CN105759038A - 一种检测生物样品中结核分枝杆菌的免疫检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测生物样品中结核分枝杆菌的免疫检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明建立了一种通过荧光染色快速检测血液或者脑脊液中结核分枝杆菌的方法与试剂盒。具体而言，使用抗结核分枝杆菌的抗体，尤其是使用抗结核分枝杆菌RD?1区ESAT?6和CFP?10抗原的单克隆或者多克隆抗体，以及间接或者直接免疫方法或者SPA方法对通过基于微孔膜的富集装置富集的生物样品检测结核分枝杆菌的存在。本发明所建立的方法具有操作简单，灵敏度高，特异性强以及能够区分致病性结核分枝杆菌与因接种卡介苗而致的非致病性结核分枝杆菌的特点，可用于结核性疾病的病原学检测和早期、快速临床诊断，是一种明确的结核病原学诊断方法。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫诊断学技术领域，具体而言，本发明涉及一种检测生物样品中结核分枝杆菌的免疫检测方法以及试剂盒。
背景技术
结核病是由单一病原体结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。近年来，由于人口流动性的增加、耐药结核的出现、结核菌与艾滋病病毒的双重感染等因素，结核病又卷土重来，再次成为严重危害人民群众身体健康的重大公共卫生问题和社会问题。据世界卫生组织（WHO）报道目前估计全球大约有20 亿人感染结核分枝杆菌，2013年新发病例900万。我国是结核病的高负担国家，结核病患者数量居世界第二位，年发病人数约为130万，占全球发病人数的14%。
结核病是一种异质性非常高的疾病，机体感染结核分枝杆菌后有人很快发病，成为活动性结核病患者，有人则终生不发病，成为潜伏感染者；结核病患者表现形式也多种多样，有的表现为肺结核，有的则表现为不同类型的肺外结核，这种异质性严重阻碍了结核病的预防、治疗、以及诊断的研究进展。
目前常用的结核分枝杆菌检测方法有很多种，主要包括传统细菌学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术，它们各有特点，但往往存在操作复杂、耗时长、假阳性率高或假阴性率高等缺陷。
(一)传统细菌学检测技术
痰结核分枝杆菌阳性是诊断肺结核病的金标准，检查方法有痰涂片法和痰培养法。
1、痰涂片法是从患者呼吸道取得的痰液标本进行涂片，再进行染色，然后在显微镜下镜检，如果痰中有细菌容易被检出，也可以粗略地分辩是哪一类或哪一种细菌。所以痰涂片检查是一种简便、快速、价廉、可以得到初步结果的常用检查方法。但是，临床结果证实痰涂片法阳性率低，约30-40%，且需要痰标本中的细菌≥104/mL才能检出，敏感性低，特异性较差。为了提高检出率，后来有人将其改良，利用离心沉淀集菌涂片，将约5mL痰液中所含结核分枝杆菌的大部分浓缩到0.1mL沉淀中，使其灵敏度有所增高，但仍然不能解决特异性的问题，不能满足临床需求。但是，由于其操作简单，不需要昂贵的设备和高水平的实验条件，适合于卫生技术条件欠发达地区的技术人员使用，所以，尽管涂片法阳性检出率不高，仍然是基层单位普遍使用的结核菌检测方法。
2、痰培养法是为了准确地获得具体是什么细菌，用人工的方法让其生长，以便于观察，并可以利用培养菌做药物敏感试验，避免盲目地使用抗生素，使患者更早得到有效治疗。痰培养与痰涂片相比更准确可靠，但需要相对较长的时间，一般需要2-4周。痰培养法耗时较长且阳性率低，一般在50-60%左右，对临床早期诊断价值有限，还需要做胸片、肺CT、支气管镜检查以及结核抗体等检查来辅助诊断。
3、痰涂片和痰培养中痰标本的采集至关重要，痰标本质量的好坏、送检及时与否等因素都将直接影响检测结果。
综上，传统细菌学检测方法存在以下三方面的缺点：
第一，基于患者痰样本进行检测，患者痰的有无、采集方法是否正确、质量好坏、送检及时与否等因素都将直接影响检测结果，从而导致基于痰样本的细菌学检测无法获得更高的检出率和更好的特异性，迄需新型检测方法替代传统痰菌检测。
第二，肺结核患者占全部结核患者的80%，其中将近50%是痰菌阴性的患者，通过传统痰菌细菌学检测势必会造成这部分人群的漏诊，需要其他方法辅助诊断；另外大约20%的结核患者表现为肺外结核，无法获得痰样本，因此也无法得到明确的细菌学证据，只能借助其它方法辅助诊断，或者试探性抗结核治疗，迄需适合菌阴及肺外结核的新型细菌学检测方法。
