CN101419237A - 结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取方法 - Google Patents
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Abstract
一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取方法，其试剂盒包括试剂盒体、以及设置在盒体中的检验试剂，所述的检验试剂包括阳性标准液、显色剂、浓缩洗涤剂和稀释液，它还包括结核分枝杆菌特异性抗原、包被的抗INF－γ抗体和载体蛋白偶联物的酶标二抗；所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ESAT－6和EIS基因表达的融合蛋白；所述的抗INF－γ抗体为鼠源性IgG抗体。特异性抗原制取方法是筛选合适的结核菌特异性抗原ESAT－6与EIS组合，制成的重组融合蛋白含有二者主要的抗原决定簇。本发明重组融合蛋白明确含有适合不同HLA限制的T细胞表位，不会因为不同人群由于HLA分布不同而影响结果。通过对不同人群的结核病人和健康人的临床测试，本发明已显示出比当前同类产品更优异的特异性和灵敏性。
Description
技术领域：
本发明涉及一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取方法，它属于医学免疫诊断学技术领域。
背景技术：
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，是当前感染性疾病的头号杀手，全球有约1/3的人口感染结核菌，每年有约800万新发结核病例，死亡170万。造成上述严重流行情况的原因是多方面的，其中，缺乏早期、特异、敏感的诊断技术和试剂是一个重要原因。目前结核病和结核菌感染的诊断主要有以下技术：1)微生物学检查，包括细菌涂片显微镜检查、结核菌培养、核酸检测；2)免疫学检查，包括抗体检测、PPD皮试、特异性IFN-γ检测。除特异性IFN-γ检测外，其他检测技术的敏感性和/或特异性均不理想。针对特异性IFN-γ检测，目前市场上已有主要应用抗原为30KD，14KD，19KD蛋白等的结核菌感染血清诊断试剂盒，并且通过进一步联合应用ESAT-6蛋白提高了对结核菌检测的敏感性和特异性以满足临床的需要。但由于这些试剂盒采用特异性多肽抗原容易受到不同人群白细胞抗原(HLA)分布的差别而影响结果，同时，不同地区结核菌及其他分枝杆菌感染情况也影响检测的结果。因此，上述试剂盒在像中国这样的发展中国家人群中检测效果并不理想。同时，这些试剂盒(澳大利亚的Cellestis公司生产的Quantiferon-TB-Gold试剂盒和英国Oxford Immun公司生产的T.Spot-TB试剂盒)价格昂贵，不适合中国市场使用。近年来，几种包括EIS(enhance intracellular survival)蛋白在内的新发现的结核菌抗原极有可能明显改变这方面的缺失。作为一种可溶性分泌型蛋白，EIS在早期的研究中被确认为结核分枝杆菌的特异性抗原。本发明者在2006年对EIS蛋白作过充分的研究并证实了EIS作为结核菌抗原的特异性。但EIS能提高结核菌在巨噬细胞中的生存能力并促进结核菌往其他正常淋巴细胞扩散被认为是主要的致病因子并导致Th1/Th2免疫调节紊乱，因此EIS并未被应用于结核菌感染检测。
另一方面，目前结核病治疗缺乏客观、量化的疗效判定指标。目前结控部门推行的短期化疗标准疗程，没有充分考虑治疗个体化因素。结核病治疗疗程的确定的主要依据：1)痰细菌学检查结果，一般的病人在抗痨治疗2个月内即转为阴性，此后的治疗不可能再有细菌学检查结果作为检测的依据；2)放射学检查，以病变的阴影变化为依据来指导治疗，但绝大部分病人在经过急性期后，阴影的改变不明显，而且也很难定量分析，更难以客观。因此，这些指标均不能客观和量化的评价结核病抗痨治疗的效果。而结核病的治疗除考虑合理的医疗费用外，还有两个特殊性：1)抗痨治疗的副作用大，过渡治疗增加毒副作用发生的几率，2)患者体内残留的结核菌是结核病人再发的重要原因，疗程不足是复发的主要原因。因此，需要一种能够全程、客观、量化的判断标准来评价结核病的的治疗效果。
发明内容：
本发明的目的是提供一种具有克服现有结核菌感染酶联免疫斑点检测试剂特异性和敏感性不足的结核菌感染酶联免疫斑点诊断试剂盒以及特异性抗原制取方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，它包括试剂盒体、以及设置在盒体中的检验试剂，所述的检验试剂包括阳性标准液、显色剂、浓缩洗涤剂和稀释液，它还包括结核分枝杆菌特异性抗原、包被的抗INF-γ抗体和载体蛋白偶联物的酶标二抗；所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ESAT-6和EIS基因表达的融合蛋白。
