る。この酵素は、該アッセイ法中にリガンドを含むサン
プルを希釈するのに用いる希釈剤の成分として与えるこ
とができる。好ましくは、このキットはこのアッセイを
実施するための、並びに本発明の方法によってリガンド
を処理するための指示を含む。
ドの存在に対してアッセイするための診断用テストキッ
トとして提供することもできる。このようなキットは腫
瘍ムチン抗原上のエピトープと反応性の−または複数の
モノクローナル抗体、例えばハイブリドーマATCC HB92
09により産生される抗体と、リガンドを処理するための
酵素、例えばノイラミニダーゼ酵素を含むことができ
る。この酵素は、該アッセイ法中にリガンドを含むサン
プルを希釈するのに用いる希釈剤の成分として与えるこ
とができる。好ましくは、このキットはこのアッセイを
実施するための、並びに本発明の方法によってリガンド
を処理するための指示を含む。
（実施例） 以下の実施例は本発明を例示するために、かつこれを
作り、使用するのに熟練した者を補助するために提供さ
れる。これら実施例は本発明の開示の範囲またはその特
許後の保護範囲を何等限定することを意図したものでは
ない。
作り、使用するのに熟練した者を補助するために提供さ
れる。これら実施例は本発明の開示の範囲またはその特
許後の保護範囲を何等限定することを意図したものでは
ない。
実施例１ ムチン抗原に対する血清のアッセイモノクロ
ーナル抗体 ムチン抗原上のエピトープW1およびM8を夫々認識する
モノクローナル抗体W1およびONC−M8を用いた。W1抗体
は既に記載したものであり〔“2G3"と呼ばれ、フランケ
ル（Frankel）等、ジャーナル オブ バイオロジー
（J.Biol.）レスポンスモディファイアーズ（Response
Modi−fiers）,1985,４,pp.273−286〕かつセタス社（C
etus Corp.）（カリフォルニア州エメリービル）から得
たものであった。ONC−M8モノクローナル抗体（アメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ATCC）承認番号HB
9209）は係属中の米国特許出願第932,781号（1986年11
月19日付出願）に記載されており、この出願は本発明と
同一の譲受人に譲渡されており、これを本発明の参考文
献とする。この抗体はオンコゲン（Oncogen）〔シアト
ル ワシントン〕から得た。テストした他の抗体は“I"
エピトープを認識するC6抗体〔フェンダーソン（Fender
son）等、モレキュラーイムノロジー（Mol.Immunolog
y）,1986,23,pp.747−754に記載〕であり、ドクタ ブ
ルース フェンダーソンおよびS.ハコモリ，フレッド
ハッチンソン キャンサーリサーチセンタ（Drs.Breece
Fenderson and S.Hakomori,Fred Hutchinson Cancer R
esearch Center（FHCRC,シアトル，ワシントン））から
入手したものであり、また血液型エピトープルイス
ｘ（Lex）を認識するL17抗体（ATCC No.HB8739;ヘルス
トローム（Hellstrom），キャンサ リサーチ（Cancer
Research）,1986,46,pp.3917−3923であって、ドクタI.
ヘルストローム，オンコゲン（Dr.I.Hellstrom,Oncogen
（シアトル ワシントン）から得たものであり、および
“i"エピトープを認識するIB2抗体〔ヤング（Young）
等、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ（J.
Biol.Chem.1981,256,pp.10967−10972に記載〕で、ドク
タ ハコモリ（Dr.Hakomori）,FHCRC,シアトル ワシン
トンにより提供されたものである。抗体1B2は腹水液と
して用いた。C6は培養上澄中で用いた。抗体W1、ONC−M
8およびL17は腹水から精製した。
ーナル抗体 ムチン抗原上のエピトープW1およびM8を夫々認識する
モノクローナル抗体W1およびONC−M8を用いた。W1抗体
は既に記載したものであり〔“2G3"と呼ばれ、フランケ
ル（Frankel）等、ジャーナル オブ バイオロジー
（J.Biol.）レスポンスモディファイアーズ（Response
Modi−fiers）,1985,４,pp.273−286〕かつセタス社（C
etus Corp.）（カリフォルニア州エメリービル）から得
たものであった。ONC−M8モノクローナル抗体（アメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ATCC）承認番号HB
9209）は係属中の米国特許出願第932,781号（1986年11
月19日付出願）に記載されており、この出願は本発明と
同一の譲受人に譲渡されており、これを本発明の参考文
献とする。この抗体はオンコゲン（Oncogen）〔シアト
ル ワシントン〕から得た。テストした他の抗体は“I"
エピトープを認識するC6抗体〔フェンダーソン（Fender
son）等、モレキュラーイムノロジー（Mol.Immunolog
y）,1986,23,pp.747−754に記載〕であり、ドクタ ブ
ルース フェンダーソンおよびS.ハコモリ，フレッド
ハッチンソン キャンサーリサーチセンタ（Drs.Breece
Fenderson and S.Hakomori,Fred Hutchinson Cancer R
esearch Center（FHCRC,シアトル，ワシントン））から
入手したものであり、また血液型エピトープルイス
ｘ（Lex）を認識するL17抗体（ATCC No.HB8739;ヘルス
トローム（Hellstrom），キャンサ リサーチ（Cancer
Research）,1986,46,pp.3917−3923であって、ドクタI.
ヘルストローム，オンコゲン（Dr.I.Hellstrom,Oncogen
（シアトル ワシントン）から得たものであり、および
“i"エピトープを認識するIB2抗体〔ヤング（Young）
等、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ（J.