第三，目前对于抗结核治疗是否治愈的评价，WHO同样推荐以细菌学指标为判断标准，因此，对于痰菌阳性的肺结核病人，在预定疗程最后2个月连续痰菌培养阴性，即为阴转治愈。而对于痰菌阴性的结核病人，在完成预定疗程后，痰菌仍然为阴性者，即为满疗程治愈。但是，一般痰菌阳性患者在治疗两个月后均无法获得痰样本，而体内细菌是否清除却不得而知；而痰菌阴性患者这一直表现为阴性，无法真正判断是否治愈。所以，以痰菌培养结果作为治疗效果评价的标准，势必造成治疗不彻底或者过治现象。
(二)免疫学检查
Nassau 等首次利用酶联免疫吸附试验在结核患者血清检测到结核抗体，由此开启了结核免疫学检测的新纪元，目前结核病免疫学检测成为结核病辅助检测重要手段之一。
1、抗体检测
结核病抗体检测技术不断获得改进和优化。ELISA是测定结核抗体研究和使用最多的技术之一，相对于传统检测方法其快速、简便2-3 h 即可完成。但是抗体免疫反应的延迟性导致早期结核病诊断结果易产生假阴性，同时共同抗原导致的交叉反应以及不能区分非结核分枝杆菌都会导致假阳性。因此，抗体检测试剂未被WHO推荐应用于结核患者的临床诊断。
2、抗原检测
机体受到感染后，首先出现的是结核抗原，因此理论上对结核抗原的检测比抗体检测更适合于早期诊断。双抗体夹心法是目前抗原检测的常用方法，但因受高活性特异性抗体难制备的限制，使得直到目前为止国内外均没有在临床上应用良好的抗原检测试剂。
3、细胞因子检测
细胞免疫是非活动性结核病筛查的重要方法，机体首次受到感染后产生的记忆T 淋巴细胞，经抗原再次刺激后增殖成效应T 细胞，分泌细胞因子。目前细胞免疫检测主要对效应T 细胞数目(ELISPOT)及分泌的细胞因子量（ELISA）进行检测,但是目前细胞免疫检测试剂无法区分活动性肺结核患者和潜伏感染者，2014年中华医学会结核病学分会和《中华结核和呼吸杂志》组织专家制定的《γ-干扰素释放试验在中国应用的建议》中认为γ-干扰素释放试验主要适用于结核感染而不是活动性结核病的诊断。
（三）分子生物学方法
1998 年结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成，给结核病诊断带来全新观念。快速基因诊断技术的初步成功，对结核病的治疗和控制带来革命性变化，展示出广阔的前景。
DNA检测
上世纪90 年代Hance
利用PCR 技术检测结核分枝杆菌，给结核病的临床诊断带来了革命性突破。在此基础上，实时荧光定量PCR 在一定程度上弥补了常规PCR检测的不足，通过利用特异性引物和荧光探针，实时监测整个PCR 进程并用标准曲线进行定量分析，使检测结果更加可靠。环介导等温扩增技术(LAMP)不需要改变温度，不依赖专门仪器设备，直接用肉眼判定结果，简单高效成本低，在一定程度上避免了实验室的交叉污染。近年新型的分子检测方法Xpert
MTB/RIF（利福平）受到广泛关注，2010年12月世卫组织认可Xpert MTB/RIF作为一种全新的结核病快速检测新方法。然而上述方法都以DNA为模板，DNA的稳定性使PCR检测结果不能辨别活菌和死菌而产生假阳性结果。
但是，相对于痰涂片检测，分子检测还是复杂程度高，而且同样主要以痰样本进行检测，目前没有相关研究探讨分子诊断方法对于血液样本的检测结果。
综上所述，这些结果都显示建立简便快捷、阳性率高的基于血液的细菌学检测方法是可行的，也是迫切需要的。
而本发明的目的是建立一种全新的基于血液或者脑脊液的致病性结核分枝杆菌特异的细菌学检测方法。该方法及试剂盒可以实现从少量血液或脑脊液中简便、快速、敏感、特异、准确的检测出结核分枝杆菌。首先，该方法利用常规血液或脑脊液样本进行检测，不受痰样本取样难、取样不规范或者样本不合格等问题的影响，对于痰菌阴性与痰菌阳性的结核患者具有相同的检测效果；第二，该方法利用抗结核分枝杆菌抗体，特别是利用针对致病性结核分枝杆菌特有的RD1区抗原ESAT-6和CFP10的单克隆抗体，只检测致病性结核分枝杆菌的存在，而不受卡介苗免疫和其它分枝杆菌的影响，特异性优于常规痰菌检测；第三，该方法采用免疫荧光检测技术，可通过WHO推荐的LED荧光显微镜观察，易于寻找阳性菌，提高检出率；第四，该方法采用膜富集技术，使得在较小的区域内，细菌致病性结核分枝杆菌密度呈指数增加，从而提高检测的灵敏度，同时可减少标本的采样体积，避免资源的浪费。采用膜富集技术具有可重复性、可靠、快速、便宜等优点，并且所需获取血液或脑脊液量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。
发明内容
本发明提供了检测生物样品中结核分枝杆菌的方法，包括步骤：
a. 使用基于微孔膜的富集装置富集生物样品；
b. 使用抗结核分枝杆菌的抗体通过免疫检测方法检测所富集生物样品中是否存在结核分枝杆菌。
