DE69725606T2

DE69725606T2 - Methoden für die diagnose von allergischen atemwegsaspergillosen

Info

Publication number: DE69725606T2
Application number: DE69725606T
Authority: DE
Inventors: Reto Crameri; Stepanie Hemmann; Kurt Blaser
Original assignee: Pharmacia Diagnostics AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2017-12-20
Also published as: DE69725606D1; WO1998028624A1; US6830891B1; SE9604815D0; AU5505198A; JP4234207B2; DK0946873T3; ATE252238T1; EP0946873B1; ES2210591T3; JP2001507130A; PT946873E; US20050074410A1; EP0946873A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Differentialdiagnose von allergischer bronchopulmonärer Aspergillose (ABPA) und rekombinante Allergene, welche in den Verfahren verwendet werden sollen. Während des Prioritätsjahres wurde das rekombinante Allergen, welches in der Prioritätsanmeldung als rAsp f2 bezeichnet wurde, offiziell mit dem Namen rAsp f6 versehen. In diesem Text wird der offizielle Name verwendet.
Technischer Hintergrund
Allergische bronchopulmonäre Aspergillose (ABPA). Allergische bronchopulmonäre Aspergillose ist die schwerste allergische Komplikation, welcher von Aspergillus-Arten, hauptsächlich A. fumigatus verursacht wird. ABPA ist das Ergebnis einer Hyperempfindlichkeit gegen Aspergillus-Antigene, hauptsächlich in Patienten, welch unter langandauerndem atopischen Asthma (8–12) oder cystischer Fibrose (16–19) leiden. Obwohl ursprünglich als eine seltene Krankheit angesehen (13), wird ABPA derzeitig mit viel größerer Häufigkeit erkannt. Es wurde berichtet, daß ABPA mit variierenden klinischen Darstellungen in etwa 15% der asthmatischen Patienten auftritt, welche gegen A. fumigatus sensitiviert sind (14, 15), während in Patienten mit cystische Fibrose das berichtete Vorkommen von 10 bis 35% variiert (16, 17). AB-PA ist als eine Immunkrankheit beschrieben worden, welche von Asthma zur fatalen zerstörerischen Lungenkrankheit mit definierten klinischen, serologischen, radiologischen und pathologischen Merkmalen reicht (8, 18–22). Wegen ihrer Schwere sollte ABPA in Patienten mit chronischem Asthma oder cystischer Fibrose, welche eine unmittelbare kutane Reaktivität gegen A. fumigatus aufzeigen, ausgeschlossen werden (8). Die diagnostischen Kriterien für ABPA sind Asthma oder cystische Fibrose, die Geschichte der röntgenographischen Infiltrate (in den meisten Fällen), die unmittelbare kutane Reaktivität gegen A. fumigatus-Extrakte, erhöhtes Gesamtserum-IgE, Präzipitation von Antikörpern gegen A. fumigatus, periphere Blut-Eosinophilie, erhöhtes spezifisches Serum-IgE und -IgG gegen A. fumigatus, verglichen zu Seren aus Patienten mit Asthma und kutaner Reaktivität gegen Aspergillus, jedoch ohne ABPA, und eine proximate (zentrale) Bronchiektasie mit einer normalen Zuspitzung der distalen Bronchien (23–25). In Fällen, wo alle Kriterien vorhanden sind, wird die Diagnose ohne weiteres vorgenommen (26). Allerdings sind selten alle der acht Kriterien gleichzeitig vorhanden, sogar bei klassischen ABPA-Patienten mit zentraler Bronchiektasie. Mit der Ausnahme von Bronchiektasie und, zu einem gewissen Ausmaß erhöhtem spezifischen Serum-IgE und -IgG gegen A. fumigatus, sind keine der diagnostischen Kriterien für ABPA spezifisch (26). Darüber hinaus werden Lungeninfiltrate und zentrale Bronchiektasie häufig in Patienten nachgewiesen, welche unter cystischer Fibrose leiden, auch in Abwesenheit von Sensitivierung gegenüber A. fumigatus, was eine Diagnose von ABPA in Patienten mit cystischer Fibrose noch schwieriger macht (16). Deshalb hat eine serologische Identifizierung von AB-PA ein größeres diagnostisches Potential, wird jedoch durch das Fehlen von standardisierten, zuverlässigen Pilzextrakten behindert (5, 7, 27–29).
Aspergillus fumigatus-Antigene. Das Hauptproblem bei der Immundiagnose von mit A. fumigatus verwandten Krankheiten stammt aus der antigenischen Komplexität des Pilzes. Antigen/Allergenextrakte von A. fumigatus enthalten Hunderte von verschiedenen Proteinen (6, 30, 31), von denen eine begrenzte Untergruppe in der Lage ist, an humanes Serum-IgE zu binden (6, 32, 33, 35). Es wurde berichtet, daß der Pilz mehr als 40 IgE-bindende Komponenten herstellt, welche komplexe IgE-Bindungsmuster erzeugen, wenn Extrakte durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Seren aus allergischen Individuen untersucht werden (32, 33). Um das Bild noch komplizierter zu machen, erkennt Serum-IgE aus unterschiedlichen Patienten stark variable Muster der Pilzproteine (6, 36). Im Falle von Patienten, welche unter ABPA leiden, können, abhängig vom Krankheitsstadium, unterschiedliche allergene "Fingerabdrücke" mit Serum aus dem gleichen Patienten erhalten werden, welches zu unterschiedlichen Zeiten entnommen wurde, sogar wenn Pilzextrakt aus dem gleichen Ansatz verwendet wird (36, 37).
Es ist vorgeschlagen worden, gereinigte native allergene Komponenten anstelle von rohen Allergenextrakten für das Diagnostizieren von ABPA zu verwenden (79). Rekombinante A. fumigatus-Allergene mit Beziehungen zu ABPA sind früher beschrieben worden (71, 83).
Die Erfinder sind namentlich genannte Autoren in einer Anzahl von Artikeln über rekombinante Allergene aus A. fumigatus (Klonierung und Expression: 39, 43, 49, 51, 52, 82 und diagnostische Anwendung: 59, 66, 32, 71, 76, 81).
Ergebnis der während des Prioritätsjahres erfolgten Recherche vom internationalen Typ
Die Bezugsstellen 66, 79 und 84 sind als von besonderer Bedeutung kategorisiert worden.
Banerjee et al. (1984) beschreibt Antigene, welche nicht intrazellular sein können. Die beschriebenen Antigene reagieren gezeigtermaßen mit Seren von Patienten mit ABPA, aber es gibt keine Daten, welche nahelegen, daß die Antigene nicht mit Seren von A. fumigatussensitivierten Patienten, welche keine ABPA aufweisen, reagieren werden.
Moser et al. (66) und Little et al., (79) beschreiben sezernierte Proteine/Antigene, welche keine Differentialdiagnose von ABPA zulassen, weil sie häufig mit Seren von A. fumigatussensitivierten Patienten ohne ABPA und Seren von ABPA-Patienten reagieren.
Die Ziele der Erfindung
Das Hauptziel der Erfindung besteht darin, verbesserte Verfahren für die Differentialdiagnose von ABPA vorzusehen.
Ein Nebenziel besteht darin, diagnostische in vitro-Verfahren vorzusehen, welche ausreichende Spezifität und Empfindlichkeit für die Diagnose von ABPA aufweisen.
Ein zweites Unterziel besteht darin, wohl-definierte Allergenpräparate vorzusehen, welche für die Diagnose von ABPA in vitro, einschließlich Immunoassay, verwendet werden können.
