CN107831316A - 一种用于诊断牛结核病的流式细胞术检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断牛结核病的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括：支持介质、荧光标记的CD4表面分子抗体、检测抗体、特异性刺激剂，其中，所述检测抗体能特异性结合并检测牛细胞白介素2，特异性刺激剂为CFP‑10和ESAT‑6的融合蛋白。本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。本发明试剂盒中所采用的牛分枝杆菌特异性抗原CFP‑10、ESAT‑6作为刺激剂特异性更高。相比于单纯颈部皮内变态反应试验与BOVIGAMTMELISA检测试剂盒，本发明试剂盒排除了交叉反应造成的假阳性的干扰，显示出良好的特异性，同时因其能够实现从单个细胞水平对特定亚型淋巴细胞IL‑2分泌水平的检测，排除群体水平检测的假阳性。

Description

一种用于诊断牛结核病的流式细胞术检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及一种用于诊断牛结核病的流式细胞术(FCM)检测试剂盒及其在牛结核病诊断领域的应用。
背景技术
牛结核病是一种主要由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患传染病，我国将其列为二类动物疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为需通报的动物疫病。该病一年四季均可发生，呈世界性流行。牛分枝杆菌不仅导致了牛自身生产力的下降，更重要的是对人类健康构成了严重的威胁。因此，无论从畜牧业还是从公共卫生角度，加大对牛结核病的研究都有着迫切的需求和深远的意义。而建立快速、特异性强、敏感度高的检测方法是牛结核病检疫中的关键步骤，也是临床中亟待解决的问题。
白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)主要是由T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子，在T细胞增殖、B细胞发育、NK细胞的活化等方面起重要作用，是一种能影响机体免疫反应各个方面的调节因子。牛感染牛分枝杆菌后，主要诱导机体产生Th1型细胞免疫应答反应，IL-2作为Th1型细胞免疫应答产生的主要细胞因子之一，其分泌水平反映着机体感染牛分枝杆菌的不同状态。通过对牛白细胞介素2(boIL-2)的分泌水平进行检测，这将在牛感染性疾病的诊断和免疫状态的评价中发挥着重要的作用。
目前应用于临床诊断牛结核病的主要方法为牛结核菌素皮内变态反应试验和体外γ-干扰素释放试验。而两种方法中使用的结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)成分复杂，包含的很多蛋白同时存在于致病分枝杆菌和非致病分枝杆菌中，不能区分结核阳性感染、免疫个体以及环境分枝杆菌感染等情况，从而限制了检测方法的特异性和敏感性。此外，ELISA检测方法是群体水平的检测。如果群体细胞因子水平提高，既有可能是分泌细胞因子的细胞数量增加，也有可能是分泌细胞的数量没增加而单个分泌水平增加，易造成假阳性。
因此，需要建立特异性更好的试剂盒用于牛结核病的检测。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种针对牛结核病的FCM检测试剂盒，该试剂盒能够对牛结核病进行高特异性地检测。
本发明的第一方面涉及一种用于诊断牛结核病的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括：支持介质、荧光标记的CD4表面分子抗体、检测抗体、特异性刺激剂，其中，所述检测抗体能特异性结合并检测牛细胞白介素2，特异性刺激剂为CFP-10和ESAT-6的融合蛋白。
本发明的第二方面涉及上述FCM检测试剂盒在用于非诊断目的的牛分枝杆菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验牛分枝杆菌抗原特异的boIL-2。
本发明的技术效果：
1)本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势；
2)本发明试剂盒中所采用的牛分枝杆菌特异性抗原CFP-10、ESAT-6由RD1基因编码，RD1只存在于结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌，而在卡介苗BCG中缺失，因此CFP-10和ESAT-6作为刺激剂特异性更高；
3)本发明是基于牛分枝杆菌特异性抗原的FCM检测试剂盒，相比于单纯颈部皮内变态反应试验和BOVIGAMTM(Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit forCattle)ELISA检测试剂盒，能够实现从单个细胞水平对特定亚型淋巴细胞分泌IL-2水平的检测，排除了交叉反应和假阳性的干扰，显示出良好的特异性；
4)该试剂盒还支持大批量样品的快速检测，同时相比较于其他细胞因子检测试剂盒，该试剂盒仅需一种细胞因子抗体，节约了成本；
5)此外，该试剂盒的使用过程中可以将表面和胞内的染色同时进行，大幅缩减了试验所需时间，简化了操作步骤，降低了操作误差，提高了灵敏度和分辨率。
附图说明
图1为实施例7中根据本发明的FCM检测试剂盒的牛外周血单个核细胞(PBMC)样品检测结果图：A.未刺激牛PBMC检测结果；B.ConA刺激牛PBMC检测结果；
