ES2210591T3 - Metodo para la diagnosis de aspergilosis broncopulmonar alargica. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA DIAGNOSTICAR LA ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR ALERGICA (ABPA) EN UN PACIENTE HUMANO. ESTE PROCEDIMIENTO TIENE LA CARACTERISTICA DE LA BUSQUEDA DE ANTICUERPOS REACTIVOS CON UNO O VARIOS ALERGENOS RECOMBINADOS DE TIPO ABPA EN EL PACIENTE, EN PARTICULAR RASPF4, RASPF6 Y RASPF8.

Description

Método para la diagnosis de aspergilosis broncopulmonar alérgica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para la diagnosis diferencial de la aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) y a alergenos recombinantes para uso en los métodos. Durante el año de prioridad, el alergeno recombinante que en la solicitud de prioridad se denominó rAsp f2 se ha denominado oficialmente rAsp f6. En este texto se usa el nombre oficial.

Antecedentes técnicos Aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA)

La aspergilosis broncopulmonar alérgica es la complicación alérgica más grave causada por especies de
Aspergillus, principalmente A. fumigatus. La ABPA es el resultado de una hipersensibilidad a antígenos de
Aspergillus principalmente en pacientes que padecen asma atópica de larga duración (8-12) o fibrosis quística (16-19). Aunque originalmente se consideró una enfermedad rara (13), en la actualidad la ABPA se reconoce con mucha más frecuencia. Se ha notificado que se produce ABPA con diversas presentaciones clínicas en aproximadamente un 15% de los pacientes asmáticos sensibilizados a A. fumigatus (14, 15), mientras que en pacientes con fibrosis quística, la incidencia presentada varía de un 10 a un 35% (16, 17). La ABPA se ha descrito como una enfermedad inmune que varía de asma a enfermedad pulmonar destructiva fatal con características clínicas, serológicas, radiológicas y patológicas definidas (8, 18-22). Debido a su gravedad, la ABPA debe descartarse en pacientes con asma crónica o fibrosis quística que presentan reactividad cutánea inmediata a A. fumigatus (8). Los criterios de diagnóstico para la ABPA son asma o fibrosis quística, historia de infiltrados roentgenográficos (en la mayoría de los casos), reactividad cutánea inmediata a extractos de A. fumigatus, nivel elevado de IgE total en suero, precipitación de anticuerpos contra A. fumigatus, eosinofilia en sangre periférica, nivel elevado de IgE e IgG específicas en suero contra A. fumigatus en comparación con sueros de pacientes con asma y reactividad cutánea a Aspergillus, pero sin ABPA, y bronquiectasis proximal (central) con estrechamiento normal de los bronquios distales (23-25). En los casos en los que están presentes todos los criterios, la diagnosis se realiza fácilmente (26). Sin embargo, rara vez están presentes los ocho criterios al mismo tiempo incluso en pacientes que padecen la ABPA clásica con bronquiectasis central. A excepción de la bronquiectasis y, hasta cierto punto, de los niveles elevados en suero de IgE e IgG específicas contra A. fumigatus, ninguno de los criterios diagnósticos es específico para la ABPA (26). Además, en pacientes que padecen fibrosis quística también se detectan comúnmente infiltrados pulmonares y bronquiectasis central en ausencia de sensibilización a A. fumigatus, lo que dificulta aún más la diagnosis de ABPA en estos pacientes con fibrosis quística (16). Por lo tanto, la identificación serológica de ABPA tiene un mayor potencial de diagnóstico aunque, sin embargo, se ve entorpecida por la falta de extractos fúngicos fiables estandarizados (5,7, 27-29).

Antígenos de Aspergillus fumigatus

El principal problema en la inmunodiagnosis de enfermedades relacionadas con A. fumigatus se debe a la complejidad antigénica del hongo. Los extractos deantígeno/alergeno de A. fumigatus contienen cientos de diferentes proteínas (6, 30, 31), de las cuales una subserie limitada es capaz de unirse a la IgE del suero humano (6, 32, 33, 35). Se ha notificado que el hongo produce más de 40 componentes de unión a IgE que generan modelos de unión a IgE complejos cuando los extractos se examinan mediante un análisis de transferencia de Western usando sueros de individuos alérgicos (32, 33). Para hacerlo incluso más complicado, la IgE del suero de diferentes pacientes reconoce modelos altamente variables de proteínas fúngicas (6, 36). En el caso de pacientes que padecen ABPA, dependiendo de la fase de la enfermedad, pueden obtenerse diferentes "huellas" alergénicas con suero del mismo paciente obtenido en diferentes tiempos, aunque se use un extracto fúngico del mismo lote (36, 37).

Se ha sugerido el uso de componentes alergénicos nativos purificados en lugar de extractos de alergenos brutos para el diagnóstico de ABPA (79). Anteriormente se han descrito alergenos de A. fumigatus recombinantes con conexiones con la ABPA (71, 83).

Los inventores son autores nombrados en varios artículos sobre alergenos recombinantes de A. fumigatus (clonación y expresión: 39, 43, 49, 51, 52, 82 y uso en diagnóstico: 59, 66, 32, 71, 76, 81).

Resultado de la investigación de tipo internacional durante el año de prioridad

Las referencias 66, 79 y 84 se han considerado referencias de relevancia particular.

Banerjee et al., (84) describe antígenos que no pueden ser intracelulares. Se demuestra que los antígenos descritos reaccionan con sueros de pacientes con ABPA, aunque no hay datos que sugieran que los antígenos no reaccionarán con sueros de pacientes sensibilizados a A. fumigatus que no padecen ABPA.

Moser et al. (66) y Little et al., (79) describen proteínas/antígenos secretados que no permiten la diagnosis diferencial de ABPA ya que a menudo reaccionan con sueros de pacientes sensibilizados a A. fumigatus sin ABPA y sueros de pacientes con ABPA.

Los objetivos de la invención

El principal objetivo de la invención es proporcionar mejores métodos para la diagnosis diferencial de ABPA.

Un subobjetivo es proporcionar métodos de diagnóstico in vitro que tengan una especificidad y sensibilidad suficientes para la diagnosis de ABPA.