其中微孔膜可以是任何材料的微孔膜，例如聚碳酸酯膜、纤维素酯类、聚酰胺类、聚砜类、含氟材料类、聚酯类、聚烯烃类、无机材料等，优选聚碳酸酯膜。微孔膜孔径大小可以是0.1-2.0微米，优选0.4-1.5微米。
其中装置是基于微孔膜的微流体结核分枝杆菌富集装置或者基于微孔膜的针头式过滤器。
其中所述的生物样品为血液、血浆、血清或者脑脊液。
其中抗体是抗结核分枝杆菌的任何抗体。多克隆抗体可以是通过兔、马、牛、羊、骡、豚鼠或鸡制备的抗结核分枝杆菌的多克隆抗体，优选通过克隆ESAT-6或CFP10抗原基因，构建原核表达载体并制备纯化ESAT-6或CFP10抗原，并且免疫上述动物获得的多克隆抗体；单克隆抗体可以是抗结核分枝杆菌的鼠单克隆抗体，优选通过克隆ESAT-6或CFP10抗原基因，构建原核表达载体并制备纯化ESAT-6或CFP10抗原，并且免疫小鼠制备的特异性单克隆抗体。
并且其中免疫检测方法可以是直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、酶免疫法或者SPA法。所述的直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、酶免疫法或者SPA法是本领域众所周知的。
相应地，本发明还提供了开展上述方法的试剂盒，包括基于微孔膜的微流体结核分枝杆菌富集装置和使用抗结核分枝杆菌的抗体通过免疫检测方法检测是否存在结核分枝杆菌的试剂。
本发明的试剂盒主要成份包括：
1）基于微孔膜的微流体结核分枝杆菌富集装置或者基于微孔膜的针头式过滤器以及微孔膜。微孔膜的材质可以是任意适宜材质，例如聚碳酸酯膜、纤维素酯类膜、聚酰胺类膜、聚砜类膜、含氟材料类膜、聚酯类膜、聚烯烃类膜、无机材料膜等，优选聚碳酸酯膜。微孔膜的大小可以是0.1-2.0微米，优选0.4-1.5微米；
2）抗结核分枝杆菌的多克隆抗体或者单克隆抗体，多克隆抗体可以是通过兔、马、牛、羊、骡、豚鼠或鸡制备的抗结核分枝杆菌的多克隆抗体，优选通过克隆ESAT-6或CFP10抗原基因，构建原核表达载体并制备纯化ESAT-6或CFP10抗原，并且免疫上述动物获得的多克隆抗体；单克隆抗体可以是抗结核分枝杆菌的鼠单克隆抗体，优选通过克隆ESAT-6或CFP10抗原基因，构建原核表达载体并制备纯化ESAT-6或CFP10抗原，并且免疫小鼠制备的特异性单克隆抗体；
3）检测用抗体或蛋白：用于直接免疫荧光检测的荧光（异硫氰酸荧光素等荧光染料）标记的抗结核分枝杆菌的抗体，优选抗ESAT-6和CFP-10的单克隆抗体；用于直接酶免疫检测的酶标记的抗结核分枝杆菌的抗体，优选抗ESAT-6和CFP-10的单克隆抗体；用于间接免疫荧光检测的荧光标记的第二抗体，如抗小鼠IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2；用于间接酶免疫检测的酶标记第二抗体，如抗小鼠IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2；及荧光标记的葡萄球菌A蛋白（SPA）；
4）任选的封闭液：包括0.1%-15%小牛血清；0.1%-15%驴血清（或血浆）；
5）任选的洗液：包括0.01mol/L PBS；含0.05%Tween 20 的0.01mol/L PBS。
附图说明
图1 为使用本发明试剂盒染色法单独加入抗ESAT-6 单克隆抗体检测的血液中结核分枝杆菌；
图2为使用本发明试剂盒染色法单独加入抗CFP-10单克隆抗体检测的血液中结核分枝杆菌；
图3为使用本发明试剂盒染色法先后加入抗ESAT-6 单克隆抗体和抗CFP-10单克隆抗体检测的血液中结核分枝杆菌。
具体实施方式
下面以实施例方式进一步描述本发明，但无论如何下面的实施例旨在是举例说明性质的，不能对本发明所要求保护的范围构成限制。因为本领域技术人员众所周知，除了下面所列实施例之外，可以对实施例所述实施方案进行个别改变亦能实现本发明的目的，因此这些改变也处于本发明所要求保护的范围内。
实施例1血浆中结核分枝杆菌的检测与鉴定
（1）采集被检者血液5-10ml(抗凝，EDTA抗凝可有利于发现结核分枝杆菌后做分子检测和耐药试验)；
（2）500-1500转/离心5-10分钟（亦可让血细胞自然下沉后分离血浆与血细胞）；
（3）基于微孔膜(微孔膜的材质可以是任意适宜材质，例如聚碳酸酯膜、纤维素酯类膜、聚酰胺类膜、聚砜类膜、含氟材料类膜、聚酯类膜、聚烯烃类膜、无机材料膜等，优选聚碳酸酯膜。)的微流体过滤装置过滤富集结核分枝杆菌；
（4）血浆2-10ml,以2ml为例说明方法与过程；
（5）血浆2ml加生理盐水或PBS 2ml，混匀；
（6）加6%次氯酸钠8ml,混匀，静置5-20分钟；
（7）加95乙醇（含1%TritonX-100）48ml,混匀，静置5-15分钟；