Biol.Chem.1981,256,pp.10967−10972に記載〕で、ドク
タ ハコモリ（Dr.Hakomori）,FHCRC,シアトル ワシン
トンにより提供されたものである。抗体1B2は腹水液と
して用いた。C6は培養上澄中で用いた。抗体W1、ONC−M
8およびL17は腹水から精製した。
血 清 ヒト患者から血液血清を採取して、23℃にて10〜90分
かけて凝固させた。次いで、サンプルを臨床用遠心機で
遠心分離する前に４℃〜６℃にて0.5〜５時間保存し
た。血液血清を凝固部分から分離し、試料に分け、−70
℃で凍結した。いくつかのテストに対し、患者からの血
清をプールした。プールした血清を10〜16人の正常な固
体および８〜17人の進行した乳癌患者から得た。
かけて凝固させた。次いで、サンプルを臨床用遠心機で
遠心分離する前に４℃〜６℃にて0.5〜５時間保存し
た。血液血清を凝固部分から分離し、試料に分け、−70
℃で凍結した。いくつかのテストに対し、患者からの血
清をプールした。プールした血清を10〜16人の正常な固
体および８〜17人の進行した乳癌患者から得た。
ノイラミニダーゼ処理 正常なヒトおよび上記のように乳癌であると診断され
たヒトから得た血清を20％（v/v）の濃度までノイラミ
ニダーゼ処理バッファーで希釈した。次に、希釈した血
清50μを、ノイラミニダーゼバッファーで希釈した50
μのノイラミニダーゼと混合し、この混合物を37℃に
て16時間インキュベートした。血清−酵素混合物を次に
等容量の、0.5％BSAを含む、pH8の50mMトリス（Tris）
で希釈して反応を停止した。次いで、この混合物を更に
W1またはONC−M8抗体（夫々1:200および1:100なる最終
濃度で）を用いて以下に述べるようにDDIAアッセイに対
し最適の希釈率まで希釈した。
たヒトから得た血清を20％（v/v）の濃度までノイラミ
ニダーゼ処理バッファーで希釈した。次に、希釈した血
清50μを、ノイラミニダーゼバッファーで希釈した50
μのノイラミニダーゼと混合し、この混合物を37℃に
て16時間インキュベートした。血清−酵素混合物を次に
等容量の、0.5％BSAを含む、pH8の50mMトリス（Tris）
で希釈して反応を停止した。次いで、この混合物を更に
W1またはONC−M8抗体（夫々1:200および1:100なる最終
濃度で）を用いて以下に述べるようにDDIAアッセイに対
し最適の希釈率まで希釈した。
血清中の処理抗原の検出 全血々清中に存在するムチン抗原を処理するための本
発明の方法の応用は、W1およびONC−M8抗体および16名
の癌患者および17人の正常な患者からの血清を用い、DD
IAで立証した。このDDIAで使用する手順は以下の通りで
あった。このアッセイは上記のようにして調製した血清
（個々のサンプルおよびプールしたサンプル両者）につ
き実施した。イムロン（Immulon）II〔ダイナテックラ
ボラトリーズ チャンティリー，バージニア（Dynatech
Laboratories,Chantilly,VA）プレートを10μ/mlのW
1抗体溶液（0.05Mトリスバッファー0.05ml中に0.5μ
の抗体を含む、pH8.0）50μ／ウエルと共に23℃にて
１時間インキュベートして該プレートを被覆した。次
に、このプレートを吸引し、かつ200μ／ウエルの遮
断バッファー（トリス中に0.5％のBSA（ウシ血清アルブ
ミン）および５％のスクロースを含む、pH8.0）を用い
て23℃にて１時間〜一夜遮断した。このプレートを、次
に再度吸引し、タオルでブロットした。
発明の方法の応用は、W1およびONC−M8抗体および16名
の癌患者および17人の正常な患者からの血清を用い、DD
IAで立証した。このDDIAで使用する手順は以下の通りで
あった。このアッセイは上記のようにして調製した血清
（個々のサンプルおよびプールしたサンプル両者）につ
き実施した。イムロン（Immulon）II〔ダイナテックラ
ボラトリーズ チャンティリー，バージニア（Dynatech
Laboratories,Chantilly,VA）プレートを10μ/mlのW
1抗体溶液（0.05Mトリスバッファー0.05ml中に0.5μ
の抗体を含む、pH8.0）50μ／ウエルと共に23℃にて
１時間インキュベートして該プレートを被覆した。次
に、このプレートを吸引し、かつ200μ／ウエルの遮
断バッファー（トリス中に0.5％のBSA（ウシ血清アルブ
ミン）および５％のスクロースを含む、pH8.0）を用い
て23℃にて１時間〜一夜遮断した。このプレートを、次
に再度吸引し、タオルでブロットした。
腫瘍および正常患者のプールしたまたは個々のサンプ
ルからの希薄血清（1:200（W1）;1:100（ONC−M8））コ
ントロールおよび標準液50μを該被覆プレートにピペ
ットで注入した。このプレートを密封し、室温にて１時
間インキュベートした。次いで、該プレートをリン酸緩
衝塩水（PBS）バッファー中の２％FCS（仔牛血清アルブ
ミン）を用いて２度手作業で洗った。次に、適当な、W1
−HRP、ONC−M8−HRP、W1−125IまたはONC−M8−125I抗
体複合体の希薄液を該プレートに加えた。HRPまたは125
I抗体複合体を濃度0.5μg/mlで用いた。このプレートを
再密封し、室温にて１時間インキュベートした。次に、
このプレートをPBSで手作業で３回洗った。W1−HRPおよ
びONC−M8−HRP複合体の結合は、0.0075％（v/v）H2O2
を含み、pH5.0の100mMクエン酸ナトリウム中で濃度0.5m
g/mlの下でOPD溶液（100μ）〔ジムドラポラトリーズ
社、サンフランシスコ、カリフォルニア（Zymed Labora
tories Inc.,San Francisco,California）〕を添加する
ことにより検出した。基質と酵素との反応の結果黄色が
生じた。100μのOPD基質は暗所で１時間インキュベー
トすることにより反応され、かつ1.5N硫酸（H2SO4）100
μを用いて停止された。この酵素基質反応はマイクロ
ウエルプレートリーダ〔ジェネティック システム社
（Genetic Systems Corp.），シアトル，ワシントン〕
を用いて、490nmでの光学密度（O.D.）の単位で読取ら
れた。125I−複合体の結合はガンマ計数器で検出した。
標準液もW1およびONC−M8抗体につき、ムチン抗原含有
滲出液を容量的に希釈することにより作製した。これら
