JP5925184B2

JP5925184B2 - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染と関連した患者状況のｉｎｖｉｔｒｏ迅速判定法

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Publication number: JP5925184B2
Application number: JP2013500451A
Authority: JP
Inventors: フェルディナントヘルマンバールマン; フリゼール、ダニーロ; ゼスター、マルティナ; ゼスター、ウルバン
Original assignee: ロフィウスバイオサイエンスゲーエムベーハー
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-21
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2031-03-21
Also published as: KR20130029063A; US20150099652A1; MD20120084A2; BR112012023678A2; US20130122523A1; ZA201206950B; AU2011228996B2; SG184103A1; MX2012010720A; CL2012002542A1; AU2011228996A1; CA2793151A1; CA2793151C; JP2013522637A; EP2548019A1; CO6640286A2; WO2011113953A1; RU2012144417A; CU20120141A7; US9476877B2

Description

本発明は、全血からＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の感染状況を迅速判定するためのｉｎｖｉｔｒｏ法に関する。

結核（ＴＢＣ）は、致命的な感染症の世界的統計において上位を占めており、約５〜１０％のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染者のみが生涯に結核を発症することになる（図１）。この疾患は、検査診断による病原体の直接検出により臨床的に確認される。皮膚試験または免疫学的試験による間接的検出では、この疾患の臨床診断を十分に行うことができない。したがって、現在利用可能な診断検査では、結核感染が疑われる患者の感染状況に関して、短期、すなわち数時間以内に信頼できる情報を得ることは技術的に不可能である。

結核の診断は、培養による病原体検出が利用可能であれば確実となる。しかし、これが容易に行えるのは、結核性の組織変化が気管支系、輸出尿路（ｅｆｆｅｒｅｎｔｕｒｉｎａｒｙｔｒａｃｔ）または腸と関連しており、排出され得る場合のみである。それ以外の場合は、針穿刺による材料入手、または試料採取による直接的な材料入手を試みることができる。これらの場合、従来の固形培地上ではＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの増殖が遅いため、結果を得るために４〜６週間待つ必要があり、また液体培養では、最新のマイコバクテリア増殖検出法を用いて、既に約２週間後には検出が可能な場合がある。

皮膚試験または免疫学的検出による間接的な検出、例えばＭｅｎｄｅｌ−Ｍａｎｔｏｕｘ皮内ツベルクリン検査では、所定量のマイコバクテリア由来精製濾過抗原（ツベルクリン）を表皮に注射する。試験対象者の免疫系がマイコバクテリアと以前接触したことがある場合、当該部位で３日以内に防御細胞の皮膚への移動を伴う防御反応が起こり、腫脹が生じる。これはクームス（Ｃｏｏｍｂｓ）によるＩＶ型反応である。この試験では、早ければＴＢＣ感染後６週間で陽性となる場合がある。試験部位において触知可能な硬結は、陽性反応と見なされる。これは、結核感染が起こったことを意味し得る。しかし、この試験では疾患の存在については分からない。陽性試験反応は、結核ワクチン接種後にも起こり得る。試験部位で皮膚が変化しないか、または発疹だけが見られる場合、結果は陰性であると見なされる。この場合、結核感染は高確率で排除される。

結論として、皮内ツベルクリン検査は極めて限定的にしか信頼できない。一方では粟粒結核または免疫抑制などのまさに深刻な経過において陰性のままである場合があり、他方では過去のワクチン接種または非定型マイコバクテリアとの接触により偽陽性反応が引き起こされる。

