MX2013001843A - Un metodo novedoso para el diagnostico de fiebre q usando una prueba inmunologica celular. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a un método para diagnosticar Fiebre Q en un sujeto, el método comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de dicho sujeto, (b) poner en contacto dicha muestra con una fuente de un antígeno Coxiella burnetii y (c) determinar el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? en dicha muestra al final de la etapa (b).

Description

UN MÉTODO NOVEDOSO PARA EL DIAGNÓSTICO DE FIEBRE Q USANDO UNA PRUEBA INMUNOLÓGICA CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un método para diagnosticar fiebre Q en un sujeto, usando la determinación de un nivel de expresión de citoquina pro-inflamatoria tal como interferón gamma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La fiebre Q es una infección sistémica causada por la bacteria intracelular Coxiella burnetii. La infección es común en animales, especialmente ganado, y se transmite a humanos principalmente a través de la ruta llevada por aire. La presentación de la enfermedad varia ampliamente, en un intervalo de infección asintomática, enfermedad febril aguda más frecuentemente con neumonía, fiebre Q complicada crónica (principalmente con endocarditis o infección vascular) y fatiga posterior a la fiebre Q.

Actualmente los Países Bajos enfrentan la epidemia más grande de fiebre Q, relacionada a las granjas de cabras. Desde 2007, se ha incrementado el número de casos ocurridos en humanos. El diagnóstico se basa en el historial de exposición, examen clínico y en PCR y serología. Debido a la dificultad del cultivo de Coxiella burnetii en el laboratorio, la variación en la respuesta del anticuerpo, y las dificultades para estandarizar la serología, el diagnóstico de laboratorio frecuentemente no es fácil. Algo de peso se le está dando a los anticuerpos dependientes de fase, donde los anticuerpos de la fase 1 se ven en la infección crónica y los anticuerpos de la fase 2 se relacionan a la infección aguda. Con experiencia acumulada en los casos complicados en la epidemia Holandesa actual, se ha experimentado que los resultados de la serología pueden ser ambiguos .

Si se diagnostica en la etapa aguda, la enfermedad puede curarse con un tiempo relativamente corto del antibiótico doxiciclina, pero la fiebre Q crónica es una infección mucho más difícil de tratar. La fiebre Q crónica tiene una tasa de mortandad alta. Una situación especial es la fiebre Q en el embarazo, en el cual el riesgo para el no nacido y la administración no están claros en su totalidad.

Un área especial donde la herramienta de diagnóstico es crítica es la vacunación de humanos con fiebre Q. Actualmente, los pacientes son seleccionados con serología y una prueba de piel, y sólo si ambos casos son negativos, la vacunación se considera un procedimiento seguro. La prueba de piel es laboriosa y difícil de realizar. Su especificidad y especificación son desconocidas.

Se necesita un método sensible y especifico para diagnosticar la fiebre Q en un sujeto, eludiendo todos los inconvenientes de los métodos existentes. Además, las pruebas actuales (con la posible excepción de la prueba de piel) no evalúan el estado de la inmunidad celular especifica, que se necesita para la cura de la infección.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: La sangre entera de los pacientes y controles se diluye 1:5 en RPMI y se expone a antigenos Coxiella burnetii por 48 horas. En el inmunoreactivo de sobrenadante se mide el Interferon gamma (IFNy). Los controles exhiben nivel básico de producción mientras que los pacientes con Fiebre Q crónica muestran una respuesta alta y los pacientes recuperados de fiebre Q no complicada muestran una respuesta intermedia .

Figura 2: La sangre entera de los individuos (n=1527) se diluye 1:5 en RPMI y se expone a Coxiella burnetii eliminada por calor por 24 horas. En el inmunoreactivo de sobrenadante se mide el Interferon gamma (IFNy) . Los controles (1181) exhiben nivel básico de producción mientras que los individuos (n=346) expuestos previo a Coxiella burnetii muestran una respuesta alta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Método de diagnóstico En un primer aspecto, la invención se relaciona a un método para diagnosticar la fiebre Q en un sujeto, el método comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra de dicho sujeto, (b) poner en contacto dicha muestra con una fuente de antigenos Coxiella burnetii y, (c) determinar el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria en dicha muestra al final de la etapa (b) .