標準液はコントロール血清のプールに20U/mlなる値を与
えることにより較正した。標準液およびコントロールを
分け、−70℃で保存した。
ルからの希薄血清（1:200（W1）;1:100（ONC−M8））コ
ントロールおよび標準液50μを該被覆プレートにピペ
ットで注入した。このプレートを密封し、室温にて１時
間インキュベートした。次いで、該プレートをリン酸緩
衝塩水（PBS）バッファー中の２％FCS（仔牛血清アルブ
ミン）を用いて２度手作業で洗った。次に、適当な、W1
−HRP、ONC−M8−HRP、W1−125IまたはONC−M8−125I抗
体複合体の希薄液を該プレートに加えた。HRPまたは125
I抗体複合体を濃度0.5μg/mlで用いた。このプレートを
再密封し、室温にて１時間インキュベートした。次に、
このプレートをPBSで手作業で３回洗った。W1−HRPおよ
びONC−M8−HRP複合体の結合は、0.0075％（v/v）H2O2
を含み、pH5.0の100mMクエン酸ナトリウム中で濃度0.5m
g/mlの下でOPD溶液（100μ）〔ジムドラポラトリーズ
社、サンフランシスコ、カリフォルニア（Zymed Labora
tories Inc.,San Francisco,California）〕を添加する
ことにより検出した。基質と酵素との反応の結果黄色が
生じた。100μのOPD基質は暗所で１時間インキュベー
トすることにより反応され、かつ1.5N硫酸（H2SO4）100
μを用いて停止された。この酵素基質反応はマイクロ
ウエルプレートリーダ〔ジェネティック システム社
（Genetic Systems Corp.），シアトル，ワシントン〕
を用いて、490nmでの光学密度（O.D.）の単位で読取ら
れた。125I−複合体の結合はガンマ計数器で検出した。
標準液もW1およびONC−M8抗体につき、ムチン抗原含有
滲出液を容量的に希釈することにより作製した。これら
標準液はコントロール血清のプールに20U/mlなる値を与
えることにより較正した。標準液およびコントロールを
分け、−70℃で保存した。
結 果 第１図に示したように、125I−標準ONC−M8抗体は、
正常な患者由来のプールした血清中のONC−M8抗体の結
合と比較して、乳癌患者由来のプールした腫瘍血清中に
存在するノイラミニダーゼ処理したムチン抗原に対する
高い結合性を示した。他方、125I−標識W1抗体は、ノイ
ラミニダーゼの濃度が増すにつれて、正常なプールした
血清中の抗原に結合するW1抗体の能力と比較して、乳癌
患者からのプールした血清中にあるムチン抗原を結合す
る能力が低いことが立証された。ONC−M8抗体は、W1抗
体と比較して、ノイラミニダーゼ濃度の増大に伴って、
正常なプールされた血清中の抗原に対しわずかに高い結
合性を示した。しかし、正常な血清とONC−M8との結合
の増加は、ノイラミニダーゼ処理後の腫瘍血清とのNC−
M8との結合の増加よりも低い。このことは、ムチン抗
原、例えばONC−M8上のいくつかの結合サイトの検出
が、ノイラミニダーゼで全血々清を処理することにより
容易なものとし得ることを示している。
正常な患者由来のプールした血清中のONC−M8抗体の結
合と比較して、乳癌患者由来のプールした腫瘍血清中に
存在するノイラミニダーゼ処理したムチン抗原に対する
高い結合性を示した。他方、125I−標識W1抗体は、ノイ
ラミニダーゼの濃度が増すにつれて、正常なプールした
血清中の抗原に結合するW1抗体の能力と比較して、乳癌
患者からのプールした血清中にあるムチン抗原を結合す
る能力が低いことが立証された。ONC−M8抗体は、W1抗
体と比較して、ノイラミニダーゼ濃度の増大に伴って、
正常なプールされた血清中の抗原に対しわずかに高い結
合性を示した。しかし、正常な血清とONC−M8との結合
の増加は、ノイラミニダーゼ処理後の腫瘍血清とのNC−
M8との結合の増加よりも低い。このことは、ムチン抗
原、例えばONC−M8上のいくつかの結合サイトの検出
が、ノイラミニダーゼで全血々清を処理することにより
容易なものとし得ることを示している。
17名の正常なヒトおよび乳癌にかかっている患者（16
名）からの個々の血清サンプルを1mUのノイラミニダー
ゼで処理した場合、125I−標識ONC−M8抗体により検出
される抗原の濃度はすべての乳癌患者につき増大してい
ることが観察され、第１図に示した結果をもたらす。正
常なヒトからの個々のサンプル中の抗原に対する結合も
増大した（第２図参照）。
名）からの個々の血清サンプルを1mUのノイラミニダー
ゼで処理した場合、125I−標識ONC−M8抗体により検出
される抗原の濃度はすべての乳癌患者につき増大してい
ることが観察され、第１図に示した結果をもたらす。正
常なヒトからの個々のサンプル中の抗原に対する結合も
増大した（第２図参照）。
これらの結果は、血清実験において、腫瘍関連抗原の
存在は、血清サンプルをノイラミニダーゼで処理した場
合には、対象の大きな比率においてある抗体によって
（アッセイにおける“正”の結果として）検出できるこ
とを示唆している。
存在は、血清サンプルをノイラミニダーゼで処理した場
合には、対象の大きな比率においてある抗体によって
（アッセイにおける“正”の結果として）検出できるこ
とを示唆している。
実施例2: ノイラミニダーゼで処理した精製抗原に対する抗体結
合 精製ムチン ムチンを、EP268,279−Ａ記載の如く、正常なヒトの
ミルク、癌患者からの複数の滲出液および抽出した乳腫
瘍から精製した。簡単にいえば、ミルクは搾乳ポンプを
用いて癌にかかっていない供与者から得た。サンプルは
収集後５〜10分以内に凍結した、乳癌患者からの滲出液
はバージニア メースン ホスピタル（Virginia,Mason
Hospital）シアトル，ワシントンから得た。滲出液は
−20℃で凍結して保存した。このムチンを、クリース
（Creth）等のバイオケミカル ジャーナル（Biochem.
J.）,1977,167,pp.557−569に記載の方法を改良して用
いて精製した。全乳および滲出液を解凍し、グアニジン
H Cl（ユナイテッド ステーツ バイオケミカル社（Un
ited States Biochemical Corp.），クリーブランド，
オハイオ）を最終濃度6Mとなるまで加え、この混合物を
透明になるまで撹拌した。塩化セシウム勾配精製、アフ
ィニティークロマトグラフィーおよびSDS−PAGEを、EP.
