JPH11507130A

JPH11507130A - 潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、および１型自己免疫性肝炎のための区別的アッセイ

Info

Publication number: JPH11507130A
Application number: JP9501255A
Authority: JP
Inventors: ターガン，ステファン; ビドリッチ，アルダ
Original assignee: セダーズ−シナイメディカルセンター
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-06-22
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: EP0846266A4; NZ310079A; DE69626026D1; NO321090B1; WO1996041183A1; JP3386815B2; EP0846266B1; MX9709440A; CA2223642C; NO975688L; ATE231972T1; AU705480B2; DE69626026T2; US5830675A; CA2223642A1; AU6040496A; NO975688D0; IL122480A0; EP0846266A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、または１型自己免疫性肝炎の核周辺抗好中球細胞質抗体の存在または非存在を検出および測定するための方法およびキットに関する。本発明の方法およびキットは、潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、および１型自己免疫性肝炎を診断するための安全かつ信頼性の高い手段を提供する。潰瘍性結腸炎および原発性硬化性胆管炎の核周辺抗好中球細胞質自己抗体に反応性の抗原もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、および１型自己免疫性肝炎のための区別的アッセイ本出願は、先に係属している1994年10月７日に出願した米国特許出願第08/320 ,163号の一部継続出願である。米国特許出願第08/320,163号は、現在では放棄されている、1993年３月10日に出願した米国特許出願第08/028,784号の継続出願である。発明の分野本発明は、潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis）、原発性硬化性胆管炎（prim ary sclerosing cholangitis）、または１型自己免疫性肝炎（type 1 autoimmun e hepatitis）の核周辺抗好中球細胞質抗体（perinuclear anti-neutrophil cyt oplasmic antibody）の存在または非存在を、検出および測定するための方法およびキットに関する。より詳細には、本発明の方法およびキットは、ELISAおよび免疫蛍光法のようなアッセイにおける好中球のDNase処理を用いて、抗体が存在する場合のポジティブコントロール値の消失を誘発する。発明の背景炎症性腸疾患（IBD）は、２つの胃腸障害（gastrointestinal disorder）（潰瘍性結腸炎(「UC」)およびクローン病(「CD」)）を記載するために使用される集合的な用語である。IBDは、世界的に生じ、かつ二百万人もの多くの人々を苦しめていると報告される。発症は全ての年齢で記録されている；しかし、IBDは主に若年成人を冒す。 IBDの最も一般的な３つの主症状は、下痢、腹痛、および発熱である。下痢は、軽症から重症までの範囲であり得、かつしばしば尿意促進および頻度を伴う。 UCでは、下痢は通常観血性であり、かつ粘液および化膿性物質をも含有し得る。貧血および体重の減少は、IBDのさらなる一般的な徴候である。一連の研究室評価、放射線医学評価、および内視鏡評価は、診断を導くため、および疾患の程度および重篤度を評価するために組み合わされる。それにもかかわらず、CD、ならびに他のタイプの腸の炎症状態（例えば、過敏性腸症候群、感染性の下痢、直腸の出血、放射線結腸炎など）からUCを区別するのは困難である。実際に、フォローアップ時間の期間に依存して、多くの患者において、結腸炎は、未定とみなされなければならないか、または最終的に診断され得ない。なぜなら、UCとCD、特に結腸のCDとの特徴が、重なるからである。 CDまたは腸の他の炎症状態に対立するものとしてのUCの選択的同定により、重要な予後徴候含意（implication）および治療的含意がもたらされる。例えば、結腸切除が示される場合、含まれるIBDのタイプにより、どの外科的選択が適切であるかを決定する。外科手術（全結腸切除）は、UCにおける治療を示すが、劇的なものである。CDでは、外科手術は決して治療でない。限定的手順（例えば、回腸直腸貫通（粘膜直腸切除）またはKock嚢）がUCにおいて望ましいかもしれないが、CDにおいては禁忌である。結腸のCDおよび他の大腸炎（colitide）からUCを容易に区別する診断マーカーの有用性は、主な臨床的進歩を示す。疾患の活性と平行し得る、または活性の切迫したフレア（impending flare）を予測さえし得る、便利でかつ信頼性の高い血液試験は、IBDの治療的管理に夥しい利点を提供し、そしてより特異的な処置様相の設計を助ける。 UCおよびCDの原因は未知であるが、免疫系が、これらの疾患における組織損傷を媒介するのに役割を担うという一般的同意が存在する。広範囲の免疫学的異常がこれらの障害において報告されてきたが、診断値として十分に信頼性が高いものはまだ存在しない。種々の自己抗体が、UC患者において観察されている。これらの抗体の中で最も著しいのは、リンパ細胞傷害性抗体および結腸上皮抗体であった。これらは遺伝的含意および病態生理学的含意を有し得たが、これらは診断的には有用ではなかった。なぜなら、低頻度の発生であるか、または特異性がないかのいずれかであるためである。自己免疫病因（eitology）を有するとも疑われる、２つの他の炎症性疾患は、原発性硬化性胆管炎（「PSC」）および１型自己免疫性肝炎（「１型AIH」）である。UCおよびCDと同様に、これらの肝臓病は、AIHおよびPSCに関連する、区別される肝臓異常を同定するために侵襲性技術（例えば、肝生検および／またはERCP ）の使用を必要とする一般的な客観的症状を共有する。 PSCは、肝臓内管の関与を有するか有さない肝臓外胆管の閉塞性炎症性線維症により特徴付けられる。この疾患は、一般に、たとえ予測不可能であっても、たゆまぬ様式で、肝硬変、門脈圧亢進症、および肝不全による死に進行する。PSC は、単独またはUCと関連して、そしてあまり一般的でないが種々の他の疾患と関連して生じ得る。症状は、通常、黄疸、そう痒症(puritis)、および非特異的上部腹痛を含む。PSCの内科療法は、コルチコステロイド、抗生物質、免疫抑制剤、および胆嚢機能促進性物質（cholecystogues）の単独または組合せを含んでいる。一般に、全ての結果は、失望するものであった。 AIHは、病因未知の障害である。この障害では、肝実質の進行性破壊が生じ、しばしば肝硬変に進行し、そしてより重篤な場合は、その保因者は処置されなければ死亡率が高い。この疾患は女性に優勢であるとはいえ、男性をも冒す。容易な疲労性が、最も一般的な主症状であり、かつ患者の77％までもが、黄疸の特徴を記載し、腹部の軽い不快感、そう痒症、食欲不振、多発性筋痛、下痢、および遅延型初潮または無月経が、頻繁な病訴である。美容的な変化（顔面の丸み、多毛症、および座瘡を含む）。AIHの組織学的に顕著な特徴は、門脈周辺壊死または漸進的壊死である。この状態は、予後が乏しく不治であると考えられる；考えられるとしても自発的または持続的な寛解はまれである。プレドニゾンおよびアザチオプリンの併用処置は、有意に平均余命を改善し、そして臨床的、生化学的、および免疫化学的な異常を正常化することが報告されている。１型AIHは、米国において最も一般的な形態の自己免疫性肝炎であり、そしてこれは、平滑筋抗体または抗核抗体血清陽性（antinuclear antibody seropositivity）、ガンマグロブリン過剰血症、同時発生性免疫学的障害、A1、B8、DR3、またはDR4に対するHLA陽性に関連し、そしてコルチコステロイド治療に応答性である。最近、p-ANCAは、１型AIHおよびPSCの両方に関連することが実証されている。 p-ANCAが70％までのPSC患者の血清に見出されているが、十分に明確になった１型AIHを有する患者の血清の92％までは高力価のpANCAを発現することが見出されたことが報告される。しかし、この発見は、これらの肝胆汁性炎症性疾患の診断に、制限された臨床的有用性しか有さない。これは、それぞれの疾患に関連する p-ANCAの間を区別できないことによる。従って、診断的、予後的、および治療的な目的のために、結腸のCDとUSとを、そして１型AIHとPSCとを区別するための、簡便かつ信頼性の高い方法に対する必要性が存在している。発明の要旨本発明は、サンプル中の潰瘍性結腸炎（「UC」）、原発性硬化性胆管炎（「PS C」）、または１型自己免疫性肝炎（「１型AIH」）の核周辺抗好中球細胞質抗体（「p-ANCA」）の存在または非存在を、検出および測定する方法を提供する。より詳細には、UC、PSC、または１型AIHのp-ANCAの存在は、DNaseを用いる好中球の処置の際のポジティブ値の消失（すなわち、コントロールと比較した検出可能なマーカーの消失）をアッセイすることにより検出される。本発明は、１型AIH に関連するp-ANCAが、PSCに関連するp-ANCAとは異なること、およびこれらのp-A NCAのそれぞれは、UCに関与するp-ANCAとは異なることを実証する。これらの相違は、それぞれのp-ANCA、p-ANCA関連疾患についてスクリーニングする際、および３つの間を区別する際に信頼され得る。本発明の１つの実施態様において、サンプル中の潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、または１型自己免疫性肝炎に関連する核周辺抗好中球細胞質抗体（p-AN CA）の存在または非存在を測定する方法は、サンプルおよび検出可能な２次抗体と固定DNase処理好中球とを、好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程、結合していない２次抗体をその複合体から分離する工程、およびコントロールに比較した複合体化２次抗体の存在、非存在、またはパターンを検出することにより、p-ANCA免疫反応性のパターンをアッセイする工程を含む。好中球のDNase処理により、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずに、細胞DNAの実質的に完全な消化がもたらされる。コントロールは、好中球をDNase処理に供しない以外は、同じ供給源由来のサンプルに本方法を繰り返した結果である。本発明はまた、サンプル中のUC、PSC、またはAIHのp-ANCAの存在または非存在を同定するために有用な試薬を含むキットを提供する。キットは、他の試薬の中でも、固定好中球および検出可能な２次抗体を含む。発明の詳細な説明本発明は、サンプル中の潰瘍性結腸炎（UC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、または１型自己免疫性肝炎（１型AIH）に対する核周辺抗好中球細胞質自己抗体（p-ANCA）の存在を検出するための方法およびキットを提供する。本発明の方法は、DNaseを用いた好中球の処理の際のポジティブ値（コントロールと比較して）の消失をアッセイする工程を含む。本発明の方法はまた、特定の疾患に関連するp-ANCAの存在と関連し得る特定の染色パターンの検出を含む。名称が示すように、好中球の細胞質成分に対する抗体は、ある慢性の炎症状態を有する患者の血清中に見出される。免疫蛍光顕微鏡によって、ANCA活性は、２つの広いカテゴリーに分けられる：細胞質好中球染色（本明細書中では、「c-AN CA染色パターン」または「細胞質染色パターン」という）および核周辺が強調される細胞質染色（本明細書中では、「p-ANCA染色パターン」または「核周辺染色パターン」という）。これらの異なる染色パターンは、アルコール固定された細胞遠心分離好中球を用いて得られる。p-ANCA染色パターンは、細胞質顆粒が固定プロセスの間に核の周辺に再配置するときに生じるアルコール固定の人為産物であることが報告されてきた。しかし、本発明は、UCに関連したp-ANCAの核周辺染色パターンが人為的でなく、むしろ抗原に関連したDNAの特異的結合の結果であることの証拠を提供する。それにもかかわらず、アルコールに誘導されるか、または真のものかどうか、独特の抗原から惹起されるANCAの型と異なる疾患との関連を有するANCAの型とを区別するためにこれらの染色パターンを供した。本発明の方法は、CDおよび腸の他の炎症状態を互いに比較したときの、UC、PS C、および１型AIHの独特な染色パターンを利用して、IBDおよびこれらの肝臓病の診断および治療と以前に結びついていた不確実性を除去して、UC、PSC、または１型AIHを同定する簡便かつ信頼性のある方法を提供する。本発明の一つの局面は、サンプル中のUCまたはPSCのp-ANCAの存在または非存在を測定する方法に関する。