CN104020297B - 用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒及其用途 - Google Patents

用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括特异性抗体：IP‑10抗体和/或CD14抗体；抗原刺激物；以及阳性对照刺激剂。本发明所述试剂盒可用于诊断活动性结核病人或结核潜伏感染者而不受接种BCG(卡介苗)的影响。本试剂盒用于活动性结核病人诊断的敏感性和特异性均高于T‑SPOT.TB商用试剂盒，均达到100％。抗结核治疗1个月后，80％以上的临床结核病人的检出率转为阴性，表明本试剂盒可用于检测临床抗结核治疗效果。

Description

用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒及 其用途
技术领域
本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒。
背景技术
结核病主要由结核分枝杆菌感染引起，2013年世界卫生组织(WHO)报道指出全球约有1200万结核病患者，其中2012年结核新发病例为860万，死亡病例为130万。结核病给人类健康造成严重威胁。我国是结核病五大高负担国之一，结核病严重阻碍我国经济和社会发展。
结核病防控的难点之一是缺乏快速准确的诊断方法。传统的结核病诊断方法有结核菌素皮试试验(TST)、结核菌痰涂片抗酸染色、结核菌痰培养以及放射性X光片等。近年来新发展的诊断方法有分子生物学方法(PCR法)和免疫学方法等。传统的诊断方法都存在敏感性或特异性低的缺陷，而PCR方法假阳性较高。新型免疫学方法中的γ-干扰素(IFN-γ)释放实验(interferon-gamma release assay,IGRA)是现阶段检测结核分枝杆菌感染准确性较高的方法，现有的商用试剂盒有T-SPOT.TB和QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-IT)，这两个试剂盒的敏感性和特异性分别为80％到90％之间，尚有待改进。
人体感染结核分枝杆菌后，体内会产生免疫记忆。当用相同的抗原再次刺激人体免疫细胞时，活化的免疫细胞会分泌大量细胞因子或趋化因子，并具有抗原特异性，即疾病特异性，因而这些免疫细胞分泌的细胞因子或趋化因子具有良好的结核病诊断潜力。
在临床抗结核治疗过程中，结核病人体内的结核分枝杆菌荷载量随着有效治疗的进行而降低，从而导致体内结核抗原特异性免疫细胞数量下降。因而抗原特异性诱导的细胞因子或趋化因子含量也随之下降，因此可见，这些细胞因子或趋化因子能较好地反映临床治疗的有效性，即临床预后价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的用于检测结核分枝杆菌感染和临床抗结核治疗效果监测的试剂盒及其用途。
在本发明的一方面，提供一种用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)以下特异性抗体：IP-10抗体和/或CD14抗体；
b)抗原刺激物；
c)阳性对照刺激剂。
所述抗原刺激物为蛋白质或多肽。所述抗原刺激物优选为结核分枝杆菌ESAT-6抗原和/或结核分枝杆菌CFP-10抗原中的一条或多条多肽或其类似物。所述的多肽由20个氨基酸组成，所述其类似物为与其同源性在75％以上的多肽或多肽修饰物。所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原具体可为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9所示序列的多肽中的至少一种；所述结核分枝杆菌CFP-10抗原具体可为序列表的SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:18所示序列的多肽中的至少一种。所述抗原刺激物为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:18所示序列中的一条或多条多肽。
序列1MTEQQWNFAG IEAAASAIQG，如SEQ ID NO:1所示；
序列2IEAAASAIQG NVTSIHSLLD，如SEQ ID NO:2所示；
序列3NVTSIHSLLD EGKQSLTKLA，如SEQ ID NO:3所示；
序列4EGKQSLTKLA AAWGGSGSEA，如SEQ ID NO:4所示；
序列5AAWGGSGSEA YQGVQQKWDA，如SEQ ID NO:5所示；
序列6YQGVQQKWDA TATELNNALQ，如SEQ ID NO:6所示；
序列7TATELNNALQ NLARTISEAG，如SEQ ID NO:7所示；