他の可能な診断法として、免疫学的試験法、いわゆるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）試験も２００５年より利用できるようになった。この試験では、血液由来の防御細胞が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原混合物で刺激される。これらの細胞が結核感染により病原体と以前に接触したことがある場合は、これらの細胞が生成するメッセンジャーＩＦＮ−γ量が増加する。ＩＦＮ−γ量は、細胞上清中で決定することができ、感染対象者の血液試料においては、同時に行われることになる陰性対照のレベルと比べ明らかに高いレベルとなる。刺激には、抗原であるＥＳＡＴ−６（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｇｅｔ）、ＣＦＰ−１０（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＴｂ７．７が用いられる。これらは感染初期に形成され、いわゆる非結核性マイコバクテリアの大部分、またはＢＣＧワクチン接種に使用されるマイコバクテリアのワクチン株によっては産生されない。これにより、真性結核感染と非定型マイコバクテリアによる感染またはワクチン接種により獲得された免疫との間の試験の極めて高い特異性が説明される。ＩＦＮ−γ試験のための２種類の試験系、すなわち、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ産生を検出する、Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ社のＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ（登録商標）ＧｏｌｄＩｎ−Ｔｕｂｅ、およびＩＦＮ−γ産生に加えてＥｌｉｓｐｏｔによって産生するＴリンパ球の数も検出する、ＯｘｆｏｒｄＩｍｍｕｎｏｔｅｃ社のＴ．ＳＰＯＴ．ＴＢ試験が、現在欧州連合において認可されている。両試験においては、血液（ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ（登録商標）ＧｏｌｄＩｎ−Ｔｕｂｅ）または単離単核血液細胞（Ｔ．ＳＰＯＴ．ＴＢ）を抗原とともに２０時間インキュベートする必要があるため、試験結果が得られるのは早くても翌日になる。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとの過去の接触に対するこれら試験の感度は、複数の研究において８２〜１００％であると記載されており、低リスク対照における特異性は９８％であると記載されている。しかし、この試験の成績には、実際面では困難性と不確実性が関連している。インキュベーションの時間枠、および３７℃の一定温度が必要であることにより誤差が生じ、検査室における方法自体に経験が必要であることによっても同様に誤差が生じる。したがって、実際は、感度および特異性について記載された値には全く届かない。感度または特異性が１００％を下回る全ての試験方法と同様に、その有意性は真性感染の有病率とともに減少する。したがって、これらのｉｎｖｉｔｒｏ試験は有病率が低い集団または職業グループに対する適用にも向いていない。

ＭａｒｃｉａＶａｌｅｒｉａＢ．Ｓ．Ｍａｒｔｉｎｓらは、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（２００７）８７、２０２−２１１において、血中のＰＰＤ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルにより、ＰＰＤに対するｉｎｖｉｖｏ応答が予測されることを報告した。ＵｍａＤｅｖｉＲａｎｇａｎａｔｈａｎらは、Ｖａｃｃｉｎｅ２８（２０１０）、１５２−１６１において、ＨＩＶ１型ＥｎｖおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を新生仔マウスにおいて引き起こす、アポトーシス促進性組換えＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについて開示した。ＳｔｅｆａｎＷｉｎｋｌｅｒらは、ＭｉｃｒｏｂｅｓａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｎ７（２００５）１１６１−１１６９において、中央アフリカの活動性肺結核患者における特異的なＴ細胞サイトカイン応答の増加について報告した。ＣｏｒｉｎｅＢｒｏｎｋｅらは、Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６６、９５０−９６１（２００５）において、ＨＬＡ−ＤＲ３拘束性のサイトメガロウイルス特異的およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の直接的なＥｘＶｉｖｏ検出について発表した。ＶｅｒｎｏｎＣ．ＭａｉｎｏおよびＬｏｕｉｓＰｉｃｋｅｒは、フローサイトメトリーによるサイトカイン発現の細胞内検出について記載した（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ３４：２０７−２１５（１９９８））。Ｔ．Ｍｅｉｅｒらは、ＥｕｒＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔＤｉｓ（２００５）２４：５２９−５３６において、臨床診療における新規市販酵素結合イムノスポットアッセイ（ＴＳＰＯＴ−ＴＢ）の結核診断に対する感度について報告した。ＨｏｌｄｅｎＴ．Ｍａｅｃｋｅｒらは、ＢＭＣＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２００５、６：１３において、サイトカインフローサイトメトリーアッセイの標準化について報告した。ＭａｒｉａＡ．Ｓｕｎｉらは、フローサイトメトリーによる、全血における抗原特異的Ｔ細胞サイトカイン発現の検出を開示した（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２１２（１９９８）８９−９８）。ＳｔｒｅｉｔｚＭらは、ＢＣＧワクチン接種集団において、ツベルクリン特異的Ｔ細胞応答の診断特異性が低いことを報告した。サブユニット抗原（例えば、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０）に基づく試験は、結核の潜伏感染の診断に有用ではあるが、活動性肺結核に対する信頼できる免疫学的検査は存在しない。注目すべきことに、既存の全ての免疫学的結核検査は、Ｔ細胞応答の大きさに基づくものであるが、Ｔ細胞応答の質の診断の可能性については今まで調査されてこなかった。これには、マイコバクテリア抗原特異的Ｔ細胞の表面マーカーの発現および官能性が含まれる（（２００７）ＬｏｓｓｏｆＲｅｃｅｐｔｏｒｏｎＴｕｂｅｒｃｕｌｉｎ−ＲｅａｃｔｉｖｅＴ−ＣｅｌｌｓＭａｒｋｓＡｃｔｉｖｅＰｕｌｍｏｎａｒｙｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ２（８）：ｅ７３５ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００００７３５）。