この方法は以下の工程：（a）好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の複合体を形成させるのに適切な条件下で、サンプルおよび検出可能な２次抗体を固定化好中球と接触させる工程であって、ここで、この固定化好中球は、この接触工程の前に、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずに細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるに十分な条件下でDNaseに供し、そしてここで、この２次抗体がp-ANCAまたはp-ANCAのクラス決定部分に特異性を有する工程；（b）複合体から結合していない２次抗体を分離する工程；（c）結合した２次抗体の存在または非存在を、コントロールと比較して測定することによって、p-ANCA含有複合体の存在または非存在をアッセイする工程であって、ここで、このコントロールは、同じ起源由来のサンプルに対して、工程（a）の好中球をDNase処理に供さないこと以外は本方法の工程を繰り返した結果である工程を含む。本発明の関連する実施態様では、直接的免疫蛍光アッセイフォーマットにおけるのと同じ方法が、１型AIHに関連するp-ANCAの存在または非存在ならびにp-ANC A UCまたはPSCの存在または非存在を検出するために使用し得る。従って、サンプル中のUC、PSC、または１型AIHに関連するp-ANCAの存在または非存在を測定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：（a）好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で、サンプルおよび検出可能な２次抗体を固定好中球と接触させる工程であって、ここで、この固定好中球を、この接触工程の前に、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずに、細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるに十分な条件下でDNaseに供し、そしてここで、この２次抗体は、p-ANCAのクラス決定部分に対する特異性を有する工程；（b）免疫複合体から結合していない２次抗体を分離する工程；（c）複合体化２次抗体の存在、非存在、またはパターンを、コントロールと比較して検出することによってp-ANCA免疫反応性のパターンをアッセイする工程であって、ここで、このコントロールは、同じ起源由来のサンプルに対して、好中球をDNase処理に供さないこと以外は本方法を繰り返した結果である工程を含む。本明細書中で使用する用語「複合体」または「免疫複合体」は、抗原決定基含有分子（例えば、抗原）と、抗体結合部位を含む分子（例えば、抗体分子）との間の特異的結合の産物をいう。本明細書中で使用する用語「免疫反応性」は、抗原決定基含有分子（例えば、抗原など）を特異的に結合するための抗体結合部位を含む分子（例えば、抗体分子など）の能力または特性をいう。本発明の方法において、細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるために十分な条件下で、好中球をDNaseに供する。用語「細胞DNAの完全な消化」によって、細胞DNAが、実質的にタンパク質および好中球の細胞DNAに通常関連する他の細胞物質を結合する能力を失うような細胞DNAの消化を意味する。いずれの特定の理論にも結びつかないで、UCおよびPSCのp-ANCAの抗原の少なくとも一部は、核DNAまたは核構造の幾つかの面の何れかと親密に結合するタンパク質であると考えられる。細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるために十分な条件は、使用されるDNase の純度および濃度にしたがって変化し、そして例えば、固定化好中球を、適切な緩衝液１ml当たり約２〜約10ユニット DNaseのDNase濃度で、約15分〜約１時間の範囲の時間、約22℃〜約40℃の範囲の温度でインキュベートする工程を含む。本発明のアッセイは、本明細書中でその全体が参考として援用される、1983年３月８日に、Davidらに発行された米国特許第4,376,110号に記載のように、フォワード、リバースまたは同時であり得る。フォワードアッセイでは、各試薬が、連続的に固定化好中球と接触する。所望であれば、次の試薬の添加前に、結合していない試薬からの結合した試薬の分離を達成し得る。リバースアッセイでは、固定化好中球へ接触させるより前に、すべての試薬を予備混合する。リバースアッセイの変法は、本明細書中でその全体が参考として援用される、1988年10月18 日に、El Shamiらに発行された米国特許第4,778,751号に記載される。同時アッセイでは、すべての試薬を別々にではなく同時に固定化好中球と接触させる。現在好ましい本発明のアッセイの工程を下記にさらに詳細に議論する。本明細書中において使用される用語「試薬」は、本発明のアッセイを実施するために有用な任意の成分をいう。例えば、サンプル、１次抗体、検出可能な２次抗体、洗浄緩衝液、溶液など。サンプルは、任意の生物学的液体（例えば、全血、血漿、もしくは他の体液またはp-ANCAを含む組織、好ましくは血清）から得られ得る。本明細書中において記載された種々のアッセイフォーマットのための分離工程（複合体からの結合していない２次抗体の除去を含む）は、当該分野で公知の方法により実施し得る。適切な場合は、適切な緩衝液での簡単な洗浄、その後の濾過または吸引で十分である。好中球を粒子状の支持体に固定化する場合（例えば、微粒子の場合）、粒子状物質を遠心分離し、続いて洗浄液を除去するのが望ましい。好中球をメンブレンまたはフィルターに固定化する場合、バキュームまたは液体吸収要素を、メンブレンまたはフィルターの反対側へ適用してメンブレンまたはフィルターを通して洗浄液を引くことが可能である。本発明の方法は、通常、室温および37℃で実行する。この方法はタンパク質の使用を含んでいるため、タンパク質の３次元構造および４次元構造を実質的に改変する温度は避けるべきである。従って、本発明の方法を実施するために適切な温度は、一般に約22℃〜約38℃の範囲である。本発明の好ましい実施態様では、好中球を固体基体上に固定化する。固体基体は、免疫測定アッセイに有用な任意の支持体であり得る。基体は、水に不溶であり、そして堅いかまたは堅くない天然物または合成物から作製され得る。しかし、基体は、好中球の所望の活性に顕著に作用しないべきである。好ましい基体は、スライドガラス、ポリエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、ガラスなどから作製される試験ウェルを含む。試験管、濾紙、濾過装置（例えば、ガラスメンブレン）、ビーズ、および粒子状物質（例えば、アガロース、架橋デキストラン、および他の多糖類など）もまた有用である。本発明の方法およびキットにしたがって、好中球の固定化を当該分野の公知の方法により達成し得る。好ましくは、DNaseならびに本発明の方法およびキットで使用した試薬に対して好中球を浸透性にする固定化方法を使用する。例えば、好中球を、試験ウェルまたはスライドガラスの表面へ適切な固定剤（例えば、メタノール、エタノール、ホルマリンなど）を用いて直接固定することにより固定化し得る。もちろん、当業者は、そのような固定剤が好中球の核および細胞の形態を実質的に変化させないべきであることを認識する。本発明の実施において使用するのに適切な好中球および２次抗体は、アッセイされるサンプルの起源に依存する。本明細書中で使用する用語「患者」、「被験体」、または「個体」は、アッセイされるべきサンプルの起源についていう場合、UC、PSC、または１型AIHのp-ANCAを産生することができる任意の動物を意味する。このような動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウスなどを含む。好ましくは、用いられる好中球および２次抗体は、試験されるべきサンプルを得た種に対して特異的反応性を有する。例えば、ヒト被験体から得たサンプル中のUC、PSC、または１型AIHのp-ANCAをアッセイするためには、好中球および２次抗体は、好ましくはヒトに対して特異的である。多数の抗体を用いる場合、各抗体は、好ましくはその抗原に種特異的である。本発明において有用な好中球は、種々の供給源（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウサギ、ラット、マウスなどの血液）から当業者に公知の方法により得られ得る。本明細書中において使用する用語「２次抗体」は、任意の抗体もしくは抗体の組み合わせまたはそれらのフラグメントをいい、少なくともその１つは、UC、PS C、または１型AIHのp-ANCAと結合し得る。例えば、２次抗体は、抗p-ANCA抗体であり得る。この抗体は、p-ANCAのエピトープに対して特異的であるが、好ましくは好中球結合との拮抗または好中球/p-ANCA結合の立体障害を引き起こすものではない。あるいは、二次抗体は、好ましくは、p-ANCAのクラス決定部分に特異性を有する抗IgGであり得る。本発明の実施に有用な２次抗体は、当該分野で周知の技術によって得られ得る。このような抗体は、ポリクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。ポリクローナル抗体は、例えば、Ghoseら、Methods of Enzymology，第93巻、32 6-327（1983）の方法により得られ得る。例えば、IgGまたはIgGのFcフラグメントは、動物（例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類など）の抗血清中でのIgG反応性ポリクローナル抗体の産生を刺激するために免疫原として使用され得る。本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は、たくさんの商業的供給源から得られ得る。あるいは、例えば、MilsteinおよびKohler Nature，256:495-97（197 5）に記載されるプロセスまたはGerhard，Monoclonal Antibodies，370-371（Pl enum Press，1980）による変法によって抗体が得られ得る。マウス抗ヒトIgG抗体が望ましい場合、マウスに最初に、例えば、ヒトIgGまたはヒトIgGのFcフラグメントを含有する免疫原を注射する。その後、マウスを屠殺し、そして当該分野で周知の方法によって、その脾臓から採取した細胞を骨髄腫細胞と融合する。得られるハイブリドーマは、ヒトIgGと反応性の単一の抗体種を分泌するクローンを単離するためにスクリーニングされる。好ましくは、ハイブリドーマは、目的のIgGに対して高度に特異的である抗体を産生するものを同定するためにスクリーニングされる。選択されるモノクローナル抗体は、UCまたはPSCのp-ANCAを検出するための所望の感度および範囲に適合する親和性を有する。そのようなモノクローナル抗体の使用は、ポリクローナル抗体の使用と比較して、本発明のアッセイにおいてより高い感度の取得手段を提供する。あるいは、UCまたはPSCのp-ANCAに対して高い親和性を有するモノクローナル抗体は、UCまたはPSCのp-ANCAについてのファージ組み合わせライブラリーの作製によって得られ得、次いで、本明細書中で参考として援用するBarbas，C.F.ら、Proceedings of the Nat'l Academy of Science，88:7978-82（1991）に記載されたのと同様のプロセスで特異性についてスクリーニングされ得る。以下の実施例は、UCに対する免疫グロブリン遺伝子レパートリーのファージ組み合わせライブラリーを作製するための方法、ならびにUCに関連するp-ANCAについてのライブラリーのスクリーニング方法を例示する。UCに関連するp-ANCAの２クローン（ 5-3および5-4）の免疫グロブリン重鎖および軽Fab鎖の核酸および推定アミノ酸配列を、配列番号１〜８に提供する。UCに関連するp-ANCAのこれらおよび他のクローンに対する抗イディオタイプ抗体は、当該分野で周知の方法により惹起され得る。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を、例えば、本明細書中で参考として援用するHarlowおよびLane，Antibodies: A Laboratory Man ual (Cold Spring Harbor Laboratory 1988)に記載されているように産生し得る。種々の文法的な形態の用語「モノクローナル抗体」は、抗原上の特定のエピトープまたは抗体上のイディオトープと免疫反応可能な一種類のみのイディオトープを含む抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体は、代表的に、それが免疫反応するエピトープまたはイディオトープに対して単一の結合親和性を示す；しかし、モノクローナル抗体は、異なるエピトープまたはイディトープに対してそれぞれ免疫特異的な、多数のイディオトープを有する分子（例えば、２重特異性モノクローナル抗体）であり得る。モノクローナル抗体は、代表的には、ただ一種類の抗体分子を分泌（産生）する、ハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンによって産生される抗体から成る。本発明によれば、UCに関連するp-ANCAとの特異的免疫活性を有する抗体物質を産生し得るが、好中球とのp-ANCAの免疫反応性を妨げないハイブリドーマが提供される。このようなハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞と骨髄腫または他の永続し得る細胞株とを融合することによって形成される。このようなハイブリドーマの調製は、KohlerおよびMilstein、Nature、256：495-497（1975）（この記載は、参考として援用される）によって、最初に記載された。ポリペプチド誘導ハイブリドーマ技術もまた、Nimanら、Proc ．Natl．Sci.、U.S.A.、80: 4949- 4953（1983）（この記載もまた、本明細書中で参考として援用される）に記載される。不死化細胞との融合のための抗体産生細胞を得るために、哺乳動物を免疫原でに接種する。