CN109425743B - 检测可溶性fam19a4蛋白的微球双抗体夹心检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
由于FAM19A4蛋白可能与多种生理和病理情形相关并在其中扮演重要角色,因此对特定样本如血液、体液及细胞培养上清等之中的可溶性FAM19A4蛋白进行定量检测具有重要意义。本发明首先涉及一种FAM19A4蛋白作为疾病诊断标志物的用途,所述疾病为感染性疾病和自身免疫病;本发明还涉及一种定量检测可溶性FAM19A4蛋白的方法和试剂盒。该方法和试剂盒利用双抗体夹心法原理使用微球固相载体和流式细胞术检测可溶性FAM19A4蛋白,可用于临床病人的血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、羊水、卵泡液等类型的体液以及基础研究和小鼠模型中各种生物学样品如细胞培养液、小鼠血液中FAM19A4蛋白的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于免疫学和生物技术领域,首先涉及一种FAM19A4蛋白作为疾病诊断标志物的用途;本发明还涉及一种检测可溶性FAM19A4蛋白的定量检测方法和试剂盒。该方法和试剂盒可用于人和小鼠体液样品中FAM19A4蛋白的检测,基础研究中各种生物学样品(如细胞培养上清液、细胞溶解液)中FAM19A4蛋白的检测,以及来源于动物模型的生物学样品中FAM19A4蛋白的检测。
技术背景
FAM19A4(family with sequence similarity 19(chemokine(C-C motif)-like),member A4;又称TAFA4)为FAM19/TAFA家族具有趋化功能的细胞因子。生物信息学发现,FAM19A4基因定位于3p14.1,序列全长2248bp,ORF全长423bp,编码140个氨基酸,分子量约16kD,等电点9.02,全长氨基酸序列中包含13个半胱氨酸,同时具有CC和CXC基序,但与经典趋化因子结构不同。其N端包含一个典型的信号肽结构,为经典分泌蛋白,成熟形式包含C端95个氨基酸。
FAM19A4进化保守,各种属间同源性较高,其中人FAM19A4与小鼠FAM19A4在蛋白质水平的同源性高达93.3%。电子表达谱提示人FAM19A4在各正常组织器官中广泛低表达,小鼠FAM19A4仅在背脊神经节中高表达。在小鼠模型中,鞘内注射FAM19A4能够显著抑制卡拉胶引起的机械痛敏,提示其具有镇痛作用。此外,FAM19A4的甲基化水平与宫颈癌高度相关,可用于后者的检测。
FAM19A4具有诱导性表达的特点,其在正常组织、细胞中低表达,在LPS或zymosan刺激的成熟DC细胞中高表达,在LPS刺激的单核巨噬细胞中高表达。FAM19A4通过与受体FPR1结合发挥对巨噬细胞和中性粒细胞的趋化活性。FAM19A4能显著促进人和小鼠巨噬细胞对真菌胞壁提取物zymosan的吞噬并促进ROS产生,FPR1抑制剂Boc能阻断上述作用;同时FAM19A4可在zymosan的刺激下进一步上调Akt的磷酸化水平。另一方面,FAM19A4能够通过抑制由LPS或zymosan引起的NF-κB活性增强,抑制p38和ERK的磷酸化,使巨噬细胞分泌炎性因子的能力下降。
研究FAM19A4在疾病中的表达和作用,具有重要意义。
由于FAM19A4蛋白与多种生理情形和疾病情形可能存在关联,并在其中扮演重要角色,因此在临床上和基础研究中,都具有对特定样本例如血液、体液、细胞培养上清、细胞裂解液等之中存在的可溶性FAM19A4蛋白进行定量检测的需求,从而迫切需要一种可靠的定量检测方法。然而,发明人在实际探索建立这一检测方法的过程中,发现常规的双抗体夹心ELISA方法需要的样本量较大,难以满足小量样本的检测要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种FAM19A4蛋白作为疾病诊断标志物的用途,所述疾病为感染性疾病和自身免疫病。