国際公開第２００８／１１３１１９号には、対象者から採取された少量の未希釈全血において細胞性免疫（ＣＭＩ）の測定を行うための方法およびキットが開示されている。具体的には、例えば５０μＬ〜５００μＬの容量の未希釈全血試料における反応を測定する方法である。したがって、小児、成人または高齢のヒト対象者を含めた対象者における、キャピラリー採取および迅速検査が容易になる。

米国特許出願公開第２００１／０００６７８９号には、かつてないほどの明瞭さで抗原特異的Ｔ細胞の定量および特性の評価を行うための新規アプローチが、これは重要なことに全血で行われるため、臨床免疫検査室における日常的な使用に適していることが開示されている。この方法によれば、単一の全血培養物から、複数のサイトカインを発現する複数のＴ細胞サブセットを同時に測定することができる、改良された、全血におけるサイトメトリックな細胞内サイトカインアッセイが提供される。全血における抗原特異的サイトカイン応答の評価には、天然試料中に存在する全てのタイプのＭＨＣ自己抗原提示細胞の存在下でＴ細胞の活性化が評価されるという重要な利点がある。また、薬剤の存在下で培養を行うか、または薬剤を投与されているヒトもしくは動物の血液を分析することによって、抗原などの特定刺激に対するＴ細胞の応答についての全身環境の効果（すなわち薬剤による増強または抑制）を反映し得る培養系（全血）が可能になるという利点もある。

本発明の目的は、従来技術の欠点を回避する方法であって、迅速で信頼性があり、さらに急性感染と潜伏感染との区別を可能とする診断法を提供することである。

この目的は、活動性結核または潜伏結核に関してＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の感染状況を全血から迅速判定するためのｉｎｖｉｔｒｏ法によって達成され、該方法は以下のステップを含む。
・全血の第１試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ４９ｄ抗体の存在下で精製ツベルクリン（ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（ＰＰＤ）を用いて刺激するステップ；
・１．５時間〜２．５時間、特に２時間、３５℃〜３９℃、特に３７℃で、任意にＣＯ_２を添加してインキュベートすることによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりＰＰＤをプロセシングするステップ；
・次いで分泌阻害剤を添加するステップ；
・強く攪拌するステップ；および
・少なくとも２．５時間、３５℃〜３９℃の温度でさらにインキュベートするステップ、ならびに
・抗原特異的Ｔ細胞の細胞内ＩＦＮ−γ産生および細胞内ＩＬ−２産生の両者からサイトカインプロファイルを決定するステップであって；
・活動性結核の存在が、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性Ｔ細胞の減少を伴う、前記サイトカインプロファイルのＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトによって示されるステップ。