Die Erfindung
Ein erster Hauptaspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren für die Differentialdiagnose von allergener bronchiopulmonärer Aspergillose (APBA). Dieser Aspekt ist gekennzeichnet durch Verwendung eines mit ABPA in Beziehung stehenden rekombinanten Allergens als ein Reagens, d. h. ein rekombinantes Allergen, welches ein Epitop trägt, gegen welches Antikörper von verschiedenen Ig-Klassen/Unterklassen, wie der IgE-Klasse oder Gesamt-IgG oder IgG-Unterklassen (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), ausgewählt wurden unter rAsp f4, rAsp f6 und rAsp f8 und mit ABPA in Beziehung stehenden Fragmenten davon, und so nachgewiesen werden können, daß ein ABPA-Befund in einem Patienten von einer allergischen Sensitivierung gegen A. fumigatus unterschieden werden kann, was besonders in Patienten, welche unter cystischer Fibrose leiden, nützlich ist.
Das Konzept von mit ABPA in Beziehung stehenden rekombinanten Allergenen beinhaltet jedwedes rekombinante Allergen, ungeachtet dessen Ursprungs, welches das obenstehend erwähnte Antikörperbindungs-Merkmal aufweist, welches die angegebene Differentialdiagnose ermöglicht. Es beinhaltet insbesondere mit ABPA in Beziehung stehende rekombinante Allergene, abgeleitet aus A. fumigatus, und ihre mit ABPA in Beziehung stehenden Fragmente. Für, mit ABPA in Beziehung stehende rekombinante Allergene, kloniert aus A. fumigatus, beinhaltet das Konzept mit ABPA in Beziehung stehende Allergene und daraus abgeleitete Fragmente aus anderen Quellen, welche ein oder mehrere ABPA-Epitope mit einem mit AB-PA in Beziehung stehenden Allergen aus A. fumigatus gemeinsam haben. Zum Prioritätsdatum wurden rAsp f4 und rAsp f6 und ihre Fragmente, wie obenstehend definiert, als die nützlichsten, mit ABPA in Beziehung stehenden Allergene erachtet. Verschiedene derivatisierte Formen, welche das Vermögen zur Bindung von Antikörpern beibehielten, wie für mit ABPA in Beziehung stehende rekombinante Allergene definiert, werden ebenfalls eingeschlossen.
Verschiedene Unteraspekte schließen in vitro- und in vivo-Testprotokolle, wie nachstehend beschrieben, ein.
Der zweite Hauptaspekt der Erfindung besteht in neuen, mit ABPA in Beziehung stehenden rekombinanten Allergenen, welche an humanes IgE, vorhanden in ABPA-Patienten, binden und im ersten Aspekt der Erfindung nützlich sind.
Verschiedene Unteraspekte dieses zweiten Hauptaspekts der Erfindung sind aus dem Nachstehenden ersichtlich und umfassen derivatisierte Formen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, underivatisierte, unlöslich gemachte und markierte, mit ABPA in Beziehung stehende Allergene.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von, mit ABPA in Beziehung stehenden, Allergenen für eine Hyposensitivierungs-Behandlung, wie sie für andere Allergene durchgeführt wird.
Klonierung von Allergenen aus Aspergillus fumigatus.
Die Klonierungsstrategie verwendete das Phagmid pComb3 (47) und die Fähigkeit der Leucin-Zipper-Proteine Jun und Fos, miteinander zu assoziieren (74, 48, 74, 75).
Ein modifiziertes gIII-Produkt, erhalten durch Fusionieren der DNA, codierend für den jun-Leucin-Zipper, flankiert von Cystein-Resten, N-terminal zum viralen Hüllprotein, wurde von einem LacZ-Promotor aus exprimiert und in den periplasmatischen Raum von E. coli mittels eines pe1B-Leader-Peptids sezerniert, wodurch es strukturell während der Infektion mit Helferphage in Phagenteilchen eingebaut wurde (49). Unter Verwendung eines zweiten LacZ-Promotors des Phagmids, wurde die fos-Leucin-Zipper-Domäne, flankiert von Cystein- Resten, co-exprimiert als N-terminales Fusionspeptid an cDNA-Proteinprodukte von A. fumigatus, in den periplasmatischen Raum von E. coli unter Verwendung des pe1B Leader-Peptids sezerniert (50). Durch Jun-Fos-Heterodimerisierung und Disulfidbindungs-Bildung stellt das gIII-Jun-Fusionsprotein, eingebaut in die Phagenteilchen, eine kovalente Verknüpfung an die Phagenoberfläche für statistische rekombinante cDNA-Produkte bereit, an welche N-terminal der Fos-Leucin-Zipper angeheftet ist (48, 49). Das Phagmid pJuFo, welches die beschriebenen Elemente enthält (49, 51, 52), ermöglicht die Expression und das Präsentieren bzw. "Display" von cDNA-Bibliotheken, in diesem Falle codierend für "shot-gun"-klonierte A. fumigatus-Peptide/Proteine, auf der Phagenoberfläche und die Anwendung der wirkungsvollen Screening-Technologie, welche auf Biopanning-Vorgehensweisen basiert, die für andere filamentöse Phagensysteme angewandt werden (46, 47). Der Schlüssel zum Erfolg bei der cDNA-Klonierung aus Bibliotheken, welche auf Phagenoberflächen präsentiert werden, liegt in der verwendeten Screening-Strategie. Der wichtigste zu berücksichtigende Faktor besteht darin, daß der zum Selektieren des Phagen verwendete Ligand auf eine Weise markiert oder immobilisiert sein sollte, welche zuläßt, daß der Ligand seine native Konformation behält (46). Es muß berücksichtigt werden, daß Proteine bei direkter Immobilisierung an eine feste Phase durch hydrophobe Wechselwirkung biologische Aktivität aufgrund von Änderungen in der dreidimensionalen Struktur verlieren können (54, 55). Im allgemeinen werden die bekannten oder erwarteten Merkmale des Liganden das für die Ligandenimmobilisierung verwendete Vorgehen vorschreiben. Für die Isolierung von Allergenen, welche von Serumantikörpern erkannt werden, hat sich herausgestellt, daß die Verwendung von Einfangantikörpern aus verschiedenen Gründen sehr effektiv ist. Zum Ersten stören monoklonale Antikörper, erzeugt gegen die konstanten Immunoglobulin-ε-Domänen Cε2, Cε3 oder Cε4, nicht die Antigenbindungsstelle des Antikörpers. Zum zweiten wird eine Oberfläche, beschichtet mit solchen Anti-IgE-Antikörpern, in der Lage sein, selektiv IgE-Antikörper aus dem Serum von Allergiepatienten zu immobilisieren. Deswegen wird, nach Abwaschen von wechselwirkenden und kreuzreagierenden Serumantikörpern anderer Isotypen zusammen mit allen anderen Serumkomponenten, eine spezifische Oberfläche, die lediglich zur Adsorption von Phagen, welcher IgEbindende Moleküle präsentiert, fähig ist, erhalten werden (51–53).
Die Anwendung von pJuFo zum Präsentieren von cDNA-Produkten und Selektieren von Phagen aus einer Bibliothek, konstruiert unter Verwendung von mRNA aus A. fumigatus (39, 51, 52), ergab eine große Vielzahl von Phagenklonen, die in der Lage waren, IgE-Antikörper aus Seren von gegen A. fumigatus sensitivierten Patienten zu binden (Tabelle 1).