268,279−Ａ記載のように、ミルクおよび滲出液につい
て行った。
合 精製ムチン ムチンを、EP268,279−Ａ記載の如く、正常なヒトの
ミルク、癌患者からの複数の滲出液および抽出した乳腫
瘍から精製した。簡単にいえば、ミルクは搾乳ポンプを
用いて癌にかかっていない供与者から得た。サンプルは
収集後５〜10分以内に凍結した、乳癌患者からの滲出液
はバージニア メースン ホスピタル（Virginia,Mason
Hospital）シアトル，ワシントンから得た。滲出液は
−20℃で凍結して保存した。このムチンを、クリース
（Creth）等のバイオケミカル ジャーナル（Biochem.
J.）,1977,167,pp.557−569に記載の方法を改良して用
いて精製した。全乳および滲出液を解凍し、グアニジン
H Cl（ユナイテッド ステーツ バイオケミカル社（Un
ited States Biochemical Corp.），クリーブランド，
オハイオ）を最終濃度6Mとなるまで加え、この混合物を
透明になるまで撹拌した。塩化セシウム勾配精製、アフ
ィニティークロマトグラフィーおよびSDS−PAGEを、EP.
268,279−Ａ記載のように、ミルクおよび滲出液につい
て行った。
ノイラミニダーゼ処理 精製ムチンに対し、コレラ菌（Vibrio cholerae:カル
ビオケム ブランド バイオケミカルズ（CALBIOCHEM B
rand Biochemicals），ラジョラ、カルフォルニア）か
ら単離したノイラミニダーゼ酵素、10阻害単位／ウエル
〔リンスレー（Linsley）等、キャンサ リサーチ（Can
cer Res.）,1986,46,pp.5444−5450〕を50mM酢酸ナトリ
ウムバッファー（0.15M NaCl,50mM酢酸ナトリウム、pH
5.5、0.1％CaCl2および0.1％NaN3）中に溶解した（“ノ
イラミニダーゼ処理バッファーpH5.5）。NaN3の存在は3
70℃でのインキュベーション中微生物の育成を制限する
のに必要であり、NaN3はこのアッセイの再現性を改善し
た。精製ムチンを、ディオン（Dion）等のバイオテクニ
ックス（Biotechniques），（1983年,9月）に記載され
ているように、ポリーＬ−リジンでプラスチックプレー
ト上に固定した。上記文献を本発明の参考資料とする。
消化は、ウエル当たり0.002〜1mUの範囲で変化する酵素
濃度を用いて、37℃にて1.5時間行った。消化を、pHを
７〜８に上げて約16時間インキュベートした後、プレー
トを洗浄することにより停止した。消化の時間は、バッ
ファーのノイラミニダーゼ濃度を0.5U/mlまで増大して
滴定し、処理ムチン抗原に対する抗体W1およびONC−M8
の結合を観察することにより予め決定した。
ビオケム ブランド バイオケミカルズ（CALBIOCHEM B
rand Biochemicals），ラジョラ、カルフォルニア）か
ら単離したノイラミニダーゼ酵素、10阻害単位／ウエル
〔リンスレー（Linsley）等、キャンサ リサーチ（Can
cer Res.）,1986,46,pp.5444−5450〕を50mM酢酸ナトリ
ウムバッファー（0.15M NaCl,50mM酢酸ナトリウム、pH
5.5、0.1％CaCl2および0.1％NaN3）中に溶解した（“ノ
イラミニダーゼ処理バッファーpH5.5）。NaN3の存在は3
70℃でのインキュベーション中微生物の育成を制限する
のに必要であり、NaN3はこのアッセイの再現性を改善し
た。精製ムチンを、ディオン（Dion）等のバイオテクニ
ックス（Biotechniques），（1983年,9月）に記載され
ているように、ポリーＬ−リジンでプラスチックプレー
ト上に固定した。上記文献を本発明の参考資料とする。
消化は、ウエル当たり0.002〜1mUの範囲で変化する酵素
濃度を用いて、37℃にて1.5時間行った。消化を、pHを
７〜８に上げて約16時間インキュベートした後、プレー
トを洗浄することにより停止した。消化の時間は、バッ
ファーのノイラミニダーゼ濃度を0.5U/mlまで増大して
滴定し、処理ムチン抗原に対する抗体W1およびONC−M8
の結合を観察することにより予め決定した。
結 合 抗体W1、M8、L17、C6および1B2を、上記のように、プ
ラスチックプレートに付着した、ノイラミニダーゼ処理
した抗原に結合するためのテストに付された。結合抗体
は間接ELISAにより検出し、ここでセイヨウワサビパー
オキシダーゼ（HRP）−複合山羊抗マウス免疫グロブリ
ン（カッペル（Cappel）、マルバーン、ペンシルベーニ
ア）をプレートに加えた。結合HRP複合体を基質、Ｏ−
フェニレンジアミン（“OPD"）（ジェネティック シス
テムズ社（Genetic Systemy Corp.），シアトル，ワシ
ントン）と共に23℃にて５〜60分インキュベートして定
量した。次いで、この反応を、等容量の1.3NH2SO4を加
えて停止させた。490nm（OPD）における吸収を、マイク
ロウエル プレート リーダ（上述のジェネティック
システムズ社）で測定した。その値はミリ吸収単位（A
490×1000）で報告し、かつ添加モノクローナル抗体の
ない時のバックグラウンド吸収率に対する補正を行った
２度の測定の平均を表す。２度の測定は一般に10％以下
で変動した。
ラスチックプレートに付着した、ノイラミニダーゼ処理
した抗原に結合するためのテストに付された。結合抗体
は間接ELISAにより検出し、ここでセイヨウワサビパー
オキシダーゼ（HRP）−複合山羊抗マウス免疫グロブリ
ン（カッペル（Cappel）、マルバーン、ペンシルベーニ
ア）をプレートに加えた。結合HRP複合体を基質、Ｏ−
フェニレンジアミン（“OPD"）（ジェネティック シス
テムズ社（Genetic Systemy Corp.），シアトル，ワシ
ントン）と共に23℃にて５〜60分インキュベートして定
量した。次いで、この反応を、等容量の1.3NH2SO4を加
えて停止させた。490nm（OPD）における吸収を、マイク
ロウエル プレート リーダ（上述のジェネティック
システムズ社）で測定した。その値はミリ吸収単位（A
490×1000）で報告し、かつ添加モノクローナル抗体の
ない時のバックグラウンド吸収率に対する補正を行った
２度の測定の平均を表す。２度の測定は一般に10％以下
で変動した。
結 果 第３図に示したように、精製ミルクムチンに対するON
C−M8抗体の結合はノイラミニダーゼ濃度を増してもそ
れ程変動しなかった。また、既に報告されているように
〔リンスレー（Linsley）等，キャンサ リサーチ（Cen
cer Res.）,1986,46,pp.6380−6386〕、W1抗体の係合は
ノイラミニダーゼの濃度の増大に伴って減少した。しか
し、ONC−M8抗体は、サンプルが増大する濃度のノイラ
ミニダーゼで消化された場合（第４図）、胸膜滲出液か
ら精製されたムチンに対して高い結合性を示した。これ
らのデータは、W1エピトープはノイラミニダーゼ感受性
でW1抗体の低い結合性を与えるが、ONC−M8抗体により
認識されるエピトープはノイラミニダーゼ処理で露出
し、結果としてONC−M8抗体の高い抗体をもたらすこと
を示している。この結果は、また腫瘍関連ムチンが正常
なムチンよりも高度にシアル酸化されているかも知れな
いことをも示唆する。
C−M8抗体の結合はノイラミニダーゼ濃度を増してもそ
れ程変動しなかった。また、既に報告されているように
〔リンスレー（Linsley）等，キャンサ リサーチ（Cen
cer Res.）,1986,46,pp.6380−6386〕、W1抗体の係合は