本発明の方法のある実施形態においては、ＰＰＤによる前記刺激に加え、ＰＢＳ、ＳＥＢ、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０および／またはワクチン抗原によりさらに刺激を行ってよい。これは、抗原特異的細胞が存在する場合、これらがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとの接触によるものであるのか、非結核性マイコバクテリアとの接触によるものであるのか、またはワクチン応答によるものであるのかを決定するために行うことができる。

本発明の別の実施形態においては、バッファー、特に、例えばＰＢＳ０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコースなどの生理学的に許容されるバッファーを、前記第１試料とオーセンティックな（「〜とオーセンティック」とは、「〜と同一の供給源に由来する」ことを意味する）第２試料の全血中に存在する抗原特異的細胞に添加することによって、陰性対照が行われる。

本発明の別の実施形態においては、前記第１試料とオーセンティックな第３試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にＳＥＢを添加することによって、陽性対照を行うことができる。

ある実施形態においては、前記第１試料とオーセンティックな第４試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、ＥＳＡＴ−６（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｇｅｔ）およびＣＦＰ−１０（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ）を添加することによって、ワクチン対照、具体的には、ＢＣＧワクチン対照を行うことができる。あるいは、前記第１試料とオーセンティックな第４試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、ＥＳＡＴ−６（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｇｅｔ）およびＣＦＰ−１０（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ）を添加することによって、全血ドナーにおいて非結核性マイコバクテリアとの接触が起こったか否かについての対照を行うことが出来る。

別の実施形態においては、前記第１試料とオーセンティックな第５試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にワクチン抗原を添加することによって、ワクチン対照を行うことができる。

本発明の方法のさらに別の実施形態においては、前記分泌阻害剤は、ブレフェルジンＡまたはモネンシンなどからなる群より選択される。

本発明によれば、前記サイトカインプロファイルの決定は、フローサイトメトリーなどの適切な方法によって行われる。

本発明の方法は、ヒト全血試料または動物全血試料に適用することができる。

本発明の方法は、特に、活動性ＴＢ患者と密接な接触のある個人または活動性ＴＢ患者と密接な接触を持ったことが疑われる個人から全血が採取される、接触者追跡調査に適用される。さらに、本発明の診断検査の結果に応じ、以下のように治療決定または治療計画が定められる。
ａ．前記サイトカインプロファイルにおいて、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞の減少を伴う、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトが検出された場合、ＩＮＨなどの予防、または４剤併用などの積極的治療が適応される。
ｂ１．診断検査においてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、以前の検査に関する情報が得られない場合、緊急の治療は不要であり、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｂ２．診断検査においてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染に対する以前の検査でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとこれまでに接触していないことが明らかになっていた場合、ＩＮＨ療法などの予防が適応される。
ｃ１．患者が応答を示さない場合、緊急の治療は不要である。
ｃ２．患者が何らかの臨床症状を示す場合、再検査が適応される。

本発明の方法はさらに、免疫抑制剤を投与される前の個人またはＨＩＶ感染などの免疫機能不全状態にある個人から採取された全血を検査するために用いることができる。本発明の診断検査の結果に応じ、以下のように治療決定または治療計画が定められる。
ａ．前記サイトカインプロファイルにおいて、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞の減少を伴う、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトが検出された場合、ＩＮＨなどの予防、または４剤併用などの積極的治療、および任意に免疫抑制療法の先送りが適応される。
ｂ１．診断検査においてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、以前の検査に関する情報が得られない場合、免疫抑制療法が可能であり、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｂ２．診断検査においてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染に対する以前の検査でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとこれまでに接触していないことが明らかになっていた場合、ＩＮＨ療法などの予防、および任意に免疫抑制療法の先送りが適応され、さらに２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｃ１．患者が応答を示さない場合、免疫療法の開始が予定される。
ｃ２．患者が何らかの臨床症状を示す場合、再検査が適応される。

