CN113945715B - 供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用 - Google Patents

供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，公开了供者特异性IL‑21和IFN‑γ的检测方法，包括提取供者PBMC和受者PBMC并冻存、检测供者特异性IL‑21、检测供者特异性IFN‑γ；还公开了应用。本发明基于ELISPOT和相关细胞因子检测试剂，分离提纯器官移植供者和受者外周血单个核细胞，辐照灭活供者细胞，使其不能产生细胞因子，但保留其抗原性，本发明可实现分泌供者特异性细胞因子的受者细胞的检测，通过本发明可检测器官移植术后供者抗原刺激活化的受者IL‑21或IFN‑γ分泌细胞，可用于评估器官移植受者术前和术后免疫系统的致敏程度，预测肾移植术后急性和慢性排斥反应的发生，动态监测有助于免疫抑制剂个体化用药调整。

Description

供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用。
背景技术
随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时常用酶联免疫吸附法(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索疾病发病机制，用于疾病的诊断和疗效判断具有重要意义。ELISPOT目前最常用于病毒特异性细胞和细胞因子的检测，但是在器官移植领域的应用相对较少，并且还未见供者抗原刺激受者细胞产生细胞因子的相关检测方案。因此，发明人发明供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用。
发明内容
基于以上问题，本发明提供供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用。
为解决以上技术问题，本发明提供了供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法，包括如下步骤：
S1：提取供者PBMC和受者PBMC，并冻存；
S2：检测供者特异性IL-21
(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20min，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；
(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：
A：100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液
B：100μl 3x105受者细胞+100μl3x105灭活的供者细胞
C：100μl 3x105受者细胞+100μl3x1053rdparty灭活的供者细胞
D：100μl 1x105受者细胞+100μl ICE 10x
E：100μl 5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mL
F：100μl 5x104受者细胞+100μl PHA5μg/mL
G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
于37℃、5％CO2条件下孵育44小时；
(3)稀释生物素标记检测抗体：9mL PBS-I+1mL 10x稀释缓冲液+100μl生物素标记检测抗体；250μl PBS-I洗涤5次；加入100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS-I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；室温孵育1小时，封闭；PBS-I双面洗板5次；加入100μl AEC底物液，室温避光孵育30分钟，洗板，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数；
S3：检测IFN-γ
(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者20min，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；
(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：
A：100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液
B：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x105灭活的供者细胞
C：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x1053rdparty灭活的供者细胞
D：100μl 5x104受者细胞+100μl ICE 10x
E：100μl 2.5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mL
F：100μl 2.5x104受者细胞+100μl PHA 5μg/mL
G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
于37℃、5％CO2条件下孵育20小时；