图2为实施例8中根据本发明的FCM检测试剂盒的牛外周血单个核细胞(PBMC)样品检测结果图：A.未刺激牛PBMC检测结果；B.ConA刺激牛PBMC检测结果；C.CFP-10和ESAT-6的融合蛋白刺激牛PBMC检测结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的第一方面涉及一种用于诊断牛结核病的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括：支持介质、荧光标记的CD4表面分子抗体、检测抗体、特异性刺激剂，其中，所述检测抗体能特异性结合并检测牛细胞白介素2，特异性刺激剂为CFP-10和ESAT-6的融合蛋白。
本发明的诊断牛结核病的FCM检测试剂盒能够特异性地诊断牛结核病，其检测灵敏度达到了BOVIGAMTM ELISA检测试剂盒的水平。
术语“FCM”为流式细胞术的简称，它最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。流式细胞术主要应用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、细胞生物学和分子生物学。80年代后期开始应用于临床，应用流式细胞术测定外周血CD4+T细胞的数量能用于检测HIV感染者疾病的进展，开启了流式细胞术应用与临床的新纪元。
作为本发明的一种实施方式，所述检测抗体为荧光标记的boIL-2单克隆抗体。优选地，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的boIL-2单克隆抗体。标记所述boIL-2单克隆抗体的方法采用常规方法。
作为本发明的一种实施方式，所述boIL-2单克隆抗体为荧光标记的boIL-2单克隆抗体，优选地，所述荧光标记为异硫氰酸荧光素标记。
作为本发明的一种实施方式，所述检测抗体为荧光标记的boIL-2单克隆抗体6D7，所述boIL-2单克隆抗体6D7由保藏号为CCTCC NO：C2015212的杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生。
杂交瘤细胞株6D7公开于专利CN105483090A。
作为本发明的另一种实施方式，所述检测抗体为boIL-2单克隆抗体6D7；其通过荧光标记的羊抗鼠二抗检测；优选地，所述检测抗体boIL-2单克隆抗体6D7通过Alexa488荧光标记的羊抗鼠二抗进行检测。
术语“CD4表面分子抗体”为能与特定T淋巴细胞表面簇分化抗原特异性结合的抗体。通过该抗体可以实现对CD4T淋巴细胞群在结核病的免疫反应过程中起到的作用进行分析。作为本发明的一种实施方式，所述荧光标记的CD4表面分子抗体为Alexa647荧光标记的CD4表面分子抗体(购自BIO-RAD)。
作为本发明的一种实施方式，所述支持介质为聚丙乙烯V型抗体染色板，在细胞离心洗涤的过程中该板更利于细胞的聚集。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：
1)阴性对照和阳性对照；
2)蛋白转运抑制剂；
3)固定剂、破膜剂；以及
4)洗涤液。
优选地，所述阴性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但不添加刺激剂；
所述阳性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但用非特异性刺激剂替换特异性刺激剂。
上述试剂均为FCM检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入检测方法中，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是方法中同时包括蛋白转运抑制剂、固定剂、破膜剂以及洗涤液。
作为本发明的一种实施方式，非特异性刺激剂为ConA；
所述蛋白转运抑制剂为布雷非德菌素A；所述固定剂为含4％的多聚甲醛PBS溶液；所述破膜剂为含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的平衡盐溶液(HBBS)；所述洗涤液为含1％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液，可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
进一步地，所述方法中还可以有选择地包括其他FCM检测所需通用试剂，如细胞培养液等。优选地，所述细胞培养液为完全1640培养液。
通常情况下，本发明的FCM检测试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
本发明的第二方面涉及一种上述FCM检测试剂盒的使用方法，其中，包括以下步骤：
1)制备牛外周抗凝血样品或牛外周血单个核细胞样品，进行刺激与培养；
2)表面染色：收集细胞至染色板，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，离心洗涤，然后每孔加入CD4表面分子抗体，避光孵育，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，离心洗涤；以及
3)胞内染色：每孔加入固定剂，室温静置，然后使用破膜剂洗涤细胞，离心洗涤，每孔加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体，室温避光染色；然后使用破膜剂洗涤细胞，离心洗涤，最后使用含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS(荧光激活细胞分离)检测。
作为本发明的一种实施方式，使用本发明的FCM检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞(PBMC)样品的方法包括下列步骤：
1、PBMC的分离与培养