種々の文法的な形態の用語「免疫原」は、UCに関連するp-ANCAに対する抗体の調製のために使用される有効成分として、UCに関連するp-ANCAを含む組成物を記載するために本明細書中で使用される。哺乳動物を接種するために使用される、UCに関連するp-ANCAの量は、免疫化ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するために十分であるべきである。この量は、特に、接種される動物の種、動物の体重に依存し、そして選択される接種レジメは、当該分野で周知である。接種物は、代表的には、マウスについては１接種当たり約10mgの免疫原を含み、そして、より大きな哺乳動物については１接種当たり約500mgまでの免疫原を含み得る。次いで、UCに関連するp-ANCAで免疫された哺乳動物の脾細胞を採取し、そしてポリエチレングリコール（PEG）1500を使用して骨髄腫と融合し得る。融合したハイブリッドを、HATに対するそれらの感受性によって選択する。抗p-ANCAイディオタイプモノクローナルを産生するハイブリドーマは、UCに関連するp-ANCAと免疫反応する抗体分子の存在についてハイブリドーマ上清をスクリーニングすることによって同定され得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を含む。これらの組成物の調製に有用な培地は、当該分野で周知であり、市販されており、そして合成培養培地、近交マウスなどを含む。例示的な合成培地は、4.5g/l グルコース、20mMグルタミン、および20％ウシ胎児血清を補充したDulbeccoの最小必須培地（DMEM; Dulbeccoら、Virol.，8: 396（1959））である。例示的な近交マウス株は、Balb/cである。本発明のアッセイの感度を増大させるための他の選択肢は、特異性を増大させた１次抗体の使用よりもむしろ、２次抗体のための多数抗体システムの使用である。従って、本発明の方法は、２次抗体のような抗体の組合せを使用して実施され得る。ここで、組合せの少なくとも一つの２次抗体は、p-ANCAまたはp-ANCAのクラス決定部分に対する特異性を有し、そして組合せの少なくとも一つの２次抗体は、検出可能である。例えば、UCおよびPSCは、患者由来の血清の２つのアリコートを、固定化した未処理またはDNase処理のヒト好中球と接触させ、その後、得られる抗体-抗原複合体をマウス抗ヒトIgGと接触させることによってヒト血液サンプル中のクローン病と区別され得る。次いで、得られる複合体を、検出可能な標識を有するヤギ抗マウスIgGと接触させ、そして結合していない抗体を除去するために洗浄する。得られる複合体を、検出可能な複合体の存在または非存在についてコントロール（すなわち、DNase処理をしない好中球）と比較してアッセイする。DNase処理好中球と複合体化した標識化ヤギ抗マウスIgGが存在しないことは、患者がUCまたはPSCを有することを示す。用語「検出可能な２次抗体」は、上記で定義したように、UCまたはPSCのp-ANC Aを結合し得、そして種々の分析方法により検出または測定され得る２次抗体をいう。この用語は、シグナルを生ずる標識の付着なしで直接検出可能な抗体またはそれらのフラグメント、または検出もしくは測定を可能にするためにシグナルを生ずるシステムで標識され得る抗体またはそれらのフラグメント（例えば、放射性同位体、酵素、発色性物質または蛍光発生性物質、化学発光性マーカーなどで標識され得る任意の２次抗体）を含む。あるいは、２次抗体は、２次抗体に標識を結合するためのビオチン-アビジン結合を使用することによって検出可能に作製され得る。上記の任意の方法では、p-ANCAと２次抗体との反応性は、標識の存在によって顕著に変えられるべきでない。多数抗体システムが２次抗体として使用される場合、抗体、抗体の組合せ、またはそれらのフラグメントの少なくとも一つは、UCまたはPSCのp-ANCAを結合し得、そして少なくとも一つは適切な分析方法によって容易に検出または測定され得る。検出可能なマーカーは、当業者に公知の手順（例えば、放射活性マーカーのためのクロラミン−Ｔ手順）、ラクトペルオキシダーゼ手順によって酵素的に、Bo lton-Hunter技術によって、または当該分野で公知の他の任意の技術によって、２次抗体に結合され得る。これらの技術および他の技術は当業者に周知であり、そして例えば、Methods in Enzymology，第70巻，第Ａ部（Van VunakisおよびLa ngone編、1980）に記載される。従って、２次抗体は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼなど）に結合され得る。現在好ましい酵素は、アルカリホスファターゼである。２重チャンネル触媒システムもまた、本発明の方法に使用され得る。これは、例えば、最初の基質としてグルコース-6-リン酸を使用する、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼを含む。適切な触媒システムは、Tomらに1982年12月28日に発行された米国特許第4,366,241号、Weng らに1988年４月26日発行された米国特許第4,740,468号、Litmanらに1989年６月2 7日に発行された米国特許第4,843,3000号、およびLitmanらに1989年７月18日に発行された米国特許第4,849,338号に記載される。これらは全て、その全体が本明細書中で参考として援用される。種々の物質に酵素を付着させるための手順は、当該分野で周知である。例えば、抗体に酵素をカップリングさせるための技術は、J.H.Kennedyら，Clin.Chim.A cta ，70:1(1976)に記載される。このようなカップリングのために有用な試薬は、例えば、グルタルアルデヒド、p-トルエンジイソシアネート、種々のカルボジイミド試薬、p-ベンゾキノン m-ペリオデート、N,N'-オルト-フェニレンジマレイミドなどを含む。あるいは、本発明の方法およびキットに有用な検出可能な酵素に対して結合された２次抗体は、多くの商業的に利用可能な供給源から得られ得る。例えば、ヤギF(ab')2抗ヒトIgG-アルカリホスファターゼは、Pennsylvania，West Groveに位置するJackson Immuno-Researchから購入され得る。上記の酵素的システムに適切な基質は、単純な色素原および蛍光原（例えば、 β-D-グルコース、ホモバニリン酸、o-ジアニシジン（o-dianisidine）、ブロモクレゾールパープル粉末、4-メチル-ウンベリフェロン、ルミノール、パラ-ジメチルアミノロフィン、パラメトキシロフィン、パラ-ニトロフェニルホスフェートなど）を含む。現在好ましい酵素基質は、パラ-ニトロフェニルホスフェートである。２次抗体はまた、蛍光発生化合物にそれを化学的に連結することにより、検出可能にされ得る。適切な蛍光発生化合物は、光または他のエネルギー源により励起した後に、紫外波長または可視波長の光を発光する化合物である。蛍光原は、単独または適切なクエンチャー分子とともに用いられ得る。現在好ましい蛍光原は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチル-ローダミンイシチオシアネート、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸、およびフィコエリトリンである。これらおよび他の適切な蛍光原を結合および使用する方法は、報告されており、そして例えば、Methods in Enzymology，第74巻，第Ｃ部，3 2105（Van VunakisおよびLangone編、1991）に記載される。あるいは、本発明の実施のために有用な蛍光原に結合され得る２次抗体は、多くの商業的供給源から得られ得る。例えば、ヤギF（ab'）2抗ヒトIgG-FITCは、T ago Immunologicals，Burlingame，Californiaから入手可能である。使用される標識または触媒シグナル生成システムの性質に応じて、シグナルは、複合体化試験サンプルを光で照射し、そして蛍光のレベルを観察することにより；標識により触媒的に変換されて色素、蛍光、または化学発光を生成し得る基質に、複合体化サンプルを接触させること、ここで、色素の形成は、視覚的に、もしくは分光光度計において観察され得る；蛍光は、視覚的に、もしくは蛍光光度計において観察され得る；または、化学発光もしくは放射性標識の場合は、放射線カウンター（例えば、ガンマカウンター）もしくはガンマ放出マーカー（例えば、ヨウ素-125）を用いることにより、検出され得る。酵素触媒システムについては、現在好ましいアルカリホスファターゼの組合せが酵素として用いられ、そしてパラ-ニトロフェニルホスフェートが基質として用いられ、色の変化が、定性的陽性反応として視覚的に検出され得る。同じまたは同様のシステムの定量的分析のためには、EMAX Microplate Reader（Molecular Devices，Menlo Park ，Californiaから入手可能）を405nmで、製造者の使用説明書に従って用い得る。本発明によれば、試験されるサンプル中のUCまたはPSCのp-ANCAの存在または非存在は、サンプルを、固定したDNase処理好中球および２次抗体と接触させ、そしてp-ANCA含有複合体の存在または非存在をアッセイすることにより決定される。p-ANCA含有複合体の存在または非存在は、コントロールと比較した、結合した２次抗体の存在または非存在をモニターすることにより決定される。p-ANCAは、コントロールと比較して試験サンプル中にポジティブ値（結合した２次抗体）の消失が存在する場合、試験サンプル中に存在すると考えられる。コントロールは、固定化好中球がDNaseに供されていない場合に、同じ供給源由来のサンプルに、本方法の同じ工程を繰り返した結果である。例えば、本発明のIIFアッセイフォーマットでは、サンプル中のUCのp-ANCAの存在、従ってUC自体の存在が、このコントロールに比較した、核周辺染色パターン（すなわち、核周辺染色パターンに関連した検出可能な複合体）の消失が存在する場合に示される。より詳細には、UCのp-ANCAの存在は、さらに、サンプルにおいて核周辺染色パターンおよび細胞質染色パターンの両方がないことにより示される。同様に、同じIIFアッセイフォーマットを用いて、サンプル中のPSCのp- ANCAの存在、従ってPSC自体の存在が、均質な細胞質染色パターンがサンプルにおいて検出され、そして核周辺染色パターンがコントロールにおいて検出される場合、すなわち、「このコントロールに比較した、均質な細胞質染色パターンへの核周辺染色パターンと関連した検出可能な複合体の変換」の場合に示される。同様に、同じIIFアッセイフォーマットを用いて、サンプル中の１型AIHのp-ANCA の存在、従って１型AIH自体の存在が、顆粒状細胞質染色パターンがサンプルにおいて検出され、そして核周辺染色パターンがコントロールにおいて検出される場合、すなわち、「このコントロールに比較した、顆粒状細胞質染色パターンへの核周辺染色パターンと関連した検出可能な複合体の変換」の場合に示される。最終的に、CDは、コントロールにおいて核周辺染色パターンがないことが検出される場合、すなわち、「このコントロールにおいて、核周辺染色パターンに関連した検出可能な複合体がない」の場合に示される。このようにして、本発明の方法は、UCのp-ANCA、PSCのp-ANCA、および１型AIH のp-ANCAの間を区別するため、ならびにこれらのp-ANCAの任意の１つをスクリーニングするため、そしてその結果、好ましくは伝統的な診断技術と組み合わせて、任意の疾患の１つをスクリーニングするため、およびこれらをCDから区別するために使用され得る。例えば、UCと診断された94人の患者由来の血清（これは、p-ANCAに血清陽性であった）、PSCと診断された10人の患者由来の血清（これは、p-ANCAに血清陽性であった）、および１型AIHと診断された22人の患者（これは、非常に高い力価（好中球結合についての平均ELISA値139±8）のp-ANCAに対して血清陽性であった）を、本発明の方法に従って、IIFアッセイフォーマットを用いてDNase感受性について分析した。表１にまとめるように、いずれの染色パターンもないことにより実証された、好中球のDNase消化後の抗原認識の消失は、UCに関連するp-ANC Aの優勢な（66/94、70％）特徴である。一方、PSCに関連するp-ANCAおよび１型AIH p-ANCAに関連するp-ANCAの大部分が、好中球のDNase処理後に細胞質成分を認識する（それぞれ、7/10、70％および1 9/22、86％）。患者がUCを有するかどうかに基づいて患者の血清をグループ分けする場合（表２、UC/非UC）、好中球のDNase処理後の核周辺染色パターンの消失が UCのp-ANCAに独特であり、UCについてスクリーニングするため、およびp-ANCAを区別するための信頼性の高い基礎を提供することが明確になる。 PSCのp-ANCAと１型AIHのp-ANCAとの間の区別化は、DNase処理された好中球で生成される特異的細胞質染色パターンに基づく。図面に例示されるように、試験した血清の大部分でのp-ANCA陽性PSC血清の核周辺染色パターン（図1B）は、細胞質的だが、特徴的にはっきりしないようになったか、またはより科学的にいえば、均質な染色パターンを示した（図１Ｄ）。比較により、試験した血清の大部分において、メタノール固定好中球での１型AIH血清により生成した核周辺染色パターン（図１Ａ）もまた、細胞質的だが特徴的に顆粒状に染色されるパターンになった（図１Ｃ）。