序列8NLARTISEAG QAMASTEGNV，如SEQ ID NO:8所示；
序列9QAMASTEGNV TGMFA，如SEQ ID NO:9所示；
序列10MAEMKTDAAT LAQEAGNFER，如SEQ ID NO:10所示；
序列11LAQEAGNFER ISGDLKTQID，如SEQ ID NO:11所示；
序列12ISGDLKTQID QVESTAGSLQ，如SEQ ID NO:12所示；
序列13QVESTAGSLQ GQWRGAAGTA，如SEQ ID NO:13所示；
序列14GQWRGAAGTA AQAAVVRFQE，如SEQ ID NO:14所示；
序列15AQAAVVRFQE AANKQKQELD，如SEQ ID NO:15所示；
序列16AANKQKQELD EISTNIRQAG，如SEQ ID NO:16所示；
序列17EISTNIRQAG VQYSRADEEQ，如SEQ ID NO:17所示；
序列18VQYSRADEEQ QQALSSQMGF，如SEQ ID NO:18所示。
本发明所述特异性抗体包括捕获抗体和检测抗体组成；所述捕获抗体包括抗IP-10包被抗体；所述检测抗体包括生物素标记的抗IP-10抗体、荧光素标记的抗IP-10抗体和/或抗CD14抗体。
此外，本发明试剂盒还可以包括链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)。
所述阳性对照刺激剂指能非特异性刺激细胞产生IP-10的物质。优选为植物血凝素或乙酸肉豆蔻佛波醇。
本发明所述试剂盒诊断原理如下：受检样本可来自于全血、血液分离获得物、胸水、肺泡灌洗液、淋巴结和脑脊液，如PBMC(外周血单个核细胞)分为三份，其中一份为无刺激物的阴性对照，另一份用抗原刺激以产生应答样品，第三份用PHA(植物血球凝集素，或简称植物血凝素)或或乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)等刺激以作为阳性对照。用抗原刺激应答样品所得的IP-10的值减去阴性对照以确定样本的抗原特异性免疫应答水平，并与受试者工作特征曲线(ROC)分析获得的参考值进行对比。如果大于或等于参考值，则表明该受试样本为阳性。同时，阳性对照值要求大于或等于参考值的2倍。
本发明所述检测方法包括但不限于：胞内细胞因子染色法(ICS)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、Luminex、PCR/RT－PCR法、免疫荧光法、放射性免疫检定、免疫学干燥棒、免疫色谱法、免疫杂交、免疫印记、细胞增殖和酶扩增免疫测定技术等。
在本发明的另一方面，提供该试剂盒的用途，包括该试剂盒在制备辅助诊断活动性结核或结核潜伏感染的试剂盒中的应用；该试剂盒在制备评价临床抗结核治疗效果的试剂盒中的应用。
由于本发明所用抗原为结核分枝杆菌特有抗原，因而可区分结核分枝杆菌感染和BCG疫苗接种者。
本发明所述结核分枝杆菌感染人群包括有临床症状的活动性结核病人和无症状的潜伏感染者。此处临床症状包括但不限于咳嗽，发热，胸片异常，胸痛，咳血等。
本发明所述释放IP-10的细胞主要为但不限于CD14+单核细胞。
本发明所述体外诊断活动性结核病人的方法，主要通过使用结核分枝杆菌特异性抗原或多肽体外刺激受检样本从而活化单个核细胞，并检测IP-10释放细胞的数量或培养上清中IP-10的表达量，确定结核分枝杆菌的感染情况。
本发明公开了一种体外评价临床抗结核特异性治疗效果的方法，主要通过使用结核分枝杆菌特异性抗原或多肽体外刺激治疗不同时间结核病人单个核细胞，并检测释放IP-10细胞数量或培养上清中IP-10的分泌量，确定结核病人的临床疗效情况。
本发明所述从活动性结核病人、正常人群以及非结核对照人群等研究对象获得的生物学样本包含但不限于：血液、肺泡灌洗液、胸水、淋巴液及其它含有单个核细胞的生物学样本。此检测方法中释放IP-10的细胞包括但不限于CD14+单核细胞、CD14－单核细胞和T细胞等。
本发明实施方案之一中，采用胞内细胞因子染色法(ICS)发现，结核分枝杆菌特异性抗原诱导的IP-10主要由CD14+单核细胞分泌，且ROC曲线分析表明其用于区分活动性结核病人和正常人群的敏感性和特异性都为100％。
本发明实施方案之二中，采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法，检测活动性结核病人PBMC体外经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后IP-10的分泌，同样，用ROC曲线分析表明其用于区分活动性结核病人和正常人群的敏感性和特异性都为100％。通过监测治疗过程中活动性结核病人样本经核分枝杆菌特异性抗原刺激后IP-10的分泌量，可反映治疗的疗效情况，即预后情况。