ノイラミニダーゼの濃度の増大に伴って減少した。しか
し、ONC−M8抗体は、サンプルが増大する濃度のノイラ
ミニダーゼで消化された場合（第４図）、胸膜滲出液か
ら精製されたムチンに対して高い結合性を示した。これ
らのデータは、W1エピトープはノイラミニダーゼ感受性
でW1抗体の低い結合性を与えるが、ONC−M8抗体により
認識されるエピトープはノイラミニダーゼ処理で露出
し、結果としてONC−M8抗体の高い抗体をもたらすこと
を示している。この結果は、また腫瘍関連ムチンが正常
なムチンよりも高度にシアル酸化されているかも知れな
いことをも示唆する。
コアおよび周辺エピトープと反応性の抗体、即ちL1
7、C6および1B2の精製胸膜滲出物ムチンに対する結合性
に及ぼすノイラミニダーゼ処理の影響は、W1およびONC
−M8の結合をテストするのに用いた手法に従って調べら
れた。結果を第１表に示す。
7、C6および1B2の精製胸膜滲出物ムチンに対する結合性
に及ぼすノイラミニダーゼ処理の影響は、W1およびONC
−M8の結合をテストするのに用いた手法に従って調べら
れた。結果を第１表に示す。
ポリラクトースアミンの分岐鎖（C6）および線状（1B
2）異性体を認識する抗体C6および1B2の結合は、第１表
に示すように、ノイラミニダーゼによって増進された。
これらの成分は骨格炭水化物構造である。これら両抗体
の胸膜滲出物ムチンに対する結合はノイラミニダーゼ処
理によって増進されるが、このことは腫瘍患者からの血
清中のムチン上のコア構造に対する抗体の結合はシアル
酸を除く処理によって増進され得ることを示している。
2）異性体を認識する抗体C6および1B2の結合は、第１表
に示すように、ノイラミニダーゼによって増進された。
これらの成分は骨格炭水化物構造である。これら両抗体
の胸膜滲出物ムチンに対する結合はノイラミニダーゼ処
理によって増進されるが、このことは腫瘍患者からの血
清中のムチン上のコア構造に対する抗体の結合はシアル
酸を除く処理によって増進され得ることを示している。
Lexエピトープはシアル酸化および非シアル酸化状態
両方で存在する。非シアル酸化形状はL17抗体によって
認識される〔ヘルストローム（Helllstrom）等，キャン
サ リサーチ（Cancer Res.）,1986,46,3917−3923〕。
L17抗体の結合もノイラミニダーゼ処理後高められた。
非シアル酸化周辺構造を認識する抗体は、従って通常シ
アル酸隠蔽されているエピトープを検出するために、ノ
イラミニダーゼで処理することにより、利用できる。
両方で存在する。非シアル酸化形状はL17抗体によって
認識される〔ヘルストローム（Helllstrom）等，キャン
サ リサーチ（Cancer Res.）,1986,46,3917−3923〕。
L17抗体の結合もノイラミニダーゼ処理後高められた。
非シアル酸化周辺構造を認識する抗体は、従って通常シ
アル酸隠蔽されているエピトープを検出するために、ノ
イラミニダーゼで処理することにより、利用できる。
実施例３ ヒト血清中のムチンに結合し得る抗体の検出のために
WGA（コムギ胚芽凝集素）捕獲アッセイを利用した。こ
のアッセイはEP第268,279号（これを本発明の参考文献
とする）に記載されている。正常なヒトおよび種々の腫
瘍（第２表参照）をわずらっている患者からの血清中の
ムチンは96ウエルの、平底形、ポリスチレンマイクロウ
エルプレート（イムロン（Immulon）II、ダイナテック
ラボラトリーズ社（Dynatech Laboratories Inc.），
アレキサンドリア，バージニア）上にトリチカム ブル
ガリス（Triticum vulgaris）レクチン（コムギ胚芽凝
集素“WGA";シグマ社（Sigma Chemical Co.），セント
ルイス，ミズーリー）を用いて固定化された。このマイ
クロウエルプレートは、pH8.0で10mMのCaCl2および10mM
のMgCl2を含む50mMトリス−HCl中にWGAを溶した20μg/m
l濃度の溶液50μ／ウエルを添加することにより調製
された。25℃にて２時間インキュベーションして該プレ
ートをWGAで被覆した後、溶液を吸収により除いた。癌
患者からの血清サンプルまたは正常なコントロールを、
pH8.0で1mM CaCl2および1mM MgCl2を含む50mMトリス−H
Clバッファー中で、1:50に希釈して、プレートに加え
た。次いでこのプレートを25℃にて１〜４時間インキュ
ベート、PBSおよび２％FCSのバッファーで洗浄する。
WGA（コムギ胚芽凝集素）捕獲アッセイを利用した。こ
のアッセイはEP第268,279号（これを本発明の参考文献
とする）に記載されている。正常なヒトおよび種々の腫
瘍（第２表参照）をわずらっている患者からの血清中の
ムチンは96ウエルの、平底形、ポリスチレンマイクロウ
エルプレート（イムロン（Immulon）II、ダイナテック
ラボラトリーズ社（Dynatech Laboratories Inc.），
アレキサンドリア，バージニア）上にトリチカム ブル
ガリス（Triticum vulgaris）レクチン（コムギ胚芽凝
集素“WGA";シグマ社（Sigma Chemical Co.），セント
ルイス，ミズーリー）を用いて固定化された。このマイ
クロウエルプレートは、pH8.0で10mMのCaCl2および10mM
のMgCl2を含む50mMトリス−HCl中にWGAを溶した20μg/m
l濃度の溶液50μ／ウエルを添加することにより調製
された。25℃にて２時間インキュベーションして該プレ
ートをWGAで被覆した後、溶液を吸収により除いた。癌
患者からの血清サンプルまたは正常なコントロールを、
pH8.0で1mM CaCl2および1mM MgCl2を含む50mMトリス−H
Clバッファー中で、1:50に希釈して、プレートに加え
た。次いでこのプレートを25℃にて１〜４時間インキュ
ベート、PBSおよび２％FCSのバッファーで洗浄する。
アッセイを行うために、モノクローナル抗体L17（ATC
CNo.HB8739）、ONC−M8およびC6を１μ/mlの濃度で加
えた。
CNo.HB8739）、ONC−M8およびC6を１μ/mlの濃度で加
えた。
血清中の捕獲ムチンに対する抗体の結合は、DDIAにつ
き上述したようにOPDを用いおよび吸収（A490×1000）
を測定することにより検出した。結果を第２表に総め
る。
き上述したようにOPDを用いおよび吸収（A490×1000）
を測定することにより検出した。結果を第２表に総め
る。
第２表から理解されるように、ノイラミニダーゼ処理
後検出されるエピトープの量は、抗体L17、ONC−M8およ
びC6につき大巾に増大した。更に、これら抗体は、酵素
で処理した後の正常なエピトープの検出量の増大と比し
て、ノイラミニダーゼ処理した後の腫瘍関連エピトープ
をより一層多量に検出することが立証された。抗体1B2
は血清アッセイではテストしなかった。しかし、1B2の
ムチンに対する結合はノイラミニダーゼ処理後増大（第
１表）したので、1B2により認識される“i"エピトープ
に対する血清アッセイの感度は、ノイラミニダーゼ処理
後同様に改善されるであろうと思われる。
後検出されるエピトープの量は、抗体L17、ONC−M8およ
びC6につき大巾に増大した。更に、これら抗体は、酵素
で処理した後の正常なエピトープの検出量の増大と比し
て、ノイラミニダーゼ処理した後の腫瘍関連エピトープ
をより一層多量に検出することが立証された。抗体1B2
は血清アッセイではテストしなかった。しかし、1B2の
ムチンに対する結合はノイラミニダーゼ処理後増大（第
１表）したので、1B2により認識される“i"エピトープ