本発明の方法はさらに、活動性ＴＢ感染が疑われる個人から採取された全血を検査するために用いることができる。

本発明の診断検査の結果に応じ、以下のように治療決定または治療計画が定められる。
ａ．前記サイトカインプロファイルにおいて、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞の減少を伴う、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトが検出された場合、４剤併用などの積極的治療が適応される。
ｂ１．診断検査においてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、以前の検査に関する情報が得られない場合、急性感染の疑いは少なく、別の診断が考慮されるべきであり、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｂ２．診断検査においてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染に対する以前の検査でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとこれまでに接触していないことが明らかになっていた場合、ＩＮＨなどの予防、または４剤併用などの積極的治療が適応され、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｃ１．患者が応答を示さない場合、緊急の治療は不要である。
ｃ２．患者が何らかの臨床症状を示す場合、再検査が適応される。

Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染サイクルを示す図である。サイトカインＩＦＮ−γの分析のみにより同定された、抗原特異的Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。活動性結核（Ａ−ＴＢ）と治療に成功した結核（Ｔ−ＴＢ）との区別は、ＰＰＤ、ＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ−１０による刺激とは独立したＩＦＮ−γ単独の分析だけで行うことでは不可能であることが分かった。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０により、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと接触のあった患者（ＥＳＡＴ−６陽性および／またはＣＦＰ−１０陽性）と純粋なＢＣＧワクチン応答を示す患者（ＥＳＡＴ−６陰性およびＣＦＰ−１０陰性、図示せず）との区別のみ可能となる。活動性結核に罹患している患者（Ａ−ＴＢ）および結核の治療に成功した対象（Ｔ−ＴＢ）におけるＰＰＤ特異的Ｔ細胞の頻度分布を示す図である。Ｔ細胞を、ＣＤ６９を介した活性化およびＰＰＤによるＩＦＮ−γの特異的誘導によって同定した。Ａ−ＴＢ患者のＰＰＤ特異的Ｔ細胞の頻度は有意に高いが、重なりが大きいため、個々の症例において、ＩＦＮ−γ単独の分析によって活動性結核（Ａ−ＴＢ）と治療に成功した結核（Ｔ−ＴＢ）とを区別することは不可能であることが分かる。結核治療に成功した４人の患者におけるＰＰＤ応答性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ／ＩＬ−２サイトカインプロファイルの例を示す図である。ＩＦＮ−γ単独陽性、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性、およびＩＬ−２単独陽性のＴ細胞の割合を図左側に数値化する。大部分の細胞が両方のサイトカインを発現する。活動性結核に罹患している４人の患者におけるＰＰＤ応答性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ／ＩＬ−２サイトカインプロファイルの例を示す図である。ＩＦＮ−γ単独陽性、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性、およびＩＬ−２単独陽性のＴ細胞の割合を図右側に数値化する。活動性結核に罹患している患者は、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性Ｔ細胞の減少を伴う、サイトカインプロファイルのＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトを示す。活動性結核に罹患している患者（Ａ−ＴＢ）および結核の治療に成功した患者（Ｔ−ＴＢ）におけるサイトカインプロファイルのまとめの図である。点線はＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性Ｔ細胞の上限（５６％）を表し、これより下では活動性結核が１００％の特異性、且つ、７０％の感度で診断可能である。この上限は受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定された。