经实验验证，本发明所述试剂盒可用于诊断活动性结核病人或结核潜伏感染者而不受接种BCG(卡介苗)的影响。本试剂盒用于活动性结核病人诊断的敏感性和特异性均高于T-SPOT.TB商用试剂盒，均达到100％。抗结核治疗1个月后，80％以上的临床结核病人的检出率转为阴性，表明本试剂盒可用于检测及有效评价临床抗结核治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中结核病人PBMC中结核分枝杆菌特异性抗原诱导的IP-10主要由CD14+单核细胞分泌的示意图。图1a为ICS检测法代表图，其中Blank代表未刺激样本，Stimulant代表抗原刺激样本，HC代表正常人样本，TB代表结核病人样本，细胞分析群为FSC/SSC中的单核细胞群。图1b为ICS检测法统计图，其中，纵坐标代表IP-10+细胞占单核细胞的比例，HC代表正常人样本，TB代表结核病人样本，Non-TB代表非结核疾病对照人群，统计分析采用Unpaired T test方法，***:P<0.001。图1c为ROC曲线分析ICS法检测抗原特异性IP-10用于诊断结核病人的敏感性和特异性的示意图。
图2为本发明实施例2中结核分枝杆菌特异性抗原诱导PBMC表达的IP－10具有结核病特异性的示意图。图2a为ELISA检测法统计图，其中HC代表正常人样本，TB代表结核病人样本，Non-TB代表非结核疾病对照人群，统计分析采用Unpaired T test方法，***:P<0.001。图2b为ROC曲线分析ELISA法检测抗原特异性IP－10用于诊断结核病人的敏感性和特异性的示意图。
图3为本发明实施例1和2中结核分枝杆菌特异性抗原诱导PBMC表达的IP－10具有临床预后价值的示意图。图3a为ICS法检测抗原特异性IP－10用于评价临床抗结核治疗疗效代表图，图3a为二个不同治疗阶段样本经抗原刺激(Stimulant)或无刺激阴性对照(Blank)，细胞分析群为FSC/SSC中的单核细胞群。图3b为ICS法检测抗原特异性IP－10用于评价临床抗结核治疗疗效统计图，其中纵坐标代表IP-10+细胞占单核细胞的比例。图3c为ELISA法检测抗原特异性IP－10用于评价临床抗结核治疗疗效示意图，其中0－1代表治疗1个月以内的结核病人样本，1－9代表治疗1至9个月的结核病人样本，统计分析采用Unpaired T test方法(***:P<0.001，**:P<0.01)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未尽之处，可以参考相应的分子克隆和细胞生物学等实验手册。本发明所述实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：胞内细胞因子染色法检测抗原特异性IP-10。
实验步骤具体如下：
1.活动性结核病人外周血收集于抗凝管中，并用Ficoll密度梯度离心法，分离获得PBMCs。
2.PBMCs经5－10ml PBS或RPMI1640洗涤2次后，重悬于含10％FBS的RPMI1640中，计算细胞数量，并调整至终浓度2.5×106/ml。
3.96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液即0.25×106细胞。实验孔中加入结核分枝杆菌特异性抗原或多肽，抗原或单条多肽终浓度为10μg/ml，多肽库中每条多肽终浓度为2μg/ml。阳性对照孔加入2.5μg/ml PHA，阴性孔加入相同体积的含10％FBS的RPMI1640培养基。各孔用含10％FBS的RPMI1640培养基补充至总体积200μl。
4.培养箱中培养2小时，37℃，5％CO2，100％湿度。
5.每孔加入0.2μl蛋白运输阻断剂(GoligStop，1：1000)，继续培养6到12小时。
6.用200μl PBS或含1％FBS的RPMI1640洗涤2次。
7.PBS或RPMI1640-1％FBS配制表面染色抗体抗CD14-PeCY7工作液，将细胞重悬于50μl表面抗体工作液中，于4℃避光染色30min。
8.用200μl PBS或含1％FBS的RPMI1640洗涤2次。
9.细胞重悬于100μl破膜和固定液中，于4℃避光孵育20min。
10.每孔加入200μl Perm/wash溶液洗涤2次。
11.用Perm/wash溶液配制胞内染色抗体IP-10-PE工作液，细胞重悬于50μl胞内抗体液中。于4℃避光孵育45min。
12.每孔加入200μl Perm/wash溶液洗涤2次。
13.细胞重悬于100-200μl PBS或含有1-2％PFA的PBS中，并转移到流式管中。于4℃避光保存至上机检测，结果见图1。由图1a可知，结核分枝杆菌特异性抗原诱导的IP－10主要由CD14+单核细胞分泌。结核病人PBMC分泌的抗原特异性IP－10显著高于正常对照人群(见图1b)。胞内细胞因子染色法中，抗原特异性诱导的IP－10用于活动性结核病人诊断的敏感性和特异性都为100％(见图1c)。