Una citoquina pro-inflamatoria es una citoquina que es capaz de promover la inflamación sistémica. Una citoquina pro-inflamatoria se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de IL-?ß, o IFNy, IL-6, y IL-17. IFNy es una citoquina pro-inflamatoria en este contexto.

En el contexto de la invención, "Fiebre Q diagnosticada" significa preferiblemente que un diagnóstico se alcanza en: - Sujetos con infección de fiebre Q aguda - Sujetos con fiebre Q crónica - Sujetos con fatiga de posterior a la fiebre Q Los sujetos que han tenido infección de fiebre Q y por lo tanto no deben recibir la vacuna para la fiebre Q. Los sujetos que no han sido infectados con Coxiella burnetii no producirán estas citoquinas in vitro. Tan pronto como haya sido detectado un nivel detectable de una citoquina pro-inflamatoria en la etapa c) , la infección de fiebre Q aguda, fiebre Q crónica o fatiga de posterior a la fiebre Q hayan sido diagnosticadas en un sujeto.

En este contexto, la infección de fiebre Q aguda se refiere a la infección recientemente adquirida causada por Coxiella burnetii . "Recientemente" puede referirse a al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o más pero menos que 30 días.

En este contexto, la fiebre Q crónica se refiere a que la enfermedad causada por Coxiella burnetii existe desde 30 días o más.

En este contexto, la fatiga posterior a la fiebre Q se refiere a fatiga severa después de la infección causada por Coxiella burnetii .

Un síntoma/parámetro asociado con la infección de fiebre Q aguda es la fiebre, neumonía o hepatitis.

Un sujeto con la infección de fiebre Q aguda puede diagnosticarse usando el ensayo de la invención. Sin el deseo de que se enlace a ninguna teoría, se espera que pueda detectarse una respuesta de citoquina intermedia en tal sujeto. El ensayo es rápido y ha agregado valor sobre la serología actual.

Un sujeto con fiebre Q crónica puede diagnosticarse usando el ensayo de la invención. Sin el deseo de que se enlace a ninguna teoría, se espera que pueda detectarse una respuesta de citoquina más alta en este sujeto que en un sujeto con infección de fiebre Q aguda. El ensayo es rápido y ha agregado valor sobre la serología actual.

En el contexto de la invención, un sujeto puede ser un ser humano o un animal. El animal puede ser una cabra. El método de diagnóstico puede aplicarse tan frecuentemente como sea necesario en un sujeto. Si el sujeto es un ser humano, el sujeto puede ser una persona que se sospecha tiene un algo riesgo de tener fiebre Q crónica, por ejemplo debido al hecho de que este sujeto viva en una región en donde la fiebre Q es común tal como en los Países Bajos, Francia o Australia. En una modalidad, no se sabe si un sujeto ha sido infectado con la bacteria de Coxiella burnetii de la fiebre Q. Si el sujeto es un animal, por ejemplo, una cabra, la invención se usa para hacer el diagnóstico de infección causada por Coxiella burnetii en el animal. En una modalidad, un sujeto que se va a diagnosticar usando un método de la invención no ha sido vacunado con una vacuna contra la fiebre Q.

En un método preferido, la fiebre Q se diagnostica cuando la etapa (c) lleva al descubrimiento de un nivel de expresión detectable o incrementado de una citoquina pro-inflamatoria .