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。

有利には、本発明の方法において、抗原特異的細胞のＩＦＮ−γ産生は、細胞内で測定される。したがって、抗原特異的Ｔ細胞を結核抗原ＰＰＤ（ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ＥＳＡＴ−６（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｇｅｔ）およびＣＦＰ−１０（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ）で刺激する時間を、これまでの試験では２０時間であったところを、６時間に短縮することができる（図２）。ＩＦＮ−γ発現ＰＰＤ応答性Ｔ細胞は、活動性結核に罹患している患者において、潜伏結核に罹患している患者または結核の治療に成功した患者と比較して、有意に高い頻度で既に測定されているが、範囲の重なりが極めて大きいため、個々の患者について、疾患のこれら２つのステージを互いに区別することができない（図３）。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０により、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと接触のあった患者（ＥＳＡＴ−６陽性またはＣＦＰ−１０陽性）と純粋なＢＣＧワクチン応答を示す患者（ＥＳＡＴ−６陰性およびＣＦＰ−１０陰性、図示せず）との区別のみが可能になる。しかし、活動性結核と、潜伏結核に罹患している患者または結核の治療に成功した患者との区別は、ＰＰＤ特異的Ｔ細胞におけるＣＤ６９を介した活性化、ならびにＩＦＮ−γおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）の同時測定によって可能である。大部分のＰＰＤ応答性Ｔ細胞は、潜伏結核または治療に成功した結核においてＩＦＮ−γおよびＩＬ−２をいずれも発現するが（図４）、活動性結核においては、サイトカインプロファイルはＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へシフトする（図５）。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の上限が確定され、これを下回る場合に１００％の特異性で活動性結核の診断が可能である。ここに示した集団では、この上限は５６％のＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性Ｔ細胞であり、それによって、活動性結核に罹患している患者（Ａ−ＴＢ）を結核の治療に成功した患者（Ｔ−ＴＢ）と７０％の感度で区別することができる（図６）。

他の実施形態では、サイトカインプロファイルの決定は、標識抗体を用いたフローサイトメトリーによって行われる。したがって、ＩＦＮ−γの測定に加え、ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ−１）、ＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ４）、ＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｄｏｍａｉｎａｎｄｍｕｃｉｎｄｏｍａｉｎ３）などの別の機能的に関連する表面分子、あるいはインターロイキン−２、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α）またはＩＰ−１０（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１０）などの別のサイトカイン類を同時に定量することも可能である。

抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析するため、特異的Ｔ細胞の活性化およびサイトカイン産生のための抗原刺激によって刺激し、次いで刺激された細胞の数を特異的抗体によって検出する。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）特異的Ｔ細胞の検査には、抗原であるＰＰＤ、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０が用いられる。活動性結核を潜伏性結核／治療に成功した結核と区別するためには、ＰＰＤを用いた試験が行われ、潜伏性結核感染／治療に成功した結核感染を以前のワクチン接種と区別するためには、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０を用いた試験が行われる。ＰＢＳは陰性対照となり、これにより、非特異的に反応するＴ細胞などのバックグラウンドシグナルを定めることができる。ＳＥＢは、陽性対照となる。

前記刺激は、全血から直接行うことが出来る。まず、全血を各１μｇ／ｍＬの濃度のＣＤ２８特異的抗体およびＣＤ４９ｄ特異的抗体と混合し、各抗原（ＰＰＤ：７．３２μｇ／ｍＬ、ツベルクリンＲＴ−５０；ＳｔａｔｅｎｓＳｅｒｕｍＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、コペンハーゲン、デンマーク）と混合する。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０をカバーするＭｔｂ由来ペプチドプールを用いて刺激を行った。ＣＦＰ−１０ペプチドおよびＥＳＡＴ−６ペプチドのプールは、１１アミノ酸が重複する１５アミノ酸長からなっており、全ペプチドがＨＰＬＣ精製されている［純度＞８０％、Ｈａｒｉｒｉら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１１；１７；３７２−３７６］。

２時間のインキュベーション時間（３７℃、６％ＣＯ_２）の後、サイトカインを細胞内に蓄積させるため、１０μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の添加によって刺激により誘導されたサイトカインのエキソサイト−シスを停止させる。続いて、さらに４時間インキュベートする（３７℃、６％ＣＯ_２）。