Verglichen mit dem Screening von λ-Bibliotheken, immobilisiert auf Festphasenträgern, besitzt das Screeningvorgehen für cDNA-Bibliotheken, welche auf der Oberfläche von filamen tösen Phagen präsentiert werden, mehrere Vorteile. Das Einfangen von Serum-IgE mit einem immobilisierten Anti-IgE-Antikörper erzeugt eine homogene Oberfläche mit immobilisiertem IgE, welches nicht denaturiert wird (53, 57) und deshalb die volle Antigenbindungsfähigkeit beibehält. Der wichtigste Vorteil folgt aus der Tatsache, daß die Phagenbibliothek in einer flüssigen Phase gehalten wird, wobei lediglich Phagen mit Affinität zum Liganden auf der Festphase nach dem Waschen zurückgehalten werden (47, 53). Desorbierter Phage kann verwendet werden, um E. coli zu infizieren, um Phage mit Affinität für den Liganden zu amplifizieren. Deshalb ermöglichen anschließende Runden des Phagenwachstums und der Selektion eine Anreicherung von Phagen, welche Proteine mit Affinität für den Liganden präsentieren (Tabelle 3). Nach Selektion von Kanditaten-Phagenklonen, welche Proteine mit IgE-Bindungseigenschaften präsentieren, können Phagenpartikel, hergestellt aus 10-ml-Kultur, präzipitiert werden (47), und Proben von 1010–1013 Phagenpartikeln von jedem Kandidatenklon können durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt von Transfer auf Nitrocellulose-Membranen, analysiert werden (49, 51). Nach Blockierung zur Absättigung freier Bindungsstellen auf dem Nitrocellulose-Blatt werden die Membranen mit Patientenserum, verdünnt 1 : 10, als "erstem Antikörper" inkubiert, und Maus-Anti-Mensch-IgE-mAb als zweiter Antikörper kann verwendet werden, um die Bindung von IgE an das ursprünglich auf der Phagenoberfläche vorhandene cDNA-Produkt sichtbar zu machen. Western-Blots können ohne weiteres unter Verwendung nicht-radioaktiver Systeme und von Meerrettichperoxidasekonjugiertem Ziege-Anti-Maus-Ig als Nachweissystem entwickelt werden. Die scheinbare Molekularmasse der IgE-bindenden Proteine, angereichert aus einer A. fumigatus-cDNA-Bibliothek, welche auf einer Phagenoberfläche präsentiert wurde, lag in dem Bereich von 10 bis über 50 kDa. Eine Nukleotidsequenz-Bestimmung (58) einiger cDNA-Inserts, welche sich hinsichtlich Größe und Restriktionsmuster unterschieden, enthüllte, daß sie für unterschiedliche Proteine codieren, wie aus den offenen Leserahmen abgeleitet wurde.
Herstellung von rekombinanten Allergenen in E. coli.
Veranschaulichende Beispiele von Herstellungsverfahren werden nun für zwei mit ABPA in Beziehung stehende rekombinante Allergene, kloniert aus A. fumigatus, welche als rAsp f4 und rAsp f6 bezeichnet werden, angegeben werden.
rAsp f6: DNA, welche die codierende Sequenz von rAsp f6 überspannte, wurde unter der transkriptionellen Steuerung des T7-Promotors (78) in einen Expressionsvektor kloniert. Das Konstrukt war in einer solchen Weise entworfen, daß ein Methionin-Rest am N-terminalen Ende der Allergen-Aminosäuresequenz angefügt wurde, während am C-Terminus die Acht-Reste-Folge-VEHHHHHH angefügt wurde, wobei die sechs aufeinanderfolgenden Histidin- Reste als ein Affinitäts-Anker bzw. -Markierer für Metall-Chelat-Affinitätschromatographie dienen (61). Nach der Sequenzbestätigung wurde das Konstrukt in E. coli BL21 [pT7POL23] (77) überführt, in welchem die Synthese der T7-RNA-Polymerase durch Erhöhen der Temperatur des Wachstumsmediums auf über 37°C induziert werden kann. Um rAsp f66 herzustellen, wurde 1 l LB-Medium, enthaltend eine angemessene Ergänzung mit Antibiotika, mit 1 ml einer Übernacht-Starterkultur, herangezogen bei 30°C, inokuliert. Nach ungefähr 3 Stunden Wachstum bei 30°C bei einer OD₆₀₀ von 0,7, wurde die Temperatur der Kultur auf 42°C umgeschaltet, um eine Expression zu induzieren. Nach 4 Stunden Inkubation bei der induzierenden Temperatur wurden die Zellen durch Zentrifugation abgeerntet und in 50 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl und 5 mM Imidazol (Resuspensionspuffer), resuspendiert. Die Zellen wurden durch Schallbehandlung aufgebrochen, und unlösliche Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand, enthaltend das überexprimierte Allergen, wurde durch einen 0,22 μm-Filter geleitet, um verbleibendes teilchenförmiges Material zu entfernen, und auf eine Baugruppe von zwei in Reihe geschalteten 5 ml-HiTrap-Chelatierungssäulen (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) aufgetragen, welche zuvor mit Ni²⁺ beladen und mit Resuspensionspuffer äqulibriert worden waren. Die Säulenbaugruppe wurde zuerst mit 50 ml Resuspensionspuffer und dann mit 50 ml Resuspensionspuffer, ergänzt mit Imidazol zu 60 mM, gewaschen. Um rAsp f6 zu eluieren, wurden 30 ml eines linearen Gradienten von 60–500 mM Imidazol in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0/0,5 M NaCl, aufgetragen, während 1-ml-Fraktionen aufgefangen und durch SDS-PAGE analysiert wurden. rAsp f6-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und einer Gelfiltration durch eine Superdex 200-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden), äquilibriert und eluiert mit 0,15 M NaCl, unterzogen. Fraktionen, welche rAsp f6 enthielten, wurden vereinigt und unter Verwendung einer Amicon-Zelle, ausgestattet mit einer YM5-Membran, konzentriert. Die Endausbeute an gereinigtem rAsp f6 aus einem Liter Bakterienkultur belief sich auf 23 mg.