Un segundo subobjetivo es proporcionar preparaciones de alergenos bien definidas que puedan usarse para la diagnosis de ABPA in vitro, incluyendo inmunoensayos.

La invención

El primer aspecto principal de la invención es un método para la diagnosis diferencial de la aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA). Este aspecto se caracteriza por usar como reactivo un alergeno recombinante relacionado con ABPA, es decir, un alergeno recombinante que lleve un epítopo contra el que se seleccionaron anticuerpos de diversas clases/subclases de Ig, tales como la clase IgE o IgG total o subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) entre rAsp f4, rAsp f6 y rAsp f8 y fragmentos relacionados con ABPA de los mismos, y que pueda detectarse de forma que pueda diferenciarse una afección de ABPA en un paciente de la sensibilización alérgica a A. fumigatus, lo cual es particularmente útil en pacientes que padecen fibrosis quística.

El concepto de alergenos recombinantes relacionados con ABPA incluye cualquier alergeno recombinante, independientemente del origen, que tenga la característica de unión al anticuerpo mencionado anteriormente permitiendo la diagnosis diferencial indicada. Esto engloba, en particular, alergenos recombinantes relacionados con ABPA derivados de A. fumigatus y sus fragmentos relacionados con ABPA. Para los alergenos recombinantes relacionados con ABPA clonados a partir de A. fumigatus, el concepto engloba alergenos relacionados con ABPA y fragmentos derivados de otras fuentes, que tienen uno o más epítopos de ABPA en común con un alergeno relacionado con ABPA de A. fumigatus. En la fecha de prioridad, rAsp f4, rAsp f6 y sus fragmentos, como se han definido anteriormente, se consideraban los alergenos relacionados con ABPA más útiles. También se incluyen diversas formas derivatizadas que retienen la capacidad de unir anticuerpos, como se define para alergenos recombinantes relacionados con ABPA.

Diversos subaspectos incluyen protocolos de ensayo in vitro e in vivo como se describe más adelante.

El segundo aspecto principal de la invención se refiere a nuevos alergenos recombinantes relacionados con ABPA que se unen a la IgE humana presente en pacientes con ABPA y útiles en el primer aspecto de la invención.

Diversos subaspectos de este segundo aspecto principal de la invención serán evidentes a partir de lo que se explica más adelante y engloban formas derivatizadas que incluyen, pero sin limitación, alergenos relacionados con ABPA no derivatizados, insolubilizados y marcados.

Otro aspecto de la invención es el uso de alergenos relacionados con ABPA para el tratamiento de la hiposensibilización como se realiza para otros alergenos.

Clonación de alergenos de Aspergillus fumigatus

La estrategia de clonación utilizó el fagémido pComb3 (47) y la capacidad de las proteínas Jun y Fos de cremallera de leucinas para asociarse entre sí (74, 48, 74, 75).

Se expresó un producto gIII modificado, obtenido mediante la fusión del ADN que codificaba la cremallera de leucinas jun flanqueada por restos de cisteína, N-terminal con respecto a la proteína de la cubierta viral, a partir de un promotor LacZ y se secretó en el espacio periplásmico de E. coli por un péptido líder peIB, incorporándose por lo tanto de forma estructural en partículas de fago durante la infección con el fago auxiliar (49). Usando un segundo promotor LacZ del fagémido, el dominio de la cremallera de leucinas fos, flanqueado por restos de cisteína, co-expresado como un péptido de fusión N-terminal para productos proteicos de ADNc de A. fumigatus, se secretó en el espacio periplásmico de E. coli usando el péptido líder peIB (50). Mediante la heterodimerización Jun-Fos y la formación de enlaces disulfuro, la proteína de fusión gIII-Jun incorporada en partículas de fago proporciona una unión covalente a la superficie del fago para productos de ADNc recombinantes aleatorios con la cremallera de leucinas Fos unida de forma N-terminal (48, 49). El fagémido pJuFo que contiene los elementos descritos (49, 51, 52) permite la expresión y la presentación de bibliotecas de ADNc, en este caso codificando péptidos/proteínas de A. fumigatus clonados aleatoriamente (shot-gun) en la superficie del fago, y la aplicación de la potente tecnología de selección basada en procedimientos de bioposicionamiento usados para otros sistemas fagos filamentosos (46, 47). La clave del éxito en la clonación del ADNc a partir de bibliotecas presentadas en superficies de fagos reside en la estrategia de selección usada. El factor más importante a considerar es que el ligando usado para seleccionar el fago debe señalizarse o inmovilizarse de tal forma que permita que el ligando retenga su conformación nativa (46). Debe tenerse en cuenta que las proteínas, cuando se inmovilizan directamente en una fase sólida por interacción hidrófoba, pueden perder actividad biológica debido a alteraciones en la estructura tridimensional (54, 55). En general, las características conocidas o esperadas del ligando dictarán el procedimiento usado para la inmovilización del ligando. Para el aislamiento de alergenos reconocidos por anticuerpos del suero, ha resultado ser muy eficaz el uso de anticuerpos de captura por diversas razones. En primer lugar, los anticuerpos monoclonales inducidos contra los dominios constantes \varepsilon de inmunoglobulina C\varepsilon2, C\varepsilon3 o C\varepsilon4 no interfieren con el sitio de unión al antígeno del anticuerpo. En segundo lugar, una superficie recubierta con tales anticuerpos anti-IgE podrá inmovilizar selectivamente anticuerpos IgE del suero de pacientes alérgicos. Por lo tanto, después de retirar los anticuerpos séricos de otros isotipos que presenten interacción y reacción cruzada junto con todos los demás componentes del suero, se obtendrá una superficie específica capaz de adsorber únicamente las moléculas que se unen a IgE de presentación del fago (51-53).

La aplicación de pJuFo para presentar productos de ADNc y seleccionar fagos de una biblioteca construida usando ARNm de A. fumigatus (39, 51, 52) produjo una amplia diversidad de clones de fago capaces unir anticuerpos IgE procedentes de sueros de pacientes sensibilizados a A. fumigatus (tabla 1).