本发明的目的还在于,为了有效地检测可溶性FAM19A4蛋白,提供一种利用流式细胞术和微球固相载体检测可溶性FAM19A4蛋白的方法,该方法以FAM19A4的多克隆抗体(Wenyan WANG等,FAM19A4is a novel cytokine ligand of formyl peptide receptor 1(FPR1)and is able to promote the migration and phagocytosis of macrophages,Cell.Mol.Immunol.,2015年12卷615-624页)作为捕获抗体,以FAM19A4的单克隆抗体作为检测抗体。实验结果表明采用该方法能够对临床病人的血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、羊水、卵泡液等绝大部分类型的体液中的可溶性FAM19A4蛋白进行定量检测。在本发明的另一个实施例中,该方法也可用于对基础研究中各种实验室样品(如细胞培养上清液、细胞溶解液)中的可溶性FAM19A4蛋白进行定量检测。在另一个实施例中,该方法也可用于检测来自动物模型的生物学样品中的可溶性FAM19A4蛋白。本发明的目的还在于,为了有效地检测可溶性FAM19A4蛋白,提供一种用于对可溶性FAM19A4蛋白进行定量检测的试剂盒。
用于实现上述目的的技术方案如下:
一种FAM19A4蛋白的用途,其特征在于,FAM19A4蛋白作为疾病诊断标志物,所述疾病为感染性疾病和自身免疫病。
优选地,所述感染为细菌感染和/或真菌感染和/或其关联的疾病和/或症状,例如本领域公知的菌血症、败血症、感染性休克等疾病。
优选地,所述感染为革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌和/或真菌感染。
优选地,所述真菌感染为白色念珠菌感染。
优选地,所述自身免疫病为系统性红斑狼疮脑病和/或类风湿性关节炎。
优选地,实现上述用途的具体方法,是使用FAM19A4的抗体,包括多克隆抗体和单克隆抗体,或本领域公知的类似于抗体的其他形式,包括但不限于Fab片段、单链抗体等,对FAM19A4蛋白进行定性或定量检测。因此,FAM19A4的抗体,包括多克隆抗体和单克隆抗体,或本领域公知的类似于抗体的其他形式,包括但不限于Fab片段、单链抗体等,能够用于检测、诊断疾病或制备相应的疾病诊断试剂盒。
优选地,所述疾病为感染性疾病和自身免疫病。
优选地,所述感染为细菌感染和/或真菌感染和/或其关联的疾病和/或症状,例如本领域公知的菌血症、败血症、感染性休克等疾病。
优选地,所述感染为革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌和/或真菌感染。
优选地,所述真菌感染为白色念珠菌感染。
优选地,所述自身免疫病为系统性红斑狼疮脑病和/或类风湿性关节炎。
优选地,所对应的待测样品为体液;进一步优选地,所述体液为血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、羊水、卵泡液;进一步优选地,所述体液为血浆、血清、关节液和/或脑脊液。
一种利用均一性可悬浮固相载体的基于流式细胞术的FAM19A4定量检测方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将FAM19A4捕获抗体与均一性可悬浮固相载体偶联;
(2)将偶联后的均一性可悬浮固相载体与待测样品充分接触,并离心弃上清;
(3)加入FAM19A4检测抗体,充分结合并清洗后加入标记二抗进行染色;
(4)用流式细胞仪对均一性可悬浮固相载体进行检测。
一种试剂盒,其特征在于包括了均一性可悬浮固相载体、FAM19A4捕获抗体、FAM19A4检测抗体、标记二抗。
优选地,上述方法和试剂盒中,均一性可悬浮固相载体是微球。
优选地,上述方法和试剂盒中,均一性可悬浮固相载体是硫酸乳胶微球。
优选地,上述方法和试剂盒中,均一性可悬浮固相载体是不同于硫酸乳胶微球的其他类型微球。所述微球具有与硫酸乳胶微球相似的一些特性,例如便于捕获抗体偶联于其上,便于通过离心、磁性吸附、外加电场吸附等方式进行富集,体积体现为与细胞大小类似、形状均一以便于在流式细胞仪中进行检测等。
优选地,在上述方法中,待测样品可以为人或小鼠的血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、羊水、卵泡液、细胞培养上清液或细胞溶解液。
优选地,上述方法进一步包括如下步骤:先以系列包含已知浓度的可溶性FAM19A4蛋白的标准品溶液作为待测样品实施步骤(1)至(4),绘制标准曲线;再以未知浓度和含量的待测样品重复步骤(1)至(4),并根据标准曲线得出其中可溶性FAM19A4蛋白的浓度。