Opcionalmente en un método de la invención, se puede comparar el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria como se determina en la etapa (c) con un valor de referencia para dicho nivel de expresión, el valor de referencia preferiblemente siendo el valor promedio para dicho nivel de expresión en una muestra de control. En el contexto de la invención, "un valor de referencia" para el nivel de expresión de dicha citoquina es preferiblemente el valor promedio para dicho nivel de expresión en una muestra de control. Una muestra de control puede derivarse de un sujeto de control o de sujetos de control o del medio de cultivo para la etapa (b) . Un sujeto de control puede ser un sujeto que no viva en una región en riesgo o que no tenga contacto con animales. "Un valor de referencia" puede referirse a que el nivel de citoquina es detectable. La evaluación del nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria puede realizarse directamente en el nivel de expresión de proteina (cuantificando la cantidad de dicha proteina citoquina) , y/o indirectamente cuantificando la cantidad de una secuencia de nucleótido codificando para dicha citoquina pro-inflamatoria. Una secuencia preferida de ácido nucleótido que codifica IFN-? es como SEQ ID NO: 1. Una secuencia de aminoácidos IFN-? preferida correspondiente se da como SEQ ID NO: 2. La persona experta entenderá que es posible aislar isoformas múltiples de IFN-? dependiendo del sujeto o especie a tratarse.

En una modalidad preferida, IFN-? a cuantificarse tiene: - al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% identidad con SEQ ID NO:2 y/o - es codificada por una secuencia de ácidos nucleótidos que tiene al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% identidad con SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad preferida, una secuencia de ácidos nucleótidos que codifica IFN-? como una citoquina pro-inflamatoria (como se describe en la presente) para cuantificarse tiene: - al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% (identidad con SEQ ID NO: 1 y/o - codifica una secuencia de aminoácidos con IFN-? que tiene al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1.

Más adelante se define la identidad en la presente. La cuantificación de la cantidad de una secuencia de nucleótidos que codifica IFN-? y/u otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente se realiza preferiblemente usando técnicas clásicas de biología molecular tal como PCR (tiempo real), formaciones o análisis northern. En esta modalidad, una secuencia de nucleótidos que codifica IFN-? (y/u otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente se refiere a un ARN mensajero (mARN) . Alternativamente, de acuerdo a otra modalidad preferida, en el método de diagnóstico del nivel de expresión de IFN-? y/u otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente se determina directamente cuantificando la cantidad de IFN-? y/u otra citoquina pro-inflamatoria. La cuantificación de la cantidad de polipéptido puede llevarse a cabo por cualquier técnica conocida. Preferiblemente, una cantidad de polipéptido se cuantifica usando una molécula que enlaza específicamente IFN-? (y/o a otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente) . Las moléculas de enlace preferidas se seleccionan de: un anticuerpo, que ha sido específicamente producido para reconocer IFN-? (y/o a otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente), cualquier otra molécula que se conozca porque enlaza específicamente IFN-? (y/o a otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente) . Dicho anticuerpo podría usarse en un inmunoensayo conocido para un experto en la técnica tal como el western blotting, o ELISA (Ensayo inmunosorbente ligado a la enzima) o FACS (Clasificación de célula activada por fluorescencia) usando perlas de látex. La preparación de un anticuerpo es conocida por aquellos expertos en la técnica. Una explicación corta de los métodos que podrían usarse para preparar anticuerpos se da más adelante en la presente. En el contexto de la invención, cualquier molécula conocida para enlazar IFN-? (y/o a otra citoquina pro-inflamatoria como se describe en la presente) puede ser un ácido nucleico, por ejemplo una región regulatoria de ADN, un polipéptido, un metabolito, un sustrato, un elemento regulatorio, un componente estructural, una molécula (transporte) chaperona, un imitador péptido, un imitador no péptido, o cualquier otro tipo de ligando. El imitador se define más adelante en la presente. Los ejemplos de las moléculas conocidas para enlazar a citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?, incluyen un receptor de dicha citoquina pro-inflamatoria tal como el receptor IFN-?, un anticuerpo dirigido contra dicha citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?. El enlace de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? a una segunda molécula de enlace puede detectarse por medio de métodos estándar conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los métodos idóneos incluyen ensayos de co-electroforesis de cromatografía de afinidad (ACE) y ELISA. La persona experta entenderá que alternativamente o en combinación con la cuantificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? y/o un polipéptido correspondiente, la cuantificación de un sustrato de un polipéptido correspondiente o de cualquier compuesto conocido que se asocie con una función o actividad de un polipéptido correspondiente o la cuantificación de una función o actividad de un polipéptido correspondiente usando un ensayo especifico se abraca dentro del enfoque del método de diagnóstico de la invención. Por ejemplo, la trans-activación de un gen objetivo por una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? o una molécula que es capaz de enlazar a una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?- (es decir una molécula de enlace IFN-?-) puede determinarse y cuantificarse, por ejemplo, en un ensayo de transfección trasnsitoria en el cual el promotor del gen objetivo está ligado a un gen reportero, por ejemplo, P-galactosidasa o luciferasa. Tales evaluaciones pueden hacerse in vitro o in vivo o ex vivo.