に対する血清アッセイの感度は、ノイラミニダーゼ処理
後同様に改善されるであろうと思われる。
本発明は疾病または感染と関連したリガンドを含む抗
原などのリガンドを処理して、処理しないと抗−リガン
ドとの係合には利用されずに残される免疫結合サイトを
露出する方法を提供する。かくして、疾病または感染に
関連したリガンド上に固有に表現され得る結合サイト
を、イムノアッセイにおいて抗−リガンドに結合し得る
ものとして、ヒト対象中の癌などの疾病の存在を検知す
ることを可能とする。特に、本発明のリガンドの処理方
法の重要な局面は、該リガンドが未精製形状で直接処理
できること、即ち全血々清、尿、痰および滲出物などの
体液サンプル中に存在するリガンドに直接処理してその
上の結合サイトの検出を改善できることにある。
原などのリガンドを処理して、処理しないと抗−リガン
ドとの係合には利用されずに残される免疫結合サイトを
露出する方法を提供する。かくして、疾病または感染に
関連したリガンド上に固有に表現され得る結合サイト
を、イムノアッセイにおいて抗−リガンドに結合し得る
ものとして、ヒト対象中の癌などの疾病の存在を検知す
ることを可能とする。特に、本発明のリガンドの処理方
法の重要な局面は、該リガンドが未精製形状で直接処理
できること、即ち全血々清、尿、痰および滲出物などの
体液サンプル中に存在するリガンドに直接処理してその
上の結合サイトの検出を改善できることにある。
本発明を好ましい態様に従って記載してきたが、前記
の明細書の記載を読めば当業者はここに開示の組成物並
びに方法に様々な変更、等価なものでの置換並びに変化
を加えることができるであろう。従って、本発明に許さ
れる保護範囲は上記特許請求の範囲並びにその等価なも
のによってのみ制限される。
の明細書の記載を読めば当業者はここに開示の組成物並
びに方法に様々な変更、等価なものでの置換並びに変化
を加えることができるであろう。従って、本発明に許さ
れる保護範囲は上記特許請求の範囲並びにその等価なも
のによってのみ制限される。
第１図は、増大するノイラミニダーゼ濃度の関数とし
て、正常なヒトからのプールした血清中に存在する抗原
に対するONC−M8およびW1抗体の結合を、乳癌のヒトか
らのプールした血清中に存在する抗原に対する抗体の結
合と比較して示した図であり、 第２図は、ノイラミニダーゼで処理した後の、正常なヒ
トおよび乳癌のヒトからの夫々の血清サンプル中に存在
する抗原に対するONC−M8抗体の結合についてのチャー
トであり、 第３図は精製ミルクムチンに対する抗体ONC−M8およびW
1抗体の結合を、増大するノイラミニダーゼ濃度の関数
として示したグラフであり、および 第４図は、ノイラミニダーゼ濃度の増大に伴う、胸膜滲
出液ムチンに対する抗体ONC−M8およびW1の結合を示す
グラフである。
て、正常なヒトからのプールした血清中に存在する抗原
に対するONC−M8およびW1抗体の結合を、乳癌のヒトか
らのプールした血清中に存在する抗原に対する抗体の結
合と比較して示した図であり、 第２図は、ノイラミニダーゼで処理した後の、正常なヒ
トおよび乳癌のヒトからの夫々の血清サンプル中に存在
する抗原に対するONC−M8抗体の結合についてのチャー
トであり、 第３図は精製ミルクムチンに対する抗体ONC−M8およびW
1抗体の結合を、増大するノイラミニダーゼ濃度の関数
として示したグラフであり、および 第４図は、ノイラミニダーゼ濃度の増大に伴う、胸膜滲
出液ムチンに対する抗体ONC−M8およびW1の結合を示す
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダイアン ホーン アメリカ合衆国 ワシントン州 98109 シアトル 404 ウェスト オリンピ ック プレイス 202 (72)発明者 ジョセフ ピー ブラウン アメリカ合衆国 ワシントン州 98109 シアトル ニュートン ストリート 409 (56)参考文献 特表 昭63−500891（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/574 C12Q 1/34 Ｂｉｏｓｉｓ Ｐｒｅｖｉｅｗｓ
Claims (15)
- 【請求項１】哺乳動物から採取した流体サンプル中に未
精製状態で存在する標的リガンドに対する免疫学的結合
を増進する方法であって、該リガンドを処理して、該リ
ガンド上の結合サイトを阻害する周辺物質を除去する工
程を含み、該リガンドがムチン抗原であることを特徴と
する上記方法。 - 【請求項２】上記流体サンプルが血清、滲出液、尿およ
び痰からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】上記除去が該リガンドを酵素処理すること
を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項４】該酵素がノイラミニダーゼ酵素である請求
項３記載の方法。 - 【請求項５】流体サンプル中に存在する標的リガンドに
対する抗−リガンドの免疫学的結合を検出するための改
良アッセイであって、 （ａ） 標的リガンドから免疫学的結合を阻害する物質
を除去して、抗−リガンド結合サイトを露出させ、ここ
で該リガンドはムチン抗原であり、 （ｂ） 該物質の除去後の該リガンドを、検出し得るよ
うに標識した抗−リガンドと接触させ、かつ （ｃ） 該リガンドに結合した標識抗−リガンドを検出
する工程を含むことを特徴とする上記アッセイ。 - 【請求項６】上記物質の除去工程が該リガンドを酵素処
理することを含む請求項５記載のアッセイ。 - 【請求項７】該酵素処理工程が、該リガンドを有効量の
ノイラミニダーゼ酵素で消化することを含む請求項６記
載のアッセイ。 - 【請求項８】流体サンプル中に存在するムチン抗原であ
る標的リガンドに対して、ATCCNo.HB9209および同HB873
9の特性をもつハイブリドーマにより産生されたモノク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体C6および1B2か
らなる群から選ばれるモノクローナル抗体である抗−リ
ガンドの免疫学的結合を検出するための改良アッセイで
あって、 （ａ） 標的リガンドから免疫学的結合を阻害する物質
を除去して、抗−リガンド結合サイトを露出させ、 （ｂ） 該物質の除去後の該リガンドを、検出し得るよ
うに標識した抗−リガンドと接触させ、かつ （ｃ） 該リガンドに結合した標識抗−リガンドを検出
する工程を含むことを特徴とする上記アッセイ。 - 【請求項９】（ａ） 流体サンプル中に存在するムチン
抗原からシアル酸を除去して、該抗原上の結合サイトを
露出させ、 （ｂ） 該ムチン抗原を基質上に固定し、 （ｃ） 該固定化ムチン抗原をモノクローナル抗体と接
触させ、および （ｄ） 該抗原に結合した抗体を検出する、 各工程を含むことを特徴とする、ムチン抗原の存在を検
出する免疫アッセイ。 - 【請求項１０】上記シアル酸の除去工程が、該ムチン抗
原と、有効量のノイラミニダーゼ酵素とを接触させるこ
とを含む請求項９記載のアッセイ。 - 【請求項１１】上記ムチン抗原の固定化工程が、該抗原
を上記基質に付着した抗体に結合させる工程を含み、該
抗体が該抗原上の少なくとも一つのエピトープと反応性
である請求項９記載のアッセイ。 - 【請求項１２】上記ムチン抗原と接触させるための上記
抗体がATCCNo.HB9209および同HB8739の特徴をもつハイ
ブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体および
モノクローナル抗体C6および1B2からなる群から選ばれ