优选地,上述试剂盒进一步包括已知浓度的可溶性FAM19A4蛋白的标准品溶液。
优选地,在上述方法和试剂盒中,FAM19A4蛋白捕获抗体为FAM19A4蛋白的多克隆抗体,例如兔抗人FAM19A4蛋白的多克隆抗体。
优选地,在上述方法和试剂盒中,FAM19A4蛋白检测抗体为FAM19A4蛋白的单克隆抗体,例如小鼠抗人FAM19A4蛋白的单克隆抗体。
优选地,在上述方法和试剂盒中,标记二抗为山羊抗小鼠抗体,并且由荧光分子或基团等常规检测标记物标记。进一步优选地,标记分子是别藻青蛋白(APC)
优选地,上述可溶性FAM19A4蛋白的定量检测方法的步骤(1)具体包括:
将兔抗人FAM19A4多克隆抗体按照制造商说明书偶联至Aldehyde/Sulfate latex硫酸乳胶微球,具体过程包括:将45μg抗体分子与50μL微球在0.025M pH6的MES缓冲液中室温孵育过夜,进而使用溶于磷酸盐缓冲液(PBS,0.1M,pH7.2)的3%牛血清白蛋白封闭微球的未结合部位。偶联后的微球可以重悬在200μL储存缓冲液(PBS,0.1M,pH 7.2,0.1%BSA;0.1%NaN3)中于4℃保存。
优选地,上述可溶性FAM19A4蛋白的定量检测方法的步骤(2)具体包括:
将微球悬液震荡混匀后按每个测试样品1μL吸取适量微球悬液,加入9倍体积的磷酸盐缓冲液,混匀后按每个样品10μL吸取至1.5mL离心管,而后与100μL样品溶液或经稀释的样品溶液混合,置于旋转混合器上4℃过夜孵育。孵育完成后离心,弃上清。
优选地,上述可溶性FAM19A4蛋白的定量检测方法的步骤(3)具体包括:
用抗体稀释缓冲液(含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液)将检测抗体稀释至2μg/mL,每个测试样品加入50μL,震荡混匀后室温孵育1小时,孵育完成后离心,弃上清,并用磷酸盐缓冲液洗微球1次。随后加入APC标记的山羊抗小鼠二抗(1:100稀释于抗体稀释缓冲液,50μL/样品),室温避光孵育0.5小时,孵育完成后离心,弃上清,并用磷酸盐缓冲液洗微球1次。
优选地,上述可溶性FAM19A4蛋白的定量检测方法的步骤(4)具体包括:
将微球重悬于200μL磷酸盐缓冲液中,进行流式细胞术检测。使用对数模式对前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)电压进行调节,FSC电压阈值设置为10 000,使单个微球群在FSC通道上位于104到105之间,设置门P1使该群位于门内(图1)。每个样品收获2 000个微球。
进一步优选地,上述流式细胞术使用BD FACSVerseTM流式细胞仪和BD FACSuiteTM软件(BD公司,美国)收集细胞,并对APC-A通道几何平均荧光强度(Geo Mean FluorescenceIntensity,GMFI)数据进行分析统计。
优选地,上述可溶性FAM19A4蛋白定量检测方法的标准曲线按如下步骤绘制:
使用检测稀释缓冲液将FAM19A4-myc-his真核重组蛋白稀释至10ng/mL,进而倍比稀释得到浓度为10ng/mL,5ng/mL,2.5ng/mL,1.25ng/mL,0.625ng/mL,0.312ng/mL,0.156ng/mL,0.078ng/mL,和0.039ng/mL的标准品梯度溶液。检测稀释缓冲液作为空白对照。上述标准品按样品检测步骤(1)至(4)进行检测,并收集APC-A GMFI数据,对应相应标准品浓度绘制标准曲线。
进一步优选地,上述标准曲线绘制使用CurveExpert 1.4软件。
优选地,上述方法和试剂盒可用于检测、诊断疾病或用于制备疾病检测、诊断试剂。
优选地,所述疾病为感染性疾病和自身免疫病。
优选地,所述感染为细菌感染和/或真菌感染和/或其关联的疾病和/或症状,例如本领域公知的菌血症、败血症、感染性休克等疾病。
优选地,所述感染为革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌和/或真菌感染。
优选地,所述真菌感染为白色念珠菌感染。
优选地,所述自身免疫病为系统性红斑狼疮脑病和/或类风湿性关节炎。