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。其中云雾状细胞层即为要分离的淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。每个PBMC样品包括3个试验孔，未加刺激剂的阴性对照孔，加入非特异性刺激剂ConA的阳性对照孔(终浓度为10μg/mL)，加入特异性刺激原CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的试验孔(终浓度为10μg/mL)。将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
2、表面染色与胞内染色依次进行
①表面染色：培养结束后，收集细胞至染色板。使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，然后每孔加入2μL CD4表面分子抗体，避光孵育20min，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。
②胞内染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。在阴性对照组和阳性对照组中分别加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
作为本发明的一种实施方式，使用本发明的FCM检测试剂盒检测牛外周抗凝血的方法包括下列步骤：
1、牛外周抗凝血的采集与培养
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②牛外周抗凝血的培养与红细胞裂解：用无菌的组织培养液1:1稀释肝素抗凝的全血。加入刺激剂后，置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。培养结束后，加入红细胞裂解液，室温孵育5-10min。
2、表面染色与胞内染色依次进行
①表面染色：收集细胞至染色板，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，然后每孔加入2μL CD4表面分子抗体，避光孵育20min，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。
②胞内染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
本发明的第三方面涉及一种上述FCM检测试剂盒的使用方法，其中，包括以下步骤：
1)制备牛外周抗凝血样品或牛外周血单个核细胞样品，进行刺激和培养；以及
2)表面染色与胞内染色同时进行：收集并洗涤细胞，每孔加入固定剂，室温静置，然后使用破膜剂洗涤细胞，离心洗涤，每孔加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体和CD4表面分子抗体，室温避光染色；然后使用破膜剂洗涤细胞，离心洗涤，最后使用含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测，优选地，所述CD4表面分子抗体为CC8。
通过在该试剂盒的使用过程中将表面和胞内的染色同时进行，大幅缩减了试验所需时间，简化了操作步骤，降低了操作误差。
本发明的第四方面涉及上述FCM检测试剂盒在用于牛外周抗凝血样品和牛PBMC样品的检测中的应用。
本发明的第五方面涉及上述FCM检测试剂盒在用于非诊断目的的牛分枝杆菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验牛分枝杆菌抗原特异的boIL-2。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1基于CFP-10和ESAT-6融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒的组装
FCM检测试剂盒组装步骤如下：
1)boIL-2单克隆抗体6D7的纯化
分泌boIL-2单克隆抗体6D7的的杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，待产生腹水后，收集腹水，将收集的6D7腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化。
2)制备异硫氰酸荧光素(FITC)标记boIL-2单克隆抗体
将纯化6D7单抗采用标准异硫氰酸荧光素标记法进行标记。将待交联单抗6D7(浓度≥1mg/mL)对交联反应液4℃透析三次，至pH为9.0；将新鲜配制的FITC(浓度为1mg/mL)溶于DMSO中；按P：F(蛋白质：FITC)＝1mg：150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h；将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮；进行交联物蛋白浓度、F/P比例的鉴定；FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN3、1％BSA，4℃避光保存。
3)将染色板、异硫氰酸荧光素标记的boIL-2单克隆抗体6D7、特异性刺激剂CFP-10和ESAT-6的融合蛋白、阴性对照(完全1640培养基)和阳性对照(刀豆蛋白ConA)分别包装组装成试剂盒。
进一步地，试剂盒中依据需要组装入：固定剂、破膜剂、洗涤剂、细胞培养液、染色板、流式管。
实施例2基于聚丙乙烯V型抗体染色板的FCM检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.PBMC的分离、培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。其中云雾状细胞层即为要分离的淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。加入刺激剂后，将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