rAsp f4: DNA, welche die codierende Sequenz von rAsp f4 umfaßt, wurde in einen Expressionsvektor unter der transkriptionellen Steuerung des T7-Promotors (78) kloniert. Das Konstrukt war auf eine solche Weise entworfen, daß die 11-Reste-Folge MRGSHHHHHHM- an das N-terminale Ende der Allergen-Aminosäuresequenz angefügt war, wobei die sechs aufeinanderfolgenden Histidin-Reste als ein Affinitäts-Anker für Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (61) dienen. Es wurde keine Aminosäure-Anfügung am C-terminalen Ende des Proteins vorgenommen. Nach Sequenzbestätigung wurde das Konstrukt in E. coli BL21 [pT7POL23] (77) überführt, in welchem die Synthese der T7-RNA-Polymerase durch Erhöhen der Temperatur der wachsenden Kultur auf über 37°C induziert werden kann. Um rAsp f4 herzustellen, wurde 1 l LB-Medium, enthaltend eine entsprechende Ergänzung mit Antibiotika, mit 1 ml einer Übernacht-Starterkultur, herangezogen bei 30°C, inokuliert. Nach ungefähr 3 Stunden Wachstum bei 30°C, bei einer OD₆₀₀ von 0,7, wurde die Temperatur der Kultur auf 42°C umgeschaltet, um die Expression zu induzieren. Nach 4 Stunden Inkubation bei der induzierenden Temperatur wurden die Zellen durch Zentrifugation abgeerntet und in 50 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl, resuspendiert. Die Zellen wurden durch Schallbehandlung aufgebrochen und unlösliches Material, einschließlich rAsp f4-Protein, wurde durch Zentrifugation aufgefangen. Das unlösliche Material wurde zweimal durch Resuspension in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 2 M Harnstoff, 0,5 M NaCl und 2% Triton X-100, gefolgt von Zentrifugation, gewaschen. Teilweise gereinigte rAsp f4-enthaltende Inklusionskörper wurden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in 70 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 6 M Guanidiniumhydrochlorid, 0,5 M NaCl, 5 mM Imidazol und 1 mM 2-Mercaptoethanol (Extraktionspuffer) extrahiert. Der Extrakt wurde durch Zentrifugation geklärt, und verbleibendes teilchenförmiges Material wurde durch Hindurchleiten durch einen 0,22 μm-Filter entfernt. Der geklärte Extrakt, enthaltend das überexprimierte Allergen wurde auf eine Baugruppe von zwei in Reihe geschalteten 5-ml-HiTrap-Chelatierungssäulen (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) geladen, welche zuvor mit Ni²⁺ beladen und mit Extraktionspuffer ohne 2-Mercaptoethanol äquilibriert worden waren. Die Säulenbaugruppe wurde zuerst mit 50 ml Extraktionspuffer, dann mit 50 ml 6 M Harnstoff in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol und 1 mM 2-Mercaptoethanol (Harnstoff-Waschpuffer) gewaschen. Um das immobilisierte rAsp f4 zu renaturieren, wurden 960 ml eines linearen Gradienten angewandt, von Harnstoff-Waschpuffer zu 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol und 1 mM 2-Mercaptoethanol (Renaturierungspuffer). Um rAsp f4 zu eluieren, wurden 30 ml Gradient von 20–1000 mM Imidazol in Renaturierungspuffer aufgetragen, während 1-ml-Fraktionen aufgefangen und durch SDS-PAGE analysiert wurden. Fraktionen, welche rAsp f4 enthielten, wurden vereinigt und einer Gelfiltration durch eine Superdex 75-Säule (Pharmacia Bitech AB, Uppsala, Schweden), äquilibriert und eluiert mit 0,15 M NaCl, unterzogen. rAsp f4 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung einer Amicon-Zelle, ausgestattet mit einer YM10-Membran, konzentriert. Die letztendliche Ausbeute an gereinigtem rAsp f4 aus einem Liter Bakterienkultur belief sich auf 34 mg.
Die Herstellung ist auch mit dem Vektor, beschrieben von Hochli et al. (60–63), durchgeführt worden.
Analyse von cDNA-Inserts
Lediglich Inserts, welche für Peptide/Proteine, die für die Diagnose von ABPA relevant sind, codieren, werden erörtert werden.
rAsp f6 (SEQ ID Nr. 1). Ein Klon, enthaltend ein Insert von 751 Basenpaaren mit einem offenen Leserahmen von 624 Basenpaaren, enthüllte einen starke Homologie mit Nukleotidsequenzen, welche für Superoxiddismutasen codieren. Die 3'-nicht-codierende Region hatte einen polyadenylierten Schwanz von 24 Basenpaaren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz diese cDNA-Klons (SEQ ID Nr. 1) war homolog zur Mangan-SOD, wobei die höchste Sequenzidentität von 48–52% zu humanen, Fruchtfliegen-, Gummibaum-, Hefe-, E. coli- und Mycobacterium leprae-Enzymen aufgezeigt wurde. Offensichtlich zeigt die A. fumigatus-MnSOD einen ähnlich hohen Grad von Sequenzidentität zu MnSODs aus einer großen Vielzahl von phylogenetisch entfernten Organismen (43). Eine Mehrfach-Sequenz-Parallelaufreihung zeigt, daß die A. fumigatus-MnSOD (rAsp f6) eine starke Homologie mit menschlicher MnSOD gemeinsam hat (51,8% Identität, 67,2% Homologie). Gegen A. fumigatus-MnSOD herangezogener IgE wird vorwiegend in Seren von Patienten nachgewiesen, welche unter ABPA leiden. Deswegen könnte MnSOD ein Kandidat für eine serologische Differentialunterscheidung zwischen ABPA und A. fumigatus-Allergie sein (siehe nachstehend). Bemerkenswerterweise induzieren sowohl rekombinanter A. fumigatus als auch menschliche MnSOD eine Proliferation der mononukleären Zellen des peripheren Bluts von A. fumigatusallergischen Subjekten mit nachweisbaren Spiegeln an spezifischem IgE gegen A. fumigatus-MnSOD. Darüber hinaus riefen die rekombinanten MnSODs sowohl aus Pilz wie auch Mensch Hautreaktionen vom Typ I in Individuen hervor, welche gegen das Pilz-Enzym sensitiviert waren, was einen Beweis für die Autoreaktivität gegen humane MnSOD in allergischen Individuen, welche gegen das aus der Umwelt stammende A. fumigatus-Allergen sensitiviert sind (43), bereitstellt.
rAsp f4 (SEQ ID Nr. 2). Dies war das zweite rekombinante, mit ABPA in Beziehung stehende Allergen, welches in unserem Screening-System gefunden wurde. Der Klon enthielt ein Insert von 1103 Basenpaaren mit einem offenen Leserahmen von 858 Basenpaaren. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz teilt keine signifikante Homologie mit irgendeinem bekannten Protein. Das Genprodukt, codiert von der verwendeten cDNA, war lediglich durch die Funktion gekennzeichnet, für welche es selektiert wurde: IgE-Bindung.
in vivo-Tests unter Verwendung von rekombinanten Allergenen.
Diese werden hauptsächlich durch Haut-Einstich-Tests veranschaulicht, in welchen eine kleine Menge einer Lösung eines Allergens in die Dermis eines Individuums eingeführt wird, woraufhin eine Rad-Reaktion um die Verabreichungsstelle herum auftritt.
Ein Protokoll für Haut-Einstich-Tests der Erfindung beinhaltete, daß ein rekombinantes Allergen in einer 0,9%igen physiologischen Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml gelöst wurde. 20 μl dieser Lösungen wurden auf die Vorderarme eines Patienten aufgebracht. Danach wurde die Haut mit einer sterilen Nadel gestochen, welche in die Epidermis bei einem Grad-Winkel eingeführt und herausgezogen wurde, um einen kleinen Bereich der Epidermis anzuheben (38). Die Nadel wurde nach der Applikation jeder Lösung verworfen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Teststellen waren 3 bis 4 cm auseinander angeordnet, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden.
Für intradermale Tests wurde eine Allergen-Lösung (100 μg/ml) in 10-fach-Verdünnungsreihen verdünnt und bei Konzentrationen, beginnend bei 10–4 μg/ml bis 10 μg/ml angewandt. Zum Testen wurden die Lösungen (100 μl) auf die Rücken der Patienten injiziert, wobei mit der Lösung mit der niedrigsten Konzentration begonnen wurde, was zu einer Größe des Rades bzw. des Kreises von der halben Größe der Hautreaktion, welche durch die Histamin-Kontrolle induziert wurden, führte. Die Teststellen lagen 5 bis 8 cm auseinander, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden. Histamindihydrochlorid wurde als Positivkontrolle bei Konzentrationen von 0,1% in Haut-Einstich-Tests bzw. 0,01% in intradermalen Tests verwendet. Physiologische 0,9%ige Kochsalzlösung wurde als eine Negativkontrolle verwendet. Die Reaktionen wurden nach 15 Minuten durch Messen des maximalen Längs- und Querdurchmessers des Rades aufgezeichnet und ausgewertet, wie beschrieben (66).