従って、本発明の別の実施態様は、サンプル中の１型AIHに関連するp-ANCAの存在または非存在を検出する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)固定好中球とサンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態を顕著に消失しないDNaseにより消化されており、そしてここで、検出可能な２次抗体は、蛍光により検出可能であり、かつp-ANCAのクラス決定部分に特異的である工程；（ｂ）免疫複合体から結合していない２次抗体を分離する工程；ならびに（ｃ）コントロールと比較した複合体の免疫蛍光染色パターンを検出する工程であって、ここで、コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、サンプルにおける顆粒状細胞質染色パターンの存在およびコントロールにおける核周辺染色パターンは、サンプル中の１型自己免疫肝炎に関連するp-ANCAの存在を示す工程、を含む。当業者は、上記のコントロールが、サンプルを試験するために用いられた好中球と同様の方法で固定された好中球を用いて生成されるが、コントロールを生成するために用いられた好中球はDNaseでの処理（すなわち、消化）に供していないことを認識する。本発明の別の実施態様によれば、サンプル中のPSCに関連するp-ANCAの存在または非存在を検出する方法が提供される。この方法は、以下の工程：(a)固定好中球とサンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、検出可能な２次抗体が、蛍光により検出可能であり、かつp-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程； (b)結合していない２次抗体を免疫複合体から分離する工程；ならびに(c)コントロールに比較して複合体の免疫蛍光染色パターンを検出する工程であって、ここで、コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、サンプルにおける均質な細胞質染色パターンの存在およびコントロールにおける核周辺染色パターンは、サンプルにおける原発性硬化性胆管炎と関連するp-ANCAの存在を示す、工程を含む。本発明のさらに別の実施態様では、１型AIHのp-ANCAからPSCのp-ANCAを区別する方法、従ってこれらの疾患の存在の間を区別する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)固定好中球とサンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、検出可能な２次抗体が、蛍光により検出可能であり、かつp-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程；(b)結合していない２次抗体を免疫複合体から分離する工程；ならびに(c)コントロールに比較して複合体の免疫蛍光染色パターンを検出する工程であって、ここで、コントロールは、固定好中球を用いる本方法を繰り返した結果であり、ここで固定好中球の細胞DNAはDNaseにより消化されておらず、そしてここで、サンプルにおける均質な細胞質染色パターンの存在およびコントロールにおける核周辺染色パターンは、PSCを示し、そしてここで、サンプルにおける顆粒状細胞質染色パターンの存在およびコントロールにおける核周辺染色パターンは、１型AIHの存在を示す、工程を含む。本発明のさらに別の実施態様では、１型AIHのp-ANCAからUCのp-ANCAを区別する方法、従ってこれらの疾患の存在の間を区別する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)固定好中球とサンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、検出可能な２次抗体が、蛍光により検出可能であり、かつp-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程；(b)結合していない２次抗体を免疫複合体から分離する工程；ならびに(c)コントロールに比較して複合体の免疫蛍光染色パターンを検出する工程であって、ここで、コントロールは、固定好中球を用いる本方法を繰り返した結果であり、ここで固定好中球の細胞DNAはDNaseにより消化されておらず、そしてここで、サンプルにおいて核周辺染色パターンが存在しないこと、そして好ましくは同様にサンプルにおける細胞質染色パターンが存在しないこと、およびコントロールサンプル中の核周辺染色パターンはUCを示し、そしてここで、サンプルにおける顆粒状細胞質染色パターンの存在およびコントロールにおける核周辺染色パターンは、１型AIHの存在を示す、工程を含む。本発明のさらに別の実施態様では、UCのp-ANCA、PSCのp-ANCA、および１型AIH のp-ANCAの間を区別する方法、従って、これらの疾患の存在の間を区別する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)固定好中球とサンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、該検出可能な２次抗体が、蛍光により検出可能であり、かつp-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程；(b)結合していない２次抗体を免疫複合体から分離する工程；ならびに(c)コントロールに比較して複合体の免疫蛍光染色パターンを検出する工程であって、ここで、コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、サンプルにおける核周辺染色パターンの非存在、好ましくは、同様にサンプルにおける細胞質染色パターンの非存在、およびコントロールにおける核周辺染色パターンの存在は、UCを示し；ここで、コントロールと比較して、核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体の、均質な細胞質染色パターンへの変換は、PSCを示し；ここで、コントロールと比較して、核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体の、顆粒状細胞質染色パターンへの変換は、１型AIHを示し；そしてここで、コントロールにおける核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体が存在しないことは、CDを示す、工程、を含む。本発明の別の局面では、サンプルにおけるUC、PSC、または１型AIHのp-ANCAの存在を測定するためのキットを提供する。本発明のキットは、固定化DNase処理アルコール固定好中球および検出可能な２次抗体を含有し得る。あるいは、キットは、固定化好中球、DNase、および検出可能な２次抗体を含有し得る。必要に応じて、用いた２次抗体または標識に依存して、キットは、US、PSC、または１型AIHのp-ANCAの検出を提供または増強する、シグナル生成物質を含み得る。さらに、他の成分（例えば、補助的な試薬）、例えば、安定剤、緩衝液、固定剤（例えば、メタノールまたはエタノール）などを含み得る。試薬は、乾燥粉末として、通常は凍結乾燥物（賦形剤を含む）として提供され得る。これは、解離に際して、本発明の方法を行うために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。本発明のキットの好ましい実施態様は、DNaseおよび固体基体（好ましくは、セルソーターにより蛍光を検出または定量するためのマイクロタイタープレートまたはビーズ）に固定化したヒト好中球を含む。UC、PSC、または１型AIHのp-AN CAの存在を検出するために、キットは、好ましくは、酵素または蛍光発生物質で標識したヤギ抗マウスIgG、およびマウス抗ヒトIgGを含む。本発明のなお別の局面では、UCの単離された抗原を提供する。抗原は、天然では、好中球において生じ、そしてFisher，Pittsburgh，Pennsylvania,カタログ番号BP-151から入手し得るTriton X-100^TMにおけるその不溶性により特徴付けられる。本発明のなお別の局面では、PSCの単離された抗原が提供される。抗原は、天然には好中球において生じ、そしてTriton X-100^TMにおけるその不溶性により特徴付けられる。本発明は、ここで、以下の非制限的な実施例の参照により、さらに詳細に記載する。実施例Ｉヒト末梢血リンパ球のFICOLL-HYPAQUE勾配遠心による分離１．500ml瓶中で31.8gのFicoll 400（Pharmacia，Sweden）を400mlの脱イオン化Ｈ₂Ｏに加える。溶解するまで激しく振る。100mlの50%ナトリウムジアトリゾエートハイパク（sodium diatrizoate hypaque）（UCLA Pharmacy，Los Angeles ，California）を加え、そして混合する。２．比重計を使用して比重を調べる。比重は、1.077-1.080のはずである。３．Ficoll-hypaque溶液を0.22または0.45μmのボトルトップ型フィルターを通して濾過滅菌する。このFicoll-hypaque溶液を、４℃で光から保護して保存し得る。４．15mlのFicoll-hypaque溶液を50ml円錐形遠心管に注ぐ。30mlのヘパリン処理をした血液を注意深く重層する。５．1000×ｇ（2000RPM）で20分間遠心分離する。６．界面を目盛り付ピペットまたはパスツールピペットを使用して取り出し、 50ml円錐形遠心管のなかに置く。７．界面層を少なくとも等容量のHanksの平衡化塩溶液（HBSS）（Irvine Scie ntific，Santa Ana，California）で希釈する。８．400×ｇ（1200RPM）で５分間遠心分離する。９．上清をデカントし、ペレットを再懸濁し、そして50ml HBSSを加える。 10．工程８および９を２回繰り返す。 11．細胞を含むRPMI 1640（Irvine Scientiric，Santa Ana，California）＋５％ウシ胎児血清（GIBCO，Gathersberg，Maryland）に再懸濁する。実施例II 好中球の単離１．ピペットを使用して実施例Ｉに記載の手順で得られた赤血球ペレットから血清および残存するFicoll-Hypaqueを注意深く取り除く。２．15mlのペレットにつき10mlの６％デキストランを加える。３．１× HBSSで50mlにあわせる。ペレットを再懸濁する。４．約45分〜１時間、赤血球を静置する。５．上清を分離し、ペレットを捨てる。上清を１× HBSSで50mlにあわせ、そして1800rpmで５分間遠心分離する。６．上清をデカントし、ペレットを軽くたたく。残存する赤血球に９mlの脱イオン水を加え、回旋させ、次いで１mlの10× HBSSを加えることにより、低張的に溶解させ、そして直ちに１× HBSSで50mlに希釈する。７．1000rpmで５分間遠心分離する。上清を捨て、そしてペレットを15mlの１ × HBSS中に再懸濁する。実施例III 好中球のスライドガラスへの固定化１．実施例IIの工程７で得られた懸濁液中の細胞を、顕微鏡および血球計算盤を使って数える。そして、十分な容量の１× HBSSのなかに細胞を再懸濁して１m l当たり2.5×10⁶個細胞を達成する。２．各スライドに0.01mlの再懸濁した細胞をアプライするためにCytospin 3^TM （Shandon，Inc．Pittsburgh，Pennsylvania）を500rpmで５分間使用する。３．サンプルを覆うために十分な容量の100％メタノール中に、スライドを10 分間インキュベートすることによって、スライドに細胞を固定する。風乾させる。このスライドを、-20℃で保存し得る。実施例IV スライドガラスに固定化された好中球のDNase処理緩衝液１ml当たり３ユニットのPromega RQ1^TMDNaseを組み合わせることにより DNase溶液を調製する。緩衝液は、40mMのTRIS-HCl(pH7.9)、10mMの塩化ナトリウム、６mM塩化マグネシウム、および10mM塩化カルシウムを含む。Promega RQ1^TMD Naseは、Madison、WisconsinのPromegaから入手し得る。実施例IIIに従って調製されたスライドを、約100mlリン酸緩衝化生理食塩水(p H7.0-7.4)で５分間リンスする。固定化好中球を、スライド１枚当たり0.05mlのD Nase溶液中で37℃で約30分間インキュベートする。このスライドを室温で約100- 250mlのリン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄する。実施例Ｖ免疫蛍光アッセイ１．0.05mlのリン酸緩衝化生理食塩水中にヒト血清の1：20希釈物を、実施例I Vに従ってDNaseで処理したスライドおよび実施例IIIの無処理のスライドに加える。である。ブランクとして0.05mlリン酸緩衝化生理食塩水を清浄なスライドに加える。容量の損失を最小にするために十分な湿度で0.5〜１時間室温にてインキュベートする。２．100-250mlリン酸緩衝化生理食塩水をいれた容器中に軽く浸すことによって血清をリンスして除去する。スライドを、リン酸緩衝化生理食塩水中に５分間浸漬する。軽く吸い取る。３．0.05mlヤギF(ab')₂抗ヒトIgG(μ)-FITCを、1：1000の抗体：リン酸緩衝化生理食塩水希釈で、各スライドに加える。容量の損失を最小にするために十分な湿度で30分間室温でインキュベートする。（ヤギF(ab')₂抗ヒトIgG(μ)-FITCは、Tago Immunologicals、Burlingame、CAおよびJackson Immunoresearch Labora tories，Baltlmore、MDから入手可能である。）４．100-250mlリン酸緩衝化生理食塩水で抗体をリンスして除去する。スライドを、100-250mlリン酸緩衝化生理食塩水に５分間浸漬する。それから風乾させる。５．蛍光顕微鏡で40×で蛍光パターンを読みとる。