所述的抗INF-γ抗体为鼠源性IgG抗体。
所述的载体蛋白偶联物为碱性磷酸酶，通过戊二醛法交联在酶标二抗体上。
所述的包被的抗IFN-γ抗体与载体蛋白的偶联物的载体的物质为聚偏二氯乙烯。
一种权利要求1中所述的结核分枝杆菌特异性抗原的制取方法，它包括如下的步骤：
A：以结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，通过genebank中报道的ESAT6(GenBank基因文库号AF420491)和EIS(GenBank基因文库号AF144099)基因序列分别设计ESAT-6和EIS基因的扩增引物SEQ NO.1/SEQ NO.2和SEQNO.3/SEQ NO.4扩增ESAT-6和EIS基因；通过在SEQ NO.2和SEQ NO.3中加入互补的碱基作为linker，等量ESAT-6和EIS基因二次扩增后获得融合蛋白基因SEQ NO.5；
引物序列：
SEQ NO.1 5’-CCGGAATTCGATGACAGAGCAGCAGTGG-3’；
SEQ NO.2 5’-GCT GCCGCCACCGCCGGATCC GCCACCGCCGCT TCCACC
GCCACCGAAGCCTGCGAACATCCCAGTGACGT-3’；
SEQ NO.3 5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGC
GGCAGCATGTTCCTACTGGCCGCGGCCAGTTTCA-3’；
SEQ NO.4 5’-CCCAAGCTTTAACTCGAACGCGGTCTGGACGGGAA-3’
SEQ NO.5
5’-ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGC
GCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAG
CAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGC
GTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACA
ACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATG
GCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCAGGTGGCGGTGGAAG
CGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGCAGCATGTTCCTACTGGCCGCGG
CCAGTTTCACCGATTTCATCGGCCCTGAATCAGCGACCGCCTGGCGGACCC
TGGTGCCCACCGACGGAGCGGTGGTGGTCCGCGATGGTGCCGGCCCGGGT
TCTGAGGTGGTCGGGATGGCGCTGTACATGGATCTGCGGTTGACGGTGCCT
GGTGAAGTGGTGCTCCCGACCGCCGGTCTCAGTTTCGTCGCGGTGGCGCC
GACGCATCGCCGGCGCGGCTTGCTGCGCGCGATGTGCGCCGAACTGCACC
GCCGCATAGCCGATTCCGGCTATCCGGTCGCGGCACTGCATGCTAGCGAGG
GCGGCATCTACGGCCGGTTCGGCTACGGGCCCGCTACCACCTTGCATGAGC
TGACGGTCGACCGACGCTTCGCGCGCTTTCACGCCGACGCACCGGGCGGC
GGCCTAGGTGGCAGCAGCGTCCGGTTGGTCAGACCCACCGAGCATCGCGG
CGAGTTTGAGGCGATCTACGAGCGATGGCGCCAGCAGGTGCCGGGCGGGC
TGCTACGCCCGCAGGTGCTCTGGGACGAGCTGCTGGCAGAATGCAAAGCC
GCGCCCGGTGGAGACCGTGAATCGTTCGCGTTACTGCATCCCGACGGGTAC
GCGCTGTACCGGGTGGATCGCACCGATCTCAAGCTAGCGCGCGTCAGCGA
ACTCAGGGCGGTAACCGCAGATGCGCATTGTGCGTTGTGGCGGGCCCTGAT
TGGCCTCGACTCCATGGAGCGAATCAGCATCATCACCCATCCACAGGACCC
GTTACCCCACCTGCTCACCGATACCCGACTGGCCCGCACTACCTGGCGCCA