Die Verwendung von rekombinanten A. fumigatus-Allergenen für in vitro-Diagnose.
Die Bindung von rekombinanten A. fumigatus-Allergenen an Antikörper kann in Immunoassays zum Messen von allergenen/antigenspezifischen Antikörpern von verschiedenen Klassen (IgA, IgG, IgD, IgE und IgM), einschließlich spezifischer Unterklassen davon, beispielsweise im Zusammenhang mit Diagnosen von Allergie und ABPA, verwendet werden. Unter den IgG-Unterklassen können IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 erwähnt werden. Die Methodik für den Assay ist die gleiche wie diejenige welche im Stand der Technik für herkömmliche Antigene/Allergene angewandt wird. Geeignete Immunoassay-Protokolle ziehen somit die Bildung eines ternären Immunkomplexes in Betracht:
[Allergen] – [Anti-Allergen-Antikörper] – [Anti-Antikörper]
worin Allergen und Anti-Antikörper zugegebene Reagenzien sind und Anti-Allergen-Antikörper aus der zu testenden Probe stammt. Der Komplex wird in einer unlöslichen oder unsolubilisierbaren Form gebildet. Unlösliche Formen werden bewirkt, indem entweder das Allergen oder der Anti-Antikörper vor, nach oder während der Bildung des Komplexes an eine feste Phase gebunden wird. Gut bekannte feste Phasen auf dem Fachgebiet sind Wände von Röhrchen und Vertiefungen, teilchenförmige und monolithische, mehr oder weniger poröse Materialien, verwendet als Adsorptionsmittel in der Chromatographie und heterogenen Immunoassays, etc. Um die Menge des Komplexes zu messen, wird entweder das Allergen oder der Anti-Antikörper mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe markiert, mit der Maßgabe, daß das Reagens, verknüpft an eine feste Phase oder verursachend eine nachträgliche Insolubilisierung, nicht markiert ist. Gut bekannte detektierbare Gruppen sind Enzyme (ELI-SA), Fluorophore, Chromophore, chemolumineszente Gruppen, radioaktive Isotope, Metallatome, Biotin, Haptene etc. Um die Klassen/Unterklassen-spezifischen Antigen/Allergenspezifischen Antikörper zu messen, muß der Anti-Antikörper Klassen/Unterklassen-spezifisch sein.
Normalerweise wird dieser Typ von Immunoassay mit sequenzieller Inkubation durchgeführt, d. h.
Schritt 1: Probe mit Allergen, gefolgt von
Schritt 2: Inkubation des in Schritt 1 gebildeten Komplexes, d. h. [Allergen] – [Anti-Allergen-Antikörper], mit Anti-Antikörper
oder umgekehrt. Im Falle, daß das in Schritt 1 verwendete Reagens an eine feste Phase gebunden ist, sollten nach jedem Schritt eine Abtrennung und ein Waschen durchgeführt werden, um unspezifische Störungen zu entfernen.
Für eine ABPA-Diagnose sind IgE und bestimmte IgG-Unterklassen die am stärksten relevanten Ig's, welche zu messen sind. Es wird angenommen, daß die zu verwendenden rekombinanten Allergene aus A. fumigatus-Proteinen abgeleitet sein sollten, welche nicht auf der Zelloberfläche exponiert oder sezerniert werden. Dies kann darauf hinweisen, daß die relevantesten A. fumigatus-Allergene, welche für ABPA relevant sind, zellgebunden sein können, beispielsweise als intrazelluläre Peptide/Proteine.
Relevante Antikörper können im Blut (einschließlich Plasma und Serum), Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), Bronchoalveolar-Flüssigkeit, Tränentropfen (Lacrymal-Flüssigkeit) etc. gefunden werden.
Die verwendeten in vitro-Testprotokolle und Ergebnisse.
Die Bindung von IgE-Antikörpern (und anderen Isotypen) an rekombinanter Allergene wurde durch einen ELISA (39) unter Anwenden des gleichen Verfahrens für alle Allergene überprüft. Kurz gesagt, wurden Polystyrol-Mikrotiterplatten 2 h lang bei 37°C mit Allergen-Protein (10 μg/ml in PBS, pH 8,0) beschichtet. Die freien Stellen wurden mit PBS, pH 7,4, enthaltend 5% (w/v) fettfreies Trockenmilchpulver, blockiert (1 h, 37°C). Nach dem Waschen wurden die Platten mit seriell zweifach-verdünnten Seren in Blocking-Puffer, enthaltend 5% Tween 20, inkubiert (2 h, 37°C). Nach dem Waschen wurden ein zweiter Antikörper aus einer kommerziellen Quelle (66) oder TN-142, ein monoklonaler Maus-Anti-Mensch-IgE-Antikörper, herangezogen gegen die Cε2-Domäne (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. C. H. Heusser, Ciba-Geigy Ltd., Basel, Schweiz), verwendet, um den Isotypspezifischen Ig-Gehalt der Seren zu quantifizieren. Die Isotyp-spezifische Ig-Bindung an die Allergene wurde mit an alkalische Phosphatase gekoppelten Ziege-Anti-Maus-IgG (66, 69) nachgewiesen. In Abwesenheit von kalibrierten Standards wurde ein Serumpool aus zwei Patienten, welche unter ABPA litten, als eine "in house"-Referenz verwendet. Die Serumverdünnungen wurden gegen die optische Dichte in einem log-log-Diagramm aufgetragen, und die lineare titrierbare Region wurde verwendet, um die Werte der optischen Dichte in willkürliche ELISA-Einheiten (EU) umzuwandeln. Die Extinktionswerte aus dem Referenz-Serumpool wurden willkürlich als 100 EU/ml für alle analysierten Isotypen gesetzt (66, 68). Der antigenspezifische ELISA gestattet eine zuverlässige Detektion von Serum-Antikörpern. Für die IgE-Bestimmungen unter Verwendung von rAsp f6 sind die Ergebnisse unter Anwendung des Pharmacia CAP-Systems (Pharmacia & Upjohn, Diagnostics, Uppsala, Schweden) bestätigt worden, wobei die rekombinanten Proteine als immobilisiertes Allergen verwendet wurden.
Für eine Auswertung des diagnostischen Wertes von rekombinanten A. fumigatus-Allergenen in vitro im großen Maßstab, wurden 54 Seren aus Patienten, welche unter ABPA litten, und aus 35 allergischen Asthmatikern mit A. fumigatus-Sensitivierung, jedoch ohne ABPA, wie abgeleitet aus klinischen Parametern, ausgewählt. Alle Patienten hatten Asthma und erfüllten die Leitlinien für die Diagnose und die Handhabung von Asthma (70). Als Negativkontrolle wurden Seren aus 10 allergischen Asthmatikern ohne A. fumigatus-Sensitivierung und aus 10 gesunden Individuen ohne eine Atopie-Vorgeschichte verwendet. Im Gegensatz zu den Seren aus sensitivierten Individuen, zeigten die Serumproben aus den 20 Kontrollindividuen IgE-Werte unterhalb des Hintergrunds für alle rekombinanten Allergene, was zeigt, daß das IgE-Detektionssystem in Beziehung zur spezifischen Sensitivierung gegen A. fumigatus steht. Die Ergebnisse der IgE-Bestimmungen, erhalten mit Seren von A. fumigatus-allergischen Asthma tikern mit oder ohne ABPA, für die bislang gefundenen relevanten rekombinanten Allergene (rAsp f4 und rAsp f6) werden nachstehend erörtert werden.