优选地,所对应的待测样品为体液;进一步优选地,所述体液为血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、羊水、卵泡液;进一步优选地,所述体液为血浆、血清、关节液和/或脑脊液。
本发明的可溶性FAM19A4蛋白定量检测方法的基础是捕获抗体与微球的偶联,通过将捕获抗体与微球偶联,进而使得抗原能够与微球结合,并进一步利用微球的各种特性进行富集和检测。本领域通常使用ELISA方法检测可溶性抗原,与之相比,本发明的方法大大降低了对样本量的要求,提高了可溶性FAM19A4蛋白的检出下限和检测浓度范围。具体地,本发明的方法和相应的试剂盒能够检出样品中低至39pg/mL、高至10ng/mL的可溶性FAM19A4蛋白。
此外,由于小鼠FAM19A4与人FAM19A4有93.3%的序列相似性,因此,本方法同样适用于小鼠FAM19A4的检测。
基于上述研究,本发明利用上述微球双抗体夹心方法和试剂盒成功检测到了人和小鼠的体液样品及其它生物学样品如细胞培养液中的可溶性FAM19A4蛋白。结果显示,相比正常培养的THP-1细胞,PMA处理后细胞培养上清中FAM19A4浓度升高,使用LPS活化后其浓度进一步升高。各种病人和正常人血清中可溶性FAM19A4蛋白表达的检测结果证明:感染患者如菌血症发热和脓毒症休克患者血清中FAM19A4蛋白的水平显著高于正常人;而自身免疫病患者如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎患者血清及血浆中FAM19A4蛋白的水平与正常人无显著差异;但在系统性红斑狼疮脑病患者的脑脊液和类风湿关节炎患者的关节液中,检测到较高水平的可溶性FAM19A4蛋白;同时,盲肠结扎穿孔术(CLP)后及白色念珠菌感染后的小鼠血清中FAM19A4的水平显著高于正常小鼠。因此,将上述方法和试剂盒用于检测血浆、血清、脑脊液、关节液中的FAM19A4蛋白水平,为多种感染性疾病的诊断、病程判断、疗效观察,指导用药及预后提供了一种新的辅助检测方法。该检测方法及其试剂盒取样方便,操作简单,灵敏度和准确性更高,更有利于推广应用。
附图说明
图1所示为利用流式细胞术收集微球的散点图。FSC:前向散射通道;SSC:侧向散射通道。
图2所示为微球双抗体夹心法检测FAM19A4标准品的代表性流式细胞检测直方图。
图3所示为微球双抗体夹心法检测FAM19A4的代表性标准曲线。
图4所示为微球双抗体夹心法检测THP-1细胞上清中FAM19A4的结果(A)及RT-PCR验证结果(B)。*,P<0.05;**,P<0.01。
图5所示为微球双抗体夹心法检测感染患者血清中FAM19A4的结果。N:正常人;F:菌血症发热患者;S:脓毒症休克患者。**,P<0.01。
图6所示为微球双抗体夹心法检测自身免疫病患者血清中FAM19A4的结果。N:正常人;RA:类风湿性关节炎患者;SLE:系统性红斑狼疮患者。ns,无显著性差异。
图7所示为微球双抗体夹心法检测自身免疫病患者血浆及组织液中FAM19A4的结果。Normal:正常人血浆;SLE-plasma:系统性红斑狼疮患者血浆;SLE-CSF:系统性红斑狼疮患者脑脊液;RA-plasma:类风湿性关节炎患者血浆;RA-synovia:类风湿性关节炎患者关节液。
图8所示为微球双抗体夹心法检测CLP术后小鼠血清中FAM19A4的结果。WT:正常小鼠;CLP:CLP术后小鼠。*,P<0.05。
图9所示为微球双抗体夹心法检测白色念珠菌感染的小鼠血清中FAM19A4的结果(A)及免疫沉淀验证(B)。nor:正常小鼠血清;C.a:白色念珠菌感染小鼠血清。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅用于阐释本发明,而不限制本发明的范围。
实施例1材料与方法
1.重组蛋白制备
真核重组蛋白FAM19A1-myc-his、FAM19A4-myc-his、FAM19A5-myc-his和LYG1-myc-his按常规真核重组蛋白制备方法制得,并由BCA定量方法测量确定其浓度不低于1mg/mL。
2.抗体
兔抗人FAM19A4多克隆抗体由FAM19A4-myc-his真核重组蛋白免疫兔获得,其具体制备方法如前述文献(Wenyan WANG等,FAM19A4is a novel cytokine ligand of formylpeptide receptor 1(FPR1)and is able to promote the migration and phagocytosisof macrophages,Cell.Mol.Immunol.,2015年12卷615-624页)所记载。小鼠抗人FAM19A4单克隆抗体由FAM19A4-myc-his真核重组蛋白免疫BALB/c裸鼠,并由ELISA筛选得到12株杂交瘤克隆。由免疫印迹和流式细胞术分析对所述12株抗体进行亲和力和特异性鉴定,并选择最佳的克隆。商品化的APC标记的山羊抗小鼠二抗购自Biolegend。
3.微球
Aldehyde/Sulfate latex硫酸乳胶微球购自Molecular Probes。
4.缓冲液
MES缓冲液,0.025M,pH6。
磷酸盐缓冲液(PBS,0.1M,pH7.2)为本领域常规缓冲液。
微球储存缓冲液为0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液加入0.1%的牛血清白蛋白(BSA)和0.1%的叠氮钠(NaN3)。
抗体稀释缓冲液为含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液。
检测稀释缓冲液,购自Pierce。
5.微球双抗体夹心法检测步骤
将兔抗人FAM19A4多克隆抗体按照制造商说明书偶联至Aldehyde/Sulfate latex硫酸乳胶微球,制备捕获微球。具体过程包括:将45μg抗体分子与50μL微球在0.025M,pH6的MES缓冲液中室温孵育过夜,进而使用溶于磷酸盐缓冲液(PBS,0.1M,pH7.2)的3%牛血清白蛋白封闭微球的未结合部位。偶联后的微球可以重悬在200μL储存缓冲液(PBS,0.1M,pH7.2,0.1%BSA;0.1%NaN3)中于4℃保存。
将微球悬液震荡混匀后按每个测试样品1μL吸取适量微球悬液,加入9倍体积的磷酸盐缓冲液,混匀后按每个样品10μL吸取至1.5mL离心管,而后与100μL样品溶液或经稀释的样品溶液混合,置于旋转混合器上4℃过夜孵育。孵育完成后离心,弃上清。
用抗体稀释缓冲液将检测抗体稀释至2μg/mL,每个测试样品加入50μL,震荡混匀后室温孵育1小时,孵育完成后离心,弃上清,并用磷酸盐缓冲液洗微球1次。随后加入APC标记的山羊抗小鼠二抗(1:100稀释于抗体稀释缓冲液,50μL/样品),室温避光孵育0.5小时,孵育完成后离心,弃上清,并用磷酸盐缓冲液洗微球1次。
将微球重悬于200μL磷酸盐缓冲液中,进行流式细胞术检测。使用BD FACSVerseTM流式细胞仪和BD FACSuiteTM软件(BD公司,美国)收集细胞,用对数模式对前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)电压进行调节,FSC电压阈值设置为10 000,使单个微球群在FSC通道上位于104到105之间,设置门P1使该群位于门内(图1)。每个样品收获2 000个微球。对APC-A通道几何平均荧光强度(Geo Mean Fluorescence Intensity,GMFI)数据进行分析统计。
6.RT-PCR、免疫沉淀及Western blot
按照常规方法进行。PCR所使用引物为FAM19A4F:5’-gcggccgccaccatgaggtccccaaggatgagagtct-3’和FAM19A4R:5’-ggtaccgcccgcgttaccttcgtagttttgact-3’;退火温度为60℃,扩增35轮。免疫沉淀及Western blot使用兔抗人FAM19A4抗体,正常兔IgG为阴性对照。
实施例2微球双抗体夹心法检测可溶性FAM19A4蛋白的标准曲线的建立
首先用检测稀释缓冲液将FAM19A4-myc-his真核重组蛋白稀释到10ng/mL,进而倍比稀释得到浓度为10ng/mL,5ng/mL,2.5ng/mL,1.25ng/mL,0.625ng/mL,0.312ng/mL,0.156ng/mL,0.078ng/mL,和0.039ng/mL的标准品梯度溶液。检测稀释缓冲液作为空白对照。上述标准品按实施例1中的检测步骤进行检测,并收集APC-A GMFI数据,对应相应标准品浓度使用CurveExpert 1.4软件绘制标准曲线。图2和表1所示为一次代表性数据,根据其绘制的标准曲线如图3所示。