（8）将上述液体加入微流体装置内或基于膜的针头式过滤器（微孔膜孔径0.4-1.5微米）过滤富集结核分枝杆菌；
（9）用1-8%多聚甲醛（pH7.4）室温固定10分钟（亦可用甲醇），纯水漂洗；
（10）0.1%-3.0%
TritonX-100通透5-30分钟，PBS或纯水漂洗；
（11）0.5%-15%
BSA(小牛血清白蛋白)或小牛血清或驴血清，37℃
封闭5-40分钟，PBS或纯水漂洗；
（12）荧光直接染色：加pH7.2
PBS 适当稀释的荧光标记ESAT-6和CFP-10的单克隆抗体，染色30分钟-2小时（亦可40C冰箱染色过夜）。用PBS漂洗，干燥，即可荧光显微镜观察微孔膜上显荧光的结核分枝杆菌。荧光标记的ESAT-6和CFP-10单克隆抗体，可单独染色，亦可两者联合染色；
（13）间接染色：加pH7.2
PBS 适当稀释的未标记ESAT-6和CFP-10的单克隆抗体，染色30分钟-2小时（亦可40C冰箱染色过夜）。用PBS漂洗后，加荧光标记的第二抗体（抗鼠抗体）或荧光标记的SPA染色20-40分钟，PBS漂洗，干燥，即可荧光显微镜观察微孔膜上显荧光的结核分枝杆菌。未标记的ESAT-6和CFP-10单克隆抗体，可单独染色，亦可两者联合染色。
实施例2
脑脊液中结核分枝杆菌的检测与鉴定
（1）新鲜采集的脑脊液0.5-2ml,
避免因标本放置过久造成细胞破坏、葡萄糖等物质分解、细菌溶解等，标本应尽量避免凝固和混入血液；
（2）基于膜的微流体过滤装置过滤富集结核分枝杆菌；
（3）脑脊液0.5-2ml,
以0.5ml为例说明方法与过程；
（4）脑脊液0.5ml加生理盐水或PBS 3.5ml，混匀；
（5）加6%次氯酸钠8ml,混匀，静置5-20分钟；
（6）加95乙醇（含1%TritonX-100）48ml,混匀，静置5-15分钟；
（7）将上述液体加入微流体装置内或基于膜的针头式过滤器（微孔膜孔径0.4-1.5微米）过滤富集结核分枝杆菌；
（8）用1-8%多聚甲醛（pH7.4）室温固定10分钟（亦可用甲醇），纯水漂洗；
（9）0.1%-3.0%
TritonX-100通透5-30分钟，PBS或纯水漂洗；
（10）0.5%-15%
BSA(小牛血清白蛋白)或小牛血清或驴血清，37℃
封闭5-40分钟，PBS或纯水漂洗；
（11）荧光直接染色：加pH7.2
PBS 适当稀释的荧光标记ESAT-6和CFP-10的单克隆抗体，染色30分钟-2小时（亦可40C冰箱染色过夜）。用PBS漂洗，干燥，即可荧光显微镜观察微孔膜上显荧光的结核分枝杆菌。荧光标记的ESAT-6和CFP-10单克隆抗体，可单独染色，亦可两者联合染色；
（12）间接染色：加pH7.2
PBS 适当稀释的未标记ESAT-6和CFP-10的单克隆抗体，染色30分钟-2小时（亦可4℃冰箱染色过夜）。用PBS漂洗后，加荧光标记的第二抗体（抗鼠抗体）或荧光标记的SPA染色20-40分钟，PBS漂洗，干燥，即可荧光显微镜观察微孔膜上显荧光的结核分枝杆菌。未标记的ESAT-6和CFP-10单克隆抗体，可单独染色，亦可两者联合染色。
Claims (34)
1.一种检测生物样品中结核分枝杆菌的方法，包括步骤：a. 使用基于微孔膜的富集装置富集生物样品；b. 使用抗结核分枝杆菌的抗体通过免疫检测方法检测所富集生物样品中是否存在结核分枝杆菌。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的微孔膜可以是任何材料的微孔膜。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的微孔膜可以是聚碳酸酯膜、纤维素酯类膜、聚酰胺类膜、聚砜类膜、含氟材料类膜、聚酯类膜、聚烯烃类膜或者无机材料膜。
4.权利要求2所述的方法，其中所述的微孔膜是聚碳酸酯膜。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的微孔膜孔径为0.1-2.0微米。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的微孔膜孔径为0.4-1.5微米。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的装置是基于微孔膜的微流体结核分枝杆菌富集装置或者基于微孔膜的针头式过滤器。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述的生物样品为血液、血浆、血清或者脑脊液。
9.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述的抗体是抗结核分枝杆菌的任何抗体。