(3)稀释生物素标记检测抗体：9mLPBS-I+1mL稀释缓冲液(10x)+100μl生物素标记检测抗体；250μl PBS-I洗涤2次，250μl PBS-Tween洗涤5次；加100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS-I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育2小时，封闭；PBS-Tween双面洗板5次；加入100μl AEC底物液，室温避光孵育25分钟；去离子水冲洗5次，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数。
进一步的，步骤S2和步骤S3中的供者细胞接受辐射时，受者细胞至于37℃孵箱中保存，盖子不宁紧，确保受者细胞活性。
进一步的，步骤S2(3)和步骤S3(3)中的样本均进行三次重复检测，取平均值，阳性质控大于50个细胞/孔，质控合格。
为解决以上技术问题，本发明还提供了检测方法在评估器官移植受者术前和术后免疫系统的致敏程度或预测肾移植术后急性和慢性排斥反应发生几率的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明基于ELISPOT和相关细胞因子检测试剂，分离提纯器官移植供者和受者外周血单个核细胞，辐照灭活供者细胞，使其不能产生细胞因子，但保留其抗原性，本发明可实现分泌供者特异性细胞因子的受者细胞的检测，通过本发明可检测器官移植术后供者抗原刺激活化的受者IL-21或IFN-γ分泌细胞，可用于评估器官移植受者术前和术后免疫系统的致敏程度，预测肾移植术后急性和慢性排斥反应的发生，动态监测有助于免疫抑制剂个体化用药调整。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
配制如下试剂：
(1)细胞洗液：RPMI(不含谷丙氨酸二肽)+青霉素/链霉素；
(2)细胞冻存液(含10％FBS和10％二甲亚砜)或直接用商品化细胞冻存液：RPMI(含谷丙氨酸二肽)+青霉素/链霉素+FBS-HI+二甲亚砜；
(3)含DNA酶的洗液：RPMI(不含谷丙氨酸二肽)+青霉素/链霉素+DNA酶；
(4)细胞培养液(含10％FBS)：RPMI(含谷丙氨酸二肽)+青霉素/链霉素+FBS-HI；FBS-HI：热灭活胎牛血清；PBS-I：0.2μm过滤膜除菌的磷酸缓冲盐溶液；PBS-Tween：含吐温的磷酸缓冲盐溶液。
提取供者PBMC和受者PBMC，供者PBMC和受者PBMC的提取和储存方法均如下：
(1)混匀含有全血的肝素抗凝管，1500rpm离心7分种，全血将分层；
(2)在不影响白膜层前提下，移除血浆层；
(3)另取单独管子收集剩余血液，按1:1体积比例加入细胞洗液，然后转移至Ficoll管；
(4)500g，离心，20分种，brake 0；
(5)移除上清；
(6)收集PBMC；
(7)用细胞洗液将管子填满；
(8)500g，离心，10分种；
(9)移除上清，重悬细胞，细胞洗液洗涤，500g，离心，5分钟；
(10)移除上清，重悬细胞，用西门子血细胞计数仪计数；
(11)计划每个管子冻存的细胞量；
(12)通常将细胞冻存于2mL管子中；
(13)把细胞置于冰上20分钟；
(14)缓慢加入等量细胞冻存液，在管子中充分混匀，分装入管子，放入梯度冻存盒；
(15)冻存细胞于-80℃过夜。然后将细胞置于液氮中长期冻存。
检测供者特异性IL-21分泌细胞实验流程如下：
第一天：包被反应板
1)稀释包被抗体(1x)：50μl包被抗体(100x)+5mLPBS-I(1:100)；
2)预润洗：25μl 70％乙醇，室温，润洗不超过1分钟；
3)洗涤：200μl PBS-I,洗涤2次；
4)包被：50μl包被抗体(1x)；
5)孵育：4℃过夜；
第二天:封闭反应板
1)准备封闭缓冲液B(1x)：2mL封闭缓冲液B(10x)+18mLPBS-I；
2)洗涤：200μl PBS-I洗涤包被反应板，3次；
3)封闭：200μl封闭缓冲液B(1x)；
4)孵育：室温，避光，至少1小时；
第二天:供受者细胞复融
1)细胞复融：取一支冻存有供者或受者PBMC的管子，用37℃水浴融化细胞至冰水混合状态，取15mL管子加5mL含DNA酶的洗液和1mLFBS-HI(即大于15％FBS)，倒入冰水混合状态的PBMC，混匀，2000rpm离心，5分钟，去上清，重悬；
2)洗涤：4.5mL含DNA酶的洗液+0.5mL FBS-HI(即10％FBS)，2000rpm离心，5分钟，去除上清，重悬细胞；
第二天:细胞计数
1)加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色(20μl台盼蓝染液+20μl细胞悬浮液)后，显微镜下计数；
2)辐射：辐射40Gy(＝64,20分钟)灭活供者细胞，辐射后2000rpm离心，5分钟；
3)浓度矫正：用细胞培养液，矫正供者或受者细胞终浓度3x106/mL(＝3x105/100μl)(注意：供者细胞接受辐射时,受者细胞需至于37℃孵箱保存，盖子不宁紧)。
第二天：细胞孵育
(1)准备:供者PBMC；HLA完全错配的供者PBMC(3rd party)；流感/巨细胞/EB病毒抗原肽库(a peptide pool ofInfluenzaA virus,Cytomegalovirus and Epstein-Barrvirus,ICE)；葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)；阳性质控：植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)
终体积: 稀释倍数: 初始量(μl): RPMI(μl):
ICE 1300 20x 65 1235
PHA 2000 500x 4 1996
SEB(1) 1000 100x 10 990
SEB(2) 2000 50x 40 1960
(2)反应板中，加入刺激剂、供者或受者细胞悬液
A:100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液
B:100μl 3x105受者细胞+100μl 3x105灭活的供者细胞