るモノクローナル抗体である請求項９記載のアッセイ。 - 【請求項１３】上記サンプルが血清、滲出液、尿および
痰からなる群から選ばれる流体サンプルである請求項９
記載のアッセイ。 - 【請求項１４】未精製のリガンドの存在につき流体サン
プルをアッセイするための診断用テテストキットであっ
て、 （ａ） 該サンプル中に存在する標的リガンドムチンと
免疫学的に反応性の抗−リガンド、および （ｂ） 該サンプル中の標的リガンドから物質を除去し
て、抗−リガンド結合サイトを露出させるためのノイラ
ミニダーゼ酵素 を含むことを特徴とする上記診断用テストキット。 - 【請求項１５】哺乳動物から採取した流体サンプル中に
未精製状態で存在する標的リガンドに対する免疫学的結
合を増進する方法であって、該リガンドを処理して、該
リガンド上の結合サイトを阻害する周辺物質を除去する
工程を含み、該流体サンプルが血清、滲出液、尿および
痰からなる群から選ばれ、周辺物質の除去が該リガンド
の酵素処理により行われ、該酵素がノイラミニダーゼ酵
素であり、かつ該リガンドがムチン抗原であることを特
徴とする上記方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10704087A | 1987-10-09 | 1987-10-09 | |
| US107040 | 1987-10-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01237454A JPH01237454A (ja) | 1989-09-21 |
| JP2779178B2 true JP2779178B2 (ja) | 1998-07-23 |
Family
ID=22314537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63255735A Expired - Fee Related JP2779178B2 (ja) | 1987-10-09 | 1988-10-11 | 標的リガンド用アッセイの感度を高める方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5646002A (ja) |
| EP (1) | EP0313244B1 (ja) |
| JP (1) | JP2779178B2 (ja) |
| AT (1) | ATE123148T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340927C (ja) |
| DE (1) | DE3853866T2 (ja) |
| ES (1) | ES2073402T3 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0316764B1 (en) * | 1987-11-20 | 1994-06-08 | Abbott Laboratories | Detection of tumor-associated markers in biological fluids |
| EP0491867B1 (en) * | 1989-09-15 | 1996-11-27 | Genetic Systems Corporation | Hybridoma ct43 producing a monoclonal antibody to a mucin epitope of colorectal cancer |
| GB9304979D0 (en) * | 1993-03-11 | 1993-04-28 | Sinvent As | Imobilisation and separation of cells and other particles |
| JP2001508647A (ja) * | 1996-11-04 | 2001-07-03 | メルク フロスト カナダ アンド カンパニー | ヒドロラーゼ結合アッセイ |
| US7407773B2 (en) * | 2000-11-03 | 2008-08-05 | Procognia, Ltd. | Method for characterizing a carbohydrate polymer |
| US7682794B2 (en) * | 2003-07-15 | 2010-03-23 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and analyzing N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) in biological materials |
| AU2004299992B2 (en) * | 2003-12-18 | 2011-03-24 | Procognia Ltd. | Method for analyzing a glycomolecule |
| JP5066615B2 (ja) * | 2011-01-31 | 2012-11-07 | 株式会社日立製作所 | フェニルボロン酸基と特異的に結合するオリゴペプチド配列 |
| WO2013151649A1 (en) | 2012-04-04 | 2013-10-10 | Sialix Inc | Glycan-interacting compounds |
| PT3218005T (pt) | 2014-11-12 | 2023-04-11 | Seagen Inc | Compostos que interagem com glicano e métodos de uso |
| SG11201803213XA (en) | 2015-11-12 | 2018-05-30 | Siamab Therapeutics Inc | Glycan-interacting compounds and methods of use |
| WO2018094143A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
| KR20240044544A (ko) | 2017-03-03 | 2024-04-04 | 씨젠 인크. | 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4116776A (en) * | 1976-04-19 | 1978-09-26 | International Radioimmune Systems, Inc. | Diagnostic blood test and kit for detecting human chorionic gonadotropin |
| US4146603A (en) * | 1977-02-18 | 1979-03-27 | Research Corporation | Tumor specific glycoproteins and method for detecting tumorigenic cancers |
| JPS57184970A (en) * | 1981-05-08 | 1982-11-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method for hcg |
| US4762800A (en) * | 1984-04-26 | 1988-08-09 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to cell surface antigens of human teratocarcinomas |