GGACGGCCTGTGGTTGCGCATCATGAACGTACCGGCCGCACTCGAGGCGC
GTGGTTACGCTCACGAAGTTGGCGAGTTTTCCACGGTCCTCGAGGTATCCG
ATGGCGGCCGGTTCGCGCTCAAGATCGGTGACGGCCGTGCGCGGTGTACC
CCGACCGATGCGGCAGCCGAGATCGAAATGGATCGGGACGTACTGGGCAG
CCTTTACCTTGGAGCGCACCGCGCTTCGACGTTAGCCGCCGCTAACCGGTT
GCGCACCAAAGATTCCCAGCTGCTTCGTCGACTCGACGCGGCGTTTGCCA
GTGATGTTCCCGTCCAGACCGCGTTCGAGTTC-3’
B：通过在扩增引物中加入对应载体的酶切位点，融合蛋白基因转入表达载体，然后将编码本发明的ESAT-6和EIS融合基因可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体，重组表达质粒转入宿主细胞并表达相应融合蛋白，蛋白序列为SEQ NO.6(497AA)；
SEQ NO.6
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQ
GVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFAGGGGSGG
GGSGGGGSMFLLAAASFTDFIGPESATAWRTLVPTDGAVVVRDGAGPGSEVV
GMALYMDLRLTVPGEVVLPTAGLSFVAVAPTHRRRGLLRAMCAELHRRIADS
GYPVAALHASEGGIYGRFGYGPATTLHELTVDRRFARFHADAPGGGLGGSSV
RLVRPTEHRGEFEAIYERWRQQVPGGLLRPQVLWDELLAECKAAPGGDRESF
ALLHPDGYALYRVDRTDLKLARVSELRAVTADAHCALWRALIGLDSMERISIIT
HPQDPLPHLLTDTRLARTTWRQDGLWLRIMNVPAALEARGYAHEVGEFSTVL
EVSDGGRFALKIGDGRARCTPTDAAAEIEMDRDVLGSLYLGAHRASTLAAAN
RLRTKDSQLLRRLDAAFASDVPVQTAFEF
C：表达的融合蛋白，通过凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫杂交(westernblotting)进行反应原性分析；表达的融合蛋白采用标准的蛋白分离纯化技术纯化，用亲和层析法获得纯化重组结核菌融合蛋白，然后对纯化蛋白进行纯度和内毒素含量分析，作为抗原应用的重组蛋白的纯度要达到98％以上，LPS含量小于0.02％；
D：直接应用eBioscience公司的抗人IFN-γ鼠源性IgG；将IgG作为包被原吸附于以PVDF板作为基质外层包裹的固相凹孔内，并用0.1％小牛血清蛋白的PBS封闭后完成预包被板的制作。
所述的分离纯化重组蛋白方法可用离子交换层析方法或疏水层析方法。
所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞，且与表达质粒相匹配。
所使用的宿主细胞是大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP。
本发明的结核分枝杆菌IFN-γ的酶联免疫斑点检测试剂盒通过提供特有的高特异性和敏感性的重组ESAT-6和EIS融合蛋白为刺激抗原，建立检测结核菌抗原特异性IFN-γ的Elispot试剂盒，用于结核菌感染的诊断及疗效判定。
本发明通过筛选合适的结核菌特异性抗原ESAT-6与EIS组合，制成的重组融合蛋白含有二者主要的抗原决定簇。同时本发明的重组融合蛋白明确含有适合不同HLA限制的T细胞表位，不会因为不同人群由于HLA分布不同而影响结果。通过对不同人群的结核病人和健康人的临床测试，本发明已显示出比当前同类产品更优异的特异性和灵敏性。
附图说明：
图1为本发明的ESAT-6&EIS融合蛋白表达示意图
图2为本发明临床实施的统计分析结果
图3为本发明与同类产品检验结果比较
图4是本发明的酶联免疫斑点试剂盒的结构示意图
具体实施方式：
下面结合附图1、图2、图3、图4，对本发明进行进一步的说明：
本发明所述的结核菌酶联免疫斑点检测试剂盒包括结核分枝杆菌特异性抗原、预包被的抗INF-γ抗体和酶标二抗。