この刺激を６時間後に中断し、細胞を固定する。まず、２ｍＭＥＤＴＡを各試料に添加し、１０秒間攪拌した後、室温で１５分間インキュベートする。１ｍＬの全血あたり９ｍＬのＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ溶解溶液を用いて、室温で１０分間インキュベーションすることにより、白血球の固定および赤血球溶解を行う。遠心分離および上清の吸引後、得られた細胞ペレットを２ｍＬのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ−５ＦＣＳ−０．５％ＢＳＡ−０．０７％ＮａＮ_３）で洗浄する。洗浄は、ＦＡＣＳバッファーを添加し、続いて遠心分離および上清を吸引することにより行われる。最後に、固定した細胞をＦＡＣＳバッファー中に集める。ここで、細胞を直接染色するか、または冷蔵庫内に４℃にて１晩保存することができる。刺激された細胞を特異的な蛍光色素標識抗体で染色するため、細胞をＦＡＣＳチューブに再分配する。各染色混合物あたり、約２２５〜３００μＬの全血からの白血球を使用する。まず、各試料あたり２ｍＬのサポニンバッファー（ＦＡＣＳバッファー／０．１％サポニン）を１０分間添加する。遠心分離およびＳＡＰバッファーの吸引後、各試料あたりそれぞれ全量５０μＬのＦＡＣＳバッファー／０．１％サポニン中に抗体混合物を添加する（抗ＣＤ４クローンＳＫ３、抗ＩＦＮ−γクローン４Ｓ．Ｂ３、抗ＩＬ−２クローンＭＱ１−１７Ｈ１２、および抗ＣＤ６９クローンＬ７８）。前記抗体は光感受性であるため、暗所にて室温で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を３ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、未結合の抗体を除去する。最後に、細胞ペレットを１５０μＬの１％パラホルムアルデヒド溶液中に集め、フローサイトメトリーによって分析する。

治療に成功した結核では、ＰＰＤによる特異的刺激によって、大部分の抗原特異的Ｔ細胞がＩＦＮ−γおよびＩＬ−２をいずれも発現することが分かる。驚くべきことに、活動性結核が存在する場合、サイトカインプロファイルは、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へシフトし、同時にＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性Ｔ細胞の減少を伴うことになる。潜伏結核感染または治療に成功した結核感染は、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０による刺激によってワクチン応答と判別可能である。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０により、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと接触のあった患者（ＥＳＡＴ−６陽性および／またはＣＦＰ−１０陽性）と純粋なＢＣＧワクチン応答を示す患者（ＥＳＡＴ−６陰性およびＣＦＰ−１０陰性）との区別が可能である。