| US4708930A (en) * | 1984-11-09 | 1987-11-24 | Coulter Corporation | Monoclonal antibody to a human carcinoma tumor associated antigen |
| US4743543A (en) * | 1985-09-09 | 1988-05-10 | Coulter Corporation | Method for enhancing and/or accelerating immunoassay detection of human carcinoma tumor associated antigen in a pathology sample |
| FR2590674B1 (fr) * | 1985-11-25 | 1989-03-03 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux reactifs de diagnostic |
| EP0316764B1 (en) * | 1987-11-20 | 1994-06-08 | Abbott Laboratories | Detection of tumor-associated markers in biological fluids |
-
1988
- 1988-10-07 CA CA000579549A patent/CA1340927C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-10 ES ES88309436T patent/ES2073402T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-10 AT AT88309436T patent/ATE123148T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-10 EP EP88309436A patent/EP0313244B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-10 DE DE3853866T patent/DE3853866T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-11 JP JP63255735A patent/JP2779178B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-02-14 US US08/195,987 patent/US5646002A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0313244B1 (en) | 1995-05-24 |
| ATE123148T1 (de) | 1995-06-15 |
| DE3853866D1 (de) | 1995-06-29 |
| DE3853866T2 (de) | 1995-09-21 |
| JPH01237454A (ja) | 1989-09-21 |
| US5646002A (en) | 1997-07-08 |
| EP0313244A2 (en) | 1989-04-26 |
| ES2073402T3 (es) | 1995-08-16 |
| EP0313244A3 (en) | 1990-08-01 |
| CA1340927C (en) | 2000-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2779178B2 (ja) | 標的リガンド用アッセイの感度を高める方法 | |
| JPH11507130A (ja) | 潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、および１型自己免疫性肝炎のための区別的アッセイ | |
| US20080182282A1 (en) | Methods for comparitive analysis of carbohydrate polymers and carbohydrate polymers identified using same | |
| PL177771B1 (pl) | Linie komórek hybrydoma i preparaty przeciwciał | |
| EP0381450B1 (en) | Assay for bone alkaline phosphatase | |
| JPS63119498A (ja) | 新規なモノクロナル抗体、その製造及び使用 | |
| JPS5811857A (ja) | アデノシンの定量法 | |
| CA2428150C (en) | Methods for comparitive analysis of carbohydrate polymers | |
| JPS6057254A (ja) | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 | |
| US20020119582A1 (en) | Signal enhancement of bispecific antibody-polymer probe for immunoassay use | |
| JPH05500454A (ja) | 結腸癌のムチンエピトープに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマｃｔ４３ | |
| JP7081861B1 (ja) | ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法 | |
| JPH022935A (ja) | アンジオテンシンの測定法 | |
| JPH0580053A (ja) | ヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法 | |
| EP0738890B1 (en) | Method for measuring cholinesterase and method for distinguishing between liver cirrhosis and hepatitis | |
| WO2018143336A1 (ja) | 膵臓癌の検査方法 | |
| JP3345507B2 (ja) | アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬 | |
| JP2878317B2 (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| EP0206779A1 (en) | Detecting antinuclear antibody | |
| JP2925684B2 (ja) | 血小板及び血管内皮細胞の疾病の測定方法 | |
| JPS62238463A (ja) | プラスミン―α２プラスミンインヒビター複合体の測定方法 | |
| JP2868841B2 (ja) | Ｇｍｐ異常症の検出方法及びキット | |
| JPH0322945B2 (ja) | ||
| JPH0921803A (ja) | ２型コラーゲンテロペプチドの測定方法 | |
| JPS6347664A (ja) | 癌抗原測定法及びそのためのキツト |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |