DE69626026T2

DE69626026T2 - Differentialtest für ulzerative kolitis, primäre sklerosierende cholangitis und autoimmun-hepatitis vom type 1.

Info

Publication number: DE69626026T2
Application number: DE69626026T
Authority: DE
Inventors: Stephan Targan; Alda Vidrich
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: IL122480A0; US5830675A; AU705480B2; EP0846266A4; CA2223642A1; CA2223642C; NZ310079A; ATE231972T1; JP3386815B2; EP0846266A1; JPH11507130A; NO975688L; NO321090B1; EP0846266B1; DE69626026D1; AU6040496A; NO975688D0; WO1996041183A1; MX9709440A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren und Kits zum Nachweis und Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von perinukleären anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern von Colitis ulcerosa, primärer sklerosierender Cholangitis oder Typ 1 Autoimmun-Hepatitis. Spezieller setzen die Verfahren und Kits der Erfindung eine DNase-Behandlung von Neutrophilen in Assays, wie ELISA und Immunfluoreszenz, ein, um den Verlust eines positiven Kontrollwerts zu ermitteln, wenn der Antikörper vorhanden ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist der Sammelbegriff, der verwendet wird, um zwei Magen-Darm-Erkrankungen zu beschreiben, Colitis ulcerosa („UC") und Crohn'-Krankheit („CD"). IBD tritt weltweit auf und es wird berichtet, dass zwei Millionen Menschen an ihr leiden. Der Ausbruch ist in allen Altersstufen dokumentiert worden; jedoch befällt IBD überwiegend junge Erwachsene.
Die drei am häufigsten vorhandenen Symptome von IBD sind Durchfall, Bauchschmerzen und Fieber. Der Durchfall kann von mild bis schwer reichen und geht oftmals mit Dringlichkeit und Häufigkeit einher. Bei UC ist der Durchfall üblicherweise blutig und kann auch Schleim und eitriges Material enthalten. Anämie und Gewichtsverlust sind zusätzliche übliche Anzeichen von IBD.
Es wird eine Batterie von im Labor erfolgenden, radiologischen und endoskopischen Auswertungsmethoden kombiniert, um eine Diagnose abzuleiten und um das Ausmaß und die Schwere der Erkrankung zu bestimmen. Nichtsdestotrotz ist das Unterscheiden von UC von CD wie auch anderen Typen von entzündlichen Leiden der Darmabschnitte, wie Reizkolon, infektiöse Diarrhöe, rektale Blutung, Strahlencolitis und dergleichen, schwierig. Tatsächlich muss abhängig von dem Zeitraum der Nachbetreuungszeitspanne bei vielen Patienten die Colitis aufgrund der überlappenden Merkmale von UC und CD, insbesondere bei CD des Kolons, als unbestimmt angesehen werden oder kann nicht definitiv diagnostiziert werden.
Die selektive Identifizierung von UC in Abgrenzung zu CD oder anderen entzündlichen Leiden der Darmabschnitte bringt wichtige Implikationen für Prognose und Therapie mit sich. Wenn beispielsweise eine Kolektomie angezeigt erscheint, bestimmt der beteiligte Typ von IBD, welche chirurgischen Optionen angemessen sind. Ein chirurgischer Eingriff (vollständige Kolektomie) stellt bei UC eine Heilung, gleichwohl eine dramatische, dar. Bei CD ist ein chirurgischer Eingriff niemals heilend. Kontinente Maßnahmen, wie der iliorektale Durchzug (Schleimhautprotektomie) oder der Kock-Beutel („Kock pouch"), können bei UC wünschenswert sein, sind aber bei CD kontraindiziert.
Die Verfügbarkeit eines diagnostischen Markers, der UC von CD des Kolons und anderen Colitiden leicht unterscheiden würde, würde einen bedeutenden klinischen Fortschritt darstellen. Ein bequemer und verlässlicher Bluttest, mittels dessen die Krankheitsaktivität verfolgt oder sogar ein bevorstehender sprunghafter Aktivitätsanstieg vorhergesagt werden könnte, würde einen gewaltigen Vorteil bei der therapeutischen Behandlung von IBD bereitstellen und zur Gestaltung von spezielleren Behandlungsmodalitäten beitragen.
Obwohl die Ursache(n) von UC und CD nicht bekannt sind, gibt es eine allgemeine Übereinkunft dahingehend, dass das Immunsystem für die Vermittlung der Gewebeschädigung bei diesen Krankheiten verantwortlich ist. Bei diesen Krankheiten ist über ein breites Spektrum von immunologischen Abnormalitäten berichtet worden, aber keine ist bislang ausreichend verlässlich gewesen, um von diagnostischem Wert zu sein.
Bei UC-Patienten sind verschiedene Autoantikörper beobachtet worden. Unter diesen Antikörpern sind lymphozytotoxische Antikörper und Kolonepithel-Antikörper am bemerkenswertesten gewesen. Obwohl diese genetische und pathophysiologische Implikationen haben können, sind sie für eine Diagnose entweder aufgrund der geringen Häufigkeit ihres Auftretens oder fehlender Spezifität nicht nützlich gewesen.
Zwei andere entzündliche Erkrankungen, von denen ebenfalls vermutet wird, dass sie Autoimmun-Ätiologien aufweisen, sind primäre sklerosierende Cholangitis („PSC") und Typ 1 Autoimmun-Hepatitis („Typ 1-AIH"). Wie UC und CD weisen diese Lebererkrankungen gemeinsame äußerliche Symptome auf, die die Verwendung von invasiven Techniken, wie Leberbiopsie und/oder ERCP, erforderlich machen, um mit AIH und PSC verbundene Leberabnormalitäten zu unterscheiden.
PSC ist durch eine obliterative entzündliche Fibrose der extrahepatischen Gallengänge mit oder ohne Beteiligung der intrahepatischen Gänge gekennzeichnet. Die Krankheit schreitet im allgemeinen in einer unerbittlichen, obgleich nicht vorhersagbaren Weise zu Zirrhose, portaler Hypertonie und Tod aufgrund von Leberversagen fort. PSC kann allein oder in Kombination mit UC und weniger häufig mit verschiedenen anderen Erkrankungen auftreten. Symptome umfassen gewöhnlich Gelbsucht, Puritis und unspezifische Oberbauchschmerzen. Eine medizinische Behandlung von PSC umfasste Corticosteroide, Antibiotika, immunsupprimierende Mittel und Cholezystagoga allein oder in Kombination. Im allgemeinen waren die Ergebnisse mit diesen allen enttäuschend.
AIH ist eine Erkrankung von unbekannter Ätiologie, bei der eine fortschreitende Zerstörung des Leberparenchyms auftritt, die sich oftmals zu Zirrhose weiterentwickelt, und sie bringt in den schwereren Fällen eine hohe Mortalitätsrate mit sich, wenn sie unbehandelt bleibt. Obwohl diese Erkrankung bei Frauen vorherrschend ist, befällt sie auch Männer. Leichte Ermüdbarkeit ist das häufigste Symptom bei der Vorstellung und bis zu 77% der Patienten beschreiben auch Merkmale von Gelbsucht, milde Oberbauchbeschwerden, Pruritus, Anorexie, Polymyalgien, Diarrhöe und verzögerte Menarche oder Amenorrhoe sind häufige Beschwerden. Kosmetische Veränderungen, einschließlich Rundwerden des Gesichts, Hirsutismus und Akne. Das histologische Kennzeichen von AIH ist periportale oder Mottenfraß-Nekrose. Das Leiden wird als unheilbar mit einer schlechten Prognose angesehen; eine spontane oder anhaltende Remission wird als selten angesehen. Es ist berichtet worden, dass eine Kombinationsbehandlung mit Prednison und Azathioprin die Lebenserwartung signifikant verbessert und klinische, biochemische und immunchemische Abnormalitäten normalisiert. Typ 1-AIH ist die häufigste Form von Autoimmun-Hepatitis in den Vereinigten Staaten und sie ist mit Seropositivität bezüglich Antikörpern gegen das glatte unwillkürliche Muskelgewebe oder antinukleären Antikörpern, Hypergammaglobulinämie, gleichzeitigen immunologischen Störungen oder Erkrankungen, HLA-Positivität für A1, B8, DR3 oder DR4 verbunden und spricht auf eine Corticosteroid-Therapie an.
Es ist unlängst gezeigt worden, dass p-ANCA sowohl mit Typ 1-AIH als auch PSC assoziiert ist. Es wird berichtet, dass p-ANCA bei bis zu 70% der PSC-Patientenseren gefunden wird, während festgestellt worden ist, dass bis zu 92% der Seren von Patienten mit wohldefinierter Typ 1-AIH hohe p-ANCA-Titer exprimieren. Diese Entdeckung ist jedoch aufgrund einer Unfähigkeit, zwischen den mit jeder Krankheit assoziierten p-ANCA zu unterscheiden, von begrenzter klinischer Anwendbarkeit bei der Diagnose dieser hepatobiliären Entzündungskrankheiten gewesen.
Dementsprechend gab es einen Bedarf an einem bequemen und verlässlichen Verfahren, um UC von CD des Kolons und PSC von Typ 1-AIH für diagnostische, prognostische und therapeutische Zwecke zu unterscheiden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren zum Nachweis und Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von perinukleären anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern („p-ANCA") von Colitis ulcerosa („UC"), primärer sklerosierender Cholangitis („PSC") oder Typ 1 Autoimmun-Hepatitis („Typ 1-AIH") in einer Probe bereit. Spezieller wird die Anwesenheit von p-ANCA von UC, PSC oder Typ 1-AIH detektiert, indem der Verlust eines positiven Werts (d.h. der Verlust eines detektierbaren Markers im Vergleich zu einer Kontrolle) nach einer Behandlung von Neutrophilen mit DNase bestimmt wird. Die Erfindung zeigt, dass der mit Typ 1-AIH assoziierte p-ANCA sich von jenem, der mit PSC assoziiert ist, unterscheidet und dass jeder von diesen p-ANCA verschieden ist von dem p-ANCA, der mit UC in Verbindung steht. Auf diese Unterschiede kann man sich stützen, um auf jeden der p-ANCA, die mit dem p-ANCA assoziierte Krankheit zu screenen und um zwischen den drei zu differenzieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen Verfahren zum Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von perinukleären anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern (p-ANCA), die mit Colitis ulcerosa, primärer sklerosierender Cholangitis oder Typ 1 Autoimmun-Hepatitis assoziiert sind, in einer Probe, die Probe und einen detektierbaren sekundären Antikörper mit fixierten, mit DNase behandelten Neutrophilen zu kontaktieren unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Komplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikör pers zu bilden, ungebundenen sekundären Antikörper von dem Komplex zu trennen und das Muster der p-ANCA-Immunreaktivität zu bestimmen, indem die Anwesenheit, Abwesenheit oder das Muster von komplexiertem sekundärem Antikörper im Vergleich zu einer Kontrolle detektiert wird. Eine DNase-Behandlung von Neutrophilen führt zu einem im wesentlichen vollständigen Verdau von zellulärer DNA ohne signifikanten Verlust von nukleärer oder zellulärer Morphologie. Die Kontrolle ist das Resultat einer Wiederholung des erfinderischen Verfahrens an einer Probe derselben Herkunft mit der Ausnahme, dass die Neutrophilen keiner DNase-Behandlung unterworfen werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren und Kits zum Nachweis der Anwesenheit von perinukleären anti-neutrophilen zytoplasmatischen Autoantikörpern (p-ANCA) für Colitis ulcerosa (UC), primäre sklerosierende Cholangitis (PSC) oder Typ 1 Autoimmun-Hepatitis (Typ 1-AIH) in einer Probe bereit. Erfinderische Verfahren umfassen, den Verlust eines positiven Werts (im Vergleich zu einer Kontrolle) nach einer Behandlung von Neutrophilen mit DNase zu bestimmen. Die erfinderischen Verfahren umfassen auch den Nachweis eines besonderen Färbungsmusters, das mit der Anwesenheit eines mit einer bestimmten Krankheit assoziierten p-ANCA korreliert werden kann.
Wie der Name sagt, werden Antikörper gegen zytoplasmatische Komponenten des Neutrophils im Serum von Patienten mit bestimmten chronischen entzündlichen Leiden gefunden. Anhand von Immunfluoreszenzmikroskopie ist ANCA-Aktivität in zwei breite Kategorien eingeteilt worden: zytoplasmatische Neutrophilen-Färbung (hier bezeichnet als „c-ANCA-Färbungsmuster" oder „zytoplasmatisches Färbungsmuster") und zytoplasmatische Anfärbung mit perinukleärer Hervorhebung (hier bezeichnet als „p-ANCA-Färbungsmuster" oder „perinukleäres Färbungsmuster"). Diese unterschiedlichen Färbungsmuster werden mit Alkohol fixierten zytozentrifugierten Neutrophilen erhalten. Es ist berichtet worden, dass das p-ANCA-Färbungsmuster ein Artefakt der Alkoholfixierung ist, der resultiert, wenn zytoplasmatische Granula sich an die Peripherie des Kerns während des Fixierungsprozesses umlagern. Die Erfindung liefert jedoch den Nachweis, dass das perinukleäre Färbungsmuster von p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, keinen Artefakt darstellt, sondern vielmehr das Ergebnis einer spezifischen Bindung an ein DNAassoziiertes Antigen darstellt. Nichtsdestoweniger haben diese Färbungsmuster, unabhängig davon ob Alkohol-induziert oder aktuell, dazu gedient, zwischen Typen von ANCA, die aufgrund von einzigartigen Antigenen produziert werden und unterschiedliche Krankheits-Assoziierungen aufweisen, zu unterscheiden.
Die Verfahren der Erfindung nutzen die einzigartigen Färbungsmuster von UC, PSC und Typ 1-AIH im Vergleich zueinander, um CD und anderen Entzündungskrankheiten der Darmabschnitte aus, um ein bequemes und verlässliches Verfahren zur Identifizierung von UC, PSC oder Typ 1-AIH bereitzustellen, das die Unsicherheit beseitigt, die zuvor mit der Diagnostizierung und Behandlung von IBD und diesen Lebererkrankungen verbunden war.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zum Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA von UC oder PSC in einer Probe, welches umfasst: (a) Kontaktieren der Probe und eines detektierbaren sekundären Antikörpers mit immobilisierten Neutrophilen unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Komplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei der immobilisierte Neutrophile einer DNase unter Bedingungen, die ausreichend sind, um einen im wesentlichen vollständigen Verdau von zellulärer DNA ohne signifikanten Verlust von nukleärer oder zellulärer Morphologie herbeizuführen, vor dem Kontaktierungsschritt ausgesetzt wird, und wobei der sekundäre Antikörper Spezifität für p-ANCA oder den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA aufweist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Komplex; (c) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA enthaltendem Komplex durch Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von gebundenem sekundärem Antikörper im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung der Schritte des vorliegenden Verfahrens an einer Probe derselben Herkunft mit der Ausnahme, dass der Neutrophile von Schritt (a) keiner DNase-Behandlung unterworfen wird, ist.
In einer damit in Beziehung stehenden Ausführungsform der Erfindung kann das gleiche Verfahren in einem indirekten Immunfluoreszenzassay-Format verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von mit Typ 1-AIH assoziiertem p-ANCA wie auch die Anwesenheit oder Abwesenheit von UC- oder PSC-p-ANCA zu detektieren. Dementsprechend wird ein Verfahren zum Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von mit UC, PSC oder Typ 1-AIH assoziierten p-ANCA in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kontaktieren der Probe und eines detektierbaren sekundären Antikörpers mit fixierten Neutrophilen unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die fixierten Neutrophilen vor dem Kontaktierungsschritt DNase ausgesetzt werden unter Bedingungen, die ausreichen, um einen im wesentlichen vollständigen Verdau von zellulärer DNA ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie herbeizuführen, und wobei der sekundäre Antikörper eine Spezifität für den Klassendeterminierenden Teil von p-ANCA aufweist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Bestimmen des Musters der p-ANCR-Immunreaktivität durch Detektieren der Anwesenheit, Abwesenheit oder des Musters von komplexiertem sekundärem Antikörper im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens an einer Probe derselben Herkunft mit der Ausnahme, dass die Neutrophilen keiner DNase ausgesetzt werden, ist.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Komplex" oder „Immunkomplex" auf das Produkt einer spezifischen Bindung zwischen einem eine antigene Determinante enthaltenden Molekül, wie einem Antigen, und einem Molekül, das eine Antikörperbindungsstelle enthält, wie beispielsweise einem Antikörpermolekül. Der Begriff „Immunreaktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit oder das Merkmal eines Moleküls, das eine Antikörperbindungsstelle aufweist, beispielsweise eines Antikörpermoleküls und dergleichen, spezifisch ein eine antigene Determinante enthaltendes Molekül, wie beispielsweise ein Antigen und dergleichen, zu binden.
In den Verfahren der Erfindung werden Neutrophile DNase ausgesetzt unter Bedingungen, die ausreichend sind, um einen im wesentlichen vollständigen Verdau von zellulärer DNA herbeizuführen. Mit dem Begriff „vollständiger Verdau von zellulärer DNA" ist ein derartiger Verdau der zellulären DNA gemeint, dass die zelluläre DNA ihre Fähigkeit, Proteine und andere zelluläre Materialien, die mit der zellulären DNA des Neutrophils normalerweise assoziiert sind, zu binden, im wesentlichen verloren hat. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, dass wenigstens ein Teil der Antigene von p-RNCA von UC und PSC Proteine sind, die entweder eng mit nukleärer DNA oder mit irgendwelchen Aspekten der Zellkernstruktur assoziiert sind.
Bedingungen, die ausreichend sind, um einen im wesentlichen vollständigen Verdau von zellulärer DNA herbeizuführen, werden gemäß der Reinheit und Konzentration der verwendeten DNase variieren und umfassen beispielsweise, den immobilisierten Neutrophilen in einer DNase-Konzentration von ungefähr 2 bis 10 Einheiten DNase pro Milliliter eines geeigneten Puffers für eine Zeitspanne im Bereich von ungefähr 15 min bis eine Stunde bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 22°C bis 40°C zu inkubieren.
Die Assays der Erfindung können vorwärts, umgekehrt/rückwärts oder gleichzeitig, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,376,110, erteilt am 08. März 1993 an David et al., beschrieben, sein. In dem Vorwärts-Assay wird jedes Reagens nacheinander mit immobilisierten Neutrophilen kontaktiert. Sofern gewünscht, kann eine Trennung von gebundenem von ungebundenem Reagens vor der Zugabe des nächsten Reagens erfolgen. In einem umgekehrten oder Rückwärts-Assay werden alle Reagenzien vor dem Kontaktieren mit immobilisierten Neutrophilen vorab gemischt. Ein modifiziertes Verfahren eines umgekehrten oder Rückwärts-Assays ist im U.S.-Patent Nr. 4,778,751, erteilt am 18. Oktober 1988 an El Shami et al., beschrieben. Bei einem gleichzeitigen Assay werden alle Reagenzien getrennt, aber gleichzeitig mit dem immobilisierten Neutrophilen kontaktiert. Die Schritte des gegenwärtig bevorzugten erfinderischen Assays werden nachfolgend detaillierter diskutiert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Reagens" auf eine jegliche Komponente, die nützlich ist, um die Assays der Erfindung auszuführen, beispielsweise die Probe, den primären Antikörper, den detektierbaren sekundären Antikörper, Waschpuffer, Lösungen und dergleichen.
Eine Probe kann aus einem beliebigen biologischen Fluid, beispielsweise Vollblut, Plasma oder anderen Körperfluiden oder -geweben, die p-ANCA enthalten, vorzugsweise Serum gewonnen werden.
Die Trennschritte für die verschiedenen Assayformate, die hier beschrieben werden, einschließlich des Entfernens von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Komplex, können durch Ver fahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgeführt werden. Sofern geeignet, ist ein einfaches Waschen mit einem geeigneten Puffer, gefolgt von Filtration oder Absaugen, ausreichend. Wenn die Neutrophilen an einem teilchenförmigen Träger immobilisiert sind, wie in dem Falle von Mikroteilchen z. B., kann es wünschenswert sein, das teilchenförmige Material zu zentrifugieren, gefolgt von einer Entfernung von Waschflüssigkeit. Wenn der oder die Neutrophile(n) an Membranen oder Filtern immobilisiert ist bzw. sind, ermöglicht das Anlegen eines Vakuums oder eines Flüssigkeit absorbierenden Elements an der gegenüberliegenden Seite der Membran oder des Filters, die Waschflüssigkeit durch die Membran oder den Filter zu ziehen.
Die Verfahren der Erfindung werden normalerweise bei Raumtemperatur und 37°C ausgeführt. Da die Verfahren die Verwendung von Proteinen umfassen, sollten Temperaturen, welche die Tertiär- oder Quartärstrukturen der Proteine substantiell modifizieren würden, vermieden werden. Dementsprechend reichen Temperaturen, die zum Ausführen der Verfahren der Erfindung geeignet sind, im allgemeinen von ungefähr 22°C bis ungefähr 38°C.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind Neutrophile an einem festen Substrat immobilisiert. Das feste Substrat kann ein jeglicher Träger sein, der in immunometrischen Assays nützlich ist. Das Substrat kann ausgehend von natürlichem oder synthetischem Material, das in Wasser unlöslich ist, hergestellt sein und kann steif oder nicht-steif sein. Jedoch sollte das Substrat die gewünschte Aktivität der Neutrophilen nicht signifikant beeinflussen. Bevorzugte Substrate umfassen Glas-Objektträger, Testvertiefungen, hergestellt aus Polyethylen, Polystyrol, Nylon, Nitrocellulose, Glas und dergleichen. Teströhrchen, Filterpapier, Filtriervorrichtungen, wie Glasmembranen, Körnchen und teilchenförmige Materialien, wie Agarose, vernetztes Dextran und andere Polysaccharide und dergleichen sind ebenfalls nützlich.
Gemäß den Verfahren und Kits der Erfindung kann eine Immobilisierung von Neutrophilen durch ein jegliches Verfahren, das in diesem Fachgebiet bekannt ist, bewerkstelligt werden. Es wird vorzugsweise ein Immobilisierungsverfahren verwendet, das die Neutrophilen für DNase und die in den Verfahren und Kits der Erfindung verwendeten Reagenzien durchlässig macht. Neutrophi1e können beispielsweise immobilisiert werden, indem man sie direkt an der Oberfläche einer Testvertiefung oder eines Glas-Objektträgers mittels einer geeigneten Fixierungssubstanz, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Formalin oder dergleichen, fixiert. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet wird es sich selbstverständlich verstehen, dass eine solche Fixierungssubstanz die nukleäre oder zelluläre Morphologie der Neutrophilen nicht substantiell verändern sollte.
Neutrophile und ein geeigneter sekundärer Antikörper für eine Verwendung bei der praktischen Ausführung der Erfindung werden von der Herkunft der dem Assay unterzogenen Probe abhängen. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe „Patient", „Subjekt" oder „Individuum" bei Bezugnahme auf die Herkunft der dem Assay zu unterziehenden Probe ein jegliches Tier, das in der Lage ist, p-ANCA von UC, PSC oder Typ 1-AIH zu produzieren, einschließlich beispielsweise Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Kaninchen, Ratten, Mäusen und dergleichen. Vorzugsweise werden Neutrophile und der sekundäre Antikörper, die eingesetzt werden, eine spezifische Reaktivität hinsichtlich der Spezies, aus welcher die zu testende Probe gewonnen wird, haben. Um beispielsweise p-ANCA von UC, PSC oder Typ I-AIH in einer von einem menschlichen Patienten gewonnenen Probe zu bestimmen, sind die Neutrophilen und der sekundäre Antikörper vorzugsweise für Menschen spezifisch. Wenn eine Mehrzahl von Antikörpern eingesetzt wird, ist vorzugsweise jeder Antikörper für dessen Antigen Spezies-spezifisch.
Neutrophile, die in der Erfindung nützlich sind, können ausgehend von verschiedenen Quellen, z. B. dem Blut eines Menschen, von nicht-menschlichen Primaten, Kaninchen, Ratten, Mäusen und dergleichen, durch Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, erhalten werden.
Der Begriff „sekundärer Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen jeglichen Antikörper oder eine jegliche Kombination von Antikörpern oder Fragmenten davon, von denen wenigstens einer bzw. eines p-ANCA von UC, PSC oder Typ I-AIH binden kann. Ein sekundärer Antikörper kann beispielsweise ein anti-p-ANCA-Antikörper sein, der für ein beliebiges Epitop von p-ANCA spezifisch ist, ist aber vorzugsweise keiner, der mit der Bindung der Neutrophilen konkurrieren würde oder eine sterische Behinderung der Neutrophiler/p-ANCA-Bindung verursachen würde. Alternativ kann ein sekundärer Antikörper ein anti-IgG sein, der vorzugsweise eine Spezifität für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA aufweist.
Sekundäre Antikörper, die bei der praktischen Ausführung der Erfindung nützlich sind, können durch Techniken, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, erhalten werden. Solche Antikörper können polyklonal oder vorzugsweise monoklonal sein. Polyklonale Antikörper können beispielsweise durch die Verfahren in Ghose et al., Methods of Enzymology, Band 93, 326–327 (1983) erhalten werden. Es können beispielsweise IgG oder Fc-Fragmente von IgG als Immunogen verwendet werden, um die Produktion von IgG-reaktiven polyklonalen Antikörpern in den Antiseren von Tieren, wie Kaninchen, Ziegen, Schafen, Nagetieren und dergleichen, zu stimulieren.
Monoklonale Antikörper, die bei der praktischen Ausführung der Erfindung nützlich sind, können aus zahlreichen kommerziell erhältlichen Quellen erhalten werden. Alternativ können die Antikörper beispielsweise durch das von Milstein und Kohler in Nature, 256: 495–97 (1975) beschriebene Verfahren oder wie durch Gerhard, Monoclonal Antibodies, 370–371 (Plenum Press, 1980) modifiziert, erhalten werden. Wenn ein Maus-anti-human IgG-Antikörper gewünscht wird, wird einer Maus zuerst ein Immunogen, das beispielsweise menschliches IgG oder Fc-Fragmente von menschlichem IgG enthält, injiziert. Die Maus wird nachfolgend getötet und aus ihrer Milz entnommene Zellen werden mit Myelomzellen durch Verfahren, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, fusioniert. Die resultierenden Hybridome werden gescreent, um Klone zu isolieren, die eine einzelne Antikörper-Spezies, die Reaktivität gegenüber menschlichem IgG zeigt, sezernieren.
Die Hybridome werden vorzugsweise gescreent, um jene zu identifizieren, die Antikörper produzieren, die für das IgG von Interesse hochspezifisch sind. Der ausgewählte monoklonale Antikörper wird eine Affinität haben, die mit der gewünschten Empfindlichkeit und dem gewünschten Spektrum zum Nachweisen von p-ANCA von UC oder PSC verträglich oder kompatibel ist. Die Verwendung solcher monoklonaler Antikörper stellt ein Mittel bereit, um in den Assays der Erfindung eine größere Empfindlichkeit im Vergleich zur Verwendung von polyklonalen Antikörpern zu erhalten.
Alternativ können monoklonale Antikörper mit einer hohen Affinität für p-ANCA von UC oder PSC durch die Erzeugung einer kombinatorischen Phagen-Bibliothek für p-ANCA von UC oder PSC und darauffolgendes Screening auf Spezifität durch ein ähnliches Verfahren, das in Barbas, C. F., et al., Proceedings of the Nat'l Academy of Science, 88: 7978–82 (1991) beschrieben worden ist, erhalten werden. Die nachfolgenden Beispiele ver anschaulichen Verfahren zur Herstellung einer kombinatorischen Phagen-Bibliothek eines Immunglobulin-Genrepertoires für UC wie auch Verfahren zum Screenen der Bibliothek auf p-ANCA, der mit UC assoziiert ist. Die Nukleinsäure und abgeleitete Aminosäuresequenz der schweren und leichten Fab-Immunglobulinketten der zwei Klone (5-3 und 5-4) von p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, werden in den SEQ ID NO. 1 bis 8 angegeben. Anti-Idiotyp-Antikörper gegen diese und andere Klone von p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, können durch Verfahren, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, erzeugt werden. Beispielsweise können polyklonale und monoklonale Antikörper produziert werden, wie beispielsweise in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Habor Laboratory 1988) beschrieben.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Idiotop-Spezies, die in der Lage ist, eine Immunreaktion mit einem bestimmten Epitop auf einem Antigen oder Idiotop an einem Antikörper einzugehen, enthalten. Ein monoklonaler Antikörper zeigt typischerweise eine einzelne Bindungsaffinität für ein Epitop oder Idiotop, mit dem es eine Immunreaktion zeigt; ein monoklonaler Antikörper kann jedoch ein Molekül sein, das eine Mehrzahl von Idiotopen aufweist, wobei jedes für ein unterschiedliches Epitop oder Idiotop immunspezifisch ist, z. B. ein bispezifischer monoklonaler Antikörper.
Monoklonale Antikörper werden typischerweise aus Antikörpern gebildet, die von Klonen einer einzelnen Zelle, die als Hybridom bezeichnet wird, die lediglich eine Art von Antikörpermolekül sezerniert (produziert), produziert werden. Gemäß der Erfindung werden Hybridome bereitgestellt, die in der Lage sind, Antikörpermaterial mit einer spezifischen Immunreaktivität gegenüber p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, das aber die Immunreaktivität von p-ANCA gegenüber Neutrophilen nicht verhindert, zu produzieren. Eine solche Hybridomzelle wird gebildet, indem eine Antikörper-produzierende Zelle und ein Myelom oder andersartige sich selbst erhaltende Zelllinie fusioniert werden. Die Herstellung von solchen Hybridomen wurde erstmals von Kohler und Milstein, Nature, 256: 495–497 (1975) beschrieben. Die Polypeptid-induzierte Hybridom-Technik wird auch von Niman et al., Proc. Natl. Sci., U.S.A., 80: 4949–4953 (1983) beschrieben.
Um eine Antikörper-produzierende Zelle für eine Fusion mit einer immortalisierten Zelle zu erhalten, wird ein Säugetier mit einem Immunogen inokuliert. Das Wort „Immunogen" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die einen p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, als aktiven Bestandteil enthält, der für die Herstellung der Antikörper gegen p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, verwendet wird.
Die Menge von p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, die verwendet wird, um das Säugetier zu inokulieren, sollte ausreichend sein, um eine Immunantwort gegen das immunisierende Polypeptid zu induzieren. Diese Menge hängt unter anderem von der Spezies des inokulierten Tiers, dem Körpergewicht des Tiers und dem gewählten Inokulationsschema ab, wie in diesem Fachgebiet wohlbekannt ist. Inokula enthalten typischerweise ungefähr 10 Mikrogramm Immunogen pro Inokulation für Mäuse und können bis zu ungefähr 500 Milligramm Immunogen pro Inokulation für größere Säugetiere enthalten.
Die Milzzellen des mit p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, immunisierten Säugetiers werden dann gewonnen und können mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) 1500 fusioniert werden. Fusionierte Hybride werden anhand ihrer Empfindlichkeit gegenüber HAT ausgewählt. Hybridome, die einen idiotypischen monoklonalen anti-p-ANCA-Antikörper produzieren, können identifiziert werden, indem Hybridom-Überstände auf die Anwesenheit von Antikörpermolekülen, die eine Immunreaktion mit p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, zeigen, gescreent werden. Solche Screening-Verfahren umfassen beispielsweise einen Radioimmunassay (RIA) oder Enzymimmunassay (ELISA).
Medien, die für die Herstellung dieser Zusammensetzungen nützlich sind, sind in dem Fachgebiet wohlbekannt und kommerziell erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzucht-Mäuse und dergleichen. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbecco's essentielles Minimalmedium (DMEM; Dulbecco et al., Virol., 8: 396 (1959)), ergänzt mit 4,5 g/l Glucose, 20 mM Glutamin und 20% fötalem Kälberserum. Ein beispielhafter Inzucht-Mäusestamm ist Balb/c.
Eine andere Alternative zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Assays der Erfindung besteht darin, ein eine Mehrzahl von Antikörpern umfassendes System für den sekundären Antikörper zu verwenden, anstatt einen einzelnen Antikörper mit verstärkter Spezifität zu verwenden. Folglich können die Verfahren der Erfindung unter Verwendung einer Kombination von Antikörpern als sekundärer Antikörper ausgeführt werden, wobei wenigstens ein sekundärer Antikörper der Kombination eine Spezifität für p-ANCA oder den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA aufweist und wenigstens ein sekundärer Antikörper der Kombination detekierbar ist. Beispielsweise können UC und PSC von Crohn'-Krankheit in einer Probe von menschlichem Blut unterschieden werden, indem zwei Aliquots von Blutserum von einem Patienten mit immobilisierten unbehandelten oder DNase-behandelten menschlichen Neutrophilen in Kontakt gebracht werden, gefolgt von einem Inkontaktbringen des resultierenden Rntikörper-Antigen-Komplexes mit Maus-anti-human IgG. Der resultierende Komplex wird dann mit Ziege-anti-Maus-IgG, der eine detektierbare Markierung aufweist, in Kontakt gebracht und gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Der resultierende Komplex wird auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines detektierbaren Komplexes im Vergleich zu der Kontrolle (d. h. nicht-DNase behandelte Neutrophile) untersucht. Die Abwesenheit des mit mit DNase behandelten Neutrophilen komplexierten, markierten Ziege-anti-Maus-IgG zeigt an, dass der Patient UC oder PSC hat.
Der Begriff „detektierbarer sekundärer Antikörper" bezieht sich auf einen sekundären Antikörper, wie oben definiert, der p-ANCA von UC oder PSC binden kann und durch verschiedene analytische Methoden detektiert oder gemessen werden kann. Dieser Begriff umfasst Antikörper oder Fragmente davon, die direkt ohne Anheftung von signalerzeugenden Markierungen detektierbar sind, oder jene, die mit einem signalerzeugenden System markiert werden können, um eine Detektion oder Messung zu erlauben, wie beispielsweise einen jeglichen sekundären Antikörper, der in der Lage ist, mit einem radioaktiven Isotop, Enzym, chromogenen oder fluorogenen Substrat, einem chemolumineszierenden Marker oder dergleichen markiert zu werden. Alternativ kann ein sekundärer Antikörper detektierbar gemacht werden, indem die Biotin-Avidin-Verknüpfung verwendet wird, um eine Markierung mit dem sekundären Antikörper zu assoziieren. Bei einer jeglichen der obigen Methoden sollte die Reaktivität des sekundären Antikörpers mit dem p-ANCA durch die Anwesenheit der Markierung nicht signifikant verändert werden. Wenn ein eine Mehrzahl von Antikörpern umfassendes System als sekundärer Antikörper verwendet wird, ist wenigstens einer der Antikörper, Kombination von Antikörpern oder Fragmenten davon, in der Lage, p-ANCA von UC oder PSC zu binden, und wenigstens einer kann durch geeignete Analysenmethoden leicht detektiert oder gemessen werden.
Detektierbare Marker können an den sekundären Antikörper gebunden werden durch Vorgehensweisen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, wie beispielsweise das Chloramin-T-Verfahren für radioaktive Markierungen, enzymatisch durch das Lactoperoxidase-Verfahren, durch die Bolton-Hunter-Techniken oder eine jegliche andere Technik, die in diesem Fachgebiet bekannt ist. Diese Techniken und andere sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und werden beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 70, Teil A (Van Vunakis und Langone, Herausgeber, 1980) beschrieben.
Folglich kann der sekundäre Antikörper an Enzyme, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, Luciferase, Malatdehydrogenase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, alkalische Phosphatase und dergleichen gebunden werden. Das gegenwärtig bevorzugte Enzym ist alkalische Phosphatase. In den Verfahren der Erfindung können auch zweizügige katalytische Systeme verwendet werden, einschließlich beispielsweise alkalische Phosphatase und Glucoseoxidase unter Verwendung von Glucose-6-phosphat als anfängliches Substrat. Geeignete katalytische Systeme werden in dem U.S.-Patent Nr. 4,366,241, erteilt am 28. Dezember 1982 an Tom et al., U.S.-Patent Nr. 4,740,468, erteilt am 26. April 1988 an Weng et al., U.S.-Patent Nr. 4,843,000, erteilt am 27. Juni 1989 an Litman et al., und U.S.-Patent Nr. 4,849,338, erteilt am 18. Juli 1989 an Litman et al., beschrieben.
Die Vorgehensweisen zur Anheftung von Enzymen an verschiedene Substanzen sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt. Techniken zum Koppeln von Enzymen an Antikörper sind beispielsweise in J. H. Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 70: 1 (1976) beschrieben. Reagenzien, die für eine solche Kopplung nützlich sind, umfassen beispielsweise Glutaraldehyd, p-Toluoldiisocyanat, verschiedene Carbodiimid-Reagenzien, p-Benzochinon-m-periodat, N,N'-o-Phenylendimaleimid und dergleichen.
Alternativ können mit einem detektierbaren Enzym verknüpfte sekundäre Antikörper, die für die Verfahren und Kits der Erfindung nützlich sind, ausgehend von zahlreichen kommerziell erhältlichen Quellen erhalten werden; beispielsweise kann Ziege-F(ab')2-anti-human IgG-alkalische Phosphatase von Jackson Immuno-Research, ansässig in West Grove, Pennsylvania, erworben werden.
Geeignete Substrate für die oben beschriebenen enzymatischen Systeme umfassen einfache Chromogene und Fluorogene, wie beispielsweise β-D-Glucose, Homovanillinsäure, o-Dianisidin, Bromkresolpurpur-Pulver, 4-Methylumbelliferon, Luminol, p-Dimethylaminolophin, p-Methoxylophin, p-Nitrophenylphosphat und dergleichen. Das gegenwärtig bevorzugte Enzymsubstrat ist p-Nitrophenylphosphat.
Ein sekundärer Antikörper kann auch detektierbar gemacht werden, indem er mit einer fluorogenen Verbindung chemisch verknüpft wird. Geeignete fluorogene Verbindungen sind jene, die Licht mit ultravioletter oder sichtbarer Wellenlänge nach einer Anregung durch Licht oder eine andere Energiequelle aussenden. Die Fluorogene können allein oder mit einem geeigneten Quencher-Molekül eingesetzt werden. Gegenwärtig bevorzugte Fluorogene sind Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Tetramethylrhodaminisothiocyanat, 7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure und Phycoerythrin. Über die Verfahren zum Konjugieren und zur Verwendung von diesen und anderen geeigneten Fluorogenen ist berichtet worden und sie werden beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 74, Teil C, 32105 (Van Vunakis und Langone, Herausgeber, 1991) beschrieben.
Alternativ kann ein mit einem Fluorogen verknüpfter sekundärer Antikörper, der für die praktische Ausführung der Erfindung nützlich ist, ausgehend von zahlreichen kommerziell erhältlichen Quellen erhalten werden, z. B. Ziege-F(ab')2-anti-human IgG-FITC, das von Tago Immunologicals, Burlingame, Kalifornien, erhältlich ist.
Abhängig von der Natur der Markierung oder des katalytischen signalerzeugenden Systems, die verwendet werden, kann ein Signal detektiert werden durch Bestrahlen der komplexierten Testprobe mit Licht und Beobachten des Fluoreszenzniveaus; durch Inkontaktbringen der komplexierten Probe mit einem Substrat, das durch die Markierung katalytisch umgewandelt werden kann, wodurch ein Farbstoff, Fluoreszenz oder Chemolumineszenz erzeugt wird, wobei die Bildung von Farbstoff visuell oder in einem Spektrophotometer beobachtet werden kann; Fluoreszenz visuell oder in einem Fluorometer beobachtet werden kann; oder im Falle von Chemolumineszenz oder einer radioaktiven Markierung durch Einsatz eines Strahlungszählers, wie eines Gammazählers, oder von γ-Strahlen emittierenden Markern, wie Iod-125. Bei Enzym-katalysierten Systemen, wenn die gegenwärtig bevorzugte Kombination von alkalischer Phosphatase als Enzym und p-Nitrophenylphosphat als Substrat verwendet wird, kann eine Farbveränderung visuell für eine qualitativ positive Reaktion detektiert werden. Für eine quantitative Analyse von diesem oder einem ähnlichen System kann ein EMAX Microplate Reader (erhältlich von Molecular Devices, Menlo Park, Kalifornien) bei 405 nm gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Gemäß der Erfindung wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA von UC oder PSC in der zu testenden Probe bestimmt, indem eine Probe mit immobilisierten, DNase-behandelten Neutrophilen und sekundärem Antikörper in Kontakt gebracht wird, und die Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA enthaltendem Komplex bestimmt wird. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA enthaltendem Komplex wird bestimmt, indem hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von gebundenem sekundärem Antikörper im Vergleich zu einer Kontrolle überwacht wird. Es wird angenommen, dass p-ANCA in der Testprobe anwesend ist, wenn es einen Verlust eines positiven Werts (gebundener sekundärer Antikörper) in der Testprobe im Vergleich zu der Kontrolle gibt. Die Kontrolle ist das Resultat einer Wiederholung der gleichen Schritte des erfinderischen Verfahrens an einer Probe derselben Herkunft, wobei der immobilisierte Neutrophile keiner DNase ausgesetzt worden ist.
Beispielsweise wird in einem IIF-Assay-Format der vorliegenden Verfahren die Anwesenheit von p-RNCA von UC in einer Probe und folglich UC selbst angezeigt, wenn ein Verlust eines perinukleären Färbungsmusters, d. h. von detektierbarem Komplex, der mit einem perinukleären Färbungsmuster assoziiert ist, im Vergleich zu der Kontrolle auftritt. Mehr bevorzugt wird die Anwesenheit von p-RNCA von UC des weiteren durch die Abwesenheit von sowohl einem perinukleären Färbungsmuster als auch einem zytoplasmatischen Färbungsmuster in der Probe angezeigt. In ähnlicher Weise wird unter Verwendung desselben IIF-Assayformats die Anwesenheit von p-RNCA von PSC in einer Probe und folglich PSC selbst angezeigt, wenn ein homogenes zytoplasmatisches Färbungsmuster in der Probe detektiert wird und ein perinukleäres Färbungsmuster in der Kontrolle detektiert wird, d. h. „Wechsel des mit einem perinukleären Färbungsmuster assoziierten detektierbaren Komplexes zu einem homogenen zytoplasmatischen Färbungsmuster im Vergleich zu der Kontrolle". In ähnlicher Weise wird unter Verwendung desselben IIF-Assayformats die Anwesenheit von p-RNCA von Typ 1-AIH in einer Probe und folglich Typ 1-AIH selbst angezeigt, wenn ein granuläres zytoplasmatisches Färbungsmuster in der Probe und ein perinukleäres Färbungsmuster in der Kontrolle nachgewiesen wird, d. h. „Wechsel des mit einem perinukleären Färbungsmuster assoziierten detektierbaren Komplexes zu einem granulären zytoplasmatischen Färbungsmuster im Vergleich zu der Kontrolle". Schließlich wird CD angezeigt, wenn die Abwesenheit eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle nachgewiesen wird, d. h. „Abwesenheit eines detektierbaren Komplexes, der mit einem perinukleären Färbungsmuster assoziiert ist, in der Kontrolle .
Auf diese Weise können die Verfahren der Erfindung verwendet werden, um zwischen p-ANCA von UC, p-ANCA von PSC und p-ANCA von Typ 1-AIH zu unterscheiden wie auch um auf jeden dieser p-ANCA zu screenen und dadurch, vorzugsweise in Kombination mit traditionellen Diagnosetechniken, auf eine jegliche der Krankheiten zu screenen und diese von CD zu unterscheiden.
Beispielsweise wurden Seren von 94 Patienten, bei denen UC diagnostiziert worden war und die hinsichtlich p-ANCA seropositiv waren, Seren von zehn Patienten, bei denen PSC diagnostiziert worden war und die hinsichtlich p-ANCA seropositiv waren, und Seren von 22 Patienten, bei denen Typ I-AIH diagnostiziert worden war und die hinsichtlich sehr hohen p-ANCA-Titern (mittlerer ELISA-Wert für die Neutrophilen-Bindung 139 ± 8) seropositiv waren, hinsichtlich DNase-Empfindlichkeit gemäß den Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines IIF-Assayformats analysiert. Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, ist ein Verlust einer Antigenerkennung nach DNase-Verdau von Neutrophilen, der durch die Abwesenheit eines jeglichen Färbungsmusters gezeigt wird, ein dominantes (66/94, 70%) Merkmal, das für p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, charakteristisch ist.
Tabelle 1. Reaktionen von p-ANCA exprimierenden Seren mit mit DNase behandelten Neutrophilen
Andererseits erkennt die Hauptmenge der p-ANCA, die mit PSC assoziiert sind, und der p-ANCA, die mit Typ 1-AIH assoziiert sind, zytoplasmatische Komponenten nach DNase-Behandlung von Neutrophilen (7/10, 70% bzw. 19/22, 86%). Wenn die Patientenseren beruhend darauf, ob der Patient UC hatte oder nicht, eingruppiert werden (Tabelle 2, UC/nicht-UC), wird klar, dass ein Verlust eines perinukleären Färbungsmusters nach DNase-Behandlung von Neutrophilen für p-ANCA von UC einzigartig ist, odurch eine verlässliche Grundlage bereitgestellt wird, auf der auf UC gescreent werden kann und p-ANCAs differenziert werden können.
Tabelle 2. Vergleich von p-ANCA von UC und der Gruppe von p-ANCA, die mit anderen Krankheiten als IIC assoziiert sind.
Die Unterscheidung zwischen p-ANCA von PSC und p-ANCA von Typ 1-AIH beruht auf dem speziellen zytoplasmatischen Färbungsmuster, das mit den mit DNase behandelten Neutrophilen produziert wird. Wie durch die Zeichnung veranschaulicht wird, wurde das perinukleäre Färbungsmuster von p-ANCA-positiven PSC-Seren (1B) bei der Hauptzahl von getesteten Seren zytoplasmatisch, aber mit einem charakteristisch breiigen, oder wissenschaftlicher gesagt, homogenen Färbungsmuster ( 1D). Im Vergleich dazu wurde das perinukleäre Färbungsmuster, das durch Typ 1-AIH-Serum mit Methanol-fixierten Neutrophilen erzeugt wird, (1A) bei der Hauptzahl der getesteten Seren ebenfalls zytoplasmatisch, aber mit einem charakteristischen granulären Färbungsmuster (1C).
Dementsprechend stellt eine andere Ausführungsform der Erfindung Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA, der mit Typ I-AIH assoziiert ist, in einer Probe bereit, die umfassen: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper durch Fluoreszenz detektiert werden kann und für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren des immunfluoreszierenden Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase nicht verdaut wurde und wobei das Vorliegen eines granulären zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle das Vorliegen von p-ANCA, der mit Typ 1 Autoimmun-Hepatitis assoziiert ist, in der Probe anzeigt. Für den Fachmann versteht sich, dass die Kontrolle, wie oben beschrieben, unter Verwendung von Neutrophilen, die auf dieselbe Weise wie die zum Testen der Proben verwendeten Neutrophilen fixiert worden sind, erzeugt worden ist, dass aber die Neutrophilen, die verwendet werden, um die Kontrolle zu erzeugen, einer Behandlung, d. h. einem Verdau, durch DNase nicht unterworfen worden sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von p-ANCA, der mit PSC assoziiert ist, in einer Probe bereitgestellt, welche umfassen: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper durch Fluoreszenz detektiert werden kann und für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren des immunfluoreszierenden Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase nicht verdaut wurde und wobei das Vorliegen eines homogenen zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle das Vorliegen von p-ANCA, der mit primärer sklerosierender Cholangitis assoziiert ist, in der Probe anzeigt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Unterscheiden von p-ANCA von PSC von p-ANCA von Typ I-AIH und folglich Unterscheiden zwischen dem Vorliegen der Erkrankungen bereitgestellt, welche umfassen: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper durch Fluoreszenz detektiert werden kann und für den Klassendeterminierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren des immunfluoreszierenden Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase nicht verdaut wurde und wobei das Vorliegen eines homogenen zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle PSC anzeigt, und wobei das Vorliegen eines granulären zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle Typ I-AIH anzeigt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Unterscheiden von p-ANCA von UC von p-ANCA von Typ I-AIH und folglich Unterscheiden zwischen dem Vorliegen der Erkrankungen bereitgestellt, welche umfassen: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper durch Fluoreszenz detektiert werden kann und für den Klassendeterminierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren des immunfluoreszierenden Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase nicht verdaut wurde und wobei die Abwesenheit eines perinukleären Färbungsmusters in der Probe und vorzugsweise ebenso die Abwesenheit eines zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und ein perinukleäres Färbungsmuster in der Kontrollprobe UC anzeigt und wobei das Vorliegen eines granulären zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle Typ I-AIH anzeigt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Unterscheiden zwischen p-ANCA von UC, p-ANCA von PSC und p-ANCA von Typ 1-AIH und folglich Unterscheiden zwischen dem Vorliegen der Erkrankungen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper durch Fluoreszenz detektiert werden kann und für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren des immunfluoreszierenden Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase nicht verdaut wurde und wobei die Abwesenheit eines perinukleären Färbungsmusters in der Probe und vorzugsweise ebenso die Abwesenheit eines zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und das Vorliegen eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrollprobe UC anzeigt; wobei ein Wechsel von detektierbarem Komplex, der mit dem perinukleären Färbungsmuster assoziiert ist, zu einem homogenen zytoplasmatischen Färbungsmuster im Vergleich zu der Kontrolle PSC anzeigt; wobei ein Wechsel von detektierbarem Komplex, der mit dem perinukleären Färbungsmuster assoziiert ist, zu einem granulären zytoplasmatischen Färbungsmuster im Vergleich zu der Kontrolle Typ I-AIH anzeigt; und wobei die Abwesenheit eines detektierbaren Komplexes, der mit dem perinukleären Färbungsmuster assoziiert ist, bei der Kontrolle CD anzeigt.
Die Erfindung wird jetzt detaillierter durch Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben.
BEISPIEL 2
TRENNUNG VON MENSCHLICHEN LYMPHOZYTEN DES PERIPHEREN BLUTS DURCH FICOLL-HYPAQUE-GRADIENTENZENTRIFUGATION

1. 31,8 g Ficoll 400 (Pharmacia, Schweden) zu 400 ml entionisiertem H₂O in einer 500 ml-Flasche zugeben. Kräftig schütteln bis zur Auflösung. 100 ml 50% Natriumdiatrizoat-Hypaque (UCLA Pharmacy, Los Angeles, Kalifornien) zugeben und mischen.
2. Die Dichte unter Verwendung eines Hygrometers überprüfen. Sie sollte 1,077–1,080 sein.
3. Ficoll-Hypaque-Lösung durch einen 0,22 oder 0,45 μm-Flaschenaufsatzfilter filtersterilisieren. Die Ficoll-Hypaque-Lösung kann vor Licht geschützt bei 4°C aufbewahrt werden.
4. 15 ml Ficoll-Hypaque-Lösung in ein konisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen gießen. Sorgfältig mit 30 ml heparinisiertem Blut überschichten.
5. Bei 1000 × g (2000 Upm) 20 min zentrifugieren.
6. Phasengrenzfläche unter Verwendung einer Serologiepipette oder Pasteurpipette entfernen und in ein konisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen geben.
7. Phasengrenzflächenphase mit mindestens einem gleichen Volumen Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, Kalifornien) verdünnen.
8. Bei 400 × g (1200 Upm) 5 min zentrifugieren.
9. Überstand abdekantieren, Pellet resuspendieren und 50 ml HBSS zugeben.
10. Schritte 8 und 9 zweimal wiederholen.
11. Zellen in RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, Kalifornien) + 5% fötales Kälberserum (GIBCO, Gathersberg, Maryland) resuspendieren.

BEISPIEL II
ISOLIERUNG VON NEUTROPHILEN

1. Unter Verwendung einer Pipette vorsichtig Serum und restliches Ficoll-Hypaque von dem Pellet von roten Blutkörperchen, das aus der in Beispiel I beschriebenen Prozedur resultiert, entfernen.
2. 10 ml 6% Dextran zu 15 Millilitern Pellet zusetzen.
3. Mit 1X HBSS auf 50 ml auffüllen. Pellet resuspendieren.
4. Rote Blutkörperchen absitzen lassen, ungefähr 45 min bis eine Stunde.
5. Überstand abtrennen, Pellet verwerfen. Überstand mit 1X HBSS auf 50 ml auffüllen und 5 min bei 1800 Upm zentrifugieren.
6. Überstand abdekantieren und Pellet abschöpfen. Restliche rote Blutkörperchen hypotonisch lysieren, indem 9 ml entionisiertes Wasser zugesetzt wird, verwirbeln und dann 1 ml 10X HBSS zugeben und unverzüglich mit 1X HBSS auf 50 ml verdünnen.
7. 5 Minuten bei 1000 Upm zentrifugieren. Überstand verwerfen und Pellet in 15 ml 1X HBSS resuspendieren.

BEISPIEL III
IMMOBILISIERUNG VON NEUTROPHILEN AUF GLASOBJERTTRÄGERN

1. Zellen in Suspension von Schritt 7 von Beispiel II unter Verwendung eines Mikroskops und eines Hämozytometers zählen und Zellen in einem ausreichenden Volumen von 1X HBSS resuspendieren, so dass 2,5 × 10⁶ Zellen pro ml erhalten werden.
2. Cytospin 3^TM (Shandon, Inc. Pittsburgh, Pennsylvania) bei 500 Upm 5 min verwenden, um 0,01 ml der resuspendierten Zellen auf jeden Objektträger aufzutragen.
3. Zellen an dem Objektträger fixieren, indem Objektträger 10 min in einem ausreichenden Volumen von 100 Methanol, um die Probe zu bedecken, inkubiert werden. Lufttrocknen lassen. Die Objektträger können bei –20°C aufbewahrt werden.

BEISPIEL IV
DNase-BEHANDLUNG VON AUF GLASOBJERTTRÄGERN IMMOBILISIERTEN NEUTROPHILEN
Eine DNase-Lösung herstellen, indem 3 Einheiten Promega RQ1^TM DNase pro ml Puffer, enthaltend 40 mM TRIS-HCl (pH 7,9), 10 mM Natriumchlorid, 6 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Calciumchlorid, zusammengegeben werden. Promega RQ1^TM DNase kann von Promega aus Madison, Wisconsin, erhalten werden.
Gemäß Beispiel III präparierte Objektträger mit ungefähr 100 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0–7,4) 5 min spülen. Immobilisierte Neutrophile in 0,05 ml DNase-Lösung pro Objektträger ungefähr 30 min bei 37°C inkubieren. Die Objektträger dreimal mit ungefähr 100–250 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur waschen.
BEISPIEL V
IMMUNFLUORESZENZASSAY

1. 0,05 ml einer 1 : 20-Verdünnung von menschlichen Seren in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zu mit DNase gemäß Beispiel IV behandelten Objektträgern und zu unbehandelten Objektträgern von Beispiel III zusetzen. 0,05 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung zu sauberen Objektträgern als Leerwerte zusetzen. 0,5 bis 1,0 h bei Raumtemperatur bei ausreichender Feuchtigkeit, um einen Volumenverlust zu minimieren, inkubieren.
2. Seren abspülen durch Eintauchen in einen Behälter mit 100-250 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Objektträger in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 5 min sich vollsaugen lassen. Leicht abtupfen.
3. 0,05 ml Ziege-F(ab')₂-anti-human IgG(μ)-FITC in einer 1 : 1000 Antikörper : Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Verdünnung jedem Objektträger zusetzen. 30 min bei Raumtemperatur bei ausreichender Feuchtigkeit, um einen Volumenverlust zu minimieren, inkubieren. (Ziege-F(ab')₂-antihuman IgG(μ)-FITC ist erhältlich von Tago Immunologicals, Burlingame, CA, und von Jackson Immunoresearch Laboratories, Baltimore, MD).
4. Antikörper mit 100–250 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung abspülen. Objektträger 5 min in 100-250 ml Phosphatgepufferter Kochsalzlösung sich vollsaugen lassen, dann lufttrocknen lassen.
5. Fluoreszenzmuster an einem Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher Vergrößerung ablesen.

Sofern gewünscht, kann eine jegliche DNA mittels Propidiumiodid-Färbung angefärbt werden, indem Objektträger gut mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur gespült und 10 s bei Raumtemperatur angefärbt werden. Objektträger dreimal mit 100-250 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur waschen und Deckgläschen auflegen.
BEISPIEL VI
DNase-EMPFINDLICHKEIT VON UC-p-ANCA-SPEZIFISCHEM ANTIGEN UNTER VERWENDUNG EINES IMMUNFLUORESZENZASSAYS
Von Promega erhaltene DNase wurde bei einer Arbeitskonzentration von 3 Einheiten/ml verwendet. Die DNase-Konzentration wurde optimiert, indem die zugesetzte DNase-Menge titriert wurde (von 1 bis 10 Einheiten/ml) und das Ausmaß des DNA-Verdaus durch Propidiumiodid-Färbung und/oder Reaktion mit anti-DNA-Antiseren untersucht wurde. Ein Verdau von zytozentrifugierten, Methanol-fixierten Neutrophilen wurde bei 37°C 30 min mit DNase, die in 40 mM Tris-HCl (pH 7,9)-Puffer, der 10 mM NaCl, 6 mM MgCl₂ und 10 mM CaCl₂ enthielt, solubilisiert worden war, ausgeführt. Es ging praktisch alle zelluläre DNA verloren, wie durch das Fehlen einer Propidiumiodid-Anfärbung angezeigt wurde. Es wurde auch keinerlei Reaktion eines anti-Histon-positiven Serums mehr beobachtet. Eine DNase-Reaktion, die wie hier beschrieben ausgeführt wird, verändert jedoch die nukleäre oder zelluläre Morphologie nicht signifikant.
Mit Trypsin in verschiedenen Konzentrationen behandelte Neutrophile reagierten nicht länger mit UC-p-ANCA-positiven Seren und ebensowenig mit anti-Histon-positivem Serum, was anzeigt, dass wenigstens ein Teil des mit p-ANCA reagierenden Antigens ein Protein ist. In ähnlicher Weise vernichtete ein Pepsin-Verdau von Neutrophilen die Reaktion eines PSC-p-ANCA-positiven Serums, was ebenfalls einen proteinartigen Charakter jener Antigen-Spezies anzeigt. Gruppen von UC-p-ANCA-positiven und c-ANCA-positiven Patientenseren wurden hinsichtlich DNase-Empfindlichkeit unter Verwendung von zytozentrifugierten, Methanol-fixierten Objektträgern, wie oben beschrieben, untersucht. Es wurden zwei andere Arten von Reaktionen festgestellt. Einige p-ANCR-positive Seren verloren nach einer DNase-Behandlung den perinukleären Aspekt der Reaktion und wurden zytoplasmatisch, während c-ANCA-positive Seren im allgemeinen zytoplasmatisch blieben. Zusätzlich wurde festgestellt, dass einige Seren, bei denen festgestellt worden war, dass sie sowohl eine perinukleäre als auch zytoplasmatische ANCA-Färbungsreaktion aufwiesen, nach einer DNase-Behandlung von Neutrophilen stets den perinukleären Aspekt der Reaktion verlo ren. Diese DNase-induzierten Färbungsmuster erwiesen sich von Experiment zu Experiment als hoch reproduzierbar.
Diese Daten zeigen, dass wenigstens drei ANCA-Reaktionen in Reaktion auf eine DNase-Behandlung von immobilisierten Neutrophilen möglich sind: 1) eine p-ANCA-Reaktion, die vernichtet wird, 2) eine p-ANCA-Reaktion, die zytoplasmatisch wird, und 3) eine c-ANCA-Reaktion, die bestehen bleibt. In allen diesen Fällen war der DNase-Verdau vollständig, wie durch ein Fehlen von Propidiumiodid-Färbung wie auch das Fehlen einer Reaktion durch einen anti-DNA-Antikörper nachgewiesen wurde.
Um zu bestimmen, ob eine DNase-Behandlung von Neutrophilen die Antigenerkennung aller mit UC assoziierten p-ANCA vernichten würde, wurde eine Gruppe (n = 94) von UC-Patientenseren, die zuvor dahingehend charakterisiert worden waren, dass sie p-ANCA enthalten, hinsichtlich einer Neutrophilen-Bindung nach DNase-Behandlung unter Verwendung des IIF-Assayformats untersucht. Bei 70% der getesteten UC-Seren resultierte die DNase-Behandlung wieder in der Vernichtung der immunogenen Reaktion, die zu einem p-ANCA-Färbungsmuster führt (2A und C). Es wurde festgestellt, dass die restlichen p-ANCA-positiven UC-Seren ein homogenes (oder breiiges) zytoplasmatisches (c-ANCA) Färbungsmuster nach DNase-Behandlung von Neutrophilen ergeben (2B und D). Folglich lieferte p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, nach DNase-Behandlung von Neutrophilen zwei mögliche Reaktionen: 1) eine p-ANCA-Reaktion, die vernichtet wird, und 2) eine p-ANCA-Reaktion, die sich in ein c-ANCA-Färbungsmuster umwandelt. Diese Veränderungen bei den Neutrophilen-Färbungsmustern, die nach einer DNase-Behandlung von Zellen erhalten wurden, waren ein konsistentes Merkmal der getesteten Seren und die gleichen Ergebnisse wurden in mehreren Experimenten erhalten.
Schließlich wurde auch untersucht, ob eine vorherige Reaktion von Neutrophilen mit p-RNCA-positivem Serum die DNase-Empfindlichkeit des Antigens beeinflussen würde. Die perinukleäre Reaktion bleibt sogar nach DNase-Verdau bestehen, wenn Neutrophile zuerst mit dem p-ANCA-positiven Serum behandelt werden. Dieses Ergebnis zeigt eine schützende Wirkung der Antikörperbindung entweder gegen einen körperlichen Rntigenverlust oder einen Verlust der Epitoperkennung.
BEISPIEL VII
VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG VON IMMUNREAKTIVEM UC-p-ANCA
Um zu untersuchen, ob die Unversehrtheit der DNA für eine UC-p-ANCA-Bindung an Neutrophile erforderlich war, wurden Methanol-fixierte Neutrophile mit DNase behandelt, mit p-ANCR-positivem Serum von einem Patienten, bei dem UC diagnostiziert worden war, in Kontakt gebracht und die UC-spezifische p-ANCA-Bindung wurde durch IIF untersucht. Zu Vergleichszwecken wurde auch die Bindung von nicht-UC-Seren untersucht. Serum, das anti-DNA-Antikörper exprimiert, (Rheumatology Diagnostics Laboratories Inc., Los Angeles, CA), ein Serum, das WG-ANCA exprimierte, ein Serum, das anti-Elastase-Antikörper exprimiert, und jenes Serum exprimiert Antikörper gegen PR3, (wobei die drei Letztgenannten allesamt von der J. Charles Jennette University of North Carolina, Chapel Hill, erhalten wurden) wurden ebenfalls mit DNase-behandelten, Methanol-fixierten Neutrophilen in Kontakt gebracht und die Bindung durch IIF untersucht. Zusätzlich wurde die Wirksamkeit des DNase-Verdaus und der nachfolgende DNA-Verlust routinemäßig durch Anfärben von Neutrophilen mit dem DNA-bindenden Farbstoff Propidiumiodid überwacht.
3 und 4 ermöglichen einen Vergleich der IIF-Färbungsmuster, die mit diesen Seren mit Methanol-fixierten Neutrophilen (obere Reihe) und DNase-behandelten, Methanol-fixierten Neutrophilen (untere Reihe) erzeugt wurden. Wie in 3A und D zu ersehen, geht das p-ANCA-Färbungsmuster, das durch p-ANCA-positives UC-Serum erzeugt wird, (3A) vollständig verloren, wenn die Neutrophilen mit DNase vorbehandelt werden, (3D), was anzeigt, dass die UC-p-ANCA-Bindung verloren geht. Ein ähnlicher Verlust von Antigenerkennung nach DNase-Behandlung wurde, wie erwartet, bei dem anti-DNA-Serum erhalten. 3B zeigt das IIF-Färbungsmuster von anti-DNA-Serum an unbehandelten Neutrophilen. Dieses Färbungsmuster geht eindeutig verloren, wenn Neutrophile mit DNase vorbehandelt werden (3E). Dass die DNase-Behandlung von Neutrophilen wirksam war, zelluläre DNA zu eliminieren, wird anhand des Fehlens einer Propidiumiodid-Färbung nach einer solchen Behandlung (3F) im Vergleich zu dem Propidiumiodid-Färbungsmuster in Abwesenheit einer DNase-Behandlung (3C) festgestellt. Die Neutrophilen-Bindung durch WG-Serum wurde durch eine DNase-Behandlung der Zellen nicht verändert ( 4A und D), während das anti-Elastase-p-ANCA-Färbungsmuster (4B) durch eine DNase-Behandlung in ein granuläres zytoplasmatisches Muster (4E) umgewandelt wurde. Schließlich wurde das Färbungsmuster, das durch anti-PR3 erzeugt wird (4C und F), durch den DNase-Verdau von Neutrophilen ebenso nicht beeinflusst.
BEISPIEL VIII
VERGLEICHENDE DNase-EMPFINDLICHKEIT VON PSC-p-ANCA-SPEZIFISCHEM ANTIGEN UND TYP 1-AIH-SPEZIFISCHEM ANTIGEN UNTER VERWENDUNG EINES IMMUNFLUORESZENZASSAYS
Eine Gruppe von p-ANCA enthaltenden Seren von Patienten mit PSC und Typ 1-AIH wurde untersucht und mit der UC-Seren-Gruppe verglichen. Alle Seren waren zuvor hinsichtlich des ANCA-Färbungsmusters durch IIF und des ANCA-Bindungsniveaus, wie durch ELISA bestimmt, charakterisiert worden. Repräsentative ANCA-Färbungsmuster vor und nach DNase-Verdau von Neutrophilen sind in 1 angegeben.
Das durch Typ 1-AIH-Serum mit Methanol-fixierten Neutrophilen erzeugte p-ANCA-Färbungsmuster ist in 1A gezeigt. Es wurde festgestellt, dass dieses p-ANCA-positive Typ 1-AIH-Serum in charakteristischer Weise ein granuläres zytoplasmatisches Färbungsmuster mit DNase-verdauten Neutrophilen ergibt (1C). Das durch Serum von Patienten, bei denen PSC diagnostiziert worden war, erzeugte p-ANCA-Färbungsmuster ist in 1B gezeigt. PSC-Seren ergaben ein überwiegend homogenes (breiiges) zytoplasmatisches Färbungsmuster mit DNase-behandelten Neutrophilen (1D).
BEISPIEL IX
IMMOBIISIERUNG VON NEUTROPHILEN AN EINER MIKROTITERPLATTE

1. Zellen in Suspension von Schritt 7 von Beispiel II unter Verwendung eines Mikroskops und Hämozytometers zählen und Zellen in einem ausreichenden Volumen von 1X HBSS resuspendieren, so dass 2,5 × 10⁶ Zellen pro ml erhalten werden. Zu einer Immulon 1^TM- oder Immulon^TM-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (erhältlich von Dynatech Laboratories aus Chantilly, Virginia) 0,1 ml pro Vertiefung zugeben und 30–60 min absitzen lassen.
2. Überstand mit einem 8 Kanal-Sammelrohr, das mit einem vakuum verbunden ist, abziehen und Platte lufttrocknen lassen (ungefähr 2 h) oder mit der Unterseite nach oben auf den Gitterrost eines Laminarströmungsabzugs legen, um zu trocknen (ungefähr 10 min).
3. Zellen an der Vertiefung fixieren, indem Zellen 10 min in 0,1 ml 100 Methanol pro Vertiefung inkubiert werden. Methanol verwerfen und Platte lufttrocknen lassen. Bei –20°C aufbewahren.

BEISPIEL X
DNase-BEHANDLUNG VON AN MIKROTITERPLATTEN IMMOBILISIERTEN NEUTROPHILEN
Eine DNase-Lösung wird hergestellt, indem 3 Einheiten Promega-RQ1TM-DNase pro ml Puffer, enthaltend 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM Natriumchlorid, 6 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Calciumchlorid, kombiniert werden.
Gemäß Beispiel VII hergestellte Platten einmal mit 25 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung spülen. Immobilisierte Neutrophile in 0,1 ml DNase-Lösung pro Vertiefung ungefähr 30 min bei 37°C inkubieren. Die Vertiefungen dreimal mit insgesamt ungefähr 100 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung waschen. Die Vertiefungen blockieren durch Zugabe von 0,15 ml 0,25% Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) und Stehenlassen bei Raumtemperatur für ungefähr eine Stunde. Blockierungsflüssigkeit verwerfen.
BEISPIEL XI
ELISA VON DNase-BEHANDELTEN FIXIERTEN NEUTROPHILEN

1. 0,1 ml menschliches Serum, das, wie gewünscht, mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,25 Rinderserumalbumin, verdünnt wurde, zu jeder Vertiefung der gemäß Beispiel VIII und Beispiel VII (d. h. mit und ohne DNase-Behandlung) präparierten Mikrotiterplatten zusetzen. 0,01 ml Phosphat-gepuffertes Serum, das 0,25 Rinderserumalbumin enthält, zu Leerwert-Vertiefungen zusetzen. Bei Raumtemperatur eine Stunde bei ausreichender Feuchtigkeit, um einen Volumenverlust zu minimieren, stehenlassen.
2. Serum ansaugen. Dreimal mit insgesamt ungefähr 100 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,02% Natriumazid (NaN₃) und 0,05 Tween, waschen.
3. Zu jeder Vertiefung 0,1 ml einer 1 : 1000-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase gekoppeltem Ziege-anti-human IgG-Antikörper in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,25 Rinderserumalbumin enthält, zusetzen. Ziege-F(ab')₂-anti-human IgG(Fc)-alkalische Phosphatase kann von Jackson Immuno-Research Laboratories in West Grove, Pennsylvania, erhalten werden. Eine Stunde bei Raumtemperatur bei ausreichender Feuchtigkeit, um einen Volumenverlust zu minimieren, inkubieren.
4. Dreimal mit insgesamt 100 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,02 Natriumazid (NaN₃) und 0,05 Tween, waschen. Drei weitere Male mit TRIS-NaCl-Lösung, enthaltend 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl und 0,02 Natriumazid, pH 7,5, waschen.
5. 0,75 g Dinatrium-p-nitrophenolphosphat (United States Biochemicals, Katalog-Nr. 19587, oder AMRESCO, Katalog-Nr. P0364) mit einem Tris-Puffer, enthaltend 75 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,02 Natriumazid, pH 8,6, zusammengeben, um eine Substrat enthaltende Lösung zu bilden. 0,01 ml Substrat enthaltende Lösung zu jeder Vertiefung hinzusetzen. Bei Raumtemperatur 60 bis 90 min bei ausreichender Feuchtigkeit, um einen Volumenverlust zu minimieren, inkubieren, bis Leerwert-Vertiefungen eine Absorption von 0,8 erreichen.
6. Platte bei 405 nm in einem EMAX Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, Kalifornien) ablesen.

BEISPIEL XII
VERÄNDERUNG BEI DER ANCA-BINDUNG AN DNase-BEHANDELTE NEUTROPHILE BEZOGEN AUF UNBEHANDELTE KONTROLLZELLEN UNTER VERWENDUNG EINES ELISA MIT DNase-BEHANDELTEN, FIXIERTEN NEUTROPHILEN
Bei einer Gruppe von p-ANCA-positiven UC-Seren entspricht die Untergruppe, bei der anhand von ELISA festgestellt wurde, dass mehr als 50% der ANCA-Bindung verloren geht, jenen, bei denen anhand von Immunfluoreszenz-Färbung der Hauptteil der oder die gesamte p-ANCA-Färbung verloren gegangen ist. Andererseits wurde festgestellt, dass Seren, die anhand von ELISR weniger als ungefähr 50% Verringerung bei der ANCA-Bindung zeigen, ein p-ANCA-Muster zeigen, das sich nach einem DNase-Verdau von Neutrophilen in eine zytoplasmatische Färbung umwandelt. Bei dieser letztgenannten Gruppe wurden auch einige Seren mit einer Mischung von perinukleärem/zytoplasmatischem Färbungsmuster gefunden, bei denen nach einer DNase-Behandlung nur das zytoplasmatische Muster erhalten blieb. Es wurde festgestellt, dass das eine Serum, das ein zytoplasmatisches ANCA-Färbungsmuster zeigt, nach einer DNase-Behandlung eine erhöhte ANCA-Bindung aufweist. Der Hauptteil (4 von 6) von p-ANCA-positiven PSC-Seren verlor weniger als 50% der ANCA-Bindung nach einer DNase-Behandlung von Neutrophilen; im Gegensatz dazu zeigten nur 5 von 14 UC-p-ANCR-positiven Seren einen solchen Verlust. Durch Immunfluoreszenz-Färbung wurde festgestellt, dass dieses PSC-Seren ein p-ANCA-Färbungsmuster zeigen, das nach einer DNase-Behandlung zytoplasmatisch wird.
Folglich kann ein ELISA mit DNase-behandelten, fixierten Neutrophilen dazu verwendet werden, um UC und PSC von CD wie auch anderen Arten von entzündlichen Leiden des Darms zu unterscheiden. Die einzigartigen perinukleären/zytoplasmatischen Färbungsmuster, die mit Assays vom Immunfluoreszenz-Typ verbunden sind, bestätigen die Verlässlichkeit des ELISA-Assays und können weitere Unterscheidungen zwischen UC und PSC ermöglichen.
BEISPIEL XIII
ANCA BEI COLITIS ULCEROSA IM BEREICH DER KINDERHEILKUNDE
Bei der Population im Bereich der Kinderheilkunde ist das Unterscheiden zwischen UC, Crohn'-Krankheit (CD) und allergi scher Colitis bei Kindern mit rektalen Blutungen (RB) besonders schwierig. Da das Auftreten von ANCA bei erwachsenen Patienten mit UC gut etabliert war, wurden Untersuchungen vorgenommen, um die Beziehung zwischen dem Auftreten von RNCA und UC im Bereich der Kinderheilkunde zu bestimmen. Um zu bestimmen, ob die Anwesenheit von ANCA, wie durch einen ELISA mit DNase-behandelten fixierten Neutrophilen gemessen, für UC im Bereich der Kinderheilkunde sensitiv und spezifisch ist, wurde Serum von Kindern mit UC (mittleres Alter = 13), CD (mittleres Alter = 14), RB (mittleres Alter = 3) und anderen entzündlichen Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts (mittleres Alter = 8) auf Blind-Weise getestet. Alle im ELISA positiven Proben wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Immunfluoreszenz-Assays untersucht, um die ANCA-Färbungsmuster zu bestimmen. ANCA wurde als Prozentsatz der Bindung von UC-positiven Seren ausgedrückt und als positiv definiert, wenn der Wert 2 Standardabweichungen über dem Mittelwert für normale Kontrollseren (≥) 12% überstieg. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3 ANCA BEI COLITIS ULCEROSA IM BEREICH DER KINDERHEILKUNDE
Zweiundsiebzig Prozent der Kinder mit UC waren ANCA-positiv verglichen mit 17% mit CD, 23% mit RB und 7% mit anderen entzündlichen Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts (Tabelle 1). Der mittlere Prozentsatz der positiven Kontrolle bei einer Verdünnung von 1 : 100 war ebenfalls bei UC signifikant höher (p < 0,00 gegenüber CD und nicht-IBD, p < 0,01 gegenüber RB). Zusätzlich waren die mittleren Titer von ANCA-positiven Proben signifikant höher, was ELISA-Titer sehr spezifisch für UC macht. Die Anwesenheit eines perinukleären Immunfluoreszenz-Musters korrelierte mit dem Titer. Es wird dementsprechend festgestellt, dass ANCA sensitiv (72%) und spezifisch (89%) für UC gegenüber anderen entzündlichen Erkrankungen ist.
BEISPIEL XIV
MIT p-ANCA VON UC UND PSC REAGIERENDES ANTIGEN IST IN TRITON X-100^TM UNLÖSLICH
1. Zellen in Suspension von Schritt 7 von Beispiel II unter Verwendung eines Mikroskops und Hämozytometers zählen und Zellen in einem ausreichenden Volumen von Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1,0% Triton X-100^TM enthält, resuspendieren, so dass 2,5 × 10⁶ Zellen pro ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,5% Triton X-100^TM enthält, erhalten werden. Auf Eis ungefähr 10 min inkubieren lassen.
2. Auf einen Glasobjektträger zytozentrifugieren, wie in Beispiel III, Schritt 2 beschrieben.
3. Zytozentrifugierten Triton X-100^TM-Extrakt gemäß der in Beispiel III, Schritt 3 erläuterten Vorgehensweise fixieren.
4. 0,05 ml einer 1 : 20-Verdünnung von UC-p-ANCA-positivem Serum oder PSC-p-RNCA-positivem Serum in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu Objektträgern hinzugeben. 0,05 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung zu sauberen Objektträgern als Leerwerte hinzugeben. 30 min bis eine Stunde bei Raumtemperatur bei ausreichender Feuchtigkeit, um einen Volumenverlust zu minimieren, inkubieren.
5. Objektträger gemäß dem Immunfluoreszenz-Assay von Beispiel V, Schritte 2–5, weiterverarbeiten.
Nach Triton X-100^TM war die Morphologie der Neutrophilen eindeutig verloren gegangen mit keinerlei Anzeichen einer klaren nukleären Struktur bei einer Reaktion mit anti-DNA-Serum. Jedoch ging während der Triton X-100^TM-Behandlung die zelluläre DNA nicht verloren. Sowohl UC-p-ANCA-positive Seren als auch PSC-p-ANCA-positive Seren zeigten starke Reaktivität gegenüber dem fixierten Triton X-100^TM-Neutrophilen-Extrakt. Basierend auf der Triton X-100^TM-Unlöslichkeit kann eine angereicherte Fraktion von UC- und PSC-p-ANCA-Antigenen hergestellt werden, um die Antigene zu isolieren.
BEISPIEL XV
KONSTRUKTION EINER BIBLIOTHEK
V_H- und V_L-kodierende DNA-Homolog-Bibliotheken aus dem Repertoire der Gene der schweren und leichten Kette von Lamina propria-Lymphozyten (LPL)-Zellen von Menschen, bei denen UC diagnostiziert worden war und die in einem ELISA mit fixierten Neutrophilen bezüglich p-ANCA seropositiv waren, wurden zufallsgesteuert zusammengegeben, exprimiert und das resultierende Antikörpermaterial hinsichtlich seiner Fähigkeit, Neutrophile zu binden, unter Verwendung einer Phagen-Display-Technik gescreent. Das Antikörpermaterial, das eine Immunreaktivität mit Neutrophilen aufwies, wurde dann hinsichtlich des p-ANCA-Färbungsmusters und hinsichtlich des Verlusts des p-ANCA-Färbungsmusters unter Verwendung von DNase-behandelten Neutrophilen als Mittel zur Identifizierung von p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, gescreent.
Diese Bibliotheken der variablen schweren und leichten Ketten wurden durch PCR-Klonierung von variablen schweren und leichten Ketten ausgehend von diesen LPL konstruiert. Die Homologen aus diesen Bibliotheken wurden zufallsgesteuert in dem dicistronischen Phagemid-Expressionsvektor pComb 3 gepaart, wie hier beschrieben, was zu einem variable schwere Kette-Fusionsprotein, das das V_H-Polypeptid und ein Fragment des Hüllproteins III des filamentösen Phagens enthielt, führte. Nachfolgend wurden E. coli mit diesen Vektoren, die das DNA-kodierende heterodimere Antikörpermaterial enthielten, transformiert. Die Expression der Vektoren wurde induziert und die Zellen mit Helfer-Phagen transformiert. Phagen, die aus den transformierten E. coli ausgeschieden wurden, enthielten verkapselt die Vektor-DNA, die die Nukleotidsequenz kodiert, und präsentierten die kodierten schweren und leichten Ketten als Fab-Antikörpermaterial verankert an der Phagenhülle über das Gen III-Ankerprotein. Dieses Phagemid-Expressionssystem verknüpft folglich sowohl den Prozess der Erkennung als auch den der Replikation in einem einzelnen Phagenpartikel.
In einem als Panning bezeichneten Verfahren, wie von Parmley et al., Gene, 74: 305–318 (1988) beschrieben, werden die Phagen, die heterodimeres Antikörpermaterial, das anti-neutrophile Immunreaktivität aufweist, exprimieren, angereichert und isoliert. Das heterodimere Antikörpermaterial wird dann des weiteren auf das Vorhandensein von p-ANCA, der mit UC assoziiert ist, durch Alkohol-fixierte indirekte Immunfluoreszenz („den IIF-Rssay") und auf den Verlust eines positiven p-ANCA-Färbungsmusters in dem IIF-Assay unter Verwendung von DNase-behandelten Alkohol-fixierten Neutrophilen untersucht.
Erzeugung einer V_N- und V_L-Bibliothek
Nukleotidsequenzen, die Immunglobulinprotein-CDRs kodieren, sind hochgradig variabel. Es gibt jedoch mehrere Regionen von konservierten Sequenzen, die die V-Domänen der leichten und schweren Ketten flankieren, die im wesentlichen konservierte Nukleotidsequenzen enthalten, d. h. Sequenzen, die mit derselben Primersequenz hybridisieren werden.
Es wurden Polynukleotidsynthese („Amplifizierungs) -Primer, die mit diesen konservierten Sequenzen hybridisieren und Restriktionsstellen in das produzierte DNA-Homolog einbauen, Restriktionsstellen, die geeignet sind, um das DNA-Homolog in funktionsfähiger oder operativer Weise an einen Vektor zu ligieren, konstruiert. Spezieller werden Primer so gestaltet, dass die resultierenden DNA-Homologen, die produziert werden, in einen Expressionsvektor im Leseraster mit der stromaufwärts befindlichen translatierbaren DNA-Sequenz bei der Region des Vektors, die die Mittel für die gerichtete Ligation enthält, insertiert werden können. Die Amplifizierung mit den hier beschriebenen Primern wird an cDNA-Matrizen ausgeführt, die ausgehend von Gesamt-RNA, die aus LPL von einem Menschen, bei dem UC diagnostiziert worden ist und der hinsichtlich p-ANCA seropositiv war, isoliert worden waren, produziert worden sind.
V_H-Primer
Für eine Amplifizierung der V_H-Domänen werden Primer gestaltet, um kohäsive Termini, die mit einer gerichteten Ligation in die einmalig vorkommenden XhoI- und SpeI-Stellen der Hc2-Expressionskassette des pComb 3-Phagemid-Expressionsvektors verträglich sind, einzuführen. In allen Fällen werden die in den SEQ ID NOs: 10 bis 16 aufgelisteten 5'-Primer ausgewählt, so dass sie komplementär zu der den ersten Strang bildenden cDNA in der konservierten N-terminalen Region (Antisinn-Strang) sind.
Zusätzlich V_H-Amplifizierungsprimer, einschließlich des einzigen 3'-Primers, sind so gestaltet, dass sie komplementär zu einem Abschnitt der ersten konstante Region-Domäne von gamma 1-schwere Kette-mRNA sind (SEQ ID NO: 9). Diese Primer werden DNA-Homologe produzieren, die Polynukleotide enthalten, die Aminosäuren aus der V_H-Domäne und der ersten konstante Region-Domäne von schweren Immunglobulinketten des IgG-Isotyps kodieren. Diese DNA-Homologen können dementsprechend verwendet werden, um Fab-Fragmente anstelle von F_v zu produzieren.
Es werden zusätzliche einzigartige 3'-Primer, die gestaltet werden, um mit ähnlichen Regionen einer anderen Klasse von schweren Immunglobulinketten, wie IgM, IgE und IgA, hybridisiert zu werden, in Betracht gezogen. Andere 3'-Primer, die mit einer spezifischen Region einer speziellen Klasse von CH₁-konstanter Region hybridisieren und angepasst sind, um die unter Verwendung dieses Primers amplifizierten V_H-Domänen zu einem Expressionsvektor zu transferieren, der in der Lage ist, jene V_H-Domänen mit einer unterschiedlichen Klasse von konstanten Regionen von schweren oder leichten Ketten zu exprimieren, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Die Amplifizierung wird in sieben separaten Reaktionen ausgeführt, von denen jede einen der in den SEQ ID NOs: 10 bis 16 gezeigten 5'-Primer und einen 3'-Primer der in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, enthält. Die 5'-Primer enthalten eine XhoI-Stelle und die 3'-Primer enthalten eine SpeI-Restriktionsstelle für die Insertion des V_H-kodierenden DNA-Homologs in die Hc2-Expressionskassette des pComb 3-Phagemid-Expressionsvektors. Siehe Barbas, C. F., et al., Proceedings of the National Academy of Science, 88: 7978–7982 (1991).
V_L-Primen
Für eine Amplifizierung der V_L-Domänen werden Amplifizierungsprimer konstruiert, die mit den konservierten Sequenzen von leichten Immunglobulinketten hybridisieren und die Restriktionsstellen enthalten, die eine Klonierung der V_L- kodierenden DNA-Homologe in die Lc2-Expressionskassette des pComb 3-Phagemid-Expressionsvektors, geschnitten mit SacI und XbaI, ermöglichen. Die 5'-Primer (SEQ ID NOs: 18 bis 20) sind so gestaltet, dass sie komplementär zu der den ersten Strang bildenden cDNA in der konservierten N-terminalen Region sind. Diese Primer führen auch eine SacI-Restriktionsendonukleasestelle ein, um zu ermöglichen, dass die V_L-kodierenden DNA-Homologen in die pComb 3-Phagemid-Lc2-Expressionskassette kloniert werden können. Der 3'-V_L-Amplifizierungsprimer (SEQ ID NO: 17) ist so gestaltet, dass er mit der konstanten Region von kappa-cDNA hybridisiert und die XbaI-Restriktionsendonukleasestelle einführt, die benötigt wird, um V_L-kodierende DNA-Homologe in die pComb 3-Phagemid-Lc2-Expressionskassette zu insertieren. Diese Primer erlauben, DNA-Homologe zu produzieren, die leichte Immunglobulin-Ketten des kappa-Isotyps kodieren. Diese Primer ermöglichen es, ein Fab-Fragment anstelle eines Fv zu produzieren.
Die Amplifizierung des Immunglobulin-leichte Kette-Genrepertoires wird in drei separaten Reaktionen ausgeführt, von denen jede einen der 5'-Primer (SEQ ID NOs: 18 bis 20) und einen der 3'-Primer (SEQ ID NO: 17) enthält. Die 5'-Primer enthalten eine SacI-Restriktionsstelle und die 3'-Primer enthalten die XbaI-Restriktionsstelle.
Amplifizierungsprimer, die gestaltet werden, um variable Regionen von menschlichen leichten Ketten des lambda-Isotyps zu amplifizieren, werden ebenfalls in Betracht gezgoen.
Alle Primer und synthetischen Polynukleotide, die hier beschrieben werden, wurden von Oligos etc. (Wilsonville, OR) erworben. Der pComb 3-Expressionsvektor wurde als Geschenk von Dr. Carlos Barbas III vom Scripps Research Institute, La Jolla, CA, zur Verfügung gestellt.
Konstruktion der V_H- und V_L-Bibliothek
Aus 1,15 × 10⁷ Lymphozyten wurde unter Verwendung von Guanidiniumisothiocyanatextraktions-Standardprotokollen Gesamt-RNA extrahiert. Siehe beispielsweise Chomcynski, P. und Saochi, N., Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987).
Bei der Vorbereitung für die PCR-Amplifizierung wird die oben hergestellte RNA als eine Matrize für die cDNA-Synthese durch eine Primer-Verlängerungsreaktion verwendet. So wurde 10 μg RNA umgekehrt (revers) zu einzelsträngiger cDNA transkribiert unter Verwendung von 1 μg oligo-dT-Primer mit 10 mM Dithiothreitol, RNasin^TM (einem Protein-RNase-Inhibitor von Promega Corporation, Madison, WI), jeweils 25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 × reverse Transkriptase-Puffer (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) und 2 μl (zweihundert Einheiten) reverse Transkriptase (Superscript, Behtesda Research Laboratories) in einem Volumen von 50 μl für 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 50 min bei 42°C. Nach einer 5-minütigen Wärmeabtötung bei 90°C und 10 min auf Eis wurde die Reaktion 20 min bei 37°C mit 1 μl (einer Einheit) RNase H (Bethesda Research Laboratories) behandelt.
Die oben erzeugte einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion („PCR")-Methode amplifiziert. Es wurden Familien-spezifische Primer für die variable Region und Isotyp-spezifische Primer für die konstante Region, wie nachfolgend beschrieben, verwendet, um schwere Kette-IgG1-V_H1-V_H6-und kappa-leichte Kette-V_L1-V_L3-spezifische Bibliotheken zu erzeugen:
Primer, um eine IgG1-schwere Kette-konstante Region-Bibliothek zu erzeugen:
Primer, um eine schwere Kette-variable Region-Bibliothek zu erzeugen:
Primer, um eine kappa-leichte Kette-konstante Region-Bibliothek zu erzeugen:
Primer, um eine kappa-leichte Kette-variable Region-Bibliothek zu erzeugen:
Die PCR-Amplifizierung wird in einer 100 μl-Reaktion, die die Produkte der Umkehrtranskriptionsreaktion (ungefähr 1 μl von 450 μl Reaktionsmischung mit der einzelsträngigen cDNA), 60 pm des 3'-V_H-Primers (SEQ ID NO: 9), 60 pm des 5'-Primers (einer von den SEQ ID NOs: 10 bis 16), 8 μl der Mischung von dNTPs in einer Konzentration von jeweils 25 mM, 10 μl 10 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer) und 5 Einheiten Taq-DNR-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) enthält, ausgeführt. Die Reaktionsmischung wird 30 Amplifizierungszyklen unter Verwendung eines 9600 Thermocycler-Geräts von Perkin-Elmer unterworfen. Jeder Amplifizierungszyklus umfasste ein Denaturieren von cDNA bei 94°C für 15 s, gefolgt von Anhybridisierung von Primern bei 52°C für 50 s und Amplifizierung bei 72°C für 90 s. Dem folgte eine 10-minütige Verlängerung bei 72°C. Mit den hier definierten Primern wurde eine effiziente und reproduzierbare DNA-Homolog-Synthese erzielt, wobei amplifizierte V_H-kodierende cDNA- Homologe mit einer Hauptbande von ungefähr 680 bp und amplifizierte V_K-kodierende cDNA-Homologe mit einer Hauptbande bei ungefähr 660 bp produziert wurden.
Nach der Verifizierung durch Agarose-Gelelektrophorese, dass alle Amplifizierungen erfolgreich waren und dass ähnliche Ausbeuten erhalten worden waren, wurden die VH-kodierenden und VL-kodierenden DNA-Homologe getrennt vereinigt und auf einem Gel aus 0,8% Seaplaque GTG-Agarose (FMC, Rockland, ME) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Ligation der V_L-kodierenden DNA-Homologe in einen Vektor
Gleiche Anteile der Produkte aus jeder leichte Kette-Primer-Verlängerungsreaktion wurden gemischt, um eine vereinigte oder gepoolte V_L-Bibliothek von UC zu erzeugen. Die gepoolte V_L-Bibliothek wurde mit 70 Einheiten XbaI pro Mikrogramm gepoolter V_L-Bibliothek und 35 Einheiten SacI pro Mikrogramm gepoolter V_L-Bibliothek doppelt verdaut. (Alle Restriktionsenzyme sind von Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, erhältlich). Verdaute Produkte wurden erneut mittels eines Gels gereinigt, wie oben beschrieben, und die Region des Gels, die DNA-Fragmente von ungefähr 660 bp enthielt, wurde ausgeschnitten, von der Agarose mittels Extraktion befreit und mittels Ethanol präzipitiert. Die resultierenden V_L-DNA-Homologe repräsentieren ein Repertoire von kappa-leichte Kette-Polypeptid-Genen mit kohäsiven Enden, die für eine gerichtete Ligation an die pComb 3-Phagemid-Lc2-Expressionskassette angepasst sind.
Die pComb 3-Phagemid-Lc2-Expressionskassette wird für die Insertion eines leichte Kette-DNA-Homologs vorbereitet, indem 30 μg des Phagemids einer Lösung, die 280 Einheiten XbaI-Restriktionsendonuklease und 160 Einheiten SacI-Restriktionsendonuklease und einen vom Hersteller empfohlenen Puffer enthält, beigemischt werden. Diese Lösung wurde 3 h bei 37°C gehalten. Die Lösung wurde mit 2 ml Glycogen, 1/10 Volumen 3 M NaRc, 2,5 Volumen Ethanol bei –20°C 1 h präzipitiert, dann pelletiert und mit 70% Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und mittels eines Gels aus 0,8% 1 × TAE-Seplaque 676 gereinigt. Eine 4 kb-Bande wurde ausgeschnitten, Phenol-extrahiert, mit LiCl₃ behandelt und auf die gleiche Weise wie PCR-Produkte Ethanol-präzipitiert.
Die Lc2-Expressionskassette war dann für eine Ligation mit den V_L-kodierenden DNA-Homologen, die oben hergestellt worden sind, bereit. Diese V_L-kodierenden DNR-Homologen wurden dann direkt in die XbaI- und SacI-restriktionsverdaute Lc2-Expressionskassette insertiert, indem 0,45 μg V_L-DNA-Homolog in 1,4 μg verdauten pComb 3 (freundlicherweise von Dr. Carlos Barbas III vom Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien, bereitgestellt und beschrieben in Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978–7982 (1991)) unter Verwendung von 10 Einheiten Ligase in einem 200 μl-Volumen von über Nacht bei 25°C gelagertem Ligasepuffer ligiert wurde, und dann durch 15-minütiges Halten bei 65°C wärmeabgetötet. Die DNA wurde präzipitiert, mit 70% Ethanol gewaschen und in 15 μl 10 mM MgCl₂ resuspendiert.
Transformation eines Wirts mit einem V_L-Bibliothek enthaltenden Vektor
Escherichia coli-XLI-Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) wurden mit resuspendierter DNA durch Elektroporation transformiert: 300 μl Stammlösung von Zellen, die durch Aufkonzentrieren von 1 l F. coli OD₆₀₀ = 0,8 auf 4 ml hergestellt worden ist, wurden einer Elektroporation mit 15 μl DNA (= 2 μg) (der gesamten Ligationsmischung) unterzogen. Die transformierten Zellen wurden durch Plasmid-Antibiotikum-Resistenz mittels Vermehrung (in) Superbrühe („super broth"), die 100 μg/ml Carbenicillin enthielt, selektiert. Die Bibliotheksgröße betrug 8,6 × 10⁷ Transformanten mit 6% Hintergrund-Religation.
Antibiotikum-resistente Kolonien wurden durch Vermehrung in Flüssigkulturen bei 37°C in Superbrühe („SB")-Medium (30 g Trypton, 20 g Hefeextrakt und 10 g 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure (Mops) pro 1 Wasser, eingestellt auf pH 7), ergänzt mit 10 μg/ml Tetracyclin, 20 μg/ml Carbenicillin, 40 mM Glucose und 10 mM MgCl₂, amplifiziert. pComb 3-Phagemide, die ein kappa-V_L-Polypeptid kodierten („Kappa-pComb 3-Phagemid") wurden unter Verwendung von Qiagen-tips^TM, einem Anionenaustauscherharz von Qiagen, Chatsworth, CA, nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Isolierte Kappa-pComb 3-Phagemide wurden mit 10 Einheiten XhoI und 3 Einheiten SpeI pro Mikrogramm Kappa-pComb 3-Phagemid doppelt verdaut. Die Reaktionsmischung wurde Ethanol-präzipitiert und das doppelt geschnittene 4,7 kb-Phagemid wurde auf einem 0,8% Seaplaque TAE-Gel wie zuvor mittels eines Gels gereinigt. Die Kappa-pComb 3-Phagemide waren jetzt für eine Ligation mit der schwere Kette-Bibliothek bereit.
Ligation der V_H-kodierenden DNA-Homologe in einen Vektor und Transformation eines Wirts
Gleiche Anteile der Produkte aus jeder schwere Kette-Primer-Verlängerung wurden gemischt, um eine vereinigte oder gepoolte V_H-kodierende DNA-Homolog-Bibliothek zu erzeugen. Die gepoolte V_H-Bibliothek wurde für eine Ligation in die Hc2-Expressionskassette des Kappa-pComb 3-Phagemids durch Verdau mit XhoI- und Spei-Nukleasen vorbereitet. Entsprechend wurde die gepoolte V_H-Bibliothek mit 70 Einheiten XhoI und 17 Einheiten Spei pro Mikrogramm gepoolter V_H-Bibliothek doppelt verdaut. Dann wurde 0,40 μg verdaute schwere Kette-Bibliothek mit 1,4 μg verdautem Kappa-pComb 3-Phagemid, das oben beschrieben worden ist, unter Verwendung von 10 Einheiten Ligase in einem Volumen von 200 μl Ligasepuffer ligiert. Die Reaktion wurde durch Wärmeabtötung bei 65°C für 15 min beendet. Die DNA wurde präzipitiert, das Pellet in 15 μl 10 mM MgCl₂ resuspendiert und zur Elektroporation von E. coli-XLI-Blue-Zellen verwendet. Elek troporierte Zellen wurden in SB, das, wie oben beschrieben, ergänzt war mit Ausnahme dessen, dass keine Glucose enthalten war, vermehrt. Die Bibliotheksgröße betrug 4,9 × 10⁷ mit 14% Hintergrund-Religation nach dem Klonieren der schweren Kette. Das Vorliegen von sowohl V_H- als auch V_L-kodierenden DNA-Homologen im Vektor wurde durch Restriktionsanalyse verifiziert, sieben von sieben Klonen enthalten beide Homologe.
Zehn Milliliter-Kulturen von elektroporierten E. coli XLI-Blue-Zellen wurde dann in SB, ergänzt mit 50 μg/ml Carbenicillin, 10 μg/ml Tetracyclin und 10 mM MgCl₂, transferiert und eine weitere Stunde inkubiert. Die kultivierten Zellen wurden dann mit 10¹² VCS-M13-Helfer-Phagen (Stratagene, La Jolla, CA) infiziert, um die Erzeugung von Kopien des Sinnstrangs der Phagemid-DNA zu initiieren. Nach der Zugabe von Helfer-Phage wurde die Mischung zu 100 ml SB, ergänzt mit 50 μl/ml Carbenicillin, 10 μl/ml Tetracyclin und 10 mM MgCl₂, zugesetzt. Die den Helfer-Phagen enthaltende Mischung wurde dann weitere 2 h bei 37°C gehalten, um den Zusammenbau von filamentösen Phagen zu ermöglichen, bei welchem das exprimierte heterodimere Antikörpermaterial von UC⁺ fusioniert an die cpIII-Bakteriophagen-Ankerdamäne in die Oberfläche des Bakteriophagenpartikels inkorporiert wurde. Nach 2 h wurde die Mischung 70 μg/ml Kanamycin ausgesetzt, um auf durch Helfer-Phagen infizierte E. coli zu selektionieren, und dann ließ man sie sich über Nacht bei 37°C, 300 Upm vermehren. Der Phage wurde durch Zentrifugation präzipitiert, was zu einem Bakterienzellenpellet und einem Phagen enthaltenden Überstand führte, wobei der Titer von Kolonie-bildenden Einheiten („CFU") durch Ausplattieren auf LB-Platten mit 100 μg/ml Carbenicillin bestimmt wurde.
BEISPIEL XVI
PANNING
Jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen wurde mit Methanol-fixierten Neutrophilen beschichtet, indem 10⁶ Neutrophile zugegeben wurden, man sie sich absetzen und lufttrocknen ließ und sie dann mit 100 Methanol fixierte. Jede Vertiefung wurde eine Stunde bei 37°C mit 3% Rinderserumalbumin („BSA") in Tris-gepufferter Kochsalzlösung („TBS") blockiert. Die Blockierungslösung wurde entfernt und 5 × 1011 Phagen in 250 μl TBS wurden zugesetzt und man ließ sie zwei Stunden bei 37°C inkubieren. Nach Waschen, Säureelution und Neutralisation wurde die Anzahl von eluierten Phagen anhand von CFU überwacht.
Eluierte Phagen wurden amplifiziert, indem E. coli-XLI-Blue reinfiziert und der Panning/Amplifikations-Zyklus fünfmal wiederholt wurde, bis es eine mindestens 100-fache Anreicherung gab. Auf diese Weise wurde eine Bibliothek von Phagen erzeugt, die hinsichtlich p-ANCA-Material mit Immunreaktivität gegenüber Neutrophilen-Antigen angereichert waren. Für die Quantifizierung der Anreicherung wurden Aliquots der ursprünglichen Bibliothek parallel zu jedem Anreicherungszyklus erneut einem Panning unterworfen, um tägliche Fluktuationen bei der Phagenrückgewinnung zu kontrollieren. Die Anreicherung wurde durch das Verhältnis von Phagen mit gegenüber ohne berechnet und mit der nicht-angereicherten Bibliothek, die an demselben Tag verarbeitet wurde, verglichen. Das Panning wurde auch in einem Format mit 96 Vertiefungen mit 10¹¹ Phagen pro Vertiefung ausgeführt, um die Formate zu vergleichen.
BEISPIEL XVII
HERSTELLUNG VON LÖSLICHEM REKOMBINANTEM ANTI-NEUTROPHILEM ANTIKÖRPER-MATERIAL VON UC UND BIBLIOTHERS-SCREENING
Die Herstellung von löslichem heterodimerem Antikörpermaterial, wurde ausgeführt, indem Phagemid unter Verwendung von Qiagen-tips^TM gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagen, Chatsworth, CA) verwendet wurden. Isoliertes Phagemid wurde dann mit 17 Einheiten Spei und 50 Einheiten NheI pro Mikrogramm Phagemid verdaut, um das cpIII-Gensegment zu entfernen. Die Phagemid-DNA wurde dann mittels eines Gels gereinigt und unter Verwendung von 10 Einheiten Ligase pro 1 μg Phagemid und Halten der Reaktionsmischung über Nacht bei 25°C selbst-ligiert. Die Reaktion wurde beendet, indem sie 15 min bei 65°C gehalten wurde. 200 ng mittels eines Gels gereinigtes Fragment wurde in einem Volumen von 20 μl selbst-ligiert und verwendet, um F. coli XLI-Blue durch Elektroporation bei 0°C in einer Kürette mit einem 0,2 cm-Spalt bei 2,5 kV, 25 μF und 200 R unter Verwendung von 40 μl E. coli-Stammlösung und 1 μl Ligationsmischung zu transformieren. Einzelne Kolonien wurden von einer LB-Agarplatten, die 100 μl/ml Carbenicillin enthielten, gepickt und in 10 ml SB, ergänzt mit 10 μg/ml Tetracyclin, 50 μg/ml Carbenicillin und 20 mM MgCl₂, sechs Stunden kultiviert. Die Kulturen wurden dann durch die Zugabe von 1 mM Isopropyl-6-D-thiogalactopyranosid („IPTG") (United States Biochemicals, Cleveland, OH) induziert und über Nacht kultiviert. Die Phagen wurden durch Zentrifugation isoliert, was zu einem Bakterienzellenpellet und einem Phagen enthaltenden Überstand führte. Der Überstand wurde entfernt und hinsichtlich Fab-Produktion durch kappa-Einfang-ELISA, wie oben beschrieben, unter Detektion mit Ziege-anti-human Fab-alkalische Phosphatase (Pierce, Rockland, IL) analysiert. Für einen Vergleich wurden jeweils zehn Klone aus den angereicherten und nicht-angereicherten Bibliotheken ausgewählt. Sechs der zehn Klone aus der nicht-angereicherten Bibliothek produzierten signifikante Mengen von Fab, wie durch einen kappa-Einfang-ELISA bestimmt wurde. Im Gegensatz dazu produzierten zehn von zehn Klonen aus der angereicherten Bibliothek Fab, was zeigt, dass bei der angereicherten Bibliothek eine positive Selektion hinsichtlich einer Fab-Expression stattgefunden hatte.
Diese Klone wurden auch hinsichtlich einer Neutrophilen-Bindung anhand eines Alkohol-fixierte Neutrophile-ELISA analysiert. Keiner der zehn Klone aus der nicht-angereicherten Bibliothek band Neutrophile, wohingegen alle Probenklone aus der angereicherten Bibliothek eine sehr starke Neutrophilen-Bindung zeigten.
Die Diversität der schwere und leichte Kette-Verwendung bei Fabs aus angereicherten und nicht-angereicherten Bibliotheken wurde überwacht, indem 4 μg Phagemid, der ein einzelnes Fab kodiert, mit 20 Einheiten BSTN1 (New England Biolabs, Beverly, MA) verdaut wurden und die Fragmente auf einem 3% Agarosegel analysiert wurden. Jeder der dreißig Klone aus der nicht-angereicherten Bibliothek zeigte ein unterschiedliches Restriktionsmuster, wohingegen die Klone aus der angereicherten Bibliothek nur zwei klonale Muster zeigten. Klone, die für diese beiden Muster repräsentativ sind (5-3 und 5-4), wurden dementsprechend durch DNA-Sequenzierung, wie nachfolgend beschrieben, direkt analysiert.
BEISPIEL XVIII REINIGUNG VON FAB
Beide angereicherten und nicht-angereicherten Bibliotheken wurden von pComb 3 zu C₃AP313H₆, einem pComb 3-Derivat, das sechs Histidine an den Carboxyterminus des Fab nach SpeI- und NheI-Verdau, um die cpIII-Ankerdomäne zu entfernen, fusioniert, transferiert (C₃AP313H₆ war ein Geschenk von Carlos Barbas III, Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien).
Bibliotheken wurden versetzt, indem die V_H- und V_L-kodierenden Polynukleotide aus den Hc2- und Lc2-Expressionskassetten von pComb 3 entfernt und nacheinander in C₃RP313H₆ ligiert wurden. Mit dem neuen Phagemid wurden E. coli-XLI-Blue-Zellen durch Elektroporation transformiert. Individuelle Kolonien wurden durch LB-Agar-Selektion, ergänzt mit 100 μl/ml Carbenicillin, isoliert.
Der Klon 5-3 aus der angereicherten Bibliothek wurde für eine Reinigung in großem Maßstab ausgewählt. Eine einzelne Kolonie wurde gepickt und man ließ sie über Nacht in 10 ml SB, ergänzt mit 10 μg/ml Tetracyclin, 50 μg/ml Carbenicillin, 10 mM MgCl₂ und 40 mM Glucose, sich vermehren. Die Bakterienkultur wurde durch Zentrifugation pelletiert, um Glucose zu entfernen, und das Zellpellet in einen Liter SB, die 50 μg/ml Carbenicillin und 20 mM MgCl₂ enthielt, transferiert. Die XL1-Blue-Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln bei 300 Upm kultiviert, bis die Absorption (OD₆₀₀) zwischen 0,6 und 0,8 lag. Die Zellkultur wurde dann mit 4 mM IPTG induziert, um das heterodimere Antikörpermaterial zu exprimieren, und bei 30°C über Nacht kultiviert. Die Zellkultur wurde zentrifugiert, um die XL1-Blue-Zellen zu pelletieren, und das Pellet in 30 ml Beschallungspuffer (50 mM NaPO₄, 300 mM NaCl₂, 0,01% NaN₃, pH 7,9) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden achtmal in Stößen von 15 s bei 50% Energie (40 Watt, „micro sonic disrupter", Tekmar, Cincinnatti, OH) beschallt.
Das beschallte Material wurde bei 15000 Upm in einer Beckman-JA20-Zentrifuge 40 min bei 4°C zentrifugiert und der Überstand nacheinander durch einen 0,45 und einen 0,22 μm-Nytex-Filter (Amicon, Beverly, MA) filtriert. Das beschallte Material wurde unverzüglich mit 20 ml/h auf eine 1 ml-NTA-Ni-Säule (Qiagen) aufgeladen und mit Beschallungspuffer, typischerweise 40-50 ml, gewaschen, bis die Absorption (OD₂₈₀) < 0,01 war. Die Säule wurde dann mit 10 ml 10 mM Imidazol in Beschallungspuffer ge waschen, um Verunreinigungen zu entfernen, gefolgt von jeweils 10 ml von 100 mM, 250 mM und 500 mM Imidazol, wobei 1 ml-Fraktionen gesammelt wurden, die anhand der OD₂₈₀ überprüft wurden. Aliquots wurden durch denaturierende und reduzierende 12 SDS-PRGE-Gele analysiert, um zu bestimmen, wo Fab eluierte. Aufgrund der Anwesenheit von Imidazol wurden Proben mit Auftragspuffer nicht gekocht, sondern vor dem Auftragen stattdessen 10 min bei 37°C denaturiert. Typischerweise eluiert das Fab in den ersten 3 Fraktionen der 100 mM Imidazol-Wäsche.
Ein Milliliter-Fraktionen, die Fab enthalten, wurden dann vereinigt oder gepoolt und unter Verwendung von Amicon-Dialysemembranen (6-8 kD-Ausschluss-Membranen) gegen PBS dialysiert, um das Imidazol zu entfernen. Die Proben wurden aufkonzentriert und eine jegliche freie schwere oder leichte Kette unter Verwendung einer Centricon 50^TM Zentrifugations-Dialyse-Membran von Amicon Corporation, Beverly, MA, entfernt.
Überraschenderweise unterschied sich die berechnete Antikörperkonzentration in der gereinigten Fraktion anhand der Gesamtprotein-Bestimmung (Bio-rad Protein Assay, Richmond, CA) von der ELISA (anti-Kappa)-Bestimmung. Pro 1 l Bakterienkultur betrug die Fab-Ausbeute ~1 mg anhand des Gesamtproteinassays gegenüber ~0,1 mg anhand des Immunoassays. Da die Verwendung der Proteine in dieser Studie ELISA-Immunreaktivität ausnutzte, werden Fab-Konzentrationen unter Verwendung des ELISA-Verfahrens angegeben.
Das 5-3-Fab wurde unter Verwendung der hier beschriebenen Assays charakterisiert. Starke Bindung (ungefähr 0,1 Mikrogramm/Milliliter) an fixierte Neutrophile in einem ELISA-Format. Es ist auch bemerkenswert, dass 5-3-p-ANCA-Fab verglichen mit UC-Serum stark reaktiv ist, da eine optimale Bindung bei 1% Serum (oder ungefähr 0,1 Milligramm/Milliliter Gesamt-IgG) auftrat. Schätzt man, dass ungefähr 1% Hyperimmun-Serum Anti gen-spezifisch ist, dann beträgt die Konzentration von nativem p-ANCA-IgG ungefähr 1 Mikrogramm/ml oder liegt in einem ähnlichen Bereich für die Bindung durch ein monovalentes Fab.
Bei entzündlichen Erkrankungen sind Marker-Antikörper vom ANCA-Typ für bestimmte definierte Neutrophilen-Proteine spezifisch. Das 5-3-p-ANCA-Fab wurde hinsichtlich Immunreaktivität mit Cathepsin G, Elastase, Myeloperoxidase und Lactoferrin in einem ELISA-Format getestet. Bei bis zu 500 Nanogramm/ml 5-3-p-ANCA-Fab wurde keine Bindung festgestellt.
Das 5-3-p-ANCA-Fab wurde auch durch einen Alkohol-fixierte Neutrophile-IIF-Assay hinsichtlich des p-ANCA-Färbungsmusters untersucht. Ein Immunfluoreszenz-Nachweis der Neutrophilen-Färbung durch 5-3-p-ANCA-Fab ergab das gleiche p-ANCA-Färbungsmuster, das durch herkömmliches UC-Serum erzeugt wird. Wenn die Immunreaktivität von 5-3-p-ANCA-Fab hinsichtlich DNase-Empfindlichkeit gemäß BEISPIEL VI oben getestet wurde, verursachte wie bei herkömmlichem p-ANCA-positivem UC-Serum die Dnase I-Behandlung von Neutrophilen den vollständigen Verlust eines detektierbaren p-ANCA-Färbungsmusters. Zusätzlich zeigte eine konfokale Mikroskopie, dass 5-3-p-ANCA-Fab Antigen bindet, das sich innerhalb der Zellkernhülle befindet, eine Charakteristik, die bei p-ANCA-seropositivem UC-Serum gefunden wird.
BEISPIEL XIX
NUKLEINSÄURESEQUENZIERUNG
Die Nukleinsäuresequenzierung wurde an doppelsträngiger DNA der Klone 5-3 und 5-4 unter Verwendung von 5'- und 3'-Primern für die schweren und leichten Ketten (SEQ ID NOs: 21 und 22 bzw. SEQ ID NOs: 23 und 24) und Sequenase 1.0 (United States Biochemicals) ausgeführt. Homologierecherchen und -zuordnungen wurden unter Verwendung von Genebank durchgeführt.
SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN (i) ANMELDER:
(A) NAME: Cedars-Sinai Medical Center
(B) STRASSE: 8700 Beverly Boulevard
(C) ORT: Los Angeles
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: Vereinigte Staaten
(F) POSTLEITZAHL: 90048–1863
(G) TELEFON: (310) 855–5284
(H) TELEFAX: (310) 967–0101
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zum selektiven Nachweis von perinukleären anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern von Colitis ulcerosa, primärer sklerosierender Cholangitis oder Typ I Autoimmun-Hepatitis
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 24
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(vi) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/196,003
(B) HINTERLEGUNGSDATUM: 11. Februar 1994
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 699 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: N-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(F) GEWEBETYP: Darm-assoziiertes Lymphgewebe
(G) ZELLTYP: Lymphozyt
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) KLON: 5-3
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..699
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Kodonstart = 1 /Produkt = „menschliche schwere Kette von IgG-ANCA, der mit UC assoziiert ist"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..15
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Produkt = „N-terminale Markierung (Tag) "
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..96
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR1 /Anmerkung= „„FR1" bezieht sich auf Gerüstregion 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 97..111
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR1 /Anmerkung= „„CDR1" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 112..153
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR2 /Anmerkung= „„FR2" bezieht sich auf Gerüstregion 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 154..204
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR2 /Anmerkung= „„CDR2" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 205..300
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR3 /Anmerkung= „„FR3" bezieht sich auf Gerüstregion 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 301..327
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR3 /Anmerkung= „„CDR3" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 328..360
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR4 /Anmerkung= „„FR4" bezieht sich auf Gerüstregion 4"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 361..651
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CH1 /Anmerkung= „„CH1" bezieht sich auf konstantes Segment 1 der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 652..678
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Gelenk /Anmerkung= „„Gelenk" bezieht sich auf partielles Gelenksegment der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 679..699
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Hex-HTAG /Anmerkung= „„Hex-HTAG" bezieht sich auf Hexahistidin-Markierung (Tag)"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
s(B) LAGE: 16..651
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Fd /Anmerkung= „„Fd" bezieht sich auf das Fd der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..300
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VHSEGMENT /Anmerkung= „„VHSEGMENT" bezieht sich auf variables Segment der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 301..315
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = D /Anmerkung= „„D" bezieht sich auf Diversitätsseqment"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 316..360
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = JH /Anmerkung= „„JH" bezieht sich auf Verbindungssegment der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..360
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VHDOMAIN /Anmerkung= „„VHDOMAIN" bezieht sich auf variable Domäne der schweren Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 233 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 732 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: N-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(F) GEWEBETYP: Darm-assoziiertes Lymphgewebe
(G) ZELLTYP: Lymphozyt
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) KLON: 5-4
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..732
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Kodonstart = 1 /Produkt = „menschliche schwere Kette von IgG-ANCA, der mit UC assoziiert ist"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..15
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Produkt = „N-terminale Markierung (Tag)"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..93
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR1 /Anmerkung= „„FR1" bezieht sich auf Gerüstregion 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 94..108
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDRl /Anmerkung= „„CDRl" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 109..150
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR2 /Anmerkung= „„FR2" bezieht sich auf Gerüstregion 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 151..201
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR2 /Anmerkung= „„CDR2" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 202..297
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR3 /Anmerkung= „„FR3" bezieht sich auf Gerüstregion 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 298..360
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR3 /Anmerkung= „„CDR3" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 361..393
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR4 /Anmerkung= „„FR4" bezieht sich auf Gerüstregion 4"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 394..684
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CH1 /Anmerkung= „„CH1" bezieht sich auf konstantes Segment 1 der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 685..711
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Gelenk /Anmerkung= „„Gelenk" bezieht sich auf partielles Gelenksegment der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 712..732
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Hex-HTAG /Anmerkung= „„Hex-HTAG" bezieht sich auf Hexahistidin-Markierung (Tag)"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..684
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Fd /Anmerkung= „„Fd" bezieht sich auf das Fd der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..297
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VHSEGMENT /Anmerkung= „„VHSEGMENT" bezieht sich auf variables Segment der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 298..363
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = D /Anmerkung= „„D" bezieht sich auf Diversitätssegment"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 364..408
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = JH /Anmerkung= „„JH" bezieht sich auf Verbindungssegment der schweren Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 16..408
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VHDOMAIN /Anmerkung= „„VHDOMAIN" bezieht sich auf variable Domäne der schweren Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 244 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 642 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNR
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(F) GEWEBETYP: Darm-assoziiertes Lymphgewebe
(G) ZELLTYP: Lymphozyt
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(C) KLON: 5-3
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..642
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Kodonstart = 1 /Produkt = „leichte κ-Kette von ANCA, der mit Colitis ulcerosa assoziiert ist"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..3
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Produkt = „N-terminale Markierung (Tag)"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 4..285
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VKSEGMENT /Anmerkung= „„VKSEGMENT" bezieht sich auf variables Segment der leichten κ-Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 286..324
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = JK /Anmerkung= „„JK" bezieht sich auf Verbindungssegment der leichten κ-Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 325..642
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CK /Anmerkung= „„CK" bezieht sich auf konstantes Segment der leichten κ-Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 4..66
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR1 /Anmerkung= „„FR1" bezieht sich auf Gerüstregion 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 67..102
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDRl /Anmerkung= „„CDR1" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 103..147
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR2 /Anmerkung= „„FR2" bezieht sich auf Gerüstregion 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 148..168
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR2 /Anmerkung= „„CDR2" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 169..264
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR3 /Anmerkung= „„FR3" bezieht sich auf Gerüstregion 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 265..291
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR3 /Anmerkung= „„CDR3" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 292..324
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR4 /Anmerkung= „„FR4" bezieht sich auf Gerüstregion 4"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 214 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 645 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(F) GEWEBETYP: Darm-assoziiertes Lymphgewebe
(G) ZELLTYP: Lymphozyt
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(D) KLON: 5-4
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..645
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Kodonstart = 1 /Produkt = „leichte κ-Kette von ANCA, der mit Colitis ulcerosa assoziiert ist"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..3
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Produkt = „N-terminate Markierung (Tag)"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 4..285
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VKSEGMENT /Anmerkung= „„VKSEGMENT" bezieht sich auf variables Segment der leichten κ-Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc RNA
(B) LAGE: 286..327
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = JK /Anmerkung= „„JK" bezieht sich auf Verbindungssegment der leichten κ-Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 328..645
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CK /Anmerkung= „„CK" bezieht sich auf konstantes Segment der leichten κ-Kette"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 4..66
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR1 /Anmerkung= „„FR1" bezieht sich auf Gerüstregion 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc RNA
(B) LAGE: 67..102
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR1 /Anmerkung= „„CDR1" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 1"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 103..147
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR2 /Anmerkung= „„FR2" bezieht sich auf Gerüstregion 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 148..168
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR2 /Anmerkung= „„CDR2" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 2"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 169..264
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR3 /Anmerkung= „„FR3" bezieht sich auf Gerüstregion 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 265..294
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CDR3 /Anmerkung= „„CDR3" bezieht sich auf Komplementaritäts-bestimmende Region 3"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 295..327
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = FR4 /Anmerkung= „„FR4" bezieht sich auf Gerüstregion 4"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 215 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..30
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CGlz /Anmerkung= „„CGlz" bezieht sich auf den cDNA-Primer für konstante Segmente der schweren IgG1-Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VHla /Anmerkung= „„VHla bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH1-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VH3a /Anmerkung= „„VH3a" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH3-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(v) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..23
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VH2f /Anmerkung= „„VH2f" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH2-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNR
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VH3f /Anmerkung= „„VH3f" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH3-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(vi) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..23
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VH4f /Anmerkung= „„VH4f" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH4-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNR
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..23
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VH6a /Anmerkung= „„VH6a" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH6-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..27
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VH6f
/Anmerkung= „„VH6f" bezieht sich auf den cDNR-Primer für variable Segmente der schweren Kette, die Mitglieder der VH6-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..58
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = CKld /Anmerkung= „„CKld" bezieht sich auf den cDNA-Primer für konstante Segmente der leichten κ-Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VK1a /Anmerkung= „„vK1a" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der leichten κ-Kette, die Mitglieder der VK1-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VK2a /Anmerkung= „„VK2a" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der leichten κ-Kette, die Mitglieder der VK2-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = VK3a /Anmerkung= „„VK3a" bezieht sich auf den cDNA-Primer für variable Segmente der leichten κ-Kette, die Mitglieder der VK3-Genfamilie sind"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..22
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Anmerkung= „5'-Sequenzierungprimer für die schwere Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..18
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Anmerkung= „3'-Sequenzierungprimer für die schwere Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..18
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Anmerkung= „5'-Sequenzierungprimer für die leichte Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_RNA
(B) LAGE: 1..21
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Anmerkung= „3'-Sequenzierungprimer für die leichte Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