其中，所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ESAT-6和EIS基因表达的融合蛋白；包被的抗INF-γ抗体为IgG抗体，抗体可为多种动物源性，在本发明中抗体优选为鼠源性抗体；所述载体蛋白偶联物为辣根过氧化酶联亲和素，辣根过氧化物可通过戊二醛法交联在二抗体上，上述二抗可为抗鼠或抗兔IFN-γ抗体；固定抗IFN-γ抗体与载体蛋白的偶联物的载体的物质很多，如聚苯乙烯，纤维素，聚丙烯酰胺，聚乙烯，聚丙烯，聚偏二氯乙烯等，本实施例中使用的是聚偏二氯乙烯(PVDF)。该载体的形式可以为试管、微量反应板凹孔，小珠，小圆片等，本实施例选择使用的是微量反应板凹孔。
为了方便同时进行大量样本的检测，所述试剂盒还包括PHA标准液，显色剂，浓缩洗涤剂和稀释液。
具体实施方案如下：
以结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，通过genebank中报道的ESAT6(GenBank基因文库号AF420491)和EIS(GenBank基因文库号AF144099)基因序列分别设计ESAT-6和EIS基因的扩增引物SEQ NO.1/SEQ NO.2和SEQNO.3/SEQ NO.4扩增ESAT-6和EIS基因；通过在SEQ NO.2和SEQ NO.3中加入互补的碱基作为linker，等量ESAT-6和EIS基因二次扩增后获得融合蛋白基因SEQ NO.5(1491bp)。具体采用AXYGEN核酸提取试剂盒提取结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA，具体操作方法按常规说明书。用PCR方法扩增ESAT-6和EIS基因。扩增所用引物序列为SEQ NO.1/SEQNO.2和SEQ NO.3/SEQ NO.4。以扩增出的ESAT-6和EIS基因片段各取等量DNA为模板用SEQ NO.1和SEQ NO.4扩增出ESAT-6和EIS融合基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后按QIAquick GELExtraction kit回收目的基因片断，具体操作按常规说明书进行。
引物序列：
SEQ NO.1 5’-CCGGAATTCGATGACAGAGCAGCAGTGG-3’；
SEQ NO.2 5’-GCT GCCGCCACCGCCGGATCC GCCACCGCCGCT TCCACC
GCCACCGAAGCCTGCGAACATCCCAGTGACGT-3’；
SEQ NO.3 5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGC
GGCAGCATGTTCCTACTGGCCGCGGCCAGTTTCA-3’；
SEQ NO.4 5’-CCCAAGCTTTAACTCGAACGCGGTCTGGACGGGAA-3’
SEQ NO.5
5’-ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGC
GCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAG
CAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGC
GTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACA
ACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATG
GCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCAGGTGGCGGTGGAAG
CGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGCAGCATGTTCCTACTGGCCGCGG
CCAGTTTCACCGATTTCATCGGCCCTGAATCAGCGACCGCCTGGCGGACCC
TGGTGCCCACCGACGGAGCGGTGGTGGTCCGCGATGGTGCCGGCCCGGGT
TCTGAGGTGGTCGGGATGGCGCTGTACATGGATCTGCGGTTGACGGTGCCT
GGTGAAGTGGTGCTCCCGACCGCCGGTCTCAGTTTCGTCGCGGTGGCGCC
GACGCATCGCCGGCGCGGCTTGCTGCGCGCGATGTGCGCCGAACTGCACC
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GCGGCATCTACGGCCGGTTCGGCTACGGGCCCGCTACCACCTTGCATGAGC
TGACGGTCGACCGACGCTTCGCGCGCTTTCACGCCGACGCACCGGGCGGC
GGCCTAGGTGGCAGCAGCGTCCGGTTGGTCAGACCCACCGAGCATCGCGG