实施例2：ELISA检测抗原特异性IP-10。
实验步骤具体如下：
1.活动性结核病人、结核潜伏感染者、正常人以及非结核肺部疾病对照人群外周血收集于抗凝管中，并用Ficoll密度梯度离心法，分离获得PBMCs。
2.PBMCs用5－10ml PBS或RPMI1640洗涤2次后重悬于含10％FBS的RPMI1640中，计算细胞数量，并调整至终浓度2.5×106/ml。
3.96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液，即0.25×106PBMC细胞。实验孔中加入结核分枝杆菌特异性抗原或多肽，抗原或单条多肽终浓度为10μg/ml，多肽库中每条多肽终浓度为2μg/ml。阳性对照孔加入2.5μg/ml PHA，阴性孔加入相同体积的含10％FBS的RPMI1640培养基。各孔用含10％FBS的RPMI1640培养基补充至总体积200μl。
4.培养箱中培养20小时，37℃，5％CO2，100％湿度。
5.收集细胞培养上清，冻于-80℃保存或直接用ELISA法检测上清中IP-10浓度。
6.96孔ELISA板中每孔加入100μl抗人IP-10包被抗体，4℃孵育过夜。
7.每孔加入300μl PBS-0.5％Tween20(PBST)洗涤5次。
8.每孔加入200μl ELISA封闭液于室温封闭1h。
9.每孔加入300μl PBST洗涤5次。
10.每孔加入100μl细胞培养上清或标准品，室温孵育2h。
11.每孔加入300μl PBST洗涤5次。
12.每孔加入100μl生物素标记检测抗体及链亲和素-辣根过氧化物酶(SAv-HRP)混合液，并于室温孵育1h。
13.每孔加入300μl PBST洗涤7次。每次作用1-2min。
14.每孔加入100μl TMB底物，于室温孵育30min。
15.每孔加入2N硫酸溶液100μl，以终止反应。
16.全波长酶标仪于450nm处检测吸光度(OD450)值。根据标准曲线计算出各样本数值，结果见图2。由图2a可见，结核病人PBMC经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后分泌的IP－10水平显著高于正常人或非结核肺部疾病对照人群(P<0.001)。ROC曲线分析表明，抗原特异性诱导的IP－10用于活动性结核病人诊断的敏感性和特异性都为100％(见图2b)。图3结果表明，经抗结核治疗1个月后，结核分枝杆菌特异性抗原诱导PBMC分泌IP-10的水平显著下降(P<0.001)，其中83.3％转为阴性水平，表明本发明试剂盒可用于检测及有效评价临床抗结核治疗效果。

Claims (8)

1.一种用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含：
a)以下特异性抗体：IP-10抗体和CD14抗体；
b)抗原刺激物；
c)阳性对照刺激剂；
该试剂盒的检测方法采用胞内细胞因子染色法。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原刺激物为ESAT-6抗原和/或CFP-10抗原中的一条或多条多肽。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原刺激物为ESAT-6抗原和/或CFP-10抗原中的一条或多条多肽，所述的多肽由20个氨基酸组成。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原刺激物为SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:18所示序列中的一条或多条多肽。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照刺激剂为植物血凝素或乙酸肉豆蔻佛波醇。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其检测样本来自于全血、血液分离获得物、胸水、肺泡灌洗液、淋巴结和脑脊液，样本分为三份：一份为无刺激物的阴性对照；另一份用抗原刺激物刺激以产生应答样品；第三份用阳性对照刺激剂刺激以作为阳性对照；用所述应答样品所得的IP-10的值减去阴性对照以确定样本的抗原特异性免疫应答水平，并与参考值进行对比；所述阳性对照刺激剂为植物血凝素。
7.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备辅助诊断活动性结核或结核潜伏感染的试剂盒中的应用。
8.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备评价临床抗结核治疗效果的试剂盒中的应用。
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