C:100μl 3x105受者细胞+100μl 3x1053rdparty灭活的供者细胞
D:100μl 1x105受者细胞+100μl ICE 10x
E:100μl 5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mL
F:100μl 5x104受者细胞+100μl PHA5μg/mL
G:100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
H:100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
孵育：44小时，37℃，5％CO2；
第四天：检测斑点
(1)稀释生物素标记检测抗体：9mL PBS-I+1mL稀释缓冲液(10x)+100μl生物素标记检测抗体(1:100)；
(2)洗涤：250μl PBS-I，5次；
(3)二抗：加100μl稀释后的生物素标记检测抗体；
(4)孵育：2小时，室温；
(5)洗板：PBS-I，5次，双面；
(6)稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素：9ml PBS-I+1ml稀释缓冲液(10x)+100μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(1:100)；
(7)加酶：100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；
(8)孵育：1小时，室温，封闭；
(9)洗板：PBS-I，5次，双面；
(10)AEC底物：100μlAEC底物液；
(11)孵育：室温，避光，30分钟；
(12)洗板：去离子水，冲洗5次，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数。
备注：AEC底物液缓冲液：1颗底物缓冲液胶囊溶于57ml去离子水.待完全溶解后，加43ml 70％乙醇(终浓度30％乙醇)；AEC底物液：10mlAEC底物液缓冲液+660μlAEC底物储备液；样本均进行三次重复检测，阳性质控大于50个细胞/孔，质控合格。
检测IFN-γ分泌细胞实验流程如下：
第一天:包被反应板
(1)稀释包被抗体(1x)：50μl包被抗体(100x)+5mLPBS-I(1:100)；
(2)预润洗：25μl 70％乙醇，室温，润洗不超过1分钟；
(3)洗涤：200μl PBS-I,洗涤2次；
(4)包被：50μl包被抗体(1x)；
(5)孵育：4℃过夜；
第二天:封闭反应板
(1)准备封闭缓冲液B(1x)：2mL封闭缓冲液B(10x)+18mLPBS-I；
(2)洗涤：200μl PBS-I洗涤包被反应板，3次；
(3)封闭：200μl封闭缓冲液B(1x)；
(4)孵育：室温，避光，至少1小时；
第二天:供受者细胞复融
(1)细胞复融：取一支冻存有供者或受者PBMC的管子，用37℃水浴融化细胞至冰水混合状态，取15mL管子加5mL含DNA酶的洗液和1mLFBS-HI(即大于15％FBS)，倒入冰水混合状态的PBMC，混匀，2000rpm离心，5分钟，去上清，重悬；
(2)洗涤：4.5mL含DNA酶的洗液+0.5mL FBS-HI(即10％FBS)，2000rpm离心，5分钟，去除上清，重悬细胞；
第二天:细胞计数
(1)加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色(20μl台盼蓝染液+20μl细胞悬浮液)后，显微镜下计数；
(2)辐射：辐射40Gy(＝64,20分钟)灭活供者细胞，辐射后2000rpm离心，5分钟；
(3)浓度矫正：用细胞培养液，矫正供者或受者细胞终浓度3x106/mL(＝3x105/100μl)(注意：供者细胞接受辐射时,受者细胞需至于37℃孵箱保存，盖子不宁紧)。
第二天:细胞孵育
(1)准备:供者PBMC；HLA完全错配的供者PBMC(3rdparty)；流感/巨细胞/EB病毒抗原肽库(a peptide pool ofInfluenzaA virus,Cytomegalovirus and Epstein-Barrvirus,ICE)；葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)；阳性质控：植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)
Figure BDA0003236533940000071
Figure BDA0003236533940000081
(2)反应板中，加入刺激剂、供者或受者细胞悬液
A：100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液
B：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x105灭活的供者细胞
C：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x1053rdparty灭活的供者细胞
D：100μl 5x104受者细胞+100μl ICE 10x
E：100μl 2.5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mL
F：100μl 2.5x104受者细胞+100μl PHA5μg/mL
G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
孵育：20小时，37℃，5％CO2；
第三天:检测斑点
(1)稀释生物素标记检测抗体：9mL PBS-I+1mL稀释缓冲液(10x)+100μl生物素标记检测抗体(1:100)；
(2)洗涤：250μl PBS-I，2次；250μl PBS-Tween，5次；
(3)二抗：加100μl稀释后的生物素标记检测抗体；