CGAGTTTGAGGCGATCTACGAGCGATGGCGCCAGCAGGTGCCGGGCGGGC
TGCTACGCCCGCAGGTGCTCTGGGACGAGCTGCTGGCAGAATGCAAAGCC
GCGCCCGGTGGAGACCGTGAATCGTTCGCGTTACTGCATCCCGACGGGTAC
GCGCTGTACCGGGTGGATCGCACCGATCTCAAGCTAGCGCGCGTCAGCGA
ACTCAGGGCGGTAACCGCAGATGCGCATTGTGCGTTGTGGCGGGCCCTGAT
TGGCCTCGACTCCATGGAGCGAATCAGCATCATCACCCATCCACAGGACCC
GTTACCCCACCTGCTCACCGATACCCGACTGGCCCGCACTACCTGGCGCCA
GGACGGCCTGTGGTTGCGCATCATGAACGTACCGGCCGCACTCGAGGCGC
GTGGTTACGCTCACGAAGTTGGCGAGTTTTCCACGGTCCTCGAGGTATCCG
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CCTTTACCTTGGAGCGCACCGCGCTTCGACGTTAGCCGCCGCTAACCGGTT
GCGCACCAAAGATTCCCAGCTGCTTCGTCGACTCGACGCGGCGTTTGCCA
GTGATGTTCCCGTCCAGACCGCGTTCGAGTTC-3’
通过在扩增引物中加入对应载体的酶切位点，融合蛋白基因转入表达载体(可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，然后将编码本发明的ESAT-6和EIS融合基因可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体(在本发明的一个实施例中，所用的质粒为pET21b+)。重组表达质粒转入宿主细胞并表达相应融合蛋白，蛋白序列为SEQ NO.6(497AA)。所用宿主细胞可使用原核细胞或真核细胞等，需要与表达质粒相匹配。具体操作方式：经琼脂凝胶纯化的目的基因产物，，取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌JM109菌株。挑取转化菌单菌落提取质粒，EcoR I和Hind III双酶切鉴定后进行序列分析以证实插入片段序列方向是否正确。选取含有基因表达载体的菌株进行DNA分析，以获取带有正确读码框的表达载体。将含有正确读码框的重组载体转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中，在含Amp(100μg/ml)的琼脂中再次筛选重组菌株，用QIAGEN Plasmid Kit大量制备质粒DNA，用灭菌生理盐水稀释成浓度为1-2μg/μl，紫外分光光度计定量。
SEQ NO.6
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQ
GVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFAGGGGSGG
GGSGGGGSMFLLAAASFTDFIGPESATAWRTLVPTDGAVVVRDGAGPGSEVV
GMALYMDLRLTVPGEVVLPTAGLSFVAVAPTHRRRGLLRAMCAELHRRIADS
GYPVAALHASEGGIYGRFGYGPATTLHELTVDRRFARFHADAPGGGLGGSSV
RLVRPTEHRGEFEAIYERWRQQVPGGLLRPQVLWDELLAECKAAPGGDRESF
ALLHPDGYALYRVDRTDLKLARVSELRAVTADAHCALWRALIGLDSMERISIIT
HPQDPLPHLLTDTRLARTTWRQDGLWLRIMNVPAALEARGYAHEVGEFSTVL
EVSDGGRFALKIGDGRARCTPTDAAAEIEMDRDVLGSLYLGAHRASTLAAAN
RLRTKDSQLLRRLDAAFASDVPVQTAFEF