Claims

活動性結核または潜伏結核に関してＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の感染状況を全血から迅速判定するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップを含む方法。
・全血の第１試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ４９ｄ抗体の存在下で精製ツベルクリン（ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（ＰＰＤ）を用いて刺激するステップ；
・１．５時間〜２．５時間、３５℃〜３９℃で、任意にＣＯ_２を添加してインキュベートすることによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりＰＰＤをプロセシングするステップ；
・次いで分泌阻害剤を添加するステップ；
・強く攪拌するステップ；および
・少なくとも２．５時間、３５℃〜３９℃の温度でさらにインキュベートするステップ、ならびに
・抗原特異的Ｔ細胞の細胞内ＩＦＮ−γ産生および細胞内ＩＬ−２産生の両者からサイトカインプロファイルを決定するステップであって；
・活動性結核の存在が、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性Ｔ細胞の減少を伴う、前記サイトカインプロファイルのＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトによって示されるステップ。
ＰＰＤによる前記刺激に加え、ＳＥＢ、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０、ならびに／またはワクチン抗原によりさらに刺激を行う、請求項１に記載の方法。
前記第１試料とオーセンティックな第２試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にＰＢＳ０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコースなどの生理緩衝液を添加することによって陰性対照が行われる、請求項１または請求項２に記載の方法。
前記第１試料とオーセンティックな第３試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にＳＥＢを添加することによって陽性対照が行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１試料とオーセンティックな第４試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にワクチン抗原を添加することによってワクチン対照が行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記第１試料とオーセンティックな第４試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にＥＳＡＴ−６（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｇｅｔ）およびＣＦＰ−１０（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ）を添加することによってＢＣＧワクチン対照が行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記第１試料とオーセンティックな第５試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞にＥＳＡＴ−６（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｇｅｔ）およびＣＦＰ−１０（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ）を添加することによって、該全血ドナーにおいて非結核性マイコバクテリアとの接触が起こったか否かについての対照が行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記分泌阻害剤が、ブレフェルジンＡまたはモネンシンなどからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記サイトカインプロファイルの決定がフローサイトメトリーによって行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記試料の全血がヒトまたは動物に由来する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記全血は活動性ＴＢ患者と密接な接触のある個人または活動性ＴＢ患者と密接な接触を持ったことが疑われる個人から採取されたものである、接触者追跡調査に適用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
以下のように治療決定されるためのデータを提供する、請求項１１に記載の方法。
ａ．前記サイトカインプロファイルにおいて、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞の減少を伴う、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトが検出された場合、ＩＮＨなどの予防、または４剤併用などの積極的治療が適応される。
ｂ１．診断検査において、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞数の全ＰＰＤ応答性Ｔ細胞数に対する割合が、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定されたＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の割合の上限を上回ることによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、以前の検査に関する情報が得られない場合、緊急の治療は不要であり、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｂ２．診断検査において、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞数の全ＰＰＤ応答性Ｔ細胞数に対する割合が、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定されたＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の割合の上限を上回ることによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染に対する以前の検査でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとこれまでに接触していないことが明らかになっていた場合、ＩＮＨ療法などの予防が適応される。
ｃ１．患者が応答を示さない場合、緊急の治療は不要である。
ｃ２．患者が何らかの臨床症状を示す場合、再検査が適応される。
前記全血は免疫抑制剤を投与される前の個人またはＨＩＶ感染などの免疫機能不全状態にある個人から採取されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
以下のように治療決定されるためのデータを提供する、請求項１３記載の方法。
ａ．前記サイトカインプロファイルにおいて、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞の減少を伴う、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトが検出された場合、ＩＮＨなどの予防、または４剤併用などの積極的治療、および任意に免疫抑制療法の先送りが適応される。
ｂ１．診断検査において、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞数の、全ＰＰＤ応答性Ｔ細胞数に対する割合が、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定されたＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の割合の上限を上回ることによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、以前の検査に関する情報が得られない場合、免疫抑制療法が可能であり、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｂ２．診断検査において、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞数の全ＰＰＤ応答性Ｔ細胞数に対する割合が、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定されたＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の割合の上限を上回ることによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染に対する以前の検査でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとこれまでに接触していないことが明らかになっていた場合、ＩＮＨ療法などの予防、および任意に免疫抑制療法の先送りが適応され、さらに２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｃ１．患者が応答を示さない場合、免疫療法の開始が予定される。
ｃ２．患者が何らかの臨床症状を示す場合、再検査が適応される。
前記全血は活動性ＴＢ感染が疑われる個人から採取されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
以下のように治療決定されるためのデータを提供する、請求項１５に記載の方法。
ａ．前記サイトカインプロファイルにおいて、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞の減少を伴う、ＩＦＮ−γ単独陽性細胞側へのシフトが検出された場合、４剤併用などの積極的治療が適応される。
ｂ１．診断検査において、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞数の全ＰＰＤ応答性Ｔ細胞数に対する割合が、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定されたＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の割合の上限を上回ることによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、以前の検査に関する情報が得られない場合、急性感染の疑いは少なく、別の診断が考慮されるべきであり、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｂ２．診断検査において、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性細胞数の全ＰＰＤ応答性Ｔ細胞数に対する割合が、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により確定されたＩＦＮ−γ／ＩＬ−２二重陽性ＰＰＤ応答性Ｔ細胞の割合の上限を上回ることによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染が明らかになり、且つ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの潜伏感染に対する以前の検査でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとこれまでに接触していないことが明らかになっていた場合、ＩＮＨなどの予防、または４剤併用などの積極的治療が適応され、２〜４週間以内に患者を再検査する必要がある。
ｃ１．患者が応答を示さない場合、緊急の治療は不要である。
ｃ２．患者が何らかの臨床症状を示す場合、再検査が適応される。