表1
实施例3利用微球双抗体夹心法检测可溶性FAM19A4蛋白的特异性、回收率和精确度
本发明的方法通过检测FAM19A1和FAM19A5验证其特异性。两者同样属于TAFA家族,与FAM19A4分别具有74%和68%的序列相似性。分别制备10 000和1 000pg/mL的FAM19A1和FAM19A5标准品,使用本发明的方法进行检测,结果均低于检测下限(表2)。这表明FAM19A4与其类似物之间无明显交叉反应,本发明的方法具有高度特异性。
在不同待测基质中加入一定浓度的FAM19A4标准品蛋白,使用本发明的方法进行检测,比较检测浓度与实际浓度,计算该检测方法的回收率。如表3所示,在检测的四种基质中,回收率均接近100%。
通过反复多次检测低(0.156ng/mL)、中(1.25ng/mL)、高(10ng/mL)浓度的三组FAM19A4标准品,验证本发明方法的精确度,用变异系数(CV%=标准差/平均值×100%)表示。在同一次试验中检测9次,计算试验内精确度,低中高浓度样品的变异系数分别为2.21%、6.78%和4.34%;重复9次试验,计算试验间精确度,低中高浓度样品的变异系数分别为5.81%、11.26%和6.03%(表4)。
表2
表3
基质类型 | 试验次数 | 平均回收率% | 范围% |
细胞培养基RPMI 1640 | 6 | 112 | 101-123 |
细胞培养基DMEM | 6 | 98 | 90-107 |
人血清 | 6 | 105 | 92-130 |
胎牛血清 | 6 | 111 | 91-125 |
表4
实施例4利用微球双抗体夹心法检测THP-1细胞上清中的FAM19A4浓度
THP-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,使用20ng/mL PMA处理24h后加入100ng/mL LPS刺激48h。利用微球双抗夹心法检测细胞培养上清中FAM19A4的浓度。结果显示,相比正常培养细胞,PMA处理后细胞培养上清中FAM19A4浓度升高,使用LPS活化后其浓度进一步升高(图4A)。该检测结果与RT-PCR方法在mRNA水平的检测结果一致(图4B)。
实施例5利用微球双抗体夹心法检测感染患者血清中FAM19A4的表达
发明人在临床中收集发热的菌血症患者及ICU的脓毒症休克患者血清,利用微球双抗体夹心法检测FAM19A4浓度,检测到在菌血症和脓毒症休克患者血清中均可检测到FAM19A4的表达上调,脓毒症休克患者表现的更为显著(如图5)。
实施例6利用微球双抗体夹心法检测自身免疫病患者血清、血浆或组织液中FAM19A4的表达
自身免疫病同样伴随免疫细胞活化、炎性因子升高等反应,但FAM19A4在患有系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)等自身免疫病患者血清或血浆中的表达与正常人相比无明显差异(如图6和7)。而相比血清及血浆,SLE患者的脑脊液和RA患者的关节液中能够检测到较高水平的FAM19A4(如图7)。
实施例7利用微球双抗体夹心法检测CLP术后小鼠血清中FAM19A4的表达
在雄性C57BL/6J小鼠中建立盲肠结扎穿孔(CLP)模型,模拟脓毒血症的发生,微球双抗体夹心法检测发现FAM19A4在CLP术后小鼠血清中表达明显上调(如图8)。
实施例8利用微球双抗体夹心法检测白色念珠菌感染的小鼠血清中FAM19A4的表达
在雌性C57BL/6J小鼠中建立了白色念珠菌感染模型,检测小鼠血清中FAM19A4的表达变化。结果显示,在5只系统性感染白色念珠菌的小鼠血清中,FAM19A4的表达随感染的进程逐渐增高,在感染后第5天达到高峰(如图9A),与感染前相比浓度升高达百万倍。通过免疫沉淀方法富集小鼠血清中的FAM19A4,经Western blot检测,证实白色念珠菌感染的小鼠血清中FAM19A4明显升高(如图9B)。
本申请的具体实施例仅用作对技术方案加以具体说明,不对本发明的保护范围作任何限制。本申请中所引用的现有技术文章,其以全文引用的方式并入本申请的记载。
Claims (1)
1.FAM19A4的抗体或特异性结合蛋白在制备疾病诊断试剂盒中的用途,所述疾病为菌血症、败血症或感染性休克。
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