En comparación con la selección de bibliotecas \lambda inmovilizadas en soportes en fase sólida, el procedimiento de selección para las bibliotecas de ADNc presentadas en la superficie de fagos filamentosos tiene varias ventajas. La captura de IgE en suero con un anticuerpo anti-IgE inmovilizado genera una superficie homogénea con IgE inmovilizada que no se desnaturaliza (56, 57) y que, por lo tanto, retiene toda la capacidad de unión al antígeno. La ventaja más importante se debe al hecho de que la biblioteca del fago se mantiene en una fase líquida donde únicamente el fago con afinidad por el ligando queda retenido en la fase sólida después del lavado (47, 53). El fago desorbido puede usarse para infectar E. coli para amplificar el fago con afinidad por el ligando. Por lo tanto, sucesivos ciclos de crecimiento y selección de fagos permiten el enriquecimiento de las proteínas de presentación de fagos con afinidad por el ligando (tabla 3). Después de la selección de proteínas que presentan clones del fago candidato con propiedades de unión a IgE, las partículas del fago producidas a partir de 10 ml de cultivo pueden precipitarse (47) y las muestras de 1010-1013 partículas de fago de cada clon candidato pueden analizarse por SDS-PAGE en condiciones de reducción, seguido de la transferencia a membranas de nitrocelulosa (49, 51). Después del bloqueo para saturar los sitios de unión libres en la lámina de nitrocelulosa, las membranas se incuban con suero de paciente diluido 1:10 como "primer anticuerpo" y puede usarse mAb de ratón anti-IgE humana como segundo anticuerpo para visualizar la unión de IgE al producto de ADNc originalmente presente en la superficie del fago. Las transferencias de Western pueden revelarse fácilmente usando sistemas no radiactivos e Ig de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante como sistema de detección. La masa molecular aparente de las proteínas de unión a IgE enriquecidas a partir de una biblioteca de ADNc de A. fumigatus presentada en la superficie del fago estaba en el intervalo de 10 a más de 50 kDa. La determinación de la secuencia de nucleótidos (58) de algunos insertos de ADNc que se diferencian en cuanto al tamaño y al modelo de restricción reveló que codifican diferentes proteínas como se deduce por las fases de lectura abiertas.

Producción de alergenos recombinantes en E. coli

A continuación se proporcionarán ejemplos ilustrativos de métodos de producción para los dos alergenos recombinantes relacionados con ABPA clonados a partir de A. fumigatus, denominados rAsp f4 y rAsp f6.

rAsp f6

Se clonó ADN que incluía la secuencia codificante de rAsp f6 en un vector de expresión bajo el control transcripcional del promotor de T7 (78). La construcción se diseñó de tal forma que se añadió un resto de metionina al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos del alergeno, mientras que en el extremo C terminal se añadió un tramo de ocho restos -VEHHHHHH, de los cuales seis restos de histidina consecutivos sirven como señal de afinidad para la cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (61). Después de la confirmación de la secuencia, la construcción se transfirió a E. coli BL21[pT7POL23] (77), donde puede inducirse la síntesis de la ARN polimerasa de T7 aumentando la temperatura del cultivo en crecimiento a aproximadamente 37ºC. Para producir rAsp f66, se inoculó 1 litro de medio LB que contenía un complemento apropiado de antibióticos con 1 ml de un cultivo iniciador de una noche desarrollado a 30ºC. Después de aproximadamente 3 horas de crecimiento a 30ºC a una OD_{600} de 0,7, la temperatura del cultivo se elevó a 42ºC para inducir la expresión. Después de 4 horas de incubación a la temperatura de inducción, las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 20 mM enfriado con hielo, pH 8,0 que contenía NaCl 0,5 M e imidazol 5 mM (tampón de resuspensión). Las células se rompieron por sonicación y los restos insolubles se retiraron por centrifugación. El sobrenadante, que contenía el alergeno sobre-expresado, se pasó a través de un filtro de 0,22 \mum para retirar el material particulado restante y se introdujo en un conjunto de dos columnas HiTrap Chelating de 5 ml conectadas en serie (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) cargadas previamente con Ni^{2+} y equilibrado con tampón de resuspensión. El conjunto de columnas se lavó primero con 50 ml de tampón de resuspensión, después con 50 ml de tampón de resuspensión suplementado con imidazol a 60 mM. Para eluir rAsp f6, se aplicó un gradiente lineal de 30 ml de imidazol 60-500 mM en Tris-HCl 20 mM pH 8,0/NaCl 0,5 M mientras se recogían fracciones de 1 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían rAsp f6 se reunieron y se sometieron a exclusión molecular a través de una columna Superdex 200 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) equilibrada y eluida con NaCl 0,15 M. Las fracciones que contenían rAsp f6 se reunieron y se concentraron usando una célula Amicon equipada con una membrana YM5. El rendimiento final de rAsp f6 purificada procedente de un litro de cultivo bacteriano fue de 23 mg.