Claims

Verfahren zum Nachweis perinukleärer anti-neutrophiler zytoplasmatischer Antikörper (p-ANCA), die mit Typ 1 Autoimmun-Hepatitis assoziiert sind, in einer Probe, das die Schritte umfaßt: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren eines Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophile durch DNase nicht verdaut wurde, und wobei das Vorliegen eines granulären zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle das Vorliegen von p-ANCA, der mit Typ 1 Autoimmun-Hepatitis assoziiert ist, in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die fixierten Neutrophilen Alkohol-fixierte Neutrophile sind.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Alkohol-fixierten Neutrophilen Methanol-fixierte Neutrophile sind.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Bedingungen, die ausreichen, einen im wesentlichen vollständigen Verdau zellulärer DNA ohne wesentlichen Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie zu bewirken, das Inkubieren der Neutrophilen in einer DNase-Konzentration von etwa 2 bis 10 Einheiten DNase pro Milliliter Puffer für eine Zeitdauer im Bereich von etwa 15 Minuten bis eine Stunde bei einer Temperatur im Bereich von etwa 22°C bis 40°C umfassen.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der sekundäre Antikörper anti-IgG ist.
verfahren zum Nachweis perinukleärer anti-neutrophiler zytoplasmatischer Antikörper (p-ANCA), die mit primärer sklerosierender Cholangitis assoziiert sind, in einer Probe, das die Schritte umfaßt: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren eines Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophile durch DNase nicht verdaut wurde, und wobei das Vorliegen eines homogenen zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle das Vorliegen von p-ANCA, der mit primärer sklerosierender Cholangitis assoziiert ist, in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die fixierten Neutrophilen Alkohol-fixierte Neutrophile sind.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Alkohol-fixierten Neutrophilen Methanol-fixierte Neutrophile sind.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Bedingungen, die ausreichen, einen im wesentlichen vollständigen Verdau zellulärer DNA ohne wesentlichen Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie zu bewirken, das Inkubieren der Neutrophilen in einer DNase-Konzentration von etwa 2 bis 10 Einheiten DNase pro Milliliter Puffer für eine Zeitdauer im Bereich von etwa 15 Minuten bis eine Stunde bei einer Temperatur im Bereich von etwa 22°C bis 40°C umfassen.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der sekundäre Antikörper anti-IgG ist.
Verfahren zur Unterscheidung primär sklerosierender Cholangitis von Typ 1 Autoimmun-Hepatitis, das die Schritte umfaßt: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedin gungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren eines Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophile durch DNase nicht verdaut wurde, und wobei das Vorliegen eines homogenen zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle das Vorliegen von p-ANCA, der mit primärer sklerosierender Cholangitis assoziiert ist, in der Probe anzeigt, und wobei das Vorliegen eines granulären zytoplasmatischen Färbungsmusters in der Probe und eines perinukleären Färbungsmusters in der Kontrolle das Vorliegen von p-ANCA, der mit Typ 1 Autoimmun-Hepatitis assoziiert ist, in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die fixierten Neutrophilen Alkohol-fixierte Neutrophile sind.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Alkohol-fixierten Neutrophilen Methanol-fixierte Neutrophile sind.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Bedingungen, die ausreichen, einen im wesentlichen vollständigen Verdau zellulärer DNA ohne wesentlichen Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie zu bewirken, das Inkubieren der Neutrophilen in einer DNase-Konzentration von etwa 2 bis 10 Einheiten DNase pro Milliliter Puffer für eine Zeitdauer im Bereich von etwa 15 Minuten bis eine Stunde bei einer Temperatur im Bereich von etwa 22°C bis 40°C umfassen.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der sekundäre Antikörper anti-IgG ist.
Verfahren zur Unterscheidung primär sklerosierender Cholangitis von Typ 1 Autoimmun-Hepatitis, das die Schritte umfaßt: (a) Kontaktieren fixierter Neutrophiler mit einer Probe und einem detektierbaren sekundären Antikörper unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Immunkomplex des Neutrophils, p-ANCA und des detektierbaren sekundären Antikörpers zu bilden, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophilen durch DNase ohne signifikanten Verlust nukleärer oder zellulärer Morphologie verdaut wurde und wobei der detektierbare sekundäre Antikörper für den Klassen-determinierenden Teil von p-ANCA spezifisch ist; (b) Trennen von ungebundenem sekundärem Antikörper von dem Immunkomplex; und (c) Detektieren eines Färbungsmusters des Komplexes im Vergleich zu einer Kontrolle, wobei die Kontrolle das Resultat einer Wiederholung des vorliegenden Verfahrens unter Verwendung fixierter Neutrophiler ist, wobei die zelluläre DNA der fixierten Neutrophile durch DNase nicht verdaut wurde, und wobei der Verlust von detektierbarem Komplex, der mit perinukleärem Färbungsmuster assoziiert ist, im Vergleich zur Kontrolle Colitis ulcerosa anzeigt, wobei die Umwandlung von detektierbarem Komplex, der mit perinukleärem Färbungsmuster assoziiert ist, in homogenes zytoplasmatisches Färbungsmuster im Vergleich zur Kontrolle primär sklerosierende Cholangitis anzeigt, wobei die Umwandlung von detektierbarem Komplex, der mit perinukleärem Färbungsmuster assoziiert ist, in granuläres zytoplasmatisches Färbungsmuster im Vergleich zur Kontrolle Typ 1 Autoimmun-Hepatitis anzeigt, und wobei die Abwesenheit eines detektierbaren Komplexes, der mit perinukleärem Färbungsmuster assoziiert ist, im Vergleich zur Kontrolle Crohn-Krankheit anzeigt.