所望であれば、スライドを室温でリン酸緩衝化生理食塩水で良く洗浄し、そして室温で10秒間染色することにより、任意のDNAをヨウ化プロピジウム染料で染色することもできる。室温で100-250mlリン酸緩衝化生理食塩水でスライドを３回洗浄し、そしてカバーガラスをかぶせる。実施例VI 免疫蛍光アッセイを使用するUC p-ANCA特異的抗原のDNase感受性 Promegaから得たDNaseを、３ユニット/mlの作業濃度で使用した。DNase濃度を、加えられたDNaseの量（１〜10ユニット/ml）を滴定すること、およびヨウ化プロピジウム染色および／または抗DNA抗血清との反応によってDNA消化の程度を試験することによって最適化した。細胞遠心分離（cytocentrifuge）され、メタノール固定された好中球の消化を、10mM NaCl、6mM MgCl₂、および10mM CaCl₂を含有する40mM Tris-HCl(pH7.9)緩衝液中に可溶化されたDNaseを用いて37℃で30分間行なった。ヨウ化プロピジウム染色がないことによって示されるように実質的にすべての細胞DNAは、消失した。また、消失は、抗ヒストン陽性血清の反応であった。本明細書中に記載されるようにDNase反応を行ったが、核または細胞の形態は、顕著に変化しない。種々の濃度でトリプシンを用いて処理された好中球は、もはやUC p-ANCA陽性血清とも、抗ヒストン陽性血清とも反応しなかった。これは、p-ANCA反応性抗原の少なくとも一部が、タンパク質であることを示す。同様に、好中球のペプシン消化は、PSC p-ANCA陽性血清反応を消滅させた。これもまた、この抗原性種のタンパク質性の特徴を示す。UC p-ANCA陽性患者およびc-ANCA陽性患者の血清のパネルを、上記のように細胞遠心分離され、メタノールで固定されたスライドを使ってDNase感受性について試験した。２つの他のタイプの反応に注目した。いくつかのp-ANCA陽性血清は、DNase処理後、反応の核周辺面を消失し、そして細胞質になった。一方、c-ANCA陽性血清は、一般に細胞質のままであった。さらに、核周辺および細胞質の両方のANCA染色反応を有することが見出されたいくつかの血清は、常に好中球のDNase処理後に反応の核周辺面を消失する。これらのDNase 誘導性染色パターンは、実験間で再現性が高いことが証明された。このデータは、少なくとも３つのANCA反応が固定化された好中球のDNase処理に応答して可能であることを示す；１）消滅するp-ANCA反応、２）細胞質化する p-ANCA反応、および３）持続するc-ANCA反応。これらの場合の全ておいて、DNas e消化は、ヨウ化プロピジウム染色がないことおよび抗DNA抗体による反応がないことにより証明されるように、完全であった。好中球のDNase処理がUCと関連するp-ANCAのすべての抗原認識を消滅させるのかどうかを決定するために、あらかじめp-ANCAを含んでいると特徴付けられたUC 患者の血清のパネル（n=94）を、DNase処理後の好中球結合についてIIFアッセイフォーマットを使用して試験した。試験したUC血清の70％で、DNase処理は、p-A NCA染色パターン（図２AおよびC）となる、免疫原性反応の消滅を再度もたらした。これは結果として示される。残りのp-ANCA陽性UC血清は、好中球のDNase処理後に細胞質（c-ANCA）の均一な（または、はっきりしない）染色パターンを与えることが見出された（図２BおよびD）。従ってUCに関連するp-ANCAは、好中球のDNase処理後に２つの可能な反応を生じた；１）消滅するp-ANCA反応、および２）c-ANCA染色パターンに変換されるp-ANCA反応。細胞のDNase処理後に得られた好中球の染色パターンにおけるこれらの変化は、試験した血清の一致した特徴であり、そして同じ結果が多数の実験において得られた。最終的に、p-ANCA陽性血清での好中球の事前の反応が、抗原のDNase感受性をもたらすかどうかも試験した。好中球が最初にp-ANCA陽性血清で処理される場合は、核周辺反応はDNase消化後であっても維持される。この結果は、抗原の物理的損失、または、エピトープ認識の損失のいずれかに対する抗体結合の防護効果を示す。実施例VII UC p-ANCA免疫活性の比較特徴付け DNAの完全性が好中球へのUC p-ANCA結合のために必要だったかどうか調べるために、メタノール固定した好中球を、DNaseで処理し、UCと診断された患者由来のp-ANCA陽性血清と接触させ、そしてUC特異的p-ANCA結合をIIFにより調べた。比較目的のために非UC血清の結合も試験した。抗DNA抗体を発現する血清(Rheuma tology Diagnostics Laboratories Inc.，Los Angeles，CA)、WG ANCAを発現した血清、抗エラスターゼ抗体を発現する血清、およびPR3に対する抗体を発現する血清（後の３つ全部は、North Carolina，Chapel HillのJ．Charles Jennette 大学から得られた）もまたDNase処理され、メタノール固定した好中球と接触させ、そして結合をIIFにより試験した。さらに、DNase消化の有効性およびその後のDNAの消失を、DNA結合染料であるヨウ化プロピジウムで好中球を染色することによってルーチンにモニターした。図３および４を、これらの血清でメタノール固定好中球で生じたIIF染色パターンと（上段）およびDNase処理されたメタノール固定好中球で生じたIIF染色パターンとを比較するために提供する。染色パターンは、（下段）である。図３A およびDに見られる様に、P-ANCA陽性UC血清によって生じたp-ANCA染色パターン（図３A）は、好中球がDNaseで前処理される場合（図３D）は完全に消失した。これは、UCp-ANCA結合が消滅することを示す。期待通り、DNase処理後の抗原認識の同様な消失が、抗DNA血清で得られた。図３Bは、未処理の好中球での抗DNA 血清のIIF染色パターンを描く。この染色パターンは、好中球がDNaseで前処理される場合、はっきりと消失する（図３E）。好中球のDNase処理が細胞DNAを排除するのに効果的であったことは、DNase処理がないときのヨウ化プロピジウム染色パターン（図３C）と比較して、このような処理後は、ヨウ化プロピジウム染色がないこと（図３F）に見られる。WG血清による好中球結合は、細胞のDNase処理によって変化しなかった（図４AおよびD）が、一方、抗エラスターゼp-ANCA染色パターン（図４B）は、DNase処理によって顆粒状細胞質パターン（図４E）に変換した。最終的に、抗PR３により生じた染色パターン（図４CおよびF）もまた好中球のDNase消化により影響を受けなかった。実施例VIII 免疫蛍光アッセイを使用する PSC p-ANCA特異的抗原および１型 AIH特異的抗原の比較DNase感受性 PSCおよび１型AIH患者由来のp-ANCA含有血清のパネルを調べ、そしてUC血清パネルと比較した。全ての血清を、IIFによるANCA染色パターンおよびELISAによって決定されるようにANCA結合レベルに関して予め特徴付けした。好中球のDNase 消化の前および後の代表的なANCA染色パターンを、図１中に示す。このメタノール固定好中球を有する１型AIH血清によって生じたp-ANCA染色パターンを図１Aで描く。このp-ANCA陽性１型AIH血清は、DNase消化された好中球で顆粒状細胞質染色パターンを生じることが典型的に見出された（図１C）。PSC と診断された患者の血清によって生じたp-ANCA染色パターンを図１Bに描く。PSC 血清は、DNase処理好中球で主に均一な（はっきりしない）細胞質染色パターンを生じた（図１D）。実施例IX マイクロタイタープレート上への好中球の固定化１．実施例IIの工程７の懸濁液中の細胞を、顕微鏡および血球計算盤を使用して数える。そして、十分な容量の１× HBSSのなかに細胞を再懸濁して１ml当たり2.5×10⁶個細胞を達成する。１ウェル当たり0.1mlを、96ウェルマイクロタイターImmulon 1^TMまたはImmulon^TMプレート（Virginia，ChantillyのDynatech La boratoriesから入手可能）に加え、そして30-60分間静置させる。２．バキュームに接続した８チャンネルマニホールドを用いて上清を引き、そしてプレートを風乾させる（約２時間）か、または乾燥させるために層流フードの格子の上に倒置する（約10分間）。３．１ウェル当たり0.1mlの100％メタノール中で10分間細胞をインキュベートすることによってウェルに細胞を固定する。メタノールを捨て、そしてプレートを風乾させる。-20℃で保存する。実施例Ｘマイクロタイタープレート上へ固定化された好中球のDNase処理 DNase溶液を、緩衝液１ml当たり３ユニットのPromega RQ1^TMDNaseを組み合わせることによって調製する。緩衝液は、40mMのTris-HCl（pH7.9）、10mM塩化ナトリウム、6mM塩化マグネシウム、および10mM塩化カルシウムを含有する。実施例VIIにしたがって調製されたプレートを、25mlリン酸緩衝化生理食塩水を用いて１回リンスする。固定化好中球を１ウェル当たり0.1mlのDNase溶液中で 37℃で約30分間インキュベートする。総量約100mlのリン酸緩衝化生理食塩水を用いてウェルを３回洗浄する。リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）中0.25％のウシ血清アルブミン0.15mlを加えることによってウェルをブロックし、そして室温で約１時間放置する。ブロッキング液を捨てる。実施例XI DNase処理された固定好中球ELISA １．0.25％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水を用いて所望のように希釈された0.1mlのヒト血清を、実施例VIIIおよび実施例VIIに従って調製されたマイクロタイタープレート（すなわち、DNase処理あり、およびDNase 処理なし）の各ウェルに加える。0.25％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水0.01mlをブランク試験のウェルに加える。容量損失を最小にするために十分な湿度で室温で１時間放置する。２．血清を吸引する。0.02％アジ化ナトリウム（NaN₃）および0.05％Tweenを含有する総量約100mlのリン酸緩衝化生理食塩水を用いて３回洗浄する。３．0.25％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水中のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgG抗体の１：1000希釈液0.1mlを各ウェルに加える。ヤギF(ab')₂抗ヒトIgG(Fc)-アルカリホスファターゼは、Pennsylvania，W est GroveのJackson Immuno-Research Laboratoriesから得られ得る。容量損失を最小にするために十分な湿度で室温で１時間インキュベートする。４．0.02％アジ化ナトリウム（NaN₃）および0.05％Tweenを含有する総量約100 mlのリン酸緩衝化生理食塩水を用いて３回洗浄する。0.05M Tris、0.15M NaCl、および0.02％アジ化ナトリウムを含有するpH7.5のTRIS-NaCl溶液を用いてさらに３回洗浄する。５．0.75gのp-ニトロフェノールリン酸二ナトリウム（United States Biochem icals カタログ番号19587またはAMRESCO カタログ番号PO364）を、75mM Tris-H Cl 塩酸、1.5mM MgCl₂、0.02％アジ化ナトリウムを含有するTris緩衝液（pH8. 6）と組み合わせて、基質含有溶液を形成する。0.01mlの基質含有溶液を各ウェルに加える。ブランクのウェルが吸光度0.8に至るまで、容量損失を最小にするために十分な湿度で室温で60〜90分間インキュベートする。６．EMAX Microplate Reader（Molecular Devices，Menlo Park，California ）中405nmでプレートを読みとる。実施例XII DNase処理された固定好中球ELISAを使用するコントロールの未処理細胞に対する DNase処理された好中球へのANCA結合における変化 p-ANCA陽性UC血清のパネルでは、ELISAによってANCA結合の50％より多くを消失することが見出されたサブセットは、免疫蛍光染色によってp-ANCA染色の大部分またはすべてを消失したものに対応する。一方、ELISAによってANCA結合において約50％未満の減少を示す血清が、好中球のDNase消化後に細胞質染色に変換されたp-ANCAパターンを示すことが見出された。この後者のグループではまた、 DNase処理後に細胞質パターンのみが維持される、核周辺／細胞質染色パターンの混合物を有するいくつかの血清が見出された。細胞質ANCA染色パターンを示すある血清は、DNase処理後に増大したANCA結合を有することが見出された。p-ANC A陽性PSC血清の大部分（６つのうちの４つ）は、好中球のDNase処理後、50％未満のANCA結合を消失した；対照的に、14のうちの５つのみのUC p-ANCA陽性血清が、このような消失を示した。免疫蛍光染色によって、これらのPSC血清は、DNa se処理後に細胞質となるp-ANCA染色パターンを示すことが見出された。従って、DNase処理された固定好中球ELISAは、CDならびに他のタイプの腸の炎症状態からUCおよびPSCを区別するために使用され得る。この独特な免疫蛍光型アッセイに関連する核周辺／細胞質染色パターンは、ELISAアッセイの信頼性を確認し、そしてUCとPSCとの間のさらなる区別を可能にし得る。実施例XIII 小児潰瘍性結腸炎におけるANCA 小児集団において、直腸出血（RB）を有する小児におけるUC、クローン病（C D）およびアレルギー性結腸炎の間を区別することは特に難しい。