Die serologischen Untersuchungen an rAsp f4 und rAsp f6 zeigen ein vollständig anderes Bild, verglichen zu demjenigen, erhalten mit anderen rekombinanten A. fumigatus-Allergenen. Spezifisches IgE gegen rAsp f4 und rAsp f6 war nicht in den 35 Seren aus allergischen Asthmatikern, sensitiviert gegen den Pilz, nachweisbar. Im Gegensatz dazu erkannten die 54 Seren aus ABPA-Patienten rAsp f4 bzw. rAsp f6 bei einer Häufigkeit von 54% bzw. 78% (Tabelle 3), wohingegen 49 Seren mindestens eines der Allergene erkannten. Deswegen besitzt die serologische Diagnose von ABPA mit den zwei Allergenen eine Spezifität von 100% und eine Empfindlichkeit > 90% (Tabelle 4). Die MnSOD (rAsp f6), ein Protein mit einer bekannten biochemischen Funktion, repräsentiert ein streng intrazelluläres Enzym. Die biologische Funktion von Asp f4 bleibt unbekannt; allerdings zeigen vorläufige Experimente zur Lokalisierung des Proteins unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, erzeugt gegen Asp f4, daß das Protein nicht von dem Pilz sezerniert wird. Deshalb ist es bei beiden Proteinen unwahrscheinlich, daß sie in freier Form als Aeroallergene vorhanden sind, was das Fehlen von spezifischem IgE gegen diese Allergene in allergischen Asthmatikern, sensitiviert gegen A. fumigatus, erklären kann. Im Gegensatz dazu weisen oder wiesen Patienten, welche unter ABPA leiden, den Pilz wachsend in der Lunge (8, 12) auf, und werden als Ergebnis der Zersetzung der Pilzzellen durch Wirtsabwehrmechanismen auch nicht-sezernierten Proteinen ausgesetzt (3). Einer der Wirtsabwehrmechanismen gegen Pilzinfektionen besteht in der Beschädigung der Hyphen und einer Phagocytose, welche von polymorphonukleären Zellen vermittelt wird (2, 3, 4). Die Entwicklung einer zellvermittelten Immunantwort gegen einen Pilz erfordert angenommenermaßen Antigen-präsentierende Zellen, um Pilz-Antigene zu prozessieren und selbige an T-Lymphozyten zu präsentieren (1). Deshalb sind Patienten, welche unter ABPA leiden, in der Lage, eine Immunantwort ebenfalls gegen intrazelluläre Proteine von A. fumigatus hervorzubringen, welche niemals von dem Immunsystem von A. fumigatusallergischen Individuen gesehen wurden, welche lediglich sezernierten Allergenen und Konidien ausgesetzt waren. Die in vivo-Relevanz von rAsp f4 und rAsp f6 ist in Hauttests untersucht worden, welche repräsentative Zahlen von Patienten mit ABPA, A. fumigatus-Allergie und gesunde Kontrollen beinhalteten (siehe nachstehend).
Diagnostischer Wert von rekombinanten A. fumigatus-Allergenen für in vivo-Tests.
In Hinsicht auf eine potentielle Unterscheidung zwischen ABPA und allergischer Sensitivierung bestanden die bedeutendsten Befunde der serologischen Untersuchungen, beinhaltend Subjekte mit Asthma und einhergehender Sensitivierung gegen A. fumigatus, in erhöhten Spiegeln an spezifischen Serum-IgE gegen rAsp f4 und rAsp f6 in Patienten, welche unter ABPA leiden. Wie in der Tabelle 3 angegeben, erreichten rAsp f4- und rAsp f6-spezifische IgE, wie gemessen durch ELISA, Werte von 54 ± 160 ELISA-Einheiten/ml und 47 ± 66 ELI-SA-Einheiten/ml in den Seren von asthmatischen Patienten mit ABPA. Im Gegensatz dazu waren spezifische IgE-Antikörper gegen diese zwei Allergene in Seren von gegen A. fumigatus sensitivierten Asthma-Patienten ohne Anzeichen für ABPA praktisch abwesend, ebenso wie in Seren von Kontrollindividuen (Tabelle 3). Basierend auf diesen Ergebnissen könnten rAsp f4 und rAsp f6 als Reagenzien für die Entwicklung eines ABPA-spezifischen Assays dienen, beruhend auf im Kreislauf befindlichen Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern. Es war deshalb von Interesse, die Allergenität dieser Proteine in vivo zu untersuchen. Um die Fähigkeit von rAsp f4 und rAsp f6, eine Mediator-Freisetzung in vivo hervorzurufen, aufzuzeigen, wurde eine intradermale Hautprovokationsuntersuchung ausgeführt, welche 12 Asthmapatienten mit ABPA, 12 gegen A. fumigatus sensitivierte allergische Asthmatiker ohne ABPA, und 5 gesunde Kontrollen, beinhaltete. Die Auswahl der Patienten und die Diagnose der Sensitivierung gegen A. fumigatus beruhten auf dem klinischen Verlauf, RAST und der Hautreaktivität gegen A. fumigatus-Extrakte, wie beschrieben (59, 66). Alle Patienten hatten Asthma und erfüllten die Leitlinien für die Diagnose und die Behandlung von Asthma (70). Zur Zeit der Untersuchung hatten alle Subjekte ein stabiles bronchiales Asthma, keine Anzeichen für Rumpf-Infektionen und erhielten keine Anti-Histamin-Medikamentenbehandlung. Die fünf gesunden Kontroll-Individuen hatte keine Vorgeschichte von Allergie oder Asthma und wiesen normale Serumspiegel von Gesamt-IgE auf. Die Diagnose von ABPA beruhte auf einem Minimum von sechs der acht Kriterien, vorgeschlagen von Rosenberg et al. (23) und Patterson et al. (24). Vier ABPA-Patienten (Tabelle 5) und ein Patient mit allergischem Asthma (Tabelle 5) wurden mit geringen Dosierungen an oralen Kortikosteroiden (5–10 mg/Tag) behandelt. Eine Ethik-Zustimmung zum Hauttest von humanen Subjekten mit rekombinanten Allergenen wurde vom zuständigen Komitee vor dem Beginn der Untersuchung erhalten. Eine vollständige Erklärung der Vorgehensweise wurde allen Individuen vor dem Test gegeben, und anschließend wurde eine schriftliche Einverständniserklärung erhalten. Die Hauptmerkmale der Subjekte, welche an der Untersuchung teilnahmen, einschließlich Alter, Geschlecht, Eosinophilen-Zählung, Gesamt-Serum-IgE, spezifisches Serum-IgE gegen rAsp f4 und rAsp f6 und RAST gegen A. fumigatus, sind in der Tabelle 5 berichtet. Alle Subjekte zeigten eine positive Hauttest-Antwort gegen intradermale Histamin-Herausforderungen (0,01%) und waren gegenüber 0,9%iger Kochsalzlösung nicht-reaktiv. Die Ergebnisse (Tabelle 5) legen eine hohe Spezifität der rAsp f4- und rAsp f6-Reaktivität für Patienten, welche unter ABPA leiden, nahe. Tatsächlich zeigte nur diese Gruppe von Patienten relevante Mengen an spezifischem IgE gegen rAsp f4 und rAsp f6 (Tabelle 3 und 4). Wie erwartet, reagierten lediglich Individuen, welche nachweisbare Mengen an Allergen-spezifischem IgE im Serum zeigten, auf die Haut-Herausforderungen mit rAsp f4 und rAsp f6. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß eine hochspezifische Diagnose von ABPA auf Grundlage von rekombinanten Allergenen durchführbar ist. Obwohl rAsp f4- und rAsp f6-basierende Serologie und Hauttests eine hohe Spezifität für ABPA in Abwesenheit von atopischer Dermatitis zeigen, erreicht die Empfindlichkeit der Diagnose jedoch nur etwa 90% (Tabelle 4). Berücksichtigt man die relativ niedrige Spezifität der diagnostischen Kriterien für ABPA, welche bis heute verfügbar ist, repräsentieren die serologischen und Hauttests mit rAsp f4 und rAsp f6 eine beträchtliche Verbesserung der Diagnose der Krankheit. Weiterhin stellen die Merkmale beider Allergene, zusammengenommen mit der Beobachtung, daß ABPA-Patienten und A. fumigatus-sensitivierte allergische Asthmatiker unterschiedliches Allergen in der Western-Blot-Analyse erkennen, ein Verständnis bzw. eine Richtlinie für eine weitere Verbesserung der Diagnose von ABPA zur Verfügung. In einer Untersuchung, über welche von Borga (6) berichtet wurde, wurde die Serum-IgE-Reaktivität gegen A. fumigatus-Allergene in zwei Gruppen von Patienten verglichen, A. fumigatus-sensitivierten Allergikern und ABPA-Patienten. Die Seren von Individuen, welche unter A. fumigatus-Allergie litten, erkannten mindestens 35 unterschiedliche IgEbindende Komponenten des Pilzes, im Größenbereich zwischen 14 und 118 kDa, von denen vier Komponenten (34, 39, 43 und 83 kDa) einzig von diesen Seren erkannt wurden. Mit Seren aus der ABPA-Gruppe wurden 39 unterschiedliche IgE-bindende Komponenten im Bereich von 14 bis 150 kDa nachgewiesen, von denen acht Komponenten mit Molekulargewichten von 15, 19,5, 54, 56, 96, 110, 126 und 150 kDa nicht von IgE aus den Allergikern erkannt wurden. Deshalb wurden von den insgesamt 43 nachgewiesenen IgE-bindenden Komponenten, Antikörper gegen 31 in beiden Patientengruppen gefunden, acht waren spezifisch für AB-PA und vier waren spezifisch für die nicht mit ABPA in Beziehung stehende Sensitivierung gegen A. fumigatus.
Die Verfügbarkeit der beschriebenen rekombinanten Allergene wird eine Identifikation von A. fumigatus-Allergikern erlauben, denen eine Sensitivierung gegen diese klonierten Allergene fehlt. Seren aus derartigen Subjekten können anschließend verwendet werden, um die A. fumigatus-Phagenoberflächen-Display-Bibliothek zu screenen, um Phagenklone zu isolieren, welche zusätzliche Allergene aufzeigen. Die wirkungsvolle Screening-Verfahrensweise, basierend auf Biopanning (45, 47, 51, 52), zusammen mit einer Richtlinie für das Auswählen der Seren, welche zum Screenen der Phagenbibliothek verwendet werden, wird die Isolierung der zusätzlichen Allergene in einer angemessenen Zeit ermöglichen. Die Herstellung, Charakterisierung und Auswertung dieser Allergene werden wahrscheinlich zur weiteren Entwicklung von spezifischen Diagnosewerkzeugen sowohl für ABPA als auch für mit A. fumigatus in Beziehung stehende Sensitivierung beitragen.
Um rAsp f6 als ein spezifisches Allergen für die Diagnose von ABPA zu verwenden, muß atopische Dermatitis ausgeschlossen werden. Ein hoher Prozentsatz von Patienten, welche unter atopischer Dermatitis mit einer moderaten RAST-Klasse gegen A. fumigatus leiden, zeigt hohe Titer von rAsp f6-spezifischem IgE im Serum. Darüber hinaus zeigten intradermale Haut-Herausforderungen mit rAsp f66 in drei Patienten, welche unter atopischer Dermatitis litten, in deutlicher Weise, daß das Allergen in der Lage ist, eine starke in vivo-Mediator-Freisetzung in diesen Patienten hervorzurufen. Bemerkenswerterweise zeigt die serologische Untersuchung von 15 Seren von Patienten, welche unter atopischer Dermatitis leiden, keinerlei spezifisches IgE gegen andere rekombinante A. fumigatus-Allergene, welche verfügbar sind (76). Der Grund für die monovalente Sensitivierung gegen Asp f2 in Patienten mit atopischer Dermatitis ist unbekannt. Allerdings ist es verlockend, zu spekulieren, daß die spezifische IgE-Antwort gegen rAsp f6 auf der Herstellung von IgE-Antikörpern beruhen könnte, welche menschliche Superoxiddismutase in diesen Individuen erkennen, was zu einer Kreuzreaktion mit der hoch-homologen Pilz-MnSOD führen würde (43). Die Verfügbarkeit sowohl der menschlichen als auch pilzlichen rekombinanten MnSOD wird eine Untersuchung der Rolle dieser Proteine in der Pathophysiologie von atopischer Dermatitis in größerer Ausführlichkeit ermöglichen.
Serologische Unterscheidung zwischen Sensitivierung gegen A. fumigatus und ABPA in Patienten mit cystischer Fibrose.
Diese Untersuchung beinhaltete 37 Patienten mit cystischer Fibrose mit einer routinemäßigen Bewertung hinsichtlich cystischer Fibrose und Allergie, einschließlich dem Haut-Einstich-Test (67, 71). Es wurde diagnostiziert, dass 15 ABPA gemäß der klinischen und immunologischen Kriterien, welche von Laufer (16) und Nelson (25) vorgeschlagen wurden, aufwiesen. 12 Patienten gehörten der Gruppe mit dokumentierter Sensitivierung gegen A. fumigatus gemäß dem RAST und dem Routine-Haut-Einstich-Test gegen A. fumigatus-Extrakte an, und 10 wurden der CF-Kontrollgruppe zugeordnet, basierend auf dem Fehlen von Sensitivierung gegen A. fumigatus (67). Die Patientenmerkmale, einschließlich Alter, Geschlecht, RAST gegen A. fumigatus und Gesamtserum-IgE sind in der Tabelle 6 berichtet. Allergen-spezifische IgE-Spiegel wurden für die Allergene rAsp f1, rAsp f3, rAsp f4 und rAsp f6 im Serum von jedem Individuum bestimmt. rAsp f1 (43) und rAsp f3 (42) entsprechen den Hauptallergenen von A. fumigatus mit einem Vorherrschen einer Sensitivierung von 69% und 76% unter astmathischen Patienten mit positivem Hauttest gegen A. fumigatus-Extrakte, wohingegen rAsp f4 und rAsp f6 (43) nur von Seren von Patienten mit ABPA erkannt werden. Es wurde in vivo durch Haut-Herausforderungen von asthmatischen Patienten, welche gegen A. fumigatus sensitiviert waren, gezeigt, daß alle vier Proteine relevante Allergene sind. Die Ergebnisse der serologi schen Untersuchung (Tabelle 9) zeigen, daß der Großteil der cystischen Fibrose-Individuen, sensitiviert gegen A. fumigatus, IgE gegen rAsp f1 und rAsp f3 (85% bzw. 100%) und zu 85% gegen beide Allergene tragen. Zusammengenommen sind rAsp f1 und rAsp f3 ausreichend, um eine Sensitivierung gegen A. fumigatus in allen der untersuchen Seren aus cystischen Fibrose-Patienten zu diagnostizieren. Gemäß der derzeitigen Definition der Allergene (41) entsprechen rAsp f1 und rAsp f3 Haupt-Allergenen, auch für die Gruppe der cystischen Fibrose. In den drei Untergruppen der analysierten Individuen, cystische Fibrose-Patienten mit A. fumigatus-Sensitivierung, mit oder ohne ABPA, und cystische Fibrose-Individuen ohne A. fumigatus-Sensitivierung, wurden relevante Spiegel an Serum-IgE gegen rAsp f4 und rAsp f6 nur in Seren von Individuen mit einer klinischen Diagnose von ABPA gefunden. In dieser Gruppe wurden rAsp f6-spezifische IgE-Spiegel, welche den Grenz- bzw. Ausschlußwert (> 5 U/ml) überstiegen, in 10 von 15 Patientenseren detektiert, während relevante Spiegel von rAsp f4-spezifischem IgE (Ausschlußwert > 7 EU/ml) in 13 der 15 Patientenseren nachgewiesen wurden. Wenn wir erhöhte Spiegel von entweder rAsp f4- oder rAsp f6-spezifischem IgE als ausreichend ansehen, um ABPA anzuzeigen, wären alle Patienten von der serologischen Diagnose abgedeckt bzw. überspannt, wohingegen 8 von 15 Patienten erhöhte Spiegel von IgE sowohl gegen rAsp f6 als auch rAsp f4 hatten. Deshalb könnte die allergenspezifische Serologie mit rAsp f4 und rAsp f6 einen wesentlichen Beitrag zu einer serologischen Differentialdiagnose von ABPA in Patienten erbringen, welche unter cystischer Fibrose und A. fumigatus-Sensitivierung leiden.