③表面染色：培养结束后，收集细胞至聚丙乙烯V型抗体染色板。使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，然后每孔加入2μL表面抗体，避光孵育20min，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。
④胞内染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入检测抗体，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
该染色板由于其V型底结构，更利于细胞的吸附与聚集。与传统的流式染色管相比，洗涤时，无需使用移液枪移去上清，也无须担心误吸到细胞，只需将板子轻轻侧甩，移去上清即可。在处理大批量样品时，可以借助排枪快速将多个实验组同时进行操作，更简便快捷。
实施例3基于boIL-2单克隆抗体6D7的FCM检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.PBMC的分离、培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。其中云雾状细胞层即为要分离的淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。加入刺激剂后，将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
③表面染色：培养结束后，收集细胞至染色板。使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，然后每孔加入2μL CD4表面分子抗体，避光孵育20min，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。
④两步法胞内染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。每孔加入50μL 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa488)，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
实施例4基于异硫氰酸荧光素标记boIL-2单克隆抗体6D7的FCM检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.PBMC的分离、培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。其中云雾状细胞层即为要分离的淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。加入刺激剂后，将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
③表面染色：培养结束后，收集细胞至染色板。使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，然后每孔加入2μL CD4表面分子抗体，避光孵育20min，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。
④一步法胞内染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
3.结果分析
本实施例中的一步法胞内染色与实施例3中的两步法胞内染色相比，步骤更为简便，节约了时间的同时也减少了实验的误差，而且实验结果显示一步法胞内染色相比较于二步法，实验的背景值也更低，因此本发明检测试剂盒的灵敏度和分辨率也得到了提高。
实施例5基于异硫氰酸荧光素标记boIL-2单克隆抗体6D7的FCM检测试剂盒检测牛外周抗凝血样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.牛外周抗凝血的培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②牛外周抗凝血的培养与红细胞裂解：用无菌的组织培养液1:1稀释肝素抗凝的全血。加入刺激剂后，置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。培养结束后，加入红细胞裂解液，室温孵育5-10min。
③表面染色：收集细胞至染色板，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，然后每孔加入2μL CD4表面分子抗体，避光孵育20min，染色结束后使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。
④胞内染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
3.结果分析
与检测牛外周血单个核细胞样品相比，直接检测牛外周抗凝血样品可以缩短检测时间，简化检测流程。
实施例6基于表面染色与胞内染色同时进行的FCM检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.PBMC的分离、培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。加入刺激剂后，将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
③表面/胞内同时染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)和2μL CD4表面分子抗体，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
3.结果分析
相比于表面和胞内的分开染色，表面和胞内的同时染色大幅缩减了试验所需时间，简化了操作步骤，操作误差也相应下降。而且实验结果显示实验的背景值也更低，因此本发明检测试剂盒的灵敏度和分辨率也得到了进一步的提高。但是该方法并不适用于大多数的CD4分子，因为固定剂例如含4％的多聚甲醛PBS溶液的固定会使得细胞表面有些位点的构象发生改变，使得抗体无法结合。