UCを有する成人患者におけるANCAの発生が、十分に確認されているので、ANCAの発生と小児UC との関係を決定するために研究を行った。DNase処理された固定好球中ELISAによって測定されたように、ANCAの存在が、小児UCに対して鋭敏および特異的であるかどうかを決定するために、UC（平均年齢１３歳）、CD（平均年齢１４歳）、RB （平均年齢３歳）、および他の胃腸炎症性障害（平均年齢８歳）を有する小児由来の血清を、ブラインド方式で試験した。すべてのELISA陽性サンプルを、ANCA 染色パターンを決定するために上記の免疫蛍光アッセイを使用して調べた。ANCA は、UC陽性血清結合の％として表され、そしてその値が、正常コントロール血清に対する平均値（≧）１２％より２標準偏差上側に超過した場合に、陽性として定義される。この結果を表３に示す。 CDを有するものは１７％、RBを有するものは２３％、および他の胃腸炎症性障害を有するものは７％であったのに対して、UCを有する小児の７２％は、ANCA陽性であった（表１）。１：100希釈での陽性コントロールの平均％もまた、UCにおいて有意に高かった（CDおよび非IBDに対してはp<0.00、RBに対してはP<0.01）。さらに、ANCA陽性サンプルの平均力価は、有意に高かった。これは、ELISA力価をUCに対して非常に特異的にさせている。核周辺の免疫蛍光パターンの存在は、力価と相関した。従って、ANCAが、他の炎症性障害に対してUCに鋭敏（72％）および特異的（89％）であることがみられた。実施例XIV UCおよびPSCのp-ANCAと反応性の抗原はTriton X-100^TMに不溶性である１．実施例IIの工程７の懸濁液中の細胞を、顕微鏡および血球計算盤を使用して数える。そして、1.0％ Triton X-100^TMを含有するリン酸緩衝化生理食塩水の十分な容量の中に細胞を再懸濁して、0.5％ Triton X-100^TMを含むリン酸緩衝化生理食塩水１ml当たり2.5×10⁶個細胞を達成する。氷上で約10分間インキュベートさせる。２．実施例III、工程２に記述したようにスライドガラスの上で細胞遠心分離する。３．実施例III、工程３に示す手順に従って、細胞遠心分離されたTriton X-10 0^TM抽出物を固定する。４．リン酸緩衝化生理食塩水中のUC p-ANCA陽性血清またはPSC p-ANCA陽性血清の１：２０希釈液0.05mlをスライドに加える。ブランクとして、0.05mlのリン酸緩衝化生理食塩水を清浄なスライドに加える。容量損失を最小にするために十分な湿度において３０分〜１時間室温でインキュベートする。５．実施例Ｖ、工程２〜５の免疫蛍光アッセイに従ってスライドをプロセスする。 Triton X-100^TM後、好中球の形態は、抗DNA血清との反応の際に明白な核構造の証拠を有さず、明らかに消失した。しかし、細胞DNAは、Triton X-100^TM処理の間に消失しなかった。UC p-ANCA陽性血清およびPSC p-ANCA陽性血清の両方とも、固定されたTriton X-100^TM好中球抽出物に対して強い反応性を示した。Trit on X-100^TM不溶性に基づいて、UCおよびPSC p-ANCA抗原の富化画分を抗原を単離するために調製し得る。実施例XV ライブラリー構築 UCと診断され、そして固定された好中球ELISAにおいてp-ANCAに対して血清陽性なヒト由来の固有層リンパ球（LPL）細胞の重鎖および軽鎖遺伝子レパートリーのV_HおよびV_LをコードするDNAホモログライブラリーを、ランダムに組合わせ、発現した、そして得られた抗体物質を、ファージディスプレイ技術を使用して好中球を結合する能力についてスクリーニングした。次いで、好中球に免疫反応性を有する抗体物質を、p-ANCA染色パターンについて、およびp-ANCA染色パターンの消失についてUCと関連するp-ANCAを同定する手段としてDNase処理好中球を使用してスクリーニングした。これらの可変重鎖ライブラリーおよび可変軽鎖ライブラリーを、これらのLPL 由来の可変重鎖および可変軽鎖のPCRクローニングによって構築した。これらのライブラリー由来のホモログは、本明細書中において記載されたように２シストロン性ファージミド発現ベクターpComb3中でランダムに組み合わされ、V_Hポリペプチドおよび繊維状ファージのコートタンパク質IIIのフラグメントを含む可変重鎖融合タンパク質をもたらした。その後、E．coliを、ヘテロ２量体の抗体物質をコードするDNAを含むこれらのベクターで形質転換した。ベクターの発現を誘導し、そして細胞をヘルパーファージで形質転換した。形質転換されたE．col iから排出されたファージは、ヌクレオチド配列をコードするベクターDNAをカプセル化し、そしてコードされた重鎖および軽鎖を遺伝子IIIアンカータンパク質を介してファージコートに係留されたFab抗体物質として提示した。従って、このファージミド発現系は、認識および複製のプロセスの両方を単一のファージ粒子に中で連結する。 Parmleyら、Gene,74:305-318（1988）によって記載されるようにパンニングと呼ばれるプロセスでは、抗好中球免疫反応性を有するヘテロ２量体の抗体物質を発現するファージを富化し、そして単離する。次いで、このヘテロ２量体の抗体物質を、さらに、アルコール固定された間接的な免疫蛍光（「IIFアッセイ」）によってUCと関連するp-ANCAの存在について、およびDNase処理アルコール固定好中球を使用してIIFアッセイにおける陽性p-ANCA染色パターンの消失についてアッセイする。V_H およびV_Lライブラリーの作製免疫グロブリンタンパク質CDRをコードするヌクレオチド配列は、非常に可変的である。しかし、実質的に保存されたヌクレオチド配列、すなわち同じプライマー配列にハイブリダイズする配列を含む、軽鎖および重鎖のVドメインに隣接する保存された配列の領域が幾つかある。ポリヌクレオチド合成（「増幅」）プライマーを構築した。このプライマーは、これらの保存された配列とハイブリダイズし、そして、作製されたDNAホモログ中へ制限部位を組み込み、この制限部位は、ベクターへDNAホモログを作動可能に連結するために適切である。より詳細には、このプライマーを、得られる、生成されるDNAホモログが、発現ベクター中へ上流の翻訳可能なDNA配列とともに指向性連結手段を含むベクターの領域で読み枠内に挿入され得るように設計した。本明細書中に記載されているプライマーを用いる増幅を、UCと診断され、そしてp-ANCAに対して血清陽性なヒトのLPLから単離された総RNAから生成されたcDNA テンプレートで行った。V_H プライマー V_Hドメインの増幅のために、プライマーを、粘着末端を導入するように設計した。この粘着末端はpComb 3ファージミド発現ベクターのHc2発現カセットのユニークなXho IおよびSpe I部位への指向性連結に適合性である。すべての場合において、配列番号10〜16に列挙された5'プライマーを、保存されたN末端領域中の第一鎖cDNA（アンチセンス鎖）を相補的であるように選択する。さらなるV_H増幅プライマー（ユニークな3'プライマーを含む）を、γ１重鎖mR NA（配列番号９）の第一の定常領域ドメインの一部分に相補的であるように設計する。これらのプライマーは、V_HドメインおよびIgGイソタイプの免疫グロブリン重鎖の第一の定常領域ドメイン由来のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むDNAホモログを生成する。従って、これらのDNAホモログを、F_vよりもむしろFabフラグメントを生成するために使用し得る。 IgM、IgE、およびIgAのような免疫グロブリン重鎖の別のクラスの同様の領域にハイブリダイズするように設計されるさらなるユニークな3'プライマーを意図する。CH₁定常領域の特定のクラスの特定の領域にハイブリダイズし、そしてこのプライマーを使って増幅されたV_Hドメインを、異なるクラスの重鎖または軽鎖の定常領域とともにこれらのV_Hドメインを発現し得る発現ベクターへ移入させるのに適合する他の3'プライマーも意図する。増幅を７つの別々の反応において行なった。各反応には、配列番号10〜16に示される5'プライマーの一つおよび配列番号９に示される3'プライマーの一つを含む。V_HをコードするDNAホモログのpComb 3ファージミド発現ベクターのHc2発現カセットへの挿入のために、5'プライマーはXho I部位を組み込み、そして3'プライマーは、Spe I制限部位を組み込む。本明細書中で参考として援用する、Bar bas，C．F．ら，Proceedings of the National Academy of Science，88，7978- 7982(1991)を参照のこと。V_L プライマー V_Lドメインの増幅のために、増幅プライマーを構築する。この増幅プライマーは、免疫グロブリン軽鎖の保存配列とハイブリダイズし、そしてSac IおよびXba Iで切断したpComb 3ファージミド発現ベクターのLc2発現カセットへのV_Lコード DNAホモログのクローニングを可能にする制限部位を組み込む。5'プライマー（配列番号１８〜２０）を、保存されたN末端領域中の第一鎖cDNAに相補的であるように設計する。これらのプライマーもまた、Sac I制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、V_LコードDNAホモログがpComb 3ファージミドLc2発現カセット中にクローン化されるのを可能にする。3’V_L増幅プライマー（配列番号17）を、κc DNAの定常領域にハイブリダイズし、そして、pComb 3ファージミドLc2発現カセットの中にV_LコードDNAホモログを挿入させるのに要求されるXba I制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するために設計する。これらのプライマーは、κイソタイプの免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAホモログが生成されるのを可能にする。これらのプライマーは、FvよりもむしろFabフラグメントを生成するのを可能にする。免疫グロブリン軽鎖遺伝子レパートリーの増幅を３つの別々の反応において行なった。各反応は、5'プライマー（配列番号１８〜２０）の一つおよび3'プライマー（配列番号１７）の一つを含む。5'プライマーは、Sac I制限部位を含み、そして3'プライマーは、Xba I制限部位を含む。 λイソタイプのヒト軽鎖可変領域を増幅するために設計された増幅プライマーもまた、意図される。本明細書中に記載されるすべてのプライマーおよび合成ポリヌクレオチドは、 Oligos（Wilsonville，OR）などから購入した。pComb 3発現ベクターは、Scripp s Research Institute，La Jolla，CAのCarlos Barbas III博士から贈与された。 V_H およびV_Lライブラリーの構築総RNAを、標準的なイソチオシアン酸グアニジニウム抽出プロトコールを使用して1.15×10⁷個リンパ球から抽出した。例えば、本明細書中で参考として援用する、Chomcynski，P.およびSaochi，N.，Anal ．Biochem．162:156-159（1987）を参照のこと。 PCR増幅のための調製において、上記のように調製されたRNAを、プライマー伸長反応によるcDNA合成のための鋳型として使用する。従って、10μg RNAを、10m M ジチオスレイトール、RNasin^TM（Promega Corporation，Madison，WIのタンパク質RNaseインヒビター）、各25mMのdATP，dCTP，dGTP,dTTP、１×リバーストランスクリプターゼ緩衝液（Bethesda Research Laboratories，Bethesda，MD）、および２μｌ（200ユニット）リバーストランスクリプターゼ（Superscript、Be thesda Research Laboratories）とともに１μg オリゴdTプライマーを50μｌ容量中で使用し、室温で10分間、その後42℃で50分間によって一本鎖cDNAへ逆転写した。５分間90℃で加熱して殺し、そして氷上に10分置いた後、反応物を、１μ ｌ（１ユニット）RNase H（Bethesda Research Laboratories）で37℃で20分間処理した。上記で生成した１本鎖cDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）法を使用して増幅した。以下に記述するようなファミリー特異的可変領域およびイソタイプ特異的定常領域プライマーを、重鎖IgG1 V_H1〜V_H6およびκ軽鎖V_L1〜V_L3特異的ライブラリーを作製するために使用した。 IgG1重鎖定常領域ライブラリーを作製するためのプライマー：重鎖可変領域ライブラリーを作製するためのプライマー： κ軽鎖定常領域ライブラリーを作製するためのプライマー： κ軽鎖可変領域ライブラリーを作製するためのプライマー： PCR増幅を、逆転写反応の産物（１本鎖cDNAの450μl反応物中の約１μl）、60 pmの3'V_Hプライマー（配列番号９）、60pmの5'プライマー（配列番号１０〜１６の１つ）、各２５mMのdNTPの混合物８μl、10μlの10× PCR緩衝液(Perkin-Elme r)、および５ユニットのTag DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer，Norwalk，CT）を含有する、100μlの反応液中で行なった。この反応混合液を、Perkin-Elmer 960 0 サーモサイクラーを使用して30サイクルの増幅に供した。各増幅サイクルは、 94℃で15秒間のcDNAの変性、その後の52℃で50秒間のプライマーのアニーリング、および72℃で90秒間の増幅を含んだ。この後、72℃で10分間の伸長を行なった。