rAsp f4

Se clonó ADN que incluía la secuencia codificante de rAsp f4 en un vector de expresión bajo el control transcripcional del promotor de T7 (78). La construcción se diseñó de tal forma que se añadió un tramo de 11 restos MRGSHHHHHHM- al extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos del alergeno, de los cuales los seis residuos de histidina consecutivos sirven de señal de afinidad para la cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (61). No se realizó ninguna adición de aminoácidos en el extremo C-terminal de la proteína. Después de la confirmación de la secuencia, la construcción se transfirió a E. coli BL21 [pT7POL23] (77), donde la síntesis de la ARN polimerasa de T7 puede inducirse elevando la temperatura del cultivo en crecimiento por encima de 37ºC. Para producir rAsp f4, se inoculó 1 litro de medio LB que contenía un complemento apropiado de antibióticos con 1 ml de un cultivo iniciador de una noche desarrollado a 30ºC. Después de aproximadamente 3 horas de crecimiento a 30ºC, a una OD_{600} de 0,7, la temperatura del cultivo se aumentó a 42ºC para inducir la expresión. Después de 4 horas de incubación a la temperatura de inducción, las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 20 mM enfriado con hielo, pH 8,0, que contenía NaCl 0,5 M. Las células se rompieron por sonicación y el material insoluble que incluía la proteína rAsp f4 se recogió por centrifugación. El material insoluble se lavó dos veces por resuspensión en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 que contenía urea 2 M, NaCl 0,5 M y Triton X-100 al 2%, seguido de centrifugación. Se extrajeron anticuerpos de inclusión que contenían rAsp f4 parcialmente purificados durante 45 minutos a temperatura ambiente en 70 ml de Tris-HCl 20 mM pH 8,0 que contenía clorhidrato de guanidinio 6 M, NaCl 0,5 M, imidazol 5 mM y 2-mercaptoetanol 1 mM (tampón de extracción). El extracto se clarificó por centrifugación y el material particulado restante se retiró pasándolo a través de un filtro de 0,22 \mum. El extracto clarificado, que contenía el alergeno sobre-expresado, se cargó en un conjunto de dos columnas HiTrap Chelating de 5 ml conectadas en serie (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) previamente cargadas con Ni^{2+} y equilibradas con tampón de extracción que carecía de 2-mercaptoetanol. El conjunto de columnas se lavó primero con 50 ml de tampón de extracción, después con 50 ml de urea 6 M en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 0,05 M, imidazol 20 mM y 2-mercaptoetanol 1 mM (tampón de lavado con urea). Para renaturalizar el rAsp f4 inmovilizado, se aplicó un gradiente lineal de 960 ml, desde tampón de lavado de urea a Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM y 2-mercaptoetanol 1 mM (tampón de renaturalización). Para eluir rAsp f4, se aplicó un gradiente de 30 ml de imidazol 20-1000 mM en tampón de renaturalización mientras se recogían fracciones de 1 ml y se analizaron por SDS-PAGE. Se reunieron las fracciones que contenían rAsp f4 y se sometieron a exclusión molecular a través de una columna Superdex 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) equilibrada y eluida con NaCl 0,15 M. Se reunieron las fracciones que contenían rAsp f4 y se concentraron usando una célula Amicon equipada con una membrana YM10. El rendimiento final de rAsp f4 purificada a partir de 1 litro de cultivo bacteriano fue de 34 mg.

La producción también se ha realizado con el vector descrito por Hochli et al (60-63).

Análisis de insertos de ADNc

Sólo se analizarán los insertos que codifiquen para péptidos/proteínas relevantes para la diagnosis de ABPA.

rAsp f6 (SEC ID Nº 1)

Un clon que contenía un inserto de 751 pares de bases con una fase de lectura abierta de 624 pares de bases reveló una homología fuerte con secuencias de nucleótidos que codifican superóxido dismutasas. La región no codificante 3' tenía una cola poliadenilada de 24 pares de bases. La secuencia de aminoácidos deducida de este de clon de ADNc (SEC ID Nº 1) era homóloga a la manganeso SOD, mostrando la mayor identidad de secuencia del 48-52% con las enzimas humanas, de la mosca de la fruta, del eucalipto, de levadura, de E. coli y de Mycobacterium leprae. Aparentemente, la MnSOD de A. fumigatus presenta un alto grado similar de identidad de secuencia con las MnSOD de una amplia diversidad de organismos filogenéticamente distantes (43). El alineamiento múltiple de secuencias demuestra que la MnSOD de A. fumigatus (rAsp f6) comparte una alta homología con la MnSOD humana (51,8% de identidad, 67,2% de homología). La IgE inducida contra la MnSOD de A. fumigatus se detecta predominantemente en sueros de pacientes que padecen ABPA. Por lo tanto, la MnSOD podría ser un candidato para una discriminación serológica diferencial entre la ABPA y la alergia a A. fumigatus (véase más adelante). En particular, tanto la MnSOD de A. fumigatus recombinante como la humana inducen la proliferación en células mononucleares de sangre periférica de sujetos alérgicos a A. fumigatus con niveles detectables de IgE específica contra la MnSOD de A. fumigatus. Además, tanto la MnSOD recombinante humana como la fúngica inducen reacciones cutáneas de tipo I en individuos sensibilizados a la enzima fúngica, proporcionando indicios de autorreactividad con la MnSOD humana en individuos alérgicos sensibilizados al alergeno de A. fumigatus ambiental (43).

rAsp f4 (SEC ID Nº 2)

Éste fue el segundo alergeno relacionado con ABPA recombinante descubierto en nuestro sistema de selección. El clon contenía un inserto de 1103 pares de bases con una fase de lectura abierta de 858 pares de bases. Su secuencia de aminoácidos deducida no comparte una homología significativa con ninguna proteína conocida. El producto génico codificado por el ADNc usado sólo se caracterizó por la función para la que se seleccionó: unión a IgE.

Ensayos in vivo que utilizan alergenos recombinantes

Éstos se ilustran principalmente por ensayos epicutáneos en los que se inserta una pequeña cantidad de una solución de un alergeno en la dermis de un individuo después de lo cual tiene lugar una reacción en forma de roncha alrededor del lugar de administración.

Un protocolo para los ensayos epicutáneos de la invención implicó la disolución de un alergeno recombinante en solución salina fisiológica al 0,9% como diluyente a una concentración final de 100 \mug/ml. Se pusieron 20 \mul de estas soluciones en los antebrazos del paciente. Después, la piel se pinchó con una aguja estéril, que se introdujo en la epidermis formando un ángulo y se levantó para elevar una pequeña porción de la epidermis (38). La aguja se desechó después de la aplicación de cada solución para evitar la contaminación. Los sitios de ensayo estaban situados a una distancia de 3-4 cm para evitar resultados falsos positivos.

Para los ensayos intradérmicos, se diluyó una solución de alergeno (100 \mug/ml) en una serie de hasta 10 diluciones y se aplicó a concentraciones desde 10-4 \mug/ml a 10 \mug/ml. Para el ensayo, las soluciones (100 \mul) se inyectaron en la espalda de los pacientes empezando con la solución que tenía la concentración más baja que producía un tamaño de la roncha que era la mitad del tamaño de la reacción cutánea inducida por el control de histamina. Los sitios de ensayo estaban situados a una distancia de 5-8 cm para evitar resultados falsos positivos. Como control positivo, se usó diclorhidrato de histamina como control positivo a concentraciones del 0,1% en los ensayos epicutáneos o del 0,01% en ensayos intradérmicos, respectivamente. Como control negativo se usó solución salina fisiológica al 0,9%. Las reacciones se registraron después de 15 minutos midiendo el diámetro longitudinal y transversal máximo de la roncha y se evaluaron como se describe (66).