(4)孵育：2小时，室温；
(5)洗板：PBS-I，5次，双面；
(6)稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素：9ml PBS-I+1ml稀释缓冲液(10x)+100μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(1:100)；
(7)加酶：100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；
(8)孵育：2小时，37℃，封闭；
(9)洗板：PBS-Tween，5次，双面；
(10)AEC底物：100μlAEC底物液；
(11)孵育：室温，避光，25分钟；
(12)洗板：去离子水，冲洗5次，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数。
备注：AEC底物液缓冲液：1颗底物缓冲液胶囊溶于57ml去离子水.待完全溶解后，加43ml 70％乙醇(终浓度30％乙醇)；AEC底物液：10mlAEC底物液缓冲液+660μlAEC底物储备液；样本均进行三次重复检测，阳性质控大于50个细胞/孔，质控合格。
通过本实施例的方法可检测器官移植术后供者抗原刺激活化的受者IL-21或IFN-γ分泌细胞，可以用于评价器官移植后供者特异性的受者免疫状态，可预测器官移植术后急性和慢性排斥反应发生，动态监测有助于免疫抑制剂个体化用药调整。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：提取供者PBMC和受者PBMC，并冻存；
S2：检测供者特异性IL-21
(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20分钟，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；
(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：
A：100μl3x105受者细胞+100μl细胞培养液
B：100μl3x105受者细胞+100μl3x105灭活的供者细胞
C：100μl3x105受者细胞+100μl3x1053rdparty灭活的供者细胞
D：100μl1x105受者细胞+100μlICE10x
E：100μl5x104受者细胞+100μlSEB100ng/mL
F：100μl5x104受者细胞+100μlPHA5μg/mL
G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
于37℃、5％CO2条件下孵育44小时；
(3)稀释生物素标记检测抗体：9mLPBS-I+1mL10x稀释缓冲液+100μl生物素标记检测抗体；250μlPBS-I洗涤5次；加入100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS-I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；室温孵育1小时，封闭；PBS-I双面洗板5次，加入100μlAEC底物液，室温避光孵育30分钟，洗板，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数；
S3：检测IFN-γ
(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20分钟，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；
(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：
A：100μl3x105受者细胞+100μl细胞培养液
B：100μl3x105受者细胞+100μl3x105灭活的供者细胞
C：100μl3x105受者细胞+100μl3x1053rdparty灭活的供者细胞
D：100μl5x104受者细胞+100μlICE10x
E：100μl2.5x104受者细胞+100μlSEB100ng/mL
F：100μl2.5x104受者细胞+100μlPHA5μg/mL
G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
于37℃、5％CO2条件下孵育20小时；
(3)稀释生物素标记检测抗体：9mLPBS-I+1mL稀释缓冲液10x+100μl生物素标记检测抗体；250μlPBS-I洗涤2次，250μlPBS-Tween洗涤5次；加100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS-I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育2小时，封闭；PBS-Tween双面洗板5次；加入100μlAEC底物液，室温避光孵育25分钟；去离子水冲洗5次，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数。
2.根据权利要求1所述的供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法，其特征在于，步骤S2和步骤S3中的供者细胞接受辐射时，受者细胞至于37℃孵箱中保存，盖子不宁紧，确保受者细胞活性。
3.根据权利要求1所述的供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法，其特征在于，步骤S2(3)和步骤S3(3)中的样本均进行三次重复检测，取平均值，阳性质控大于50个细胞/孔，质控合格。
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