10.权利要求9所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
11.权利要求10所述的方法，其中所述多克隆抗体可以是来自兔、马、牛、羊、骡、豚鼠或鸡。
12.权利要求10所述的方法，其中所述多克隆抗体是抗ESAT-6或CFP10抗原的多克隆抗体。
13.权利要求9所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
14.权利要求12所述的方法，其中所述的单克隆抗体是鼠单克隆抗体。
15.权利要求12所述的方法，其中所述的单克隆抗体是抗ESAT-6或CFP10抗原的单克隆抗体。
16.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述的免疫检测方法可以是直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、酶免疫法或者SPA法。
17.一种检测生物样品中结核分枝杆菌的试剂盒，包括：a.基于微孔膜的微流体结核分枝杆菌富集装置，和；b.使用抗结核分枝杆菌的抗体通过免疫检测方法检测是否存在结核分枝杆菌的试剂。
18.权利要求17所述的试剂盒，其中所述的微孔膜可以是任何材料的微孔膜。
19.权利要求18所述的试剂盒，其中所述的微孔膜可以是聚碳酸酯膜、纤维素酯类膜、聚酰胺类膜、聚砜类膜、含氟材料类膜、聚酯类膜、聚烯烃类膜或者无机材料膜。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述的微孔膜是聚碳酸酯膜。
21.权利要求17所述的试剂盒，其中所述的微孔膜孔径为0.1-2.0微米。
22.权利要求21所述的试剂盒，其中所述的微孔膜孔径为0.4-1.5微米。
23.权利要求17所述的试剂盒，其中所述的装置是基于微孔膜的微流体结核分枝杆菌富集装置或者基于微孔膜的针头式过滤器。
24.权利要求17-23中任一项所述的试剂盒，其中所述的生物样品为血液、血浆、血清或者脑脊液。
25.权利要求17-23中任一项所述的试剂盒，其中所述的抗体是抗结核分枝杆菌的任何抗体。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中所述抗体是多克隆抗体。
27.权利要求26所述的试剂盒，其中所述多克隆抗体可以是来自兔、马、牛、羊、骡、豚鼠或鸡。
28.权利要求26所述的试剂盒，其中所述多克隆抗体是抗ESAT-6或CFP10抗原的多克隆抗体。
29.权利要求25所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。
30.权利要求29所述的试剂盒，其中所述的单克隆抗体是鼠单克隆抗体。
31.权利要求29所述的试剂盒，其中所述的单克隆抗体是抗ESAT-6或CFP10抗原的单克隆抗体。
32.权利要求17-23中任一项所述的试剂盒，其中所述的免疫检测试剂是直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、直接或间接酶免疫法或者SPA法所使用的试剂。
33.权利要求32所述的试剂盒，其中所述的直接免疫荧光法所使用的检测试剂是荧光标记的抗结核分枝杆菌的抗体，间接免疫荧光法所使用的检测试剂是荧光标记的第二抗体，直接酶免疫法所使用的检测试剂是酶标记的抗结核分枝杆菌的抗体，间接酶免疫法所使用的检测试剂是酶标记的第二抗体，SPA法所使用的检测试剂是荧光标记的葡萄球菌A蛋白。
34.权利要求33所述的试剂盒，其中所述的荧光标记是用异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、花青素或叶绿素蛋白标记的，所述的酶标记是用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或者葡萄糖氧化酶标记的，所述的第二抗体是抗小鼠IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）或IgG（ab’）2。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105759038A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110305874A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-10-08 | 浙江省肿瘤医院 | 长爪沙鼠免疫球蛋白IgG1、IgG2重组蛋白、基因及其应用 |
| CN111289741A (zh) * | 2018-12-08 | 2020-06-16 | 艾维可生物科技有限公司 | 一种偶联cfp-10特异性单抗的纳米磁珠及其制备方法与应用 |