El uso de alergenos de A. fumigatus recombinantes para diagnósticos in vitro

La unión de alergenos de A. fumigatus recombinantes a anticuerpos puede usarse en inmunoensayos para medir anticuerpos específicos de alergeno/antígeno de diversas clases (IgA, IgG, IgD, IgE e IgM), incluyendo subclases específicas de los mismos, por ejemplo, en relación con la diagnosis de alergias y de ABPA. Entre las subclases de IgG pueden mencionarse IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La metodología para los ensayos es la misma que la que se usó en la técnica anterior para antígenos/alergenos convencionales. De esta forma, los protocolos de inmunoensayos adecuados contemplan la formación de un complejo inmune ternario:

[alergeno]-[anticuerpo anti-alergeno]-[anti-anticuerpo] donde el alergeno y el anti-anticuerpo son reactivos añadidos y anticuerpo anti-alergeno procede de la muestra a ensayar. El complejo se forma en una forma insoluble o insolubilizable. Las formas insolubles se obtienen teniendo el alergeno o el anti-anticuerpo unido a una fase sólida antes, después o durante la formación del complejo. Son fases sólidas bien conocidas en el campo paredes de tubos y pocillos, materiales particulados y monolíticos más o menos porosos usados como adsorbentes en cromatografía e inmunoensayos heterogéneos, etc. Para medir la cantidad de complejo, el alergeno o el anti-anticuerpo se marca con un grupo analíticamente detectable, con la condición de que no se marque el reactivo unido a la fase sólida o que origina la post-insolubilización. Son grupos detectables bien conocidos enzimas (ELISA), fluoróforos, cromóforos, grupos quimioluminiscentes, isótopos radiactivos, átomos metálicos, biotina, haptenos, etc. Para medir anticuerpos específicos de antígeno/alergeno de clase/subclase específica, el anti-anticuerpo tiene que ser de una clase/subclase específica.

Normalmente este tipo de inmunoensayo se realiza con incubación secuencial, es decir,

etapa 1: muestra con alergeno seguido de

etapa 2: incubación del complejo formado en la etapa 1, es decir [alergeno]-[anticuerpo anti-alergeno] con anti-anticuerpo

o viceversa. En el caso de que el reactivo usado en la etapa 1 se una a una fase sólida, debe realizarse la separación y el lavado después de cada etapa para eliminar la interferencia no específica.

Para la diagnosis de la ABPA, las inmunoglobulinas más relevantes a medir son la IgE y ciertas subclases de IgG. Se cree que los alergenos recombinantes a usar deben proceder de proteínas de A. fumigatus que no estén expuestas en la superficie celular o que no se secreten. Esto puede indicar que los alergenos de A. fumigatus más relevantes para la ABPA puede estar unidos a células, por ejemplo, como péptidos/proteínas intracelulares.

Los anticuerpos relevantes pueden encontrarse en la sangre (incluyendo plasma y suero), saliva, líquido cefalorraquídeo (CSF), fluido bronquioalveolar, lágrimas (fluido lacrimal) etc.

Los protocolos de ensayo in vitro usados y resultados

La unión de anticuerpos IgE (y otros isotipos) a alergenos recombinantes se evaluó mediante un ensayo ELISA (39) usando el mismo método para todos los alergenos. En resumen, se recubrieron placas de microtitulación de poliestireno durante 2 horas a 37ºC con proteína de alergeno (10 \mug/ml en PBS, pH 8,0). Los sitios libres se bloquearon con PBS, pH 7,4 que contenía un 5% (p/v) de leche desnatada y deshidratada en polvo (1 h, 37ºC). Después del lavado, las placas se incubaron con sueros diluidos dos veces en serie en tampón de bloqueo que contenía Tween 20 al 5% (2 h, 37ºC). Después del lavado, se usó un segundo anticuerpo de fuente comercial (66) o TN-142, un anticuerpo anti-IgE humana monoclonal inducido contra el dominio C\varepsilon2 (suministrado amablemente por Dr. C. H. Heusser, Ciba-Geigy Ltd., Basel, Suiza) para cuantificar el contenido de Ig específica de isotipo de los sueros. La unión de Ig específica de isotipo a los alergenos se detectó con IgG de cabra anti-ratón conjugada con fosfatasa alcalina (66, 69). En ausencia de patrones calibrados, se usó un conjunto de sueros de dos pacientes que padecían ABPA como referencia interna. Se representaron las diluciones en suero frente a la densidad óptica en un diagrama log-log y la región titulable lineal se usó para convertir los valores de densidad óptica en unidades ELISA arbitrarias (EU). Los valores de absorbancia del conjunto de sueros de la referencia se establecieron arbitrariamente como 100 EU/ml para todos los isotipos analizados (66, 68). El ELISA específico de antígeno permite la detección fiable de anticuerpos séricos. Para las determinaciones de IgE usando rAsp f6, los resultados se han validado usando el sistema de Pharmacia CAP (Pharmacia & Upjohn, Diagnostics, Uppsala, Suecia) con las proteínas recombinantes como alergeno inmovilizado.

Para una evaluación a gran escala del valor de diagnóstico in vitro de los alergenos de A. fumigatus recombinantes, se seleccionaron 54 sueros de pacientes que padecían ABPA y 35 de pacientes asmáticos alérgicos con sensibilización a A. fumigatus pero sin ABPA como se dedujo a partir de los parámetros clínicos. Todos los pacientes tenían asma y cumplían las directrices para la diagnosis y el tratamiento del asma (70). Como control negativo, se usaron sueros de 10 asmáticos alérgicos sin sensibilización a A. fumigatus y sueros de 10 individuos sanos sin historia de atopia. A diferencia de los sueros de individuos sensibilizados, las muestras de suero de los 20 individuos de control mostraron valores de IgE por debajo del nivel de fondo para todos los alergenos recombinantes, demostrando que el sistema de detección de IgE se refiere a la sensibilización específica a A. fumigatus. Los resultados de las determinaciones de IgE obtenidos con sueros de asmáticos alérgicos de A. fumigatus con o sin ABPA para los alergenos recombinantes relevantes descubiertos hasta ahora (rAsp f4 y rAsp f6) se analizarán más adelante.