重组蛋白在原核与真核细胞中的表达，通过凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫杂交(western blotting)进行反应原性分析。具体操作方式：把得到的ESAT-6和EIS融合蛋白基因及pET载体DNA分别用EcoR I和Hind III双酶切再用T4DNA连接酶处理16h(16℃)克隆到原核表达载体pET21b+质粒中在大肠杆菌中表达，在变性条件下用Ni亲合法纯化带有多聚组氨酸标签的重组蛋白。重组蛋白表达的免疫印迹(Western blotting)分析。SDS-PAGE检测后，凝胶上的蛋白通过电转移装置转移到硝酸纤维素(NC)膜上，NC膜放入封闭液中室温下封闭2h，用1xPBS洗漂3次，每次10min；再将NC膜放入杂交袋中，加入1:25或1:50稀释的结合杆菌单抗血清5ml，封闭后室温下缓慢振荡过夜，同前洗膜三次，加入1:2000稀释的HPR-标记二抗，37℃温育1h；同前洗膜3次，加入预先混合底物液，室温显色至适当将NC膜转移至蒸馏水终止反应。结果如图1所示，表明能表达上述融合基因编码的蛋白质。表达的融合蛋白采用标准的蛋白分离纯化技术纯化，获得纯化重组结核菌融合蛋白。分离纯化重组蛋白有多种方法，例如离子交换层析，疏水层析，亲和层析等，在本实施例中使用的是亲和层析法。然后对纯化蛋白进行纯度和内毒素含量分析，作为抗原应用的重组蛋白的纯度要达到98％以上，LPS含量小于0.02％。
本实施例中直接应用eBioscience公司的抗人IFN-γ鼠源性IgG。将IgG作为包被原吸附于以PVDF板作为基质外层包裹的固相凹孔内，并用0.1％小牛血清蛋白的PBS封闭后完成预包被板的制作。检测前，先活化预包被板。然后加入分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和EIS融合蛋白刺激放入的人血淋巴细胞，待测细胞释放IFN-γ，再加入酶标二抗，使之结合；拍板后加入辣根素酶标亲和素，显色后终止，测定斑点总数并分析结果。
本发明试剂盒临床应用
一、样品来源
深圳宝安区某自然村209例健康人群的结合菌感染筛选。
二、检测步骤和结果
按照实施例4中操作分离采集血液的PBMC，在活化预包被好的平板中，每孔加入100μl，细胞浓度为2×105 cells/孔。背景阴性对照孔中不入任何刺激物，阳性照每孔加入1μL PHA标准液，终浓度5ug/mL。加入ESAT-6和EIS的融合蛋白(用Lympho-SpotTM无血清培养基或者RPMI1640配制成终浓度为1μg/孔)到实验孔。当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37℃，5％CO2培养箱培养16-36h。第二天洗板后加入检测抗体孵育1h，再加入酶联亲和素孵育1小时，最后加入显色剂显色。待显色洗板后，通过ELISPOT读板仪斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析.结果如图2，其中平均每2×105细胞中IFN-γ阳性细胞数为4.153±12.91(mean±SD)。按mean±1SD为判断阳性反应的阈值，则真正健康人群中阳性率为12/209＝5.747％，说明本发明的试剂盒具有很好的特异性。
本发明与国外相似ELISPOT产品比较
一、样品来源
共200例样本其中100例来自本发明人单位确诊肺结核病人，100例健康对照组来自本发明人单位员工，某学校在校生及某物业管理公司员工。本发明试剂盒所用标本采集按实施例6所述，QuantiFERON-TB-GOLD检测用试剂盒提供采血管采集3ml。
二、检测方法及结果
200例样本均采用本发明的试剂盒及QuantiFERON-TB-GOLD进行平行检测。其中试剂盒检测按照上述操作规程操作，全血干扰素测定按QuantiFERON-TB-GOLD试剂盒说明书进行操作。结果如图3所示，本发明的试剂盒在检测肺结核患者敏感度(86.3％阳性率)明显高于TB-GOLD(77.2％阳性率)。
本实施例中结核菌感染的酶联免疫斑点检测试剂盒的结构：
试剂盒的结构如图4所示，包括盒体，铝膜真空包装96孔/48孔酶标板10，泡沫托架，泡沫托架上制有凹孔，图中1～9标号试剂瓶，均为安放在泡沫托架的凹孔内，泡沫托架及酶标板安放在盒体内。其中酶标板由塑料制架和可分拆的塑料条组成。所述的放置在试剂瓶1～9中的试剂组合的具体构成如表1所示。
表1
| 标号 | 名称 | 标识 | 规格 | 存储条件、保质期 |
| 1 | 生物素标记抗体 | 蓝盖0.5ml管 | 50μl | 4℃，6个月 |
| 2 | 辣根过氧化酶联亲和素 | 红盖0.5ml管 | 50μl | 4℃，6个月 |
| 3 | 复溶液R(20X) | 蓝盖15ml管 | 10μl | 4℃，6个月 |
| 4 | 浓缩洗涤液(50X) | 无色15ml管 | 10μl | 4℃，6个月 |
| 5 | 底物显色液I(20X) | 粉盖1.5ml管 | 500μl | 4℃，6个月 |
| 6 | 底物显色液II(20X) | 棕盖1.5ml管 | 500μl | 4℃，6个月 |
| 7 | 底物显色液III(20X) | 无色0.5ml管 | 50μl | 4℃，6个月 |
| 8 | 阳性标准液(PHA) | 绿盖0.5ml管 | 50μl | 4℃，6个月 |