Tabelle 1. Typische Anreicherung von Phagen aus einer cDNA-Phagen-Display-Bibliothek durch "Biopanning". Phagen, welche cDNA-Produkte aus einer A. fumigatus-Expressionsbibliothek präsentierten, wurden in eine Einzelvertiefung einer Mikrotiterplatte gebracht, welche mit humanem Serum-IgE beschichtet war (51, 52). Nach Adsorption und gründlichem Waschen wurden adhärierende Phagen eluiert und verwendet, um E. coli für eine weitere Runde des Phagenwachstums und der Selektion zu infizieren.
Tabelle 2. Hauptmerkmale von Phagen, isoliert aus einer A. fumigatus-cDNA-Bibliothek, präsentiert auf einer Phagenoberfläche, und unterworfen einer selektiven Anreicherung unter Verwendung von Patienten-Serum-IgE als Ligand
Tabelle 3. Sensitivierung von asthmatischen Patienten mit ABPA oder A. fumigatus-Allergie gegen die rekombinanten Allergene rAsp f4 und rAsp f6.
Tabelle 4. Unterscheidung zwischen ABPA und Sensitivierung gegen A. fumigatus durch rAsp f4- und rAsp f6-IgE-spezifische Serologie.
Tabelle 5. Grundsätzliche Merkmale der untersuchten Subjekte und Hautreaktivität gegen rAsp f4 und rAsp f6.
Tabelle 6. Serologische Untersuchungen von Patienten mit cystischer Fibrose mit oder ohne Sensitivierung gegen A. fumigatus-Extrakte
Während des Prioritätsjahres erhaltene Resultate
Die cDNA, welche für rAsp f8 codierte wurde isoliert und auf die gleiche Weise wie rAsp f4 und rAsp f6 exprimiert, und entspricht der codierenden Sequenz für ein saures ribosomales P₂-Protein und repräsentiert deshalb ein klassisches nicht-sezerniertes Protein. Obwohl nicht klinisch getestet, repräsentiert das Protein ein IgE-bindendes Protein bei Auswertung im ELI-SA gemäß den obenstehend angegebenen Verfahrensweisen. Alle bislang durch ELISA erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß rAsp f8 hoch spezifisch für Seren von Patienten, welche unter ABPA leiden, ist. Keiner der 35 allergischen Asthmatiker, welche getestet wurden, zeigte nachweisbare Spiegel von rAsp f8-spezifischem IgE (2,3 ± 0,4 EU/ml), was statistisch nicht unterschiedlich von dem Wert ist, welcher für die 20 gesunden Individuen erhalten wurde (1,2 ± 0,6 EU/ml). Im Gegensatz dazu waren 17 der 54 Patienten, welche unter ABPA litten (31%), deutlich gegen rAsp f8 sensitiviert. Der mittlere EU/ml-Wert der Gesamtprobe entspricht 8 ± 14 der Gesamtfälle der Sensitivierung, beinhaltend alle A. fumigatus-sensitivierten Patienten (Allergiker + ABPA, n = 89), entsprechend zu 19% (EU/ml 5,4 ± 12). Allerdings trägt dieses neue ABPA-spezifische Allergen nicht zur Verbesserung der Differentialdiagnose von ABPA bei, weil alle Patienten, welche rAsp f8 erkennen, bereits rAsp f4, rAsp f6 oder beide von ihnen erkennen.
Die DNA-Sequenz für rAsp f8 ist als SEQ ID Nr. 5 und die entsprechende Aminosäuresequenz als SEQ ID Nr. 6 gezeigt. Die Sequenzen sind vorläufig ermittelt und können an bis zu 10 Positionen unkorrekt sein, z. B. sind die Positionen 92, 94, 108, 156 und 183 in der DNA-Sequenz für rAsp f8 nicht endgültig bestätigt worden.
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Sequenz-Auflistungen

Claims

Ein in vitro Verfahren für die Differentialdiagnose von ABPA in einem menschlichen Individuum, dadurch gekennzeichnet, dass bestimmt wird, ob das Individuum Antikörper trägt, die mit einem oder mehreren, mit ABPA in Beziehung stehenden, rekombinanten Allergenen) reaktiv ist/sind und dass das eine oder mehrere Allergene) aus rAsp f4 und rAsp f6 und mit ABPA in Beziehung stehenden Fragmenten davon gewählt ist/sind.
Ein in vitro Verfahren für die Differentialdiagnose von ABPA in einem menschlichen Individuum, dadurch gekennzeichnet, dass bestimmt wird, ob das Individuum Antikörper trägt, die mit einem oder mehreren, mit ABPA in Beziehung stehenden, rekombinanten Allergenen) reaktiv ist/sind und dass das eine oder mehrere Allergene) aus rAsp f8 und mit ABPA in Beziehung stehenden Fragmenten davon gewählt ist/sind.
Das in vitro Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen von A. fumigatus abgeleitet ist.
Das in vitro Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen einem nicht-sekretierten Protein aus A. fumigatus entspricht.
Das in vitro Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro Immunassay an einer Fluid-Probe des Individuums durchgeführt wird, um die Konzentration von Antikörpern, die gegen diese rekombinanten Allergene gerichtet sind, insbesondere von Antikörpern der IgE-Klasse oder IgG-Klasse oder Sub-Klassen davon, zu bestimmen.
Das in vitro Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper der IgE-Klasse bestimmt werden.
Das in vitro Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro Immunassay an einer Fluid-Probe des Individuums durchgeführt wird, um die Konzentration von Antikörpern, die gegen diese rekombinanten Allergene gerichtet sind, insbesondere von Antikörpern der IgE-Klasse oder IgG-Klasse oder Sub-Klassen davon, zu bestimmen.
Das in vitro Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper der IgE-Klasse bestimmt werden.