Las investigaciones serológicas de rAsp f4 y rAsp f6 muestran un marco completamente diferente en comparación con el obtenido con otros alergenos de A. fumigatus recombinantes. No se detectó IgE específica contra rAsp f4 y rAsp f6 en los 35 sueros de pacientes asmáticos alérgicos sensibilizados al hongo. Por el contrario, los 54 sueros de pacientes con ABPA reconocieron rAsp f4 y rAsp f6 a una frecuencia del 54% y del 78%, respectivamente (tabla 3), mientras que 49 sueros reconocieron al menos uno de los alergenos. Por lo tanto, la diagnosis serológica de ABPA con los dos alergenos tiene una especificidad del 100% y una sensibilidad > 90% (tabla 4). El MnSOD (rAsp f6), una proteína con una función bioquímica conocida, representa un enzima estrictamente intracelular. La función biológica de Asp f4 sigue sin conocerse; sin embargo, algunos experimentos preliminares para localizar la proteína usando anticuerpos monoclonales inducidos contra Asp f4 indican que el hongo no secreta la proteína. Por lo tanto, es poco probable que las dos proteínas estén presentes en forma libre como aeroalergenos, lo que puede explicar la falta de IgE específica contra estos alergenos en pacientes asmáticos alérgicos sensibilizados a A. fumigatus. Por el contrario, los pacientes que padecen ABPA tienen o han tenido el hongo creciendo en el pulmón (8, 12) y, como resultado de la desintegración de las células fúngicas por mecanismos de defensa del hospedador, también se exponen a proteínas no secretadas (3). Uno de los mecanismos de defensa del hospedador contra infecciones fúngicas consiste en dañar las hifas y en una fagocitosis mediada por células polimorfonucleares (2, 3, 4). Se cree que el desarrollo de una respuesta inmune mediada por células contra un hongo requiere que las células presentadoras de antígenos procesen y presenten antígenos fúngicos contra linfocitos T (1). Por lo tanto, los pacientes que padecen ABPA también pueden montar una respuesta inmune a proteínas intracelulares de A. fumigatus nunca vistas por el sistema inmune de individuos alérgicos a A. fumigatus, que se exponen únicamente a alergenos secretados y conidios. La relevancia in vivo de rAsp f4 y rAsp f6 se ha evaluado en ensayos cutáneos que implican números representativos de pacientes con ABPA, alergia a A. fumigatus y controles de salud (véase más adelante).

Valor diagnóstico de alergenos de A. fumigatus recombinantes para ensayos in vivo

En relación con la discriminación potencial entre ABPA y la sensibilización alérgica, los descubrimientos más significativos de las investigaciones serológicas que implicaban sujetos con asma y sensibilización concomitante a A. fumigatus, fueron niveles elevados de IgE en suero específica contra rAsp f4 y rAsp f6 en pacientes que padecían ABPA. Como se indica en la tabla 3, la IgE específica contra rAsp f4 y rAsp f6, medida por medio de ELISA, alcanzó valores de 54 \pm 160 unidades de ELISA/ml y 47 \pm 66 unidades de ELISA/ml en sueros de pacientes asmáticos con ABPA. Por el contrario, los anticuerpos IgE específicos contra estos dos alergenos estuvieron prácticamente ausentes en sueros de pacientes asmáticos sensibilizados a A. fumigatus sin indicios de ABPA, así como en sueros de individuos de control (tabla 3). Basándose en estos resultados, rAsp f4 y rAsp f6 podrían servir como reactivos para el desarrollo de un ensayo específico de ABPA basado en anticuerpos IgE específicos de alergeno circulantes. Por lo tanto, se tuvo interés en evaluar la alergenicidad de estas proteínas in vivo. Para demostrar la capacidad de rAsp f4 y rAsp f6 para inducir una liberación mediadora in vivo, se realizó un estudio de provocación cutánea intradérmica que implicaba 12 pacientes asmáticos con ABPA, 12 asmáticos alérgicos sensibilizados a A. fumigatus sin ABPA y 5 controles sanos. La selección de los pacientes y la diagnosis de sensibilización a A. fumigatus se basaron en la historia clínica, RAST y reactividad cutánea a los extractos de A. fumigatus como se describe en (59, 66). Todos los pacientes padecían asma y cumplían las directrices para la diagnosis y el tratamiento del asma (70). En el momento del estudio, todos los sujetos padecían asma bronquial estable, sin indicios de infecciones de pecho y no recibían medicación con anti-histamínicos. Los cinco individuos de control sanos no tenían historia de alergia o asma y tenían niveles en suero normales de IgE total. La diagnosis de ABPA se basó en un mínimo de 6 de los 8 criterios propuestos por Rosenberg et al (23) y Patterson et al (24). Cuatro pacientes con ABPA (tabla 5) y un paciente con asma alérgica (tabla 5) se trataron con dosis bajas de corticosteroides orales (5-10 mg/día). Antes de empezar el estudio se obtuvo una aprobación ética de ensayos cutáneos en sujetos humanos con alergenos recombinantes del comité responsable. Se proporcionó una explicación completa del procedimiento a todos los individuos antes del ensayo y posteriormente se obtuvo un consentimiento por escrito. En la tabla 5 se presentan las principales características de los sujetos que participaron en el estudio incluyendo la edad, sexo, recuento de eosinófilos, IgE total en suero, IgE en suero específica contra rAsp f4 y rAsp f6 y RAST a A. fumigatus. Todos los sujetos mostraron una respuesta de ensayo cutáneo positiva a exposiciones a histamina intradérmica (0,01%) y no fueron reactivos a la solución salina al 0,9%. Los resultados (tabla 5) sugieren una alta especificidad de la reactividad de rAsp f4 y rAsp f6 para pacientes que padecen ABPA. De hecho, sólo este grupo de pacientes mostró cantidades relevantes de IgE específica contra rAsp f4 y rAsp f6 (tablas 3 y 4). Como era de esperar, sólo los individuos que mostraban cantidades detectables de IgE específica de alergeno en suero reaccionaban a exposiciones cutáneas con rAsp f4 y rAsp f6. Estos resultados demuestran claramente que es factible una diagnosis muy específica de ABPA basada en alergenos recombinantes. Sin embargo, aunque los ensayos cutáneos y serológicos basados en rAsp f4 y rAsp f6 muestran una alta especificidad para ABPA en ausencia de dermatitis atópica, la sensibilidad de la diagnosis sólo llega hasta aproximadamente un 90% (tabla 4). Teniendo en cuenta la especificidad relativamente baja de los criterios de diagnóstico para ABPA disponibles hasta la fecha, los ensayos serológicos y cutáneos con rAsp f4 y rAsp f6 representan una mejora considerable de la diagnosis de la enfermedad. Además, las características de los dos alergenos, consideradas conjuntamente con la observación de que los pacientes con ABPA y los pacientes asmáticos alérgicos sensibilizados a A. fumigatus reconocen diferentes alergenos en el análisis de transferencia de Western, proporcionan un número racional para una mejora adicional de la diagnosis de ABPA. En un estudio presentado por Borga (6), se comparó la reactividad de IgE en suero ante alergenos de A. fumigatus en dos grupos de pacientes, pacientes alérgicos sensibilizados a A. fumigatus y pacientes con ABPA. Los sueros de individuos que padecían alergia a A. fumigatus reconocieron al menos treinta y cinco componentes de unión a IgE diferentes del hongo, que tenían un tamaño que variaba entre 14 y 118 kDa, de los cuales cuatro componentes (34, 39, 43 y 83 kDa) se detectaron únicamente por estos sueros. Con los sueros del grupo ABPA, se detectaron treinta y nueve componentes de unión a IgE diferentes que variaban de 14 a 150 kDa, de los cuales ocho componentes con pesos moleculares de 15, 19,5, 54, 56, 96, 110, 126 y 150 kDa no se reconocían por la IgE de los pacientes alérgicos. Por lo tanto, a partir del total de 43 componentes de unión a IgE detectados, se descubrieron anticuerpos contra 31 en los dos grupos de pacientes, 8 fueron específicos para ABPA y 4 fueron específicos para la sensibilización no relacionada con ABPA a A. fumigatus.