効率的かつ再現性の高いDNAホモログ合成を本明細書中で規定したプライマーを用いて達成された。これは、約680bpの主要バンドを有する増幅されたcDNA V_H コードホモログおよび約660bpで主要バンドを有する増幅されたcDNA V_κコードホモログを生成する。アガロースゲル電気泳動によって、すべての増幅が成功であったこと、および同様の収量が達成されたことを確認後、V_HコードDNAホモログおよびV_LコードDNA ホモログを別々にプールし、そして0.8％ Seaplaque GTG Agarose（FMC，Rockla nd,ME）上で製造者の指示に従ってゲル精製した。V_L コードDNAホモログのベクターへの連結各軽鎖プライマー伸長反応からの産物の等しい部数をUC⁺のプールされたV_Lライブラリーを作製するために混合した。プールされたV_Lライブラリーを、プールされたV_Lライブラリー１mg当たり70ユニットのXba Iおよび、プールされたV_Lライブラリー１mg当たり35ユニットのSac Iで二重消化した。（すべての制限酵素は、Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN.から入手可能である。）消化された産物を、上記のように再度ゲル精製し、そして約660bpのDNAフラグメントを含むゲルの領域を切り出し、アガロースから抽出し、そしてエタノール沈澱した。得られるV_LDNAホモログは、pComb 3ファージミドLc2発現カセットへの指向性連結のために適合させた粘着末端を有するκ軽鎖ポリペプチド遺伝子のレパートリーを表わす。 pComb 3ファージミドLc2発現カセットを、軽鎖DNAホモログを挿入するために、280ユニットのXba Iおよび160 ユニットのSac I制限エンドヌクレアーゼおよび、製造者によって推奨される緩衝液を含む溶液に30μgのファージミドを混ぜることによって調製する。この溶液を、37℃で３時間維持した。溶液を、２mlグリコーゲン、１/10容量の３M NaAc、2.5容量エタノールを用いて-20℃で１時間沈澱させ、次いでペレット化し、そして70％エタノールで洗浄した。ペレットを、水中に再懸濁し、そして0.8％１× TAE Seplaque 676上でゲル精製した。４k bのバンドを切り出し、フェノール抽出し、LiCl₃処理し、そしてPCR産物と同様にエタノール沈澱させた。次いで、Lc2発現カセットを、上記で調製されたV_LコードDNAホモログとの連結のために用意した。次いでこれらのV_LコードDNAホモログを、Xba IおよびSac I で制限消化されたLc2発現カセット中に直接挿入した。これは、0.45μgのV_LDNA ホモログを1.4μgの消化されたpComb 3（Scripps Research Institute，La Joll a，CaliforniaのCarlos Barbas III博士によって好意で提供された、そして本発明書中で参考として援用するBarbasら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88:7978-7 982（1991）に記述される）中に連結することにより行った。連結は、10ユニットのリガーゼを使用して、200μl容量リガーゼ緩衝液中に25℃で一晩保存し、次いで65℃で15分間（Boehringer-Mannheim）維持することにより加熱して殺すことにより、DNAを沈澱させ、70％エタノールで洗浄し、そして15μlの10mM MgCl₂ 中に再懸濁した。V_L ライブラリーを含むベクターによる宿主の形質転換 Escherichia coli XLI-Blue細胞（Stratagene，La Jolla，CA）を、エレクトロポーレーションにより再懸濁されたDNAで形質転換した：E．coli OD₆₀₀=0.8の１Lを４mlの細胞まで濃縮することによって作製されたストックの300μlを、15 μlのDNA（約２μg）（連結混合液のすべて）でエレクトロポーレーションした。形質転換された細胞を100μg/mlカルベニシリンを含有するsuper brothの増殖によるプラスミドの抗生物質耐性によって選択した。ライブラリーの大きさは、６％の再連結バックグランドで8.6×10⁷個形質転換体であった。抗生物質耐性コロニーを、10μg/mlテトラサイクリン、20μg/mlカルベニシリン、40mMグルコース、および10mM MgCl₂を補充したsuper broth（「SB」）培地（水１L当たり、30gトリプトン、20g酵母抽出物、および10g 3[N-モルホリノ]プロパン−スルホン酸（Mops）、pH７に調製した）中の37℃での液体培養における増殖によって増幅した。κV_LポリペプチドをコードするpComb 3ファージミド（「κ-pComb 3ファージミド」）を、Qiagen-tips^TM、Qiagen，Chatsworth，CAの陰イオン交換樹脂を製造者の使用説明書に従って使用して単離した。単離された κ-pComb 3ファージミドを、κ-pComb 3ファージミド１mg当たり10ユニットのXh o Iおよび３ユニットのSpe Iで二重消化した。反応混合液を、エタノール沈澱し、そして4.7Kbの二重切断されたファージミドを、前のように0.8％ Seaplaque T AEゲル上でゲル精製した。κ-pComb 3ファージミドを、この時点で重鎖ライブラリーとの連結のために準備した。V_H コードDNAホモログのベクター中への連結および宿主の形質転換各重鎖プライマー伸長からの産物の等しい部数を、プールされたV_HをコードDN Aホモログライブラリーを生成するために混合した。プールされたV_Hライブラリーを、Xho IおよびSpe Iヌクレアーゼで消化によってκ-pComb 3ファージミドの Hc2発現カセットへの連結のために調製した。従って、プールされたV_Hライブラリーを、プールされたV_Hライブラリー１mg当たり70ユニットのXho Iおよび17ユニットのSpe Iで二重消化した。次いで、0.40μgの消化された重鎖ライブラリーを200μl容量のリガーゼ緩衝液中の10ユニットのリガーゼを使用して上記の消化されたκ-pComb 3ファージミド1.4μgと連結した。この反応を、65℃で15分間加熱して殺すことにより停止させた。DNAを、沈澱させ、ペレットを15μlのl0mM M gCl₂中に再懸濁し、そしてE．coli XLI-Blue細胞をエレクトロポーレーションするのに使用した。エレクトロポーレーションされた細胞を、グルコースが含まれていなかったことを除いては上記のように補充されたSB中で増殖させた。このライブラリーの大きさは、重鎖クローニング後、14％の再連結バックグランドで4. 9×10⁷個であった。ベクター中のV_HコードDNAホモログおよびV_Lコードホモログの両方の存在は、７クローンのうち７つが両方のホモログを含むことが、制限分析により証明された。次いで、エレクトロポーレーションされたE．coli XLI-Blue細胞の10 mlの培養物を、50μg/mlカルベニシリン、10μg/mlテトラサイクリン、および10mM MgC l₂を補充したSBに移し、そしてもう１時間インキュベートした。次いで、培養された細胞を、ファージミドDNAのセンス鎖のコピーの生成を開始させるために10¹ ² VCS-M13ヘルパーファージ（Stratagene，La Jolla，CA）に感染させた。ヘルパーファージを加えた後、混合液を、50μl/mlカルベニシリン、10μl/mlテトラサイクリン、および10 mM MgCl₂が補充されたされた100mlのSBに加えた。次いで、そのヘルパーファージを含む混合物を、繊維状バクテリオファージのアセンブリーを可能にするためにさらに２時間37℃でインキュベートした。ここで、cpIII バクテリオファージアンカードメインへ融合されたUC⁺の、発現されたヘテロ２量体の抗体物質は、バクテリオファージ粒子の表面へ取り込まれた。２時間後、混合物を、70μg/mlカナマイシンでスパイクし、ヘルパーファージが感染したE．coliを選択し、次いで、37℃で300rpmで一晩生育させた。ファージを、遠心分離により沈澱させて細菌細胞ペレットおよび100μg/mlカルベニシリンを有するLBプレート上にプレーティングすることによって決定されたコロニー形成単位（「CFU」）の力価を有するファージ含有上清を得た。実施例XVI パンニング 24ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを、10⁶個好中球を加え、それらを静置させ、風乾させ、次いで100％メタノールで固定することによってメタノール固定された好中球でコートした。各ウェルを、Tris緩衝化生理食塩水（「 TBS」）中３％ウシ血清アルブミン（「BSA」）を用いて１時間37℃でブロックした。ブロッキング溶液を除去し、そして250μl TBS中５X10¹¹個ファージを添加し、そして37℃で２時間インキュベートさせた。洗浄後、酸溶離し、そして中和し、溶離したファージ数をCFUによりモニターした。溶離されたファージを、E．coli XLI-Blueを再感染することにより増幅し、そして、パンニング/増幅サイクルを、少なくとも100倍富化されるまで５回くり返した。このようにして、好中球抗原との免疫反応性を有し、p-ANCAに対して富化されたファージのライブラリーを作製した。富化定量のために、元のライブラリーのアリコートを、ファージ回収における日々の変動を制御するために各富化サイクルと平行して再パンニングした。富化を、ファージの排出量に対する投入量の比によって計算し、そして、同じ日に行われた富化されていないライブラリーと比較した。パンニングもまた、96ウェルフォーマットにおいて、１ウェル当たり10¹¹個ファージを使ってフォーマットを比べるために行なった。実施例XVII UCの可溶性組み換え抗好中球抗体物質の調製およびライブラリースクリーニング可溶性ヘテロ２量体抗体物質、特にFabの調製を製造者の使用説明書に従ってQ iagen-tips^TMを使用してファージミドを単離することによって行った（Qiagen， Chatsworth，CA）。次いで、単離されたファージミドを、ファージミド１μg当たり17ユニットのSpe Iおよび50ユニットのNhe Iで消化してcpIII遺伝子セグメントを取り除いた。次いで、このファージミドDNAを、ゲル精製し、そして、1μ gファージミド当たり10ユニットのリガーゼを使用し、そして反応混合物を25℃ で一晩維持することによって自己連結した。この反応を、それを65℃で15分間維持することによって停止した。200ngのゲル精製されたフラグメントを、20μl容量中で自己連結し、そしてE．coli XLI-Blueを、０℃で0.2cmギャップキュベット（curette）中2.5kV、25μF、および200Rで、40μlのE．coliストック、および１μlの連結混合物を使用するエレクトロポーレーションにより形質転換するために使用した。シングルコロニーを、100μl/mlカルベニシリンを含有するLB 寒天プレートから拾い、そして10μg/mlテトラサイクリン、50μg/mlカルベニシリン、および20mM MgCl₂を補充したSB 10ml中で６時間増殖させた。次いで、培養物を１mMイソプロピル６-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）（United S tates Biochemicals，Cleveland，OH）の添加により誘導し、そして一晩増殖させた。ファージを遠心分離により単離し、細菌細胞ペレットおよびファージ含有上清を得た。上清を取り出し、そして、上記のようにκ-捕獲 ELISAによりFab生成について分析した。これは、ヤギ抗ヒトFabアルカリホスファターゼ（Pierce ，Rockland，IL）で検出する。富化ライブラリーおよび未富化ライブラリー由来の各10クローンを、比較のために選択した。未富化ライブラリー由来の10クローンのうちの６つが、κ-捕獲 ELISAによりアッセイされたとき、有意な量のFabを生産した。対照的に、富化ライブラリー由来の10クローンのうちの10が、Fabを生産した。これは、富化ライブラリーが、Fab発現について明確に選択されたことを示す。これらのクローンもまた、アルコール固定された好中球のELISAによって好中球結合について分析した。未富化ライブラリー由来の10クローンはいずれも好中球を結合しなかったが、富化ライブラリー由来のすべてのクローンが貧欲な好中球結合を実証した。富化ライブラリーおよび未富化ライブラリー由来のFab中の重鎖および軽鎖の使用量の多様性を、シングルFabをコードするファージミド４μgを20ユニットの BSTN1（New England Biolabs，Beverly，MA）で消化し、そして３％アガロースゲル上でフラグメントを分析することによってモニターした。未富化ライブラリー由来の30クローンのそれぞれは、別々の消化パターンを示したが、富化ライブラリー由来のクローンはたった２つのクローナルパターンを示した。従って、これらの２つのパターン（５-３および５-４）の代表的クローンを、下記のように DNA配列決定によって直接分析した。実施例XVIII Fabの精製富化ライブラリーおよび未富化ライブラリーの両方を、pComb 3からC₃AP313H₆ へ移した。C₃AP313H₆はpComb 3誘導体であり、６つのヒスチジンをFabのＣ末端へ融合させ、Spe IおよびNhe I消化後にcpIIIアンカードメインを取り除く。（C₃ AP313H₆は、Carlos Barbas III，Scripps Research Institute，La Jolla，Cal iforniaから贈与された。）ライブラリーを、pComb 3のHc2およびLc2発現カセットからV_HコードポリヌクレオチドおよびV_Lコードポリヌクレオチドを取り出し、そしてこれらを連続的にC₃AP313H₆に連結することにより移行した。E．coli XLI -Blue細胞を、エレクトロポレーションによって新たなファージミドで形質転換した。