| 9 | ESAT-6&EIS融合蛋白 | 紫盖0.5ml管 | 5μg | 4℃，6个月 |
本发明通过建立以上检测IFN-γ细胞因子的ELISPOT方法并配备其他相关试剂，制备成结核分枝杆抗原ELISPOT试剂盒。
试剂盒重复性试验：
从三批预包被的PVDF板中，每板各抽出40个微孔，测定同一浓度PHA标准液刺激同一样品外周淋巴细胞后产生的斑点数，重复测定3次，计算差异系数。结果表明差异系数范围在10-15％。
试剂盒保存期试验：
试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的膜表外观、斑点显色效果测试、阳性检测均与新制试剂盒相同。考虑在运输和使用过程中，会有非常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化试验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常，从以上结果可以得出试剂盒可以在2-8℃至少保存6个月以上。
Claims (8)
1、一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，它包括试剂盒体、以及设置在盒体中的检验试剂，所述的检验试剂包括阳性标准液、显色剂、浓缩洗涤剂和稀释液，其特征在于它还包括结核分枝杆菌特异性抗原、包被的抗INF-γ抗体和载体蛋白偶联物的酶标二抗；所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ESAT-6和EIS基因表达的融合蛋白。
2、如权利要求1中所述的结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，其特征在于所述的抗INF-γ抗体为鼠源性IgG抗体。
3、如权利要求1中所述的结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，其特征在于所述的载体蛋白偶联物为碱性磷酸酶，通过戊二醛法交联在酶标二抗体上。
4、如权利要求1中所述的结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，其特征在于所述的包被的抗IFN-γ抗体与载体蛋白的偶联物的载体的物质为聚偏二氯乙烯。
5、一种权利要求1中所述的结核分枝杆菌特异性抗原的制取方法，其特征在于它包括如下的步骤：
A：以结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，通过genebank中报道的ESAT6和EIS基因序列分别设计ESAT-6和EIS基因的扩增引物SEQNO.1/SEQ NO.2和SEQ NO.3/SEQ NO.4扩增ESAT-6和EIS基因；通过在SEQ NO.2和SEQ NO.3中加入互补的碱基作为linker，等量ESAT-6和EIS基因二次扩增后获得融合蛋白基因SEQ NO.5；
B：通过在扩增引物中加入对应载体的酶切位点，融合蛋白基因转入表达载体，然后将编码本发明的ESAT-6和EIS融合基因可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体，重组表达质粒转入宿主细胞并表达相应融合蛋白，蛋白序列为SEQ NO.6(497AA)；
C：表达的融合蛋白，通过凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫杂交(westernblotting)进行反应原性分析；表达的融合蛋白采用标准的蛋白分离纯化技术纯化，用亲和层析法获得纯化重组结核菌融合蛋白，然后对纯化蛋白进行纯度和内毒素含量分析，作为抗原应用的重组蛋白的纯度要达到98％以上，LPS含量小于0.02％；
D：直接应用eBioscience公司的抗人IFN-γ鼠源性IgG；将IgG作为包被原吸附于以PVDF板作为基质外层包裹的固相凹孔内，并用0.1％小牛血清蛋白的PBS封闭后完成预包被板的制作。
6、如权利要求5中所述的结核分枝杆菌特异性抗原的制取方法，其特征在于所述的分离纯化重组蛋白方法可用离子交换层析方法或疏水层析方法。
7、如权利要求5中所述的结核分枝杆菌特异性抗原的制取方法，其特征在于所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞，且与表达质粒相匹配。
8、如权利要求7中所述的结核分枝杆菌特异性抗原的制取方法，其特征在于所使用的宿主细胞是大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP。
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