En un método de la invención, se usa una muestra de un sujeto. Un método de la invención es por lo tanto un método in vitro o ex vivo. Una muestra preferiblemente comprende o consiste de un fluido obtenido de un sujeto. Más preferiblemente, un fluido comprende o consiste de o se selecciona de: orina, sangre, fluido de la médula espinal, saliva, semen, o lavado broncoalveola . Un fluido preferido es, comprende, consiste de o se deriva de la sangre. La sangre puede diluirse antes de usarse de forma adicional. La dilución puede ser 1:4, 1:5 o 1:6 en medio de cultivo o una solución amortiguadora.

En un método de la invención, dicha muestra obtenida de la etapa (a) es subsecuentemente conectada con una fuente de un antigeno Coxiella burnetii . La elección del antigeno depende de las cepas Coxiella burnetii prevalentes en diferentes áreas del mundo. El contacto puede tener una duración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 24, 30, 48, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 100, 110 horas, o más. Preferiblemente el contacto tiene una duración de 4-96 horas. Esta etapa de contacto puede ser una etapa de cultivo en un medio de cultivo tal como RPMI 1640.

Una fuente de antigeno Coxiella burnetii puede referirse a que se está usando una célula Coxiella burnetii completa. En una modalidad preferida, una célula Coxiella burnetii completa se inactiva con calor o se fija con formalina. La inactivación por calor podría remplazarse con eliminación por calor. La persona experta sabe cómo obtener células Coxiella burnetii inactivadas por calor o fijadas con formalina. Las células inactivadas por calor se preparan calentando preferiblemente a 95, 96, 97, 98 o 99°C por 20, 25 o 30 minutos. Más preferiblemente las células inactivadas por calor se preparan calentando a 99°C por 30 minutos. Las células fijadas con formalina pueden obtenerse poniendo en contacto las células con formaldehido por 40, 50, 60 minutos.

Más preferiblemente, las células se ponen en contacto o se transfieren a formaldehído al 4% por una hora. Subsecuentemente las células se lavan varias veces con solución amortiguadora PBS (Solución Salina Amortiguada en Fosfato) . Alternativamente, puede usarse parte de una célula Coxiella burnetii . Una parte de una célula Coxiella burnetii es preferiblemente una parte antigénica de la misma; que comprende o consiste de un antigeno. Un antigeno puede ser una proteina, una digestión de la proteina y/o un fragmento de la misma, que puede estar en una forma purificada o puede estar comprendida dentro de una composición cruda, preferiblemente de origen biológico, tal como un lisado, sonicado o fijado de Coxiella burnetii. Alternativamente, un antigeno puede sintetizarse químicamente o producirse enzimáticamente in vitro. La fuente de una proteína, o fragmento de la misma como un antígeno, también puede ser un ácido nucleico que lo codifica, o fragmento del mismo, de una plantilla de ARN o ADN. En una modalidad preferida, una fuente de un antígeno Coxiella burnetii es una célula Coxiella burnetii completa o un antígeno de dicha célula. El uso de una célula Coxiella burnetii completa es atractivo y preferido antes del uso de una parte de una célula Coxiella burnetii por al menos dos razones. El uso de una célula Coxiella burnetii completa es más fácil y más económico para la persona experta. No hay necesidad de identificar y sintetizar subsecuentemente las partes idóneas (es decir partes antigénicas) de una célula Coxiella burnetii. Además, usando una célula Coxiella burnetii completa, toda la parte idónea potencial (es decir todos los antigenos) de una célula Coxiella burnetii está presente. El método de diagnóstico por lo tanto se espera sea mucho más sensible y eficiente que un método de diagnóstico correspondiente llevado a cabo usando un antigeno dado. Se obtuvieron resultados muy prometedores usando célula Coxiella burnetii completa inactivada por calor (figura 2 ) .

Subsecuentemente, el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? se determina en dicha muestra al final de la etapa de contacto de la etapa (b) . En una modalidad preferida, al final de la etapa de contacto, el sobrenadante se aisla por centrifugación y la secuencia de nucleótido o la proteina de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? es determinada por una persona experta usando métodos conocidos. La centrifugación puede ser a 1200 rpm a 4°C. Alternativamente, se puede agregar un detergente a la muestra al final de la etapa b) . Podrían usarse muchos detergentes tal como Tritón X al 0.1 %. Agregar detergente es atractivo ya que se espera que no se necesite etapa de centrifugación. Se puede determinar el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria en la muestra que comprende dicho detergente, que también es llamado un lisado celular.

En un método de diagnóstico más preferido, la fiebre Q se diagnostica cuando la expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? es detectable o se detecta y opcionalmente cuando la comparación lleva al descubrimiento de una expresión detectable de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? y/o un incremento en su nivel de expresión. En sujetos de control y en muestras de control como se definió antes, IFN-? (y cualquier otra citoquina pro-inflamatoria) generalmente no es detectable.

La detección de la expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? o un incremento de su nivel de expresión y/o un incremento o una detección del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? (o nivel de estado sólido de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?) es preferiblemente definido como que es un nivel de expresión detectable o un cambio detectable de nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? y/o de una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? (o nivel de estado sólido de la citoquina pro-inflamatoria codificada tal como IFN-? o cualquier otra actividad detectable de la misma o cambio detectable en una actividad biológica de la misma) usando un método como se definió previamente comparado al nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? y/o de una secuencias de nucleótidos correspondiente (o nivel del estado sólido de la citoquina pro-inflamatoria codificada correspondiente tal como IFN-?) en un sujeto de control o en un control. De acuerdo a una modalidad preferida, la detección de un incremento o una actividad de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? se cuantifican usando un ensayo de mARN especifico para el gen que codifica dicha citoquina pro-inflamatoria tal como lFN-? como se definió anteriormente en la presente. Preferiblemente, un incremento del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? se refiere a un incremento de al menos 5% del nivel de expresión de dicha secuencia de nucleótidos usando PCR. Los cebadores preferidos que se usaron para PCR se identifican como Cebador Delantero 5' -CTCTTGGCTGTTACTGCCAGG-3' (SEQ ID N0:3); y Cebador Inverso 5 ' -CTCCACACTCTTTTGGATGCT-3 ' (SEQ ID N0:4). Más preferiblemente, un incremento del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos se refiere a un incremento de al menos 10%, incluso más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150%, o más.

Preferiblemente, un incremento del nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? se refiere a un incremento de al menos 5% del nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? usando western blotting y/o usando ELISA o un ensayo idóneo. Más preferiblemente, un incremento del nivel de expresión de un polipéptido se refiere a un incremento de al menos 10%, incluso más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150%, o más.

Preferiblemente, un incremento de una actividad de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? se refiere a un incremento de al menos 5% de la actividad del polipéptido usando un ensayo idóneo. Más preferiblemente, un incremento de la actividad de polipétido se refiere a un incremento de al menos 10%, incluso más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos -150% o más.

En un método de diagnóstico más preferido, la fiebre Q se diagnostica cuando la detección o comparación lleva a encontrar un nivel detectable o un incremento del nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? o un incremento o detección del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?, dicha detección o incremento siendo detectado en el nivel de la secuencia de aminoácidos de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?, más preferiblemente un incremento de al menos 5% del nivel de expresión de dicha citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? usando ELISA como se definió en la presente.

El método de la invención es atractivo ya que el diagnóstico se alcanza con más certeza. Además, este método es no invasivo, sencillo, reproducible, sensible, especifico, y eficiente en costo y tiempo.

Dispositivo de ensayo En un segundo aspecto, se proporciona un dispositivo de ensayo para diagnóstico de fiebre Q en un sujeto, en donde dicho dispositivo comprende una molécula que enlaza específicamente a citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?. Este dispositivo puede usarse en un método de diagnóstico de la invención. Cualquier sujeto o médico podría usar este dispositivo en casa/oficina, repetir el uso de tal dispositivo tanto como sea necesario.

El tipo de moléculas que se conoce enlazan específicamente a citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? ya han sido descritas anteriormente en la presente. En una modalidad preferida, una molécula que específicamente enlaza una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? y que está presente en el dispositivo es un anticuerpo.

En una modalidad preferida, un dispositivo de ensayo es una tira de prueba de flujo lateral también conocida como varilla, preferiblemente, aunque no necesariamente, encerrada en una cápsula, diseñada para ser leída por un sujeto, y el ensayo es un inmunoensayo intercalado. Tales dispositivos están impregnados con reactivos que específicamente indican la presencia de una molécula dada, aquí una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? al cambiar de color bajo contacto con una muestra. Las muestras preferidas del sujeto ya han sido definidas en la presente. Un anticuerpo es preferiblemente etiquetado por conjugación a una etiqueta físicamente detectable, y durante el contacto con una muestra que contiene una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? forma un complejo. Dicho complejo de anticuerpo-citoquina pro-inflamatoria, tal complejo anticuerpo-IFN-? entonces se pone en contacto con un segundo anticuerpo, que reconoce dicho primer anticuerpo y que se inmoviliza sobre un soporte sólido dentro del dispositivo. Un segundo anticuerpo captura dicho complejo de anticuerpo-citoquina pro-inflamatoria o complejo anticuerpo-IFN-? para formar un complejo intercalado anticuerpo-citoquina pro-inflamatoria-anticuerpo o un complejo intercalado anticuerpo-IFN-y-complej o, y el complejo resultante, que se inmoviliza sobre el soporte sólido, es detectable por virtud de la etiqueta. Una tira de prueba puede entonces insertarse en un lector, donde se mide una señal de dicha etiqueta en el complejo. Alternativamente, una tira de prueba podría insertarse en el lector previo a la adición de la muestra. Alternativamente y de acuerdo a una modalidad preferida, la presencia de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? es visualizada por un sujeto como un cambio de color de al menos una parte del dispositivo. Las tiras de inmersión usualmente están hechas de papel o cartón. Usualmente están presentes moléculas adicionales en un dispositivo como control negativo o positivo. Un control positivo típico podría ser un anticuerpo que reconoce una molécula que se sabe está presente en una muestra a probarse. Un control negativo típico podría ser un anticuerpo que reconoce una molécula que se sabe está ausente en una muestra a probarse.

Identidad de secuencia La "identidad de secuencia" se define en la presente como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótido ) , como se determina comparando las secuencias. La identidad entre las secuencias de dos aminoácidos o dos ácidos nucleicos es preferiblemente definida evaluando su identidad dentro de una SEQ ID NO entera como se identifica en la presente o parte de la misma. Parte de la misma puede referirse a al menos 50% de la longitud de la SEQ ID NO, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%.

En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según pueda ser el caso, como se determinó por la combinación de las hebras de tales secuencias. La "similitud" entre las dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos, incluyendo pero no limitando a aquellos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M . , ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M . , and Griffin, H. G.r eds .,' Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. , Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., and Lipraan, D., SIAM J. Applied Math. , 48: 1073 (1988).

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñaan para dar la combinación más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos preferidos de programas de computadora para determinar la identidad y similitud entre las dos secuencias incluyen por ejemplo el pagúete del programa GCG (Devereux, J. , et al, Nucleic Acids Research 12 (1) : 387 (1984) ) , BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa BLAST X está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El algoritmo bien conocido Smith Waterman también puede usarse para determinar la identidad.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89: 10915-10919 (1992); Penalización de espacio: 12; y Penalización de longitud de espacio: 4. Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa "Ogap" de Genetics Computer Group, ubicado en Madison, I. Los parámetros arriba mencionados son los parámetros por omisión para comparaciones de aminoácidos (junto con ninguna penalización para espaciados finales) .

Los parámetros preferidos para comparación de ácidos nucleótidos incluyen lo siguiente: Algoritmo: Needleman and unsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: coincidencias=+10 , no coincidencias=0 ; penalización de espaciado: 50; penalización de longitud de espaciado: 3. Disponible como el programa de espaciado de Genetics Computer Group, ubicado en Madison, Wis. Arriba se dan los parámetros por omisión para las comparaciones de ácidos nucleicos.

Opcionalmente , en la determinación de la similitud del grado de aminoácidos, la persona experta también puede tomar en consideración las tan llamadas sustituciones de aminoácidos "conservadores", como estará claro para una persona experta. Las sustituciones de ácidos conservadores se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteina y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina , lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina . Las variantes sustitucionales de la secuencia de aminoácidos descritos en la presente son aquellos en los cuales al menos un residuo en las secuencias descritas ha sido removido y un residuo diferente insertado en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos que ocurren de manera natural son como siguen: Ala a Ser; Arg a Lys; Asn a Gin a His; Asp a Glu; Cys a Ser a Ala; Gin a Asn; Glu a Asp; Gly a Pro; His a Asn a Gin; He a Leu a Val; Leu a He a Val; Lys a Arg, Gin a Glu; Met a Leu a He; Phe a Met, Leu a Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp a Phe; y Val a He o Leu.

Anticuerpos Algunos aspectos de la invención se refieren al uso de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que específicamente enlaza a una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?. Los métodos para generar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que específicamente enlazan a un polipéptido se describen en por ejemplo Harlow and Lañe (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y WO 91/19818; WO 91/18989; WO 92/01047; WO 92/06204; WO 92/18619; y E.U.A. 6,420,113 y las referencias citadas allí dentro. El término "enlace específico" como se usa en la presente, incluye tanto enlace específico de afinidad alta como de afinidad baja. El enlace específico puede exhibirse, por ejemplo, por medio de un anticuerpo de afinidad o fragmento de anticuerpo que tenga un Kd de al menos aproximadamente 10~4 M. El enlace específico también puede exhibirse por un anticuerpo de afinidad alta o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tenga un Kd de al menos aproximadamente de 10"7 M, al menos aproximadamente 10"8 M, al menos aproximadamente 10"9 M, al menos aproximadamente 10"10 M, o pueda tener un Kd de al menos aproximadamente 10"11 M o 10"12 M o más grande.