La disponibilidad de los alergenos recombinantes descritos permitirá la identificación de pacientes alérgicos a A. fumigatus que carecen de sensibilización a estos alergenos clonados. Posteriormente pueden usarse sueros de tales sujetos para seleccionar la biblioteca de presentación de superficie de fagos de A. fumigatus para aislar los clones de fagos que presentan alergenos adicionales. El potente procedimiento de selección basado en bioposicionamiento (45, 47, 51, 52), junto con una base lógica para la selección de los sueros usados para seleccionar la biblioteca de fagos, permitirá el aislamiento de los alergenos adicionales en un período de tiempo razonable. Es probable que la producción, caracterización y evaluación de estos alergenos contribuya al desarrollo adicional de herramientas de diagnóstico específicas tanto para ABPA como para la sensibilización relacionada con A. fumigatus.

Para usar rAsp f6 como alergeno específico para la diagnosis de ABPA, tiene que excluirse la dermatitis atópica. Un alto porcentaje de pacientes que padecen dermatitis atópica con clase RAST moderada a A. fumigatus muestran altas titulaciones de IgE específica contra rAsp f6 en suero. Además, las exposiciones cutáneas intradérmicas con rAsp f66 en tres pacientes que padecían dermatitis atópica demostró claramente que el alergeno puede provocar una fuerte liberación mediadora in vivo en estos pacientes. En particular, la investigación serológica de 15 sueros de pacientes que padecen dermatitis atópica no muestra ninguna IgE específica contra los demás alergenos de A. fumigatus recombinantes disponibles (76). Se desconoce la razón de la sensibilización monovalente a Asp f2 en pacientes con dermatitis atópica. Sin embargo, se intenta especular que la respuesta de IgE específica contra rAsp f6 podría deberse a la producción de anticuerpos IgE que reconocen la superóxido dismutasa humana en estos individuos, lo que daría lugar a una reacción cruzada con la MnSOD fúngica altamente homóloga (43). La disponibilidad tanto de la
MnSOD recombinante humana como de la fúngica permitirá estudiar con más detalle el papel de estas proteínas en la patofisiología de la dermatitis atópica.

Discriminación serológica entre la sensibilización a A. fumigatus y ABPA en pacientes con fibrosis quística