個々のコロニーを、100μl/mlカルベニシリンを補充したLB寒天選択によって単離した。富化ライブラリー由来の５-３クローンを、大規模精製のために選択した。シングルコロニーを拾い、そして10μg/mlテトラサイクリン、50μg/mlカルベニシリン、10mM MgCl₂、および40mMグルコースを補充したSB 10ml中で一晩増殖させた。細菌の培養物を、グルコースを取り除くために遠心分離によってペレット化し、そして細胞ペレットを、50μg/mlカルベニシリンおよび20mM MgCl₂を含む１ LのSBへ移した。XLI-Blue細胞を、吸光度（OD₆₀₀）が0.6から0.8の間になるまで、300rpmで振とうしながら37℃で生育させた。次いで、その細胞培養物を、ヘテロ２量体の抗体物質を発現させるために４mM IPTGで誘導し、そして30℃で一晩増殖させた。細胞培養物を遠心分離して、XLI-Blue細胞をペレット化し、そしてペレットを30ml超音波処理緩衝液（50mM NaPO₄、300mM NaCl₂、0.01％NaN₃、 pH7.9）に再懸濁した。再懸濁された細胞を、50％出力（40W超音波破砕機、Tekm ar，Cincinnati，OH）で15秒間のバーストで８回超音波処理した。この超音波処理物を、Beckman JA-20遠心分離機において15,000rpmで４℃で40 分間遠心分離し、そして、上清を連続的に0.45および0.22ミクロンNytex フィルター（Amicon，Beverly，MA）を通して濾過した。超音波処理物を、直ちに20ml/ 時間で１ml NTA-Niカラム（Qiagen）にのせ、そして、吸光度（OD₂₈₀）が0.01未満になるまで超音波処理緩衝液（代表的には40〜50ml）で洗浄した。次いで、カラムを超音波緩衝液中10mMのイミダゾール10mlで夾雑物を取り除くために洗浄し、その後100mM，250mM，および500mMイミダゾール各10mlで洗浄し、OD₂₈₀によってモニターされる１ml画分を集めた。アリコートを、どこにFabが溶出されているかを決定するためにSDS-PAGE 12％変および還元ゲルによって分析した。イミダゾールの存在のために、ローディング染料を有するサンプルを、煮沸しなかったが、そのかわり、のせる前に37℃で10分間変性させた。代表的には、Fabは、1 00mMイミダゾール洗浄の最初３つの画分中に溶出する。次いで、Fabを含む１ml画分をプールし、そしてイミダゾールを取り除くためにAmiconの透析膜を使用してPBSに対して透析した（６-８kDカットオフメンブレン）。サンプルを濃縮し、そして、全ての遊離の重鎖または軽鎖を、Centricon 50^TM（Amicon Corporation，Beverly，MAからの遠心分離透析膜）を使用して除去した。奇妙にも、精製された画分中の計算された抗体レベルは、ELISA（抗κ ）試験に対して総タンパク質（Bio-rad Protein Assay，Richmond，CA）が異なっていた。細菌培養物比当たり、Fab収量は、免疫アッセイによって約0.1mgであるのに対して総タンパク質アッセイによって約１mgであった。この研究でのタンパク質の使用は、ELISA免疫反応性を利用したので、Fab濃度は、ELISA法を使用して報告される。５-３Fabを、本明細書中に記載のアッセイを使用して特徴付けた。固定好中球へのELISAフォーマットにおける強力な結合（おおよそ0.1μg/ml）。最適な結合が１％血清（または、おおよそ0.1μg/ml総IgG）で起きたので、５-３ p-ANCA F abがUC血清と比較して貧欲であることもまた、注目に値する。おおよそ１％の過免疫血清が抗原特異的であると評価したら、ネイティブなp-ANCA IgGのレベルは、１価のFabによって結合されるために、おおよそ１μg/ml、または同様の範囲である。炎症性疾患において、ANCA型マーカー抗体は、ある規定された好中球タンパク質に対して特異的である。５-３ p-ANCA FabをカセプシンG、エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、およびラクトフェリンについてELISAフォーマット中で免疫反応性について試験した。結合は、500ng/mlまでの５-３ p-ANCA Fabでも検出されなかった。５-３ p-ANCA Fabを、p-ANCA染色パターンについてアルコール固定好中球IIF アッセイによっても試験した。５-３ p-ANCA Fabによる好中球染色の免疫蛍光検出は、従来のUC血清によって生成されたのと同じp-ANCA染色パターンを生じた。５-３ p-ANCA Fabの免疫反応性を、上記の実施例VIにしたがって、DNase感受性について試験した場合、従来のp-ANCA血清陽性UC血清についてのように、好中球のDNase I処理が、検出可能なp-ANCA染色パターンの完全な消失を引き起こした。さらに、共焦点顕微鏡は、５-３ p-ANCA Fabが核膜の内側に局在する抗原と結合することを実証した。この特徴はp-ANCA血清陽性UC血清中に見つかった。実施例XIX 核酸配列決定核酸配列決定を、重鎖および軽鎖に対する5'および3'プライマー（それぞれ配列番号21および22、ならびに配列番号23および24）、およびSequenase 1.0（Uni ted States Biochemicals）を使用して、５-３および５-４クローンの２本鎖DNA で行なった。ホモロジー検索および整列を、Genebankを使用して実施した。本発明は、現在好ましい実施態様を参照して記載されているが、本発明の精神から逸脱すること無く種々の改変が行われ得ることが理解されるはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中の１型自己免疫性肝炎に関連する核周辺抗好中球細胞質抗体（p- ANCA）の存在を検出する方法であって、以下の工程： (a)固定好中球と、サンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA 、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、該固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、該検出可能な２次抗体が、p-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程； (b)結合していない２次抗体を該免疫複合体から分離する工程；および (c)コントロールに比較して該複合体の染色パターンを検出する工程であって、ここで、該コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない該固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、該サンプルにおける顆粒状細胞質染色パターンの存在および該コントロールにおける核周辺染色パターンは、該サンプルにおける１型自己免疫性肝炎と関連するp-ANCAの存在を示す、工程、を包含する、方法。２．前記固定好中球が、アルコール固定好中球である、請求項１に記載の方法。３．前記アルコール固定好中球が、メタノール固定好中球である、請求項２に記載の方法。４．核または細胞の形態の実質的な消失を伴わずに、細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるに十分な前記条件が、前記好中球を、緩衝液１mlあたり約２〜約10 単位のDNaseのDNase濃度において、約15分間〜約１時間の範囲の時間、約22℃〜約40℃の範囲の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項３に記載の方法。５．前記２次抗体が抗IgGである、請求項４に記載の方法。６．サンプル中の原発性硬化性胆管炎に関連する核周辺抗好中球細胞質抗体（p- ANCA）の存在を検出する方法であって、以下の工程： (a)固定好中球と、サンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA 、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、該固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、該検出可能な２次抗体が、p-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程； (b)結合していない２次抗体を該免疫複合体から分離する工程；および (c)コントロールに比較して該複合体の染色パターンを検出する工程であって、ここで、該コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない該固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、該サンプルにおける均質な細胞質染色パターンの存在および該コントロールにおける核周辺染色パターンは、該サンプルにおける原発性硬化性胆管炎と関連するp-ANCAの存在を示す、工程、を包含する、方法。７．前記固定好中球が、アルコール固定好中球である、請求項６に記載の方法。８．前記アルコール固定好中球が、メタノール固定好中球である、請求項７に記載の方法。９．核または細胞の形態の実質的な消失を伴わずに、細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるに十分な前記条件が、前記好中球を、緩衝液１mlあたり約２〜約10 単位のDNaseのDNase濃度において、約15分間〜約１時間の範囲の時間、約22℃〜約40℃の範囲の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項８に記載の方法。１０．前記２次抗体が抗IgGである、請求項９に記載の方法。１１．原発性硬化性胆管炎と１型自己免疫性肝炎とを区別する方法であって、以下の工程： (a)固定好中球と、サンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA 、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、該固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、該検出可能な２次抗体が、p-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程； (b)結合していない２次抗体を該免疫複合体から分離する工程；および (c)コントロールに比較して該複合体の染色パターンを検出する工程であって、ここで、該コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない該固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、該サンプルにおける均質な細胞質染色パターンの存在および該コントロールにおける核周辺染色パターンは、原発性硬化性胆管炎を示し、そしてここで、該サンプルにおける顆粒状細胞質染色パターンの存在および該コントロールにおける核周辺染色パターンは、１型自己免疫性肝炎を示す、工程、を包含する、方法。１２．前記固定好中球が、アルコール固定好中球である、請求項１１に記載の方法。１３．前記アルコール固定好中球が、メタノール固定好中球である、請求項１２に記載の方法。１４．核または細胞の形態の実質的な消失を伴わずに、細胞DNAの実質的に完全な消化を生じるに十分な前記条件が、前記好中球を、緩衝液１mlあたり約２〜約 10単位のDNaseのDNase濃度において、約15分間〜約１時間の範囲の時間、約22℃ 〜約40℃の範囲の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項１３に記載の方法。１５．前記２次抗体が抗IgGである、請求項１４に記載の方法。１６．潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、クローン病、および１型自己免疫性肝炎を区別する方法であって、該方法は、以下の工程： (a)固定好中球と、サンプルおよび検出可能な２次抗体とを、好中球、p-ANCA 、および検出可能な２次抗体の免疫複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程であって、ここで、該固定好中球の細胞DNAは、核または細胞の形態の顕著な消失を伴わずにDNaseにより消化されており、そしてここで、該検出可能な２次抗体が、p-ANCAのクラス決定部分に特異的である、工程； (b)結合していない２次抗体を該免疫複合体から分離する工程；および (c)コントロールに比較して該複合体の染色パターンを検出する工程であって、ここで、該コントロールは、固定好中球の細胞DNAがDNaseにより消化されていない該固定好中球を用いて本方法を繰り返した結果であり、そしてここで、該コントロールと比較して、核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体の消失は、潰瘍性結腸炎を示し、ここで、該コントロールと比較して、核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体の、均質な細胞質染色パターンへの変換は、原発性硬化性胆管炎を示し、ここで、該コントロールと比較して、核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体の、顆粒状細胞質染色パターンへの変換は、１型自己免疫性肝炎を示し、そしてここで、該コントロールにおける核周辺染色パターンに関連する検出可能な複合体が存在しないことは、クローン病を示す、工程、を包含する、方法。