General En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitante para referirse a que los artículos seguidos de la palabra están incluidos, pero los artículos no específicamente mencionados no están excluidos. Además el verbo "consistir" puede remplazarse por "consistir esencialmente de" refiriéndose a que un método o dispositivo de ensayo como se definió en la presente puede comprender etapa (s) adicional, respectivamente componente ( s ) que los identificados específicamente, dicha etapa (s) adicional, respectivamente componente (s) no alteran la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "uno" de este modo usualmente se refiere "al menos uno". Todas las referencias de patentes y bibliografía citadas en la presente especificación se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el enfoque de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplo Método Las muestras de sangre se tomaron de pacientes e individuos saludables en tubos vacutainer EDTA (Becton and Dickinson, Leiden, Países Bajos). De estas muestras 200 µ? se diluyeron 1:5 en medio de cultivo (RPMI 1640) y se incubaron en 24 pozos de placas de cultivo de tejido (Costar, Badhoevedorp, Países Bajos) . Como un estímulo, 100 ng/ml de inactivado por formaldehido (es decir fijado con formaldehido) Coxiella burnetii fase 1 cepa Henzerling (CSL limitado, Australia) se agregaron a estos cultivos (fig. 1). Las células inactivadas por formaldehido se preparan transfiriéndolas e incubándolas con 4% de formaldehido por una hora. Subsecuentemente las células se lavaron muchas veces con PBS. No se agregó estímulo a los cultivos de control. Los cultivos se incubaron a 37 °C y 5% C02 por 48 horas. Cepa de 9 millas Coxiella burnetii eliminada por calor o inactivada por calor (CVI, Lelystad, Países Bajos) se usó en el segundo estudio (fig. 2). Protocolo idéntico, excepto 24 horas de incubación. Las células inactivadas por calor se prepararon calentándolas a 99°C por 30 minutos.

Después de este periodo de incubación, los sobrenadantes se cosecharon y se centrifugaron a 15000g por 5 minutos, y después de esto se almacenaron a -20 °C hasta la medición del interferon ? (IFNy) . IFN ? se midió usando un ELISA especifico (Pelikine Sanquin, Amsterdam, Países Bajos).

Resultados En cultivos sin estimulación no se encontró IFNy detectable como fue el caso en controles no infectados expuestos a antígenos Coxiella in vitro.

Los pacientes con Fiebre Q crónica activa (endocarditis, infección vascular) , actualmente siendo tratados con antibióticos mostraron altas concentraciones de IFNy (Fig 1). Los pacientes que se recuperaron de fiebre Q aguda no complicada mostraron una respuesta inmediata (Fig 1).

En un segundo estudio un cohorte grande de individuos (n= 1527) se seleccionó antes de la vacunación. Estos individuos vivieron en una región con riesgo de alta exposición a Coxiella burnetii. Después de la selección los niveles IFN-? se correlacionaron con prueba de piel positiva de serología para Coxiella burnetii. Los individuos (n=346) que han sido expuestos antes a Coxiella burnetii exhiben una producción alta de IFN-? (Fig 2) . Esto en contrate a individuos que no tuvieron prueba de serología o piel positiva (Fig 2 ) . 2 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly lie Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys lie Met Gln Ser Gln lie Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser lie Gln Lys Ser Val Glu Thr lie 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala lie His Glu Leu lie Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln 165 <210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador <400> 3 ctcttggctg ttactgccag g 21 <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador <400> 4 ctccacactc ttttggatgc t 21

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar Fiebre Q en un sujeto, el método caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de dicho sujeto, (b) poner en contacto dicha muestra con una fuente de un antigeno Coxiella burnetii y (c) determinar el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?, en dicha muestra al final de la etapa (b) .

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fiebre Q se diagnostica cuando la etapa (c) lleva a descubrir un nivel de expresión detectable o un incremento del nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el nivel de expresión de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? se determina directamente cuantificando la cantidad de una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? y/o indirectamente cuantificando la cantidad de una secuencia de nucleótidos codificando una citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?.

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha fuente de un antigeno Coxiella burnetii es una célula Coxiella burnetii entera inactivada por calor o fijada con formalina.

5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque ha sido diagnosticada la infección por fiebre Q aguda, Fiebre Q crónica o fatiga post Fiebre Q.

6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho sujeto no ha sido vacunado con una vacuna contra la fiebre Q.

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la muestra es un fluido obtenido del sujeto.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el fluido se selecciona de sangre o fluido de médula espinal.

9. Un dispositivo de ensayo para el diagnóstico de fiebre Q en un sujeto, caracterizado porque el dispositivo comprende molécula que específicamente enlaza a citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-?.

10. Un dispositivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula que específicamente enlaza a citoquina pro-inflamatoria tal como IFN-? es un anticuerpo .

11. Un dispositivo de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque el dispositivo es una tira de prueba de flujo lateral.