Este estudio implicó 37 pacientes con fibrosis quística con una evaluación rutinaria de la fibrosis quística y alergia, incluyendo un ensayo epicutáneo (67, 71). En 15 pacientes se diagnosticó ABPA de acuerdo con los criterios clínicos e inmunológicos propuestos por Laufer (16) y Nelson (25). 12 pacientes pertenecían al grupo con sensibilización documentada a A. fumigatus de acuerdo con el ensayo RAST y el ensayo epicutáneo rutinario para extractos de A. fumigatus y 10 se asignaron al grupo de control CF basándose en la falta de sensibilización a A. fumigatus (67). En la tabla 6 se presentan las características de los pacientes incluyendo la edad, sexo, RAST a A. fumigatus e IgE total en suero. Se determinaron los niveles de IgE específica de alergeno para los alergenos rAsp f1, rAsp f3, rAsp f4 y rAsp f6 en suero de cada individuo. rAsp f1 (43) y rAsp f3 (42) corresponden a alergenos principales de A. fumigatus con una prevalencia de sensibilización del 69% y del 76% entre los pacientes asmáticos con ensayo cutáneo positivo para los extractos de A. fumigatus, mientras que rAsp f4 y rAsp f6 (43) se reconocen sólo por sueros de pacientes con ABPA. Se ha demostrado que las cuatro proteínas son alergenos relevantes in vivo por exposiciones cutáneas de pacientes asmáticos sensibilizados a A. fumigatus. Los resultados de la investigación serológica (tabla 9) demuestran que la mayoría de los individuos con fibrosis quística sensibilizados a A. fumigatus llevan IgE contra rAsp f1 y rAsp f3 (85% y 100%, respectivamente) y un 85% llevan IgE contra los dos alergenos. Considerados conjuntamente, rAsp f1 y rAsp f3 son suficientes para diagnosticar la sensibilización a A. fumigatus en todos los sueros investigados procedentes de pacientes con fibrosis quística. De acuerdo con la definición actual de alergenos (41), rAsp f1 y rAsp f3 corresponden a los principales alergenos también para el grupo de fibrosis quística. En los tres subgrupos de individuos analizados, los pacientes con fibrosis quística con sensibilización a A. fumigatus, con o sin ABPA, y los individuos con fibrosis quística sin sensibilización a A. fumigatus, sólo se encontraron niveles relevantes de IgE en suero contra rAsp f4 y rAsp f6 en sueros de individuos con diagnosis clínica de ABPA. En este grupo, se detectaron niveles de IgE específica contra rAsp f6 que excedían el valor límite (> 5 U/ml) en 10 de 15 sueros de pacientes, mientras que se detectaron niveles relevantes de IgE específica contra rAsp f4 (valor límite > 7 EU/ml) en 13 de los 15 sueros de pacientes. Si consideramos niveles elevados de IgE específica contra rAsp f4 o rAsp f6 suficientes para indicar ABPA, todos los pacientes estuvieron cubiertos por la diagnosis serológico, mientras que 8 pacientes de 15 tenían niveles elevados de IgE tanto contra rAsp f6 como contra rAsp f4. Por lo tanto, la serología específica de alergeno con rAsp f4 y rAsp f6 podría proporcionar una contribución substancial a una diagnosis serológica diferencial de ABPA en pacientes que padecen fibrosis quística y sensibilización a A. fumigatus.

TABLA 1

1

2

3

TABLA 4

4

5

6

7

8

Resultados obtenidos durante el año de prioridad

El ADNc que codificaba rAsp f8 se aisló y se expresó de la misma forma que rAsp f4 y rAsp f6 y corresponde a la secuencia codificante de una proteína ribosómica ácida P_{2} y, por lo tanto, representa una proteína no secretada clásica. Aunque no se ensayó clínicamente, la proteína representa una proteína de unión a IgE cuando se evalúa en ELISA de acuerdo con los procedimientos presentados anteriormente. Todos los resultados obtenidos hasta ahora del ELISA demuestran que rAsp f8 es altamente específica para sueros de pacientes que padecen ABPA. Ninguno de los 35 pacientes asmáticos alérgicos ensayados mostró niveles detectables de IgE específica de rAsp f8 (2,3 \pm 0,4 EU/ml), que no es estadísticamente diferente del valor obtenido para los 20 individuos sanos (1,2 \pm 0,6 EU/ml). Por el contrario, 17 de los 54 pacientes que padecen ABPA (31%) se sensibilizaron claramente contra rAsp f8. El valor medio EU/ml de la muestra entera corresponde a 8 \pm 14 del total. La sensibilización que incluye todos los pacientes sensibilizados a A. fumigatus (alérgicos + ABPA, n = 89) corresponde a un 19% (EU/ml, 5,4 \pm 12). Sin embargo, este nuevo alergeno específico para ABPA no contribuye a la mejora de la diagnosis diferencial de ABPA, porque todos los pacientes que reconocen rAsp f8 ya reconocen rAsp f4, rAsp f6 o ambos.

La secuencia de ADN para rAsp f8 se muestra como SEC ID Nº 5 y la secuencia de aminoácidos correspondiente como SEC ID Nº 6. Las secuencias se determinan de forma preliminar y pueden no ser exactas en hasta 10 posiciones, por ejemplo las posiciones 92, 94, 108, 156 y 183 en la secuencia de ADN para rAsp f8 no se han confirmado finalmente.

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SEC ID Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

Longitud de la secuencia de ADN de rAsp f6: 624

\vskip1.000000\baselineskip

9

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SEC ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

Longitud de la secuencia de aminoácidos de rAsp f6: 207

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

Longitud de la secuencia de ADN de rAsp f4: 861

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

Longitud de la secuencia de aminoácidos de rAsp f4: 286

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13

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

Longitud de la secuencia de ADN de rAsp f8: 336

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14

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

Longitud de la secuencia de aminoácidos de rAsp f8: 111

\vskip1.000000\baselineskip

15

Claims (8)

1. Un método in vitro para la diagnosis diferencial de ABPA en un individuo humano, caracterizado por la determinación de si el individuo lleva anticuerpos reactivos con uno o más alergenos recombinantes relacionados con ABPA y porque dicho uno o más alergenos se seleccionan entre rAsp f4 y rAsp f6 y fragmentos relacionados con ABPA de los mismos.

2. Un método in vitro para la diagnosis diferencial de ABPA en un individuo humano, caracterizado por la determinación de si el individuo lleva anticuerpos reactivos con uno o más alergenos recombinantes relacionados con ABPA y porque dicho uno o más alergenos se seleccionan entre rAsp f8 y fragmentos relacionados con ABPA de los mismos.

3. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el alergeno procede de A. fumigatus.

4. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el alergeno corresponde a una proteína no secretada procedente de A. fumigatus.

5. El método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque se realiza un inmunoensayo in vitro en una muestra de fluido del individuo para la determinación del nivel de anticuerpos dirigidos contra dichos alergenos recombinantes, en particular anticuerpos de la clase IgE o de la clase IgG o de subclases de las mismas.

6. El método in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque se determinan anticuerpos de la clase IgE.

7. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque se realiza un inmunoensayo in vitro en una muestra de fluido del individuo para la determinación del nivel de anticuerpos dirigido contra dichos alergenos recombinantes, en particular anticuerpos de la clase IgE o de la clase IgG o de subclases de las mismas.

8. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque se determinan anticuerpos de la clase IgE.