发明人通过多次创造性地实验，发现CD4分子的特定克隆CC8可适用表面和胞内的同时染色的方法，适用于预固定，即在细胞表面染色之前进行细胞固定。
实施例7基于非特异性刺激剂ConA的FCM检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.PBMC的分离、培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。其中云雾状细胞层即为要分离的淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。每个PBMC样品包括2个试验孔，未加刺激剂的阴性对照孔，加入非特异性刺激剂ConA的阳性对照孔(终浓度为10μg/mL)。将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
③表面/胞内同时染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)和2μL CD4表面分子抗体，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
结果如图1所示，在检测牛PBMC样品时，阳性对照组中CD4+IL2+的细胞数显著多于阴性对照组，结果表明本发明的试剂盒可用于对牛PBMC进行检测，结果可以有效检测出经ConA刺激牛PBMC中分泌boIL-2的CD4+T淋巴细胞，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。
实施例8基于特异性刺激原CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒检测牛外周单个核细胞样品
1.实验材料
使用实施例1中制备的牛结核病FCM检测试剂盒。
2.PBMC的分离、培养及检测
①采血：牛尾静脉采血5mL，立即匀速地注入肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒抗凝管使肝素钠与血液充分混匀，避免血液凝固。室温(20±5℃)下，运送至实验室。
②PBMC细胞的分离与培养：在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温800×g离心20min。管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。其中云雾状细胞层即为要分离的淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温500×g离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后将细胞浓度调为1×106个/mL，然后将细胞铺入24孔板中，每孔1mL。每个PBMC样品包括3个试验孔，未加刺激剂的阴性对照孔，加入非特异性刺激剂ConA的阳性对照孔(终浓度为10μg/mL)，加入特异性刺激原CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的试验孔(终浓度为10μg/mL)。将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养4h，然后加入蛋白转运抑制剂BFA，再置于37℃、5％CO2培养箱培养16h。
③表面/胞内同时染色：每孔加入50μL固定剂，室温静置作用15min，然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍。加入FITC标记的boIL-2单克隆抗体6D7(1μg/mL)和2μL CD4表面分子抗体，室温避光染色30min；然后使用破膜剂洗涤细胞，每孔200μL，350×g离心5min，洗两遍，最后使用400μL含1％BSA的PBS重悬细胞至流式管中，上机进行FACS检测。
3.试验有效的条件
ConA阳性对照组中CD4+IL-2+细胞数大于阴性对照组中CD4+IL-2+细胞数，且ConA阳性对照组中CD4+IL-2+细胞比例＞0.5％，判定PBMC样品有效。
4.牛结核病结果判定
当刺激组CD4+IL-2+细胞比例-未刺激组CD4+IL-2+细胞比例＞0.25％时，则判定为阳性，反之则判为阴性。
结果如图2所示。本发明的试剂盒可以有效检测出牛结核病抗原特异性分泌boIL-2+的CD4+T淋巴细胞，具有较好的敏感性和特异性。
实施例9基于CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒与BOVIGAMTMELISA检测试剂盒结果比较
地点：江苏某牛场。
时间：2017年5月。
试验头数：8头。
本试验检测了临床奶牛PBMC样品，并且与市售BOVIGAMTM ELISA试剂盒进行对比，以进一步确认CFP-10和ESAT-6的融合蛋白作为牛结核病FCM检测试剂盒刺激原的效果。牛结核病FCM检测试剂盒检测牛外周单个核细胞样品的结果判定同实施例8所述，结果如表1所示。
表1.基于CFP-10和ESAT-6的融合蛋白牛结核病FCM检测试剂盒结果与BOVIGAMTMELISA检测试剂盒结果对比(单位：头)
“+”代表阳性，“—”代表阴性
共检测8头结核疑似牛，以BOVIGAMTMELISA试剂盒检验结果作为参考，以该试剂盒检测为阳性的奶牛判定为牛结核阳性，该试剂盒检测为阴性的奶牛判定为牛结核阴性。将FCM检测试剂盒检测出的真阳性牛数/ELISA试剂盒检测出的阳性牛数算出该试剂盒的敏感性；FCM检测试剂盒检测出的真阴性牛数/ELISA试剂盒检测出的阴性牛数算出该试剂盒的特异性。将两种试剂盒检测出来共同阳性牛数/[(ELISA试剂盒检测出的阳性牛数+FCM检测试剂盒检测出的阳性牛数)/2]计算出阳性符合率；将两种试剂盒检测出来共同阴性牛数/[(ELISA试剂盒检测出的阴性牛数+FCM检测试剂盒检测出的阴性牛数)/2]计算出阴性符合率。将(FCM检测试剂盒检测出的阳性牛数+FCM检测试剂盒检测出的阴性牛数)/[(FCM检测试剂盒检测出的阳性牛数+ELISA试剂盒检测出的阳性牛数)/2+(FCM检测试剂盒检测出的阴数+ELISA试剂盒检测出的阴性牛数)/2]计算出总符合率。