| CN111549152A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-18 | 南京实践医学检验有限公司 | 一种快速富集脑脊液中结核分枝杆菌的试剂盒及检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030022160A1 (en) * | 2000-02-01 | 2003-01-30 | Roland Maes | Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents |
| US20090258347A1 (en) * | 2004-12-14 | 2009-10-15 | University Of The Witwatersrand | Method for diagnosing and monitoring cellular reservoirs of disease |
| CN201819826U (zh) * | 2010-09-15 | 2011-05-04 | 肖乐义 | 一种细胞分离鉴定装置 |
| CN102791378A (zh) * | 2010-01-28 | 2012-11-21 | 西门子公司 | 用于液体过滤的组件和方法以及在显微镜检查中的使用 |
| CN104755626A (zh) * | 2012-08-08 | 2015-07-01 | 尼科拉奥斯·波拉基斯 | 用于直接检测结核分枝杆菌的方法 |
-
2016
- 2016-04-15 CN CN201610235208.0A patent/CN105759038A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030022160A1 (en) * | 2000-02-01 | 2003-01-30 | Roland Maes | Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents |
| US20090258347A1 (en) * | 2004-12-14 | 2009-10-15 | University Of The Witwatersrand | Method for diagnosing and monitoring cellular reservoirs of disease |
| CN102791378A (zh) * | 2010-01-28 | 2012-11-21 | 西门子公司 | 用于液体过滤的组件和方法以及在显微镜检查中的使用 |
| CN201819826U (zh) * | 2010-09-15 | 2011-05-04 | 肖乐义 | 一种细胞分离鉴定装置 |
| CN104755626A (zh) * | 2012-08-08 | 2015-07-01 | 尼科拉奥斯·波拉基斯 | 用于直接检测结核分枝杆菌的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KEVIN P. FENNELLY ,ET AL: "The Small Membrane Filter Method of Microscopy to Diagnose Pulmonary Tuberculosis", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
| 杨笑: "结核性脑膜炎患者脑脊液单核细胞内结核抗原检测的应用研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111289741A (zh) * | 2018-12-08 | 2020-06-16 | 艾维可生物科技有限公司 | 一种偶联cfp-10特异性单抗的纳米磁珠及其制备方法与应用 |
| CN110305874A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-10-08 | 浙江省肿瘤医院 | 长爪沙鼠免疫球蛋白IgG1、IgG2重组蛋白、基因及其应用 |
| CN111549152A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-18 | 南京实践医学检验有限公司 | 一种快速富集脑脊液中结核分枝杆菌的试剂盒及检测方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160713 |