经统计学分析，基于CFP-10和ESAT-6的融合蛋白牛结核病FCM检测试剂盒与市售的BOVIGAMTMELISA检测试剂盒结果的阳性符合率为88.89％，阴性符合率为85.71％，总符合率为87.5％，具有良好的检测效果，显示其在牛结核病诊断中具有较好的诊断价值。
实施例10基于特异性刺激原CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒检测无结核病牛群
地点：江苏某牛场。
时间：2017年5月。
试验头数：97头。
所有实验奶牛均为新西兰进口荷斯坦牛，为结核病净化牛群。使用单纯颈部皮内变态反应试验、BOVIGAMTMELISA试剂盒与基于特异性刺激原CFP-10和ESAT-6融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒同时检测该牛群。结果如表2所示。
表2.不同检测方法在结核病净化牛群中检测效果比较
检测方法 检测样品数(头) 阳性数(头) 阳性率
TST 97 6 6.2％
ELISA 97 1 1.0％
FCM 97 0 0％
结果显示，在结核病净化牛群中，基于特异性刺激原CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒的特异性为100％，而其它两种基于抗体的检测方法都存在一定比例的假阳性。由于这两种方法中使用的结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)成分复杂，包含的很多蛋白同时存在于致病分枝杆菌和非致病分枝杆菌中，不能区分结核阳性感染、免疫个体以及环境分枝杆菌感染等情况，从而限制了检测方法的特异性和敏感性。此外，ELISA检测方法是群体水平的检测。如果群体细胞因子水平提高，既有可能是分泌细胞因子的细胞数量增加，也有可能是分泌细胞的数量没增加而单个分泌水平增加，因此群体水平的检测易造成假阳性。而基于特异性刺激原CFP-10和ESAT-6的融合蛋白的牛结核病FCM检测试剂盒能够实现从单个细胞水平对特定亚型淋巴细胞分泌IL-2水平的检测，排除了这些方面的干扰，显示其具有良好的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种用于诊断牛结核病的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括：支持介质、荧光标记的CD4表面分子抗体、检测抗体、特异性刺激剂，其中，所述检测抗体能特异性检测牛细胞白介素2，特异性刺激剂为CFP-10和ESAT-6的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的FCM检测试剂盒，其中，所述检测抗体为荧光标记的boIL-2单克隆抗体，优选地，所述所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的boIL-2单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的FCM检测试剂盒，其中，所述检测抗体为荧光标记的boIL-2单克隆抗体6D7，所述boIL-2单克隆抗体6D7由保藏号为CCTCC NO：C2015212的杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生。
4.根据权利要求1所述的FCM检测试剂盒，其中，所述检测抗体为boIL-2单克隆抗体6D7；其通过荧光标记的羊抗鼠二抗检测；优选地，所述检测抗体boIL-2单克隆抗体6D7通过Alexa488荧光标记的羊抗鼠二抗检测。
5.根据权利要求1所述的FCM检测试剂盒，其中，所述荧光标记的CD4表面分子抗体为Alexa647荧光标记的CD4表面分子抗体；优选地，所述CD4表面分子抗体为CC8；优选地，所述CD4表面分子抗体与所述检测抗体在使用时同时加入样品中以用于表面和胞内的同时染色。
6.根据权利要求1所述的FCM检测试剂盒，其中，所述支持介质包括聚丙乙烯V型抗体染色板。
7.根据权利要求1所述的FCM检测试剂盒，其中，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：
1)阴性对照和阳性对照；
2)蛋白转运抑制剂；
3)固定剂、破膜剂；以及
4)洗涤液。
8.根据权利要求7所述的FCM检测试剂盒，其中，所述阴性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但不添加刺激剂；所述阳性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但用非特异性刺激剂替换特异性刺激剂。
9.根据权利要求8所述的FCM检测试剂盒，其中，非特异性刺激剂为ConA；
所述蛋白转运抑制剂为布雷非德菌素A，
所述固定剂为含4％的多聚甲醛PBS溶液，
所述破膜剂为含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液，
所述洗涤液为含1％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液，优选地，所述FCM检测试剂盒还包括细胞培养液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的FCM检测试剂盒在用于非诊断目的的牛分枝杆菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验牛分枝杆